Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines SREBP-1 sont des facteurs de transcription connus pour leur rôle dans la régulation du métabolisme lipidique. Plus récemment des études faites in vitro (myotubes humains en culture primaire) et in vivo (muscle tibial de souris) ont montré que la surexpression de SREBP-1a ou SREBP-1c induit une atrophie musculaire et bloque la différenciation musculaire, en inhibant notamment l’expression des protéines structurales du muscle squelettique et des facteurs de la différenciation musculaire (MRFs). Les travaux de thèse présentés dans ce manuscrit ont eu pour but de décrypter le mécanisme de l’atrophie induite par SREBP-1 et de déterminer comment les protéines SIRT1 pourraient réguler ce facteur de transcription. L’atrophie musculaire résulte d’un déséquilibre entre la quantité de protéines synthétisées et dégradées. Dans nos études, nous montrons que SREBP-1 régule la synthèse protéique et la dégradation protéique, respectivement via le contrôle négatif de l’expression des MRFs et via le contrôle de l’expression des atrogènes, MuRF1 et Atrogin-1. Dans le muscle squelettique, nous démontrons que la désacétylase SIRT1 régule l’activité transcriptionnelle de SREBP-1. Les protéines SREBP-1 et SIRT1 étant toutes deux impliquées dans la régulation du métabolisme lipidique, nous mettons en évidence une nouvelle voie de signalisation reliant le métabolisme énergétique et nutritionnel avec l’activité transcriptionnelle de SREBP-1 dans le muscle. Étant donné le rôle de SIRT1 et SREBP-1 dans le métabolisme lipidique et musculaire, nous nous sommes intéressés au rôle des phospholipides et plus particulièrement des céramides dans la régulation de la masse musculaire.Nos études montrent que la régulation de la quantité de céramides par la cytokine TNFα régule la masse musculaire. Ainsi, nos travaux mettent en évidence de nouveaux liens entre le métabolisme lipidique et la régulation de la masse et du métabolisme musculaire. / SREBP-1 transcription factors are involved in lipid metabolism regulation. Recently, in vitro and in vivo studies have shown that SREBP-1a or SREBP-1c overexpression induce muscular atrophy and block muscular differentiation, notably by inhibiting structural proteins and Myogenics Regulatory Factors (MRFs) expression. The aims of this work are the mecanism determination of the muscular atrophy induced by SREBP-1 overexpression and the elucidation of the role of SIRT1 proteins on SREBP-1 regulation.The muscular atrophy results from an imbalance between the amount of synthesized and degraded proteins. In our studies, we shown that SREBP-1 regulates protein synthesis and protein degradation, respectively via a negative control of MRFs expression and via a control of atrogenes expression, MuRF1 and Atrogin-1. In skeletal muscle, we shown that SIRT1 desacetylase enzyme regulates SREBP-1 transcription activity. Because of SREBP-1 and SIRT1 proteins involvement in lipid metabolism regulation, our results suggest a new signalisation pathway linking energetic metabolism and SREBP-1 transcriptionnal activity in muscle. As SIRT1 and SREBP-1 have a role on lipid and muscular metabolism, we took an interest in phospholipids involvement and more specifically in ceramides involvement in muscle mass regulation. Our studies shown that the regulation of the amount of ceramids by the TNFα regulates muscle mass. Thus, our work allows to identify new links between lipid metabolism and muscle mass and metabolism regulation.

La perte de masse et de force musculaires liée à l'âge, ou sarcopénie, pourrait être partiellementexpliquée par un défaut de récupération de masse musculaire après des épisodes générateursd'atrophie musculaire. Ainsi, les périodes d'immobilisation qui augmentent avec l'âge (alitement,convalescence, fracture) pourraient être suivies d'une absence de récupération musculaire etcontribuer à la fonte musculaire au cours du vieillissement. Les causes de ce défaut de récupérationimpliquent notamment un déséquilibre du taux de renouvellement protéique et du taux derenouvellement cellulaire. L'objectif de cette thèse a donc été de mettre en évidence les mécanismesresponsables de l'atrophie musculaire chez le rat âgé au cours de l'immobilisation et ceux quiseraient défaillants afin de déceler les mécanismes à cibler pour favoriser la récupérationmusculaire.Des rats âgés ont été immobilisés pendant 8 jours par plâtrage unilatéral de la patte arrière, puislaissés en récupération pendant 40 jours après le déplâtrage. Nous avons montré que chez cesanimaux nourris avec un régime contenant 13% de caséine, l'immobilisation entraîne une atrophiedes muscles immobilisés mais, contrairement au rat adulte, le rat âgé ne récupère jamais la massemusculaire perdue. L'atrophie des muscles immobilisés peut être expliquée par 1/ une augmentationde l'apoptose et de la protéolyse ubiquitine-protéasome-dépendante musculaires, 2/ une diminutionde la régénération des cellules musculaires et 3/ une diminution de la protéosynthèse musculaire àl'état nourri. Tous ces phénomènes pourraient résulter de la présence d'un fort stress oxydant etd'une importante inflammation intramusculaire. Tous ces paramètres sont normalisés dès 10 jours derécupération, ce qui permet de stopper l'atrophie mais ne permet pas d'initier la phase derécupération musculaire. Nous avons donc testé l'effet de différentes supplémentationsnutritionnelles au cours de la période de récupération afin de favoriser un gain de masse musculairepost immobilisation. Des supplémentations en leucine (acide aminé bien connu pour stimuler laprotéosynthèse et inhiber la protéolyse) ont ainsi été réalisées. Chez les rats supplémentés, uneamélioration de la synthèse protéique et une normalisation plus précoce des activités protéolytiquesdu protéasome ont été observées. Cependant cette amélioration du métabolisme protéique ne s'estpas traduite par un gain de masse musculaire. Par contre, la modulation qualitative et quantitative desapports en protéines a pu permettre d'obtenir une récupération significative de masse musculaire :ainsi des régimes contenant 13% de lactosérum et des régimes hyper-protéinés ont permis de gagner50% de la masse perdue et ce, dès 20 jours de récupération.Nos résultats montrent que l'immobilisation chez le rat âgé aggrave la sarcopénie. Une fortealtération du métabolisme protéique permet d'expliquer la perte de muscle et la seule normalisationde la protéolyse et de la protéosynthèse permet d'expliquer l'absence de récupération musculaire.Nous avons montré que la modulation des apports en protéines au cours de la phase de récupérationpouvait permettre un gain de protéines.

À la fois le sommeil et la privation de sommeil ont un impact sur la synthèse protéique au niveau du cerveau, mais la contribution des mécanismes traductionnels à la régulation de l’éveil et du sommeil n’a été que peu étudiée. Dans ce mémoire de maitrise, nous étudions le rôle de deux répresseurs de la traduction protéique, les protéines de liaison du facteur 4E d’initiation eucaryote 1 et 2, 4E-BP1 et 4E-BP2 dans l’architecture du sommeil et l’activité électroencéphalographique (EEG), ainsi que dans la réponse EEG et moléculaire à la privation de sommeil. Ces deux protéines inhibent la synthèse protéique en séquestrant une protéine nécessaire à l’initiation de la traduction, eIF4E. Activé par différentes voies de signalisation intra- et extracellulaires, mTORC1 phosphoryle les 4E-BP, ce qui relâche l’inhibition et permet l’initiation de la synthèse protéique. 4E-BP1 est très exprimé au niveau des noyaux suprachiasmatiques et est impliqué dans les rythmes circadiens. 4E-BP2, très exprimé au niveau du cerveau, est nécessaire pour la mémoire et la plasticité synaptique. Des électrodes EEG et électromyographiques (EMG) ont été implantées chez des souris mutantes pour les gènes encodant 4E-BP1 ou 4E-BP2 (Eif4ebp1-/- et Eif4ebp2-/-). Les souris ont été enregistrées pendant 48h et soumises à une privation de sommeil de 6h au début de la seconde journée d’enregistrement. L’effet de la privation sur l’expression de certains gènes a également été mesuré dans le cortex préfrontal des souris. Les souris Eif4ebp1-/- diffèrent des souris sauvages dans la quantité et la qualité du sommeil et de l’éveil. De légères différences au niveau de l’expression génique après privation ont également été trouvées. Les souris Eif4ebp2-/- présentaient, quant à elles, seulement des changements dans la qualité de l’activité EEG en éveil, révélé suite à la privation de sommeil. Les résultats de mon projet de maitrise suggèrent une implication de la machinerie de traduction protéique dans la régulation du sommeil et de l’éveil, et pointent vers des rôles différents des deux répresseurs de la traduction. / Albeit it is known that sleep and sleep loss are impacting protein synthesis in the brain, several unknowns persist about the contribution of the mechanisms of translational control to wakefulness and sleep regulation. In this master project, we studied the role of two suppressors of protein synthesis, the eukaryotic initiation factor 4E-binding protein 1 and 2 (4E-BP1 and 4E-BP2) in sleep architecture and electroencephalographic (EEG) activity as well as in the EEG and molecular responses to acute sleep loss. These two proteins normally repress cap-dependent translation initiation by binding eIF4E. When activated by extracellular and intracellular signaling, mTORC1 phosphorylates 4E-BPs leading to their dissociation from eIF4E, thus allowing the translation initiation. 4E-BP1 is highly expressed in the suprachiasmatic nucleus and implicated in circadian rhythms. 4E-BP2, widely expressed in the brain, is critical for memory and plasticity. Yet, there is no data on their implication in sleep regulation. Mutant mice for the genes encoding 4EBP1 or 4E-BP2 (Eif4ebp1-/- and Eif4ebp2-/- mice) were implanted with EEG and electromyographic (EMG) electrodes and recorded under undisturbed conditions and following a 6-h sleep deprivation (SD). The effect of SD on the expression of genes known to respond to SD was also assessed in the prefrontal cortex of Eif4ebp1-/- and Eif4ebp2-/- mice. Mice lacking Eif4ebp1 differed from wildtype mice regarding the quantity and quality of their sleep and wakefulness, and more subtly in the gene expression response to SD. Moreover, Eif4ebp2-/- mice differed from wild-type mice only for wakefulness and sleep quality, changes in EEG spectral activity generally revealed during and after SD. The results of my master project point towards an implication of the translation machinery in the regulation of wakefulness and sleep and of synchronized cortical activity and suggest different roles of effectors of translational control.

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Un dispositif de stimulation électrique in vitro sur des lignées cellulaires a été optimisé afin de nous permettre d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la SHF. Deux lignées cellulaires (GH3 et PC12) ont été analysées au niveau transcriptomique, protéomique et de la sécrétion hormonale et de neurotransmetteurs.Nous avons comparé les niveaux de sécrétion de PRL des GH3 traitées par SHF, SBF ou par la dopamine; ainsi que les niveaux des catécholamines (DA, AD et NA) des PC12 traitées par SHF, SBF ou par la 6-OHDA. La synthèse protéique des cellules stimulées a été analysée par les techniques d'incorporation de 35S méthionine et de SELDI-TOF-MS. Enfin nous avons recherché les modifications d'expression génique des cellules stimulées en utilisant la technique des microarray à base d'oligonucléotides longs sur nylon et détection radioactive.Les premières expériences montrent une diminution significative de la quantité de prolactine à un niveau comparable à celui obtenu avec l'inhibiteur conventionnel, la dopamine. De la même façon, la production de catécholamines dans le milieu est inhibée. Les données transcriptomiques montrent l'existence des profils d'expression caractéristique de la neurostimulation à haute fréquence, avec environ 100 gènes discriminants impliqués dans la synthèse protéique, la signalisation calcique, l'énergétique cellulaire pour les principaux. Nous avons confirmé l'impact de la neurostimulation sur la synthèse protéique en SELDI-TOF comme en incorporation de méthionine. Un mécanisme original de SHF peut donc être proposé, impliquant la neutralisation de la synthèse protéique dans l'inactivation réactionnelle des structures neuronale

Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliqués dans la synthèse protéique bactérienne. Dans un premier chapitre, les origines de la synthèse protéique au temps du monde ARN sont traitées en guise d'introduction. Ce travail théorique se poursuit par la présentation d'une structure à haute résolution du facteur d'élongation G (EF-G) en complexe avec le ribosome par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET). Grâce aux avancées techniques de la cryo-MET, nous avons observé pour la première fois EF-G lié au ribosome en l'absence de tout inhibiteur. Cet état particulièr d'EF-G permet de visualiser une flexibilité de son doamine III. Cette étude permet aussi de rationaliser le fonctionnement de l'antibiotique acide fusidique. Nous nous sommes ensuite intéressés aux voies de sauvetage de la synthèse protéique et plus particulièrement de la trans-traduction. Ce mécanisme fascinant permet le recyclage des ribosomes bloqués sur un ARN messager défectueux. Cette voie de sauvetage est généralement vitale ou alors indispensable pour la virulence bactérienne. Nous avons réalisé une étude structurale préliminaire de la dégradation de l'ARNm défectueux durant ce processus. Après une revue traitant du sujet, nous présentons une étude de la trans-traduction comme cible pour le développement de nouveaux antibiotiques. Pour cela, nous avons mis au point un système rapporteur avec contrôle interne de l'activité trans-traductionnelle bactérienne. Après avoir mis au point ce système et validé son utilisation, nous l'avons exploité en testant des molécules ciblant la trans-traduction. / The current PhD work brings together various studies linked to bacterial protein synthesis. The first chapter is about the origins of protein synthesis at the time of the RNA world. This theoretical work continues with the presentation of a high-resolution structure of the elongation factor G (EF-G) in complex with the ribosome by cryo-electron transmission microscopy (cryo-TEM). We describe for the first time EF-G bound to the ribosome in the absence of any inhibitor. This particular structure of EF-G displays a yet unseen positioning of its third domain, which becomes very flexible. This study helps to understand the way the antibiotic fusidic acid blocks translation. The work then switches to a study of trans-translation, the main rescuing system of stalled ribosomes in bacteria. Trans-translation is generally vital or at least necessary for bacterial virulence. We conducted a preliminary structural study on the way faulty mRNAs are degraded during this process. This is why we present a study of trans-translation as a target for the development of new antibiotics. For this we developed and validated a reporter system for trans-translation, which is used to screen molecules targeting trans-translation.

Les cardiolipines (CL) sont des phospholipides possédant de nombreux rôles dans la structure et le fonctionnement des mitochondries. Elles sont, par exemple, impliquées dans la stabilisation des complexes des oxydations phosphorylantes, la fusion/fission des membranes mitochondriales, l’import de protéines mitochondriales, la biogénèse des centres fer-soufre (Fe-S), l’apoptose, la protection des mitochondries contre le stress oxydatif…L’ensemble de ces fonctions nécessitent que les chaînes d’acides gras de la CL soient majoritairement insaturées. Le maintien de cette composition en chaînes insaturées requiert une activité acyltransférase portée par la protéine tafazzine, qui est codée par le gène nucléaire TAZ. Des mutations dans ce gène sont la cause du syndrome de Barth (BTHS), qui se caractérise notamment par des myopathies cardiaques et squelettiques, une neutropénie (responsable de nombreuses infections) et des défauts de la chaîne respiratoire. Malgré des progrès considérables dans la compréhension des mécanismes conduisant à la pathogénicité, il n’existe toujours aucune thérapie pour traiter cette maladie. Nous avons donc utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae, chez qui la voie de remodelage des CL par la tafazzine est bien conservée, pour modéliser le BTHS et, ainsi non seulement étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de cette maladie, mais aussi identifier différentes voies thérapeutiques potentielles (suppresseurs génétiques et molécules pharmacologiques). Nous avons tout d’abord construit une levure délétée pour le gène orthologue TAZ (TAZ1 chez la levure), la souche Δtaz1. En accord avec des études précédentes, la souche Δtaz1 présente une diminution quantitative de la CL accompagnée d’un changement qualitatif des chaînes d’acides gras1,2 (plus d’acides gras saturés et moins d’insaturés). Nous montrons aussi que cette levure mutante a un défaut de croissance en milieu respiratoire à température élevée (36°C) ainsi que des défauts dans plusieurs composants impliqués dans les oxydations phosphorylantes2. De façon intéressante, alors que le défaut primaire (diminution des CL et changement qualitatif des chaines d’acide gras) est toujours présent, nous montrons que les oxydations phosphorylantes sont restaurées dans la souche Δtaz1 surexprimant Odc1p2, un transporteur mitochondrial d’intermédiaires du cycle de Krebs, ou par plusieurs composés chimiques. Plusieurs de ces drogues sauvant le mutant, dont la cycloheximide, sont des inhibiteurs partiels de la synthèse protéique cytosolique. Cet effet a été confirmé génétiquement par des mutations affectant les ribosomes cytosoliques. L’ensemble des résultats suggère qu’un défaut au niveau des CL provoquerait un stress protéostatique probablement impliqué dans le processus pathologique. / The phospholipid cardiolipin (CL) has many roles in mitochondrial structure and function, ranging from assembly/stability and functioning of the oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, fusion and fission of mitochondrial membranes, mitochondrial protein import, iron-sulfur (Fe-S) biogenesis, apoptosis, and protection of mitochondria against oxidative damage. The maintenance of a proper unsaturated acyl chain composition of CL involves the acyltransferase tafazzin in which mutations cause Barth syndrome (BTHS), resulting in cardiac and skeletal myopathy, cyclic neutropenia and respiratory chain defects. Despite considerable progress in the understanding of the underlying pathogenic mechanisms, there are still no effective therapies to treat this disease. We are using the yeast Saccharomyces cerevisiae, in which the tafazzin-based cardiolipin remodeling pathway is conserved, as a model system for the exploration of potential therapeutic pathways against BTHS, by way of genetic suppressors and chemical screening. We first constructed a yeast strain lacking the orthologous taffazin gene (Δtaz1). Consistent with previous studies, our Δtaz1 yeast failed to grow on non-fermentable carbon sources at elevated temperatures (36°C) and exhibited defects in several components of the mitochondrial respiratory system. Interestingly, we found that oxidative phosphorylation was fully restored in Δtaz1 yeast by overexpressing Odc1p [1]-a mitochondrial carrier that transports Krebs cycle intermediates- and by a number of chemical compounds. Some of the rescuing drugs, especially cycloheximide, act by partially inhibiting cytosolic protein synthesis leading to a full recovery of oxidative phosphorylations. Our findings identify potential cellular components and pathways for the pharmacological treatment of BTHS patients.

Au cours du vieillissement, l’organisme subit de nombreuses altérations, dont une perte de masse et de fonction musculaire appelée sarcopénie. Ses causes sont multifactorielles. Elle est partiellement liée à une altération de la stimulation de la synthèse protéique musculaire post-prandiale, et certains facteurs tels que le stress oxydant, l’inflammation et la résistance à l’insuline, responsables de nombreux dysfonctionnements métaboliques, accélèrent ce phénomène. Or, ces dérégulations peuvent être induites par une alimentation trop riche en sucres ajoutés, caractéristique des habitudes alimentaires actuelles et qui pourrait donc accélérer le vieillissement. Pourtant, à ce jour, peu d'études ont étudié les effets combinés du vieillissement et d'un régime riche en sucres ajoutés, et à notre connaissance, aucune ne s’est intéressée à la sarcopénie. Ainsi, notre objectif au cours de cette thèse a été de déterminer si un régime riche en sucres ajoutés était capable d'accélérer la sarcopénie. Il était également intéressant d'étudier les effets combinés du vieillissement et de ce régime sur d'autres tissus qui semblent particulièrement exposés, le foie, et le cerveau. Enfin, nous avons également voulu analyser les effets préventifs d'un mélange de micronutriments à la fois in vivo et in vitro. Pour cela, des rats âgés de 16 mois ont été nourris durant 5 mois avec un régime contrôle ou un régime composé à 62% de saccharose, supplémenté ou non en rutine, vitamine A, vitamine E, vitamine D, zinc, et sélénium. En outre, nous avons également inclut un groupe de témoins adultes (8 mois), nourris avec un régime contrôle. Par ailleurs, les effets anti-inflammatoires des micronutriments ont été testés in vitro.Nous avons pu constater que le régime riche en saccharose a accéléré la perte de masse musculaire liée à l’âge en altérant la synthèse protéique musculaire post prandiale, vraisemblablement via l’altération de la sensibilité à l’insuline plutôt que par une augmentation du stress oxydant et de l'inflammation, qui ont été peu affectés par le régime. Il a également entraîné un gain de masse grasse et une augmentation marquée des triglycérides hépatiques et plasmatiques, qui pourraient en partie s’expliquer par une modification de l’activité des enzymes du métabolisme lipidique dans le foie. Au niveau cérébral, la surconsommation de fructose a entraîné une diminution de la concentration protéique qui ne semble pas due à un défaut de synthèse protéique. La supplémentation en micronutriments n’a que partiellement contrecarré les effets du saccharose puisqu’elle n’a pas eu d’effet sur la masse maigre mais a permis de limiter la prise de masse grasse, notamment en inhibant la lipogenèse hépatique. Elle a également restauré la synthèse protéique diminuée au cours du vieillissement dans le cerveau. In vitro, elle a permis de réduire l'inflammation induite expérimentalement.Ainsi, cette thèse a permis de montrer qu’un régime riche en sucres ajoutés accélère la sarcopénie chez le rat âgé mais entraîne également des altérations au niveau hépatique et cérébral. La prévention par les micronutriments testés reste malgré tout limitée. / With aging, several alterations occur, including a loss of muscle mass and function, called sarcopenia. Many factors are responsible for the development of sarcopenia, but some factors as inflammation, oxidative stress and insulin resistance, which have many deleterious effects during aging, can reduce meal-induced stimulation of muscle protein synthesis which was shown to partly explain age-related muscle mass loss. Those factors can be induced by a diet rich in added sugar, characteristic of current dietary habits. Although this kind of diet could accelerate aging features, little is known about combined effect of aging and high sugar diet, particularly on sarcopenia. Thus, the purpose of this work was to determine whether high chronic intake of added sugars could accelerate sarcopenia. We also interested in the combined effect of added sugars and aging on other exposed tissues: liver and brain. Finally, we assessed the preventive effects of a micronutrient supplementation both in vivo and in vitro.In order to do that, for 5 months, 16 month old rats were starch fed or sucrose fed (62% sucrose), with or without micronutrients supplementation (rutin, vitamin A, vitamin E, vitamin D, selenium and zinc). Additionally, an adult control group of 8 month old rats was included. Besides, anti-inflammatory effects of micronutrients were tested in vitro.We showed that high sucrose diet accelerated age-related muscle mass loss by impairing postprandial protein synthesis, likely through decreased insulin sensitivity since inflammation and oxidative stress were only slightly affected by high sucrose diet. This diet also resulted in fat mass gain and increased plasma and liver triglycerides, by modulating the activity of enzymes involved in liver lipid metabolism. In the brain, high sucrose consumption led to decreased protein concentration independently of protein synthesis alteration. Micronutrients supplementation only partially reversed high sucrose diet effects: it did not act on lean body mass but prevented fat mass gain, by inhibiting hepatic lipogenesis. It also restored brain protein synthesis, which was reduced by aging. In vitro, it reduced experimentally induced inflammation.Thus, this work showed that a high sucrose diet accelerates sarcopenia in old rats but also induces liver and brain alterations. Prevention by micronutrients remained limited.

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