Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / nÃo hà / Paclitaxel (PCX) foi o 1 antineoplÃsico efetivo no tratamento de cÃnceres refratÃrios a quimioterapia convencional. Clinicamente, induz artralgias e mialgias de carÃter incapacitante que comprometem a qualidade de vida e limitam o tempo de tratamento antitumoral, acometendo atà 57% dos doentes. Apesar destas repercussÃes clÃnicas nada foi descrito atà o momento, visando elucidar o envolvimento de citocinas prÃ-inflamatÃrias, na gÃnese da atividade hipernociceptiva do PCX, jà que a droga compartilha com o LPS uma via de sinalizaÃÃo desencadeada por receptores Toll (TLR-4 e TLR-2) para geraÃÃo de genes que codificam TNF-&#945;. Dados da literatura sugerem que ocorra um âcross-talkâ entre esses dois membros da famÃlia Toll e, que agonistas diferentes de TLR-2 e TLR-4 sÃo capazes de induzir a ativaÃÃo de NF-&#945;B, AP1 e MAP kinase e a geraÃÃo de TNF-&#945;, citocina chave na cascata de liberaÃÃo de mediadores inflamatÃrios finais que atuam diretamente no nociceptor. Dados do laboratÃrio registraram que o zymosan (ZY) intrarticular em joelhos de ratos produz uma periartrite caracterÃstica da hipernocicepÃÃo no teste de incapacitaÃÃo articular (IA), e que PCX (8mg/kg) amplificou essa resposta quando se injetou  da dose do ZY. Tal amplificaÃÃo foi inibida com o prÃ-tratamento com inibidores de citocina e de prostanÃides. Objetivo. Investigar a participaÃÃo do TLR-4 e TNF-&#945; na gÃnese do efeito potencializador do PCX na artralgia experimental induzida por ZY. Material e MÃtodos. Ratos foram prÃ-tratados Sc com talidomida (TLD), pentoxifilina, dexametasona, indometacina ou celecoxib e estimulados com subdose de ZY (250&#956;g/animal; i-art). ApÃs a 1 medida do tempo de suspensÃo de pata (TSP) no teste de IA, os animais receberam PCX (8mg/kg; ip). Numa segunda etapa os ratos receberam durante trÃs dias consecutivos o prÃ-tratamento com atorvastatina (3, 10, 30mg/kg/dia; VO). Os seguintes parÃmetros foram avaliados: modulaÃÃo da hipernocicepÃÃo no teste de incapacitaÃÃo articular, dosagem de citocinas em lavado de joelho de ratos (TNF-&#945;, IL-1&#945;, Il-6, KC e CINC) e imunohistoquÃmica para TNF-&#945;, IL-1&#945; e TLR-4 no tecido sinovial. Resultados. Ficou demonstrado que PCX (8mg/kg) potencializa a artralgia experimental induzida por ZY em ratos avaliada pelo aumento significativo do TSP (p<0,001) na 4Âh de artrite em relaÃÃo ao controle no teste de IA. Tal efeito foi inibido de maneira significativa pelo prÃ-tratamento com TLD (45mg/kg) e essa inibiÃÃo foi associada à reduÃÃo dos nÃveis de TNF-&#945; produzido pelas cÃlulas do tecido sinovial no lavado articular e da marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-&#61537;. Da mesma forma a inibiÃÃo dessa resposta amplificadora do PCX foi ratificado pelo prÃ-tratamento com atorvastatina nas trÃs doses utilizadas no modelo, tambÃm sendo associado à diminuiÃÃo significativa dos nÃveis de TNF-&#61537; no lavado articular e visÃvel reduÃÃo na marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-&#61537;, IL-1&#61538; e TLR-4, nas trÃs doses utilizadas. ConclusÃes. PCX potencializa a hipernocicepÃÃo induzida por ZY por um mecanismo indireto sobre cÃlulas residentes da membrana sinovial que liberam TNF-&#61537; provavelmente pela ativaÃÃo da NF-&#61547;B via TLR-4/MD2, pois esse efeito potencializador foi inibido pela atorvastatina, um provÃvel antagonista de TLR-4. O TNF-&#61537; liberado age iniciando a cascata de mediadores envolvidos com a dor inflamatÃria, o que justifica em parte as artralgias dos pacientes em tratamento com PCX. / Paclitaxel (PCX) was the first effective antineoplastic medicine in the treatment of tumors that do not respond to conventional chemotherapy. Clinically, it induces incapacitating arthralgias and myalgias that interfere with the patient quality of life and limit the duration of the treatment. This is observed in up to 57% of the patients using the drug. Despite these clinical manifestations, nothing has been published that could explain the involvement of pro-inflammatory cytokines in the triggering of the hypernociceptive effect of PCX, even though it is known that the drug shares with LPS a signaling pathway started by Toll-like receptors (TLR-2 and TLR-4) that activates genes coding for TNF-&#945;. The literature suggests that there is a crosstalk between these two members of the Toll family and that different agonists of TLR-2 and TLR-4 are able to induce the activation of NF-kB, AP1 and MAP kinase in the generation of TNF-&#945;, a key cytokines in the cascade liberating the final inflammatory mediators that act directly on the nociceptor. Data obtained in laboratory show that the injection of zymozan into rat knee-joints produces a periarthritis characteristic of the hypernociception seen in the knee joint incapacitation test and that PCX (8mg/kg) amplified the response when  of the zymozan (ZY) doses was injected. The amplification was inhibited when animals were pre-treated with inhibitors of cytokines and prostanoids. Objective: To study the role of TNF-&#945; and TLR-4 on the initiation of the potentiating effect of PCX on the experimental arthralgia induced by ZY. Material and Methods: Rats were pre-treated Sc with thalidomide, pentoxifiline, dexametazone, indometacin and celecoxib and then stimulated with an intra-articular subdoses of ZY (250&#956;g/animal). After the first measurement of the paw elevation time in the knee joint incapacitation test, the animals were treated with PCX (8mg/kg ip). On a second trial, rats were treated for three consecutive days with atorvastatin (3, 10, 30mg/kg/day; VO). The following parameters were evaluated: modulation of the effect on the knee joint incapacitation test (JIT), amount of cytokines in the ratâs knee lavage (TNF-&#945;, IL-1 &#946;, IL-6, KC and CINC) and immunohistochemistry for TNF-&#945;, IL-1&#946; and TLR-4 on synovial tissue. Results: It was shown that PCX (8mg/kg) potentiates the experimental arthralgia induced by ZY in the rats as evaluated by the significant increase in paw elevation time (p<0.001) at the 4th h of arthritis in relations to controls. Such effect was significantly inhibited by pre-treatment with thalidomide (45mg/kg) and the inhibition was associated with a decrease in the amount of TNF-&#945; produced by synovial tissue cells and detected in the joint lavage and in the immunohistochemistry for TNF-&#945;. Likewise the inhibition of the amplifying response to PCX was seen with pre-treatment with atorvastatin at the three doses used in the experiment, which was also associated with a lower TNF-&#945; in the joint lavage and perceptible decrease in the immunohistochemistry for TNF-&#945;, IL-1&#946; and TLR-4. Conclusions: PCX potentiates the hypernociception induced by ZY through an indirect effect on synovial membrane resident cells that release TNF-&#945; probably through activation of the NF-kB pathway by TLR-4/MD2, since the potentiating effect was inhibited by atorvastatin, a TLR-4 antagonist. Released TNF-&#945; act starting the cascade of mediators involved in the inflammatory pain and this partially explains the arthralgia in patients treated with PCX.

A talidomida foi amplamente prescrita entre 1950 e 1960, em quase 50 países, como hipnosedativo não-barbitúrico e antiemético para indisposição matinal durante a gravidez, sendo em seguida fortemente controlada em função da ocorrência de sérios problemas de teratogenicidade. Nos últimos anos, vários esforços foram realizados no sentido de buscar identificar e elucidar as propriedades antiinflamatórias, imunomodulatórias e antiangiogênicas da talidomida. Na mesma direção, investigações clínicas foram conduzidas em pacientes com diversas doenças, como mieloma múltiplo, carcinoma renal, câncer de próstata, Síndrome da rejeição paciente-enxerto, entre outras. A talidomida possui um centro quiral e dois anéis amida em sua estrutura e é sintetizada como racemato, constituída por dois enantiômeros ativos: (+)-(R)- e (+)-(S)-talidomida. A talidomida racêmica apresenta duas formas polimórficas, alfa ( ) e beta ( ). Assim, a variabilidade observada em relação ao polimorfismo representa um ponto crítico se considerarmos o potencial de alteração de propriedades biofarmacêuticas em decorrência da predominância de um ou outro polimorfo. No Brasil o medicamento talidomida é fabricado exclusivamente pela FUNED – Fundação Ezequiel Dias, laboratório público do Estado de Minas Gerais que integra o Sistema Oficial de produção de Medicamentos do País. Neste contexto, este trabalho tem como principal objetivo a avaliação de características físicas, físico-químicas e tecnológicas dos polimorfos da talidomida, com ênfase nos ensaios de cristalização, dissolução, degradação e compressão. Os resultados deste trabalho contribuíram para um melhor entendimento da relação entre características cristalográficas e propriedades farmacêuticas, agregando uma base científica capaz de avaliar as diferenças existentes destes polimorfos e garantir o controle de qualidade adequado do produto final produzido em um Laboratório Oficial. Estes estudos contribuíram para o cumprimento de exigências regulatórias. / Thalidomide was widely prescribed between 1950 and 1960, in nearly 50 countries, as sedative and antiemetic for morning sickness during pregnancy. After the occurrence of serious problems of teratogenicity it was heavily controlled. Growing interest has been observed in recent years to identify and elucidate the anti-inflammatory, immunomodulatory and anti-angiogenic properties of thalidomide. In the same direction, clinical investigations have been conducted in patients with various diseases such as myeloma, renal carcinoma, and prostate cancer, among others. Thalidomide possesses a chiral center and two amide rings in its structure and is synthesized as racemate, consisting of two active enantiomers: (+)-(R)- and (+)-(S)-thalidomide. It is known that the racemic thalidomide has two polymorphic forms, alpha ( ) and beta ( ). Thus, the observed variability in relation to the polymorphism represents a critical point considering the potential of changes in biopharmaceutical properties due to the predominance of one of them. In Brazil thalidomide tablets are manufactured exclusively by FUNED – Fundação Ezequiel Dias, the public laboratory of the State of Minas Gerais, which integrates the Country's Official System of drug production. In this context, the objectives of this work are the assessment of physical characteristics, physicalchemical and technological properties of polymorphic forms of thalidomide, with emphasis on crystallization, dissolution, degradation and compression. The results of this work contributed to a better understanding of the relationship between characteristic crystallographic properties and pharmaceutical properties, aggregating a scientific basis to assess the differences of these polymorphs and ensure the appropriate quality control of the final product produced in an official laboratory. These studies contributed to compliance with regulatory requirements.

A talidomida foi amplamente prescrita entre 1950 e 1960, em quase 50 países, como hipnosedativo não-barbitúrico e antiemético para indisposição matinal durante a gravidez, sendo em seguida fortemente controlada em função da ocorrência de sérios problemas de teratogenicidade. Nos últimos anos, vários esforços foram realizados no sentido de buscar identificar e elucidar as propriedades antiinflamatórias, imunomodulatórias e antiangiogênicas da talidomida. Na mesma direção, investigações clínicas foram conduzidas em pacientes com diversas doenças, como mieloma múltiplo, carcinoma renal, câncer de próstata, Síndrome da rejeição paciente-enxerto, entre outras. A talidomida possui um centro quiral e dois anéis amida em sua estrutura e é sintetizada como racemato, constituída por dois enantiômeros ativos: (+)-(R)- e (+)-(S)-talidomida. A talidomida racêmica apresenta duas formas polimórficas, alfa ( ) e beta ( ). Assim, a variabilidade observada em relação ao polimorfismo representa um ponto crítico se considerarmos o potencial de alteração de propriedades biofarmacêuticas em decorrência da predominância de um ou outro polimorfo. No Brasil o medicamento talidomida é fabricado exclusivamente pela FUNED – Fundação Ezequiel Dias, laboratório público do Estado de Minas Gerais que integra o Sistema Oficial de produção de Medicamentos do País. Neste contexto, este trabalho tem como principal objetivo a avaliação de características físicas, físico-químicas e tecnológicas dos polimorfos da talidomida, com ênfase nos ensaios de cristalização, dissolução, degradação e compressão. Os resultados deste trabalho contribuíram para um melhor entendimento da relação entre características cristalográficas e propriedades farmacêuticas, agregando uma base científica capaz de avaliar as diferenças existentes destes polimorfos e garantir o controle de qualidade adequado do produto final produzido em um Laboratório Oficial. Estes estudos contribuíram para o cumprimento de exigências regulatórias. / Thalidomide was widely prescribed between 1950 and 1960, in nearly 50 countries, as sedative and antiemetic for morning sickness during pregnancy. After the occurrence of serious problems of teratogenicity it was heavily controlled. Growing interest has been observed in recent years to identify and elucidate the anti-inflammatory, immunomodulatory and anti-angiogenic properties of thalidomide. In the same direction, clinical investigations have been conducted in patients with various diseases such as myeloma, renal carcinoma, and prostate cancer, among others. Thalidomide possesses a chiral center and two amide rings in its structure and is synthesized as racemate, consisting of two active enantiomers: (+)-(R)- and (+)-(S)-thalidomide. It is known that the racemic thalidomide has two polymorphic forms, alpha ( ) and beta ( ). Thus, the observed variability in relation to the polymorphism represents a critical point considering the potential of changes in biopharmaceutical properties due to the predominance of one of them. In Brazil thalidomide tablets are manufactured exclusively by FUNED – Fundação Ezequiel Dias, the public laboratory of the State of Minas Gerais, which integrates the Country's Official System of drug production. In this context, the objectives of this work are the assessment of physical characteristics, physicalchemical and technological properties of polymorphic forms of thalidomide, with emphasis on crystallization, dissolution, degradation and compression. The results of this work contributed to a better understanding of the relationship between characteristic crystallographic properties and pharmaceutical properties, aggregating a scientific basis to assess the differences of these polymorphs and ensure the appropriate quality control of the final product produced in an official laboratory. These studies contributed to compliance with regulatory requirements.

A talidomida foi amplamente prescrita entre 1950 e 1960, em quase 50 países, como hipnosedativo não-barbitúrico e antiemético para indisposição matinal durante a gravidez, sendo em seguida fortemente controlada em função da ocorrência de sérios problemas de teratogenicidade. Nos últimos anos, vários esforços foram realizados no sentido de buscar identificar e elucidar as propriedades antiinflamatórias, imunomodulatórias e antiangiogênicas da talidomida. Na mesma direção, investigações clínicas foram conduzidas em pacientes com diversas doenças, como mieloma múltiplo, carcinoma renal, câncer de próstata, Síndrome da rejeição paciente-enxerto, entre outras. A talidomida possui um centro quiral e dois anéis amida em sua estrutura e é sintetizada como racemato, constituída por dois enantiômeros ativos: (+)-(R)- e (+)-(S)-talidomida. A talidomida racêmica apresenta duas formas polimórficas, alfa ( ) e beta ( ). Assim, a variabilidade observada em relação ao polimorfismo representa um ponto crítico se considerarmos o potencial de alteração de propriedades biofarmacêuticas em decorrência da predominância de um ou outro polimorfo. No Brasil o medicamento talidomida é fabricado exclusivamente pela FUNED – Fundação Ezequiel Dias, laboratório público do Estado de Minas Gerais que integra o Sistema Oficial de produção de Medicamentos do País. Neste contexto, este trabalho tem como principal objetivo a avaliação de características físicas, físico-químicas e tecnológicas dos polimorfos da talidomida, com ênfase nos ensaios de cristalização, dissolução, degradação e compressão. Os resultados deste trabalho contribuíram para um melhor entendimento da relação entre características cristalográficas e propriedades farmacêuticas, agregando uma base científica capaz de avaliar as diferenças existentes destes polimorfos e garantir o controle de qualidade adequado do produto final produzido em um Laboratório Oficial. Estes estudos contribuíram para o cumprimento de exigências regulatórias. / Thalidomide was widely prescribed between 1950 and 1960, in nearly 50 countries, as sedative and antiemetic for morning sickness during pregnancy. After the occurrence of serious problems of teratogenicity it was heavily controlled. Growing interest has been observed in recent years to identify and elucidate the anti-inflammatory, immunomodulatory and anti-angiogenic properties of thalidomide. In the same direction, clinical investigations have been conducted in patients with various diseases such as myeloma, renal carcinoma, and prostate cancer, among others. Thalidomide possesses a chiral center and two amide rings in its structure and is synthesized as racemate, consisting of two active enantiomers: (+)-(R)- and (+)-(S)-thalidomide. It is known that the racemic thalidomide has two polymorphic forms, alpha ( ) and beta ( ). Thus, the observed variability in relation to the polymorphism represents a critical point considering the potential of changes in biopharmaceutical properties due to the predominance of one of them. In Brazil thalidomide tablets are manufactured exclusively by FUNED – Fundação Ezequiel Dias, the public laboratory of the State of Minas Gerais, which integrates the Country's Official System of drug production. In this context, the objectives of this work are the assessment of physical characteristics, physicalchemical and technological properties of polymorphic forms of thalidomide, with emphasis on crystallization, dissolution, degradation and compression. The results of this work contributed to a better understanding of the relationship between characteristic crystallographic properties and pharmaceutical properties, aggregating a scientific basis to assess the differences of these polymorphs and ensure the appropriate quality control of the final product produced in an official laboratory. These studies contributed to compliance with regulatory requirements.

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Entretanto, seus efeitos tóxicos e teratogênicos tornam sua utilização limitada e motivam pesquisas para a síntese de análogos que apresentem eficácia semelhante na imunomodulação, sem efeitos tóxicos. Diversos análogos da talidomida vêm sendo desenvolvidos no laboratório de química da UFJF. Em estudos anteriores, mostramos que a introdução de dois anidridos ftálicos na composição aumenta significativamente a atividade biológica e solubilidade em água do composto, sem aumento da toxicidade em modelos experimentais in vitro e in vivo. O presente trabalho visa a síntese de dois novos compostos análogos da talidomida, CAT-15 e CAT-16, formados por apenas um derivado anidrido ftálico aberto, mantendo um grupo amino livre, e a avaliação da sua atividade anti-inflamatória utilizando linhagem de célula HT-29 e células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) estimuladas com LPS. A citotoxicidade dos compostos foi avaliada pelo ensaio do MTT, com tratamento por 18 horas para células HT-29 e por 24 e 48 horas para PBMC, usando concentrações crescentes de talidomida, CAT-15, CAT-16. A dexametasona foi utilizada como controle positivo. A produção de TNF-α, CXCL-10, IL-6, IL-8 e IL-10 foi avaliada pelo método de ELISA. Os novos compostos não foram tóxicos para as células HT-29 e PBMC em nenhuma das concentrações testadas, com exceção de CAT-16 a 1600µM. Células HT-29 produziram grande quantidade de CXCL-10 em resposta ao LPS e os resultados deste trabalho mostram que a talidomida e os análogos CAT-16 e CAT-15 apresentam atividade inibitória sobre a produção desta quimiocina. O composto CAT-16 modulou a produção de CXCL-10 em concentrações menores que a talidomida em ambos os modelos de tratamento (simultâneo e prétratamento). Em contrapartida, a modulação por CAT-15 foi observada apenas no modelo de pré-tratamento. Com relação a IL-8, a talidomida e o CAT-16 inibiram a produção desta citocina por células HT-29 apenas na concentração de 100µM. Ao contrário das células HT-29, o PBMC produziu TNF-α em resposta ao LPS, tendo a talidomida e o análogo CAT-16 apresentado capacidade de inibição da produção do TNF-α em ambos os tempos de tratamento. O análogo CAT-15 não influenciou a produção de TNF-α por PBMC em nenhuma das concentrações e tempos de tratamento. Este estudo também mostra a atividade da talidomida e dos nos análogos sobre a produção de IL-6 e IL-10 por PBMC, havendo significativa inibição da produção de IL-6 por todos os compostos e tempos de tratamento e sobre IL-10 pelo composto CAT-15 após 48 horas de incubação. Nossos resultados sugerem a aplicabilidade dos novos compostos, CAT-15 e CAT-16, no controle de respostas inflamatórias uma vez que inibiram a produção de moléculas chave como TNF-α, IL6, IL-10, IL-8 e CXCL-10. Ainda, esses compostos possuem estruturas simplificadas, têm baixo custo de produção, são hidrossolúveis e não possuem centro quiral. Esses resultados podem contribuir no desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para certas condições inflamatórias. / Thalidomide is a potent anti-inflammatory drug used in the treatment of various pathologies including Erythema Nodosum Leprosum (ENL), cancer, Crohn's disease and other inflammatory and vascular disorders. However, its toxic and teratogenic effects make its use limited and motivate research groups to synthesize analogues presenting similar immunomodulation efficacy, without toxic effects. Several analogs of thalidomide have been developed in the laboratory of chemistry of the UFJF. Previously, we have shown that introduction of two phthalic anhydrides into the composition significantly enhances biological activity and water solubility, without enhanced toxicity. The present work aims at the synthesis of two new analogues of thalidomide, CAT-15 and CAT-16, formed by only one open phthalic anhydride derivative, maintaining a free amino group, and the evaluation of its anti-inflammatory activity using HT- 29 and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated with LPS. The cytotoxicity of the compounds was evaluated by the MTT assay, with 18 hours treatment for HT-29 cells and for 24 and 48 hours for PBMC, using increasing concentrations of thalidomide, CAT-15, CAT-16. Dexamethasone was used as a positive control. Production of TNF-α, CXCL-10, IL-6, IL-8 and IL-10 was evaluated by the ELISA method. The novel compounds were not toxic to HT-29 and PBMC cells at any of the concentrations tested, with the exception of CAT-16 at 1600μM. HT-29 cells produced large amounts of CXCL-10 in response to LPS and the results of this work show that thalidomide and the CAT-15 and CAT-16 analogs exhibit inhibitory activity on the production of this chemokine. CAT-16 compound modulated the production of CXCL-10 at lower concentrations than thalidomide in both treatment models (simultaneous and pretreatment). In contrast, CAT-15 modulation was observed only in the pre-treatment model. Regarding IL-8, thalidomide and CAT-16 inhibited their production by HT-29 cells only at the concentration of 100 μM. Unlike HT-29 cells, PBMC produced TNF-α in response to LPS, with thalidomide and CAT-16 analog being able to inhibit TNF- production at both treatment times. The CAT-15 analogue did not influence the production of TNF-α by PBMC at any of the concentrations and treatment times. This study also shows the activity of thalidomide and the analogs on IL-6 and IL-10 production by PBMC, with significant inhibition of IL-6 production by all compounds and treatment times and on IL-10 by compound CAT-15 after 48 hours of incubation. Our results suggest the applicability of the new compounds, CAT-15 and CAT-16, in the control of inflammatory responses since they inhibited the production of key molecules such as TNF-α, IL-6, IL-10, IL-8 and CXCL-10. Furthermore, these compounds have simplified structures, and low cost of production, are water soluble and have no chiral center. These results may contribute to the development of novel treatment strategies for certain inflammatory conditions.

Mieloma Múltiplo é a segunda doença com maior prevalência nas doenças malignidades hematológica, incurável com média de sobrevivência de 3-5 anos. MM é uma malignidade das células do plasma caracterizada pela destruição e reabsorção óssea e supressão da formação do osso. A quimiocina SDF-1 (CXCL12) e seu receptor CXCR4 têm um importante papel direcional na migração, homing das células do plasma em mieloma múltiplo e mobilização das células de MM para fora da medula óssea. A talidomida tem sido usada com êxito no tratamento de pacientes com mieloma múltiplo. Neste estudo verificamos o efeito da talidomida na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo e em linhagem de células de mieloma múltiplo humano (RPMI-8226) tratados e sem tratamento de talidomida. Nossos resultamos mostraram uma expressão heterogênea na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 nos pacientes com mieloma múltiplo estudado (n= 79). Entretanto, pacientes com mieloma múltiplo tratados com talidomida mostraram uma baixa expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXC4 quando comparados com pacientes recém diagnosticados para mieloma múltiplo e pacientes com mieloma múltiplo tratados com outros medicamentos. Nossos resultados sugerem que o tratamento com talidomida induz uma baixa regulação na expressão no ligante SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo / Multiple Myeloma (MM) is a second most prevalent hematological malignancy and remains incurable with a median survival of 3-5 years. MM is a plasma cell malignancy characterized by devastating bone destruction due to the enhanced bone resorption and suppressed bone formation. The chemokine stromal-derived factor-1 (SDF-1) and its receptor CXCR4 play an important role in directional migration, homing of plasma cells in multiple myeloma (MM) and mobilization of MM cells out of the bone marrow. The drug thalidomide has been successfully used in the treatment of patients with MM. In this study, we assessed the effect of thalidomide on SDF-1 and CXCR4 expression in MM patients and human myeloma-derived cell line, RPMI 8226 treated with or without thalidomide. A heterogeneous expression pattern of chemokines SDF-1 and CXCR4 receptor were observed for all MM patients studied. However, patients treated with thalidomide showed a significantly decrease in expression of SDF-1 and CXCR4 as compared to newly diagnosed MM patients and MM patients treated with other drugs. RPMI 8226 cell line treated with 10, 20 and 100µM thalidomide also demonstrated decrease in SDF-1 and CXCR4 expression as compared with cell control (RPMI-8226 without thalidomide). Ours results indicate that thalidomide therapy induces down-regulation of CXCR4 and its ligand SDF-1 in multiple myeloma

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / IntroduÃÃo: O cloridrato de irinotecano (CPT-11) à um inibidor da topoisomerase I, clinicamente efetivo no tratamento de vÃrios tipos de cÃncer. Apesar da mucosite intestinal (MI) acompanhada de severa diarrÃia ser o efeito colateral mais limitante do uso terapÃutico do CPT-11, os exatos mecanismos que levam a estes efeitos nÃo sÃo estabelecidos. Objetivo: avaliar o envolvimento de mediadores inflamatÃrios (citocinas, Ãxido nÃtrico â NO e prostaglandinas â PGs) na patogÃnese dos eventos que acompanham a MI induzida pelo CPT-11; e estudar o efeito de inibidores da sÃntese e liberaÃÃo de citocinas, como pentoxifilina (PTX) e talidomida (TLD), e de um inibidor seletivo da ciclooxigenase-2 (COX-2), o celecoxibe (CLX), na lesÃo intestinal induzida pelo CPT-11. Material e MÃtodos: camundongos Swiss, machos, foram tratados durante quatro dias consecutivos com CPT-11 (50, 75 e 100 mg/kg, i.p.) ou veÃculo (0,5 mL, i.p.), a fim de se obter a melhor dose capaz de induzir injÃrias consistentes com o mÃnimo de letalidade. Os animais foram tratados com PTX (1,7, 5 e 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c), CLX (3, 10, 30 mg/kg, gavagem) ou veÃculo (0,5 mL, s.c. ou gavagem), um dia antes da primeira administraÃÃo do CPT-11 (75 mg/kg), e diariamente, atà o sacrifÃcio, no quinto ou sÃtimo dia. Os seguintes parÃmetros foram avaliados: diarrÃia, variaÃÃo de massa corpÃrea, leucograma, sobrevida, anÃlise histopatolÃgica, atividade de mieloperoxidase (MPO), dosagem de citocinas (TNF-&#945;, IL-1&#946; e KC) por ELISA e imunohistoquÃmica para TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS e COX-2 nas mucosas duodenais. Resultados: CPT-11 induziu diarrÃia significante, acompanhada de perda acentuada de massa corpÃrea, leucopenia e reduÃÃo da sobrevida. As alteraÃÃes histopatolÃgicas intestinais induzidas pelo CPT-11 caracterizaram-se pela presenÃa de infiltrado inflamatÃrio nas cÃlulas da lÃmina prÃpria, perda da arquitetura das criptas e achatamento dos vilos. Observou-se ainda, aumento intestinal na atividade de MPO e dos nÃveis de TNF-&#945;, IL-1&#946; e KC, alÃm do aumento significativo na marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS e COX-2. O tratamento com PTX inibiu a diarrÃia tardia, reduziu as alteraÃÃes histopatolÃgicas, a atividade de MPO, e os nÃveis de TNF-&#945;, IL-1&#946; e KC, assim como a marcaÃÃo imunohistoquÃmica para TNF-&#945;, IL-1&#946; e iNOS na mucosa duodenal, entretanto, nÃo preveniu significativamente a perda de massa corpÃrea, a leucopenia e tampouco a mortalidade dos animais. O tratamento com TLD reduziu as lesÃes histopatolÃgicas induzidas pelo CPT-11 na mucosa intestinal, os nÃveis intestinais de MPO e TNF-&#945;, bem como a marcaÃÃo imunohistoquÃmica de TNF-&#945;, mas nÃo foi capaz de prevenir a diarrÃia, a perda de massa corpÃrea, a leucopenia e a sobrevida. O tratamento com CLX nÃo foi capaz de reduzir os parÃmetros inflamatÃrios e sistÃmicos observados nos animais tratados com CPT-11. ConclusÃo: Estes resultados sugerem o envolvimento de TNF-&#945;, IL-1&#946;, KC, NO e PGs na patogÃnese da MI induzida pelo CPT-11. PTX e TLD preveniram significativamente as alteraÃÃes histolÃgicas e inflamatÃrias induzidas pelo CPT-11, entretanto, somente PTX foi capaz de inibir o curso da diarrÃia / Introduction: Irinotecan (CPT-11) is an inhibitor of DNA topoisomerase I and clinically effective against several cancers. A major toxic effect of CPT-11 is delayed diarrhea; however, the exact mechanism by which the drug induces diarrhea has not been established. Purpose: The aim of the present study was to elucidate the involvement of cytokines (TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC), nitric oxide (NO) and prostaglandins (PGs) in the pathogenesis of CPT-11-induced mucositis and the effects of the cytokine production inhibitors, pentoxifylline (PTX) and thalidomide (TLD), as well as the effects of the selective cyclooxygenase (COX-2) inhibitor, celecoxib (CLX), in the CPT-11 induced intestinal mucositis, in mice. Materials and methods: the animals were treated with CPT-11 (50, 75 or 100 mg/kg, i.p.) or vehicle (0,5 ml, i.p.) daily for four days, in order to investigate the best dose able to induce intestinal mucositis without important mortality. In another set of experiments, the animals received PTX (1.7, 5, 15 mg/kg, s.c.), TLD (15, 30, 60 mg/kg, s.c.), CLX (3, 10, 30 mg/kg, oral gavage) or vehicle (0,5 ml, s.c. or oral gavage) one day before the 1st administration of CPT-11 (75 mg/kg; i.p.) and daily until the sacrifice, on the 5th or 7th day. The systemic parameters evaluated were: diarrhea, body mass variation, survival curve and leucogram. In addition, it was also performed histological analysis, myeloperoxidase (MPO) activity assay, duodenum levels of TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC by ELISA and immunohistochemistry for TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS and COX-2 in the duodenal segments. Results: CPT-11 induced an important diarrhea, weight loss, leucopenia and mortality increase. It was also observed histopathological changes, such as shortened villi, loss of the crypt architecture and inflammatory cells infiltration, observed in the lamina propria, as well as, an increase in MPO activity, TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC tissue levels and a marked immuno-staining for TNF-&#945;, IL-1&#946;, iNOS and COX-2. The treatment with PTX inhibited the delayed diarrhea and reduced the following parameters: histopathological alterations, MPO activity, tissue levels of TNF-&#945;, IL-1&#946; and KC, and the immuno-staining for TNF-&#945;, IL-1&#946; and iNOS, however, did not prevent leucopenia, weight loss and mortality. TLD significantly reduced all the inflammatory parameters evaluated, but was not able to prevent diarrhea, leucopenia, weight loss and mortality. On the other hand, CLX did not inhibit the inflammatory nor the systemic alterations induced by CPT-11. Conclusion: These results suggest an important role of TNF-&#945;, IL-1&#946;, KC, NO and PGs in the pathogenesis of intestinal mucositis induced by CPT-11. PTX and TLD showed a protector effect in intestinal structures, however, only PTX reduced the severity of CPT-11-induced diarrhea

Mieloma Múltiplo é a segunda doença com maior prevalência nas doenças malignidades hematológica, incurável com média de sobrevivência de 3-5 anos. MM é uma malignidade das células do plasma caracterizada pela destruição e reabsorção óssea e supressão da formação do osso. A quimiocina SDF-1 (CXCL12) e seu receptor CXCR4 têm um importante papel direcional na migração, homing das células do plasma em mieloma múltiplo e mobilização das células de MM para fora da medula óssea. A talidomida tem sido usada com êxito no tratamento de pacientes com mieloma múltiplo. Neste estudo verificamos o efeito da talidomida na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo e em linhagem de células de mieloma múltiplo humano (RPMI-8226) tratados e sem tratamento de talidomida. Nossos resultamos mostraram uma expressão heterogênea na expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXCR4 nos pacientes com mieloma múltiplo estudado (n= 79). Entretanto, pacientes com mieloma múltiplo tratados com talidomida mostraram uma baixa expressão da quimiocina SDF-1 e seu receptor CXC4 quando comparados com pacientes recém diagnosticados para mieloma múltiplo e pacientes com mieloma múltiplo tratados com outros medicamentos. Nossos resultados sugerem que o tratamento com talidomida induz uma baixa regulação na expressão no ligante SDF-1 e seu receptor CXCR4 em pacientes com mieloma múltiplo / Multiple Myeloma (MM) is a second most prevalent hematological malignancy and remains incurable with a median survival of 3-5 years. MM is a plasma cell malignancy characterized by devastating bone destruction due to the enhanced bone resorption and suppressed bone formation. The chemokine stromal-derived factor-1 (SDF-1) and its receptor CXCR4 play an important role in directional migration, homing of plasma cells in multiple myeloma (MM) and mobilization of MM cells out of the bone marrow. The drug thalidomide has been successfully used in the treatment of patients with MM. In this study, we assessed the effect of thalidomide on SDF-1 and CXCR4 expression in MM patients and human myeloma-derived cell line, RPMI 8226 treated with or without thalidomide. A heterogeneous expression pattern of chemokines SDF-1 and CXCR4 receptor were observed for all MM patients studied. However, patients treated with thalidomide showed a significantly decrease in expression of SDF-1 and CXCR4 as compared to newly diagnosed MM patients and MM patients treated with other drugs. RPMI 8226 cell line treated with 10, 20 and 100µM thalidomide also demonstrated decrease in SDF-1 and CXCR4 expression as compared with cell control (RPMI-8226 without thalidomide). Ours results indicate that thalidomide therapy induces down-regulation of CXCR4 and its ligand SDF-1 in multiple myeloma

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cÃncer de pulmÃo tem sido, na Ãltima dÃcada, a principal causa de morte por cÃncer no mundo, apesar do surgimento de novos quimioterÃpicos e das terapias alvo-direcionadas. Por isso, faz-se necessÃrio o entendimento das alteraÃÃes moleculares e biolÃgicas envolvidas nos processos de carcinogÃnese e crescimento tumoral, bem como o desenvolvimento de modelos experimentais adequados que permitam estudar o comportamento biolÃgico dos tumores de pulmÃo e o efeito de drogas antineoplÃsicas. O objetivo desse estudo foi desenvolver um modelo de tumor no pulmÃo em ratos imunocompetentes de execuÃÃo simples e fÃcil reprodutibilidade, e avaliar a atividade de drogas antitumorais. Cento e noventa e um ratos Wistar fÃmeas, peso mÃdio de 199Â23g, foram distribuÃdos ao acaso em trÃs etapas experimentais. Todos os animais foram anestesiados com tribromoetanol 2,5% (1 ml/100g de rato) intraperitonial (ip), traqueostomizados e intubados com cateter de polietileno 16G, seguindo-o por via intrabrÃnquica (ib) atà as porÃÃes inferiores do pulmÃo para inocular cÃlulas do tumor 256 de Walker. A 1a etapa (n=32) foi feita para estabelecer a tÃcnica do implante de cÃlulas por via ib e o Ãndice de pega tumoral, inoculando-se de 105 a 5Ã105 cÃlulas. A 2a etapa (n=16) para avaliar o volume tumoral no 5o dia do implante de 4Ã105 cÃlulas e correlacionar os achados da tomografia computadorizada de alta resoluÃÃo (TCAR) de tÃrax com os da necropsia. A 3a etapa (n=143) para a avaliar o efeito de drogas e validar o modelo, sendo dividida em duas fases. A 1a fase (n=72) para avaliar o volume tumoral no 5o ou 6o dia do implante de 4Ã105 cÃlulas do tumor, composta de cinco grupos: Grupo controle (Gc), NaCl 0,9% (1ml/gavagem); Grupo celecoxib (Gclx), 15, 30 e 60 mg/kg/dia/gavagem; Grupo talidomida (Gtld), 45 mg/kg/d/sc; Grupo gefitinib (Ggfb), 25 mg/kg/dia; Grupo talidominda + gefititinib (Gtld +gfb). A 2a fase (n=71) para avaliar a sobrevida dos animais, com seis grupos: Gc, Gclx (15, 30, 60), Gtld, Ggfb, Gtld + gfb, Grupo paclitaxel (Gpcl), 8 mg/kg ip. O Ãndice geral de pega do tumor com o implante 4Ã105 cÃlulas foi de 96% (149/155), sendo 90% na 1a etapa, 100% na 2a etapa e 96% na 3a etapa. A mortalidade cirÃrgica foi de 4,2% (8/191) e 21 animais foram excluÃdos do estudo por ausÃncia de tumor no pulmÃo, morte por infecÃÃo (abscesso pulmonar) e outras causas nÃo relacionadas com o tumor. Na 2a etapa, as medidas do tumor feitas na TCAR e comparadas com a necropsia foram semelhantes (r=0, 953, p<0,0001). Na 1a fase da 3a etapa, nÃo se observou diferenÃa no volume tumoral dos animais dos grupos tratados em relaÃÃo ao controle; e na 2a fase verificou-se aumento significante da sobrevida mediana dos animais tratados com TLD, GFB e PCL (13, 13 e 29 dias, respectivamente), em relaÃÃo ao controle (11dias), teste de Log Rank: p<0,001. Conclui-se que o modelo de tumor de pulmÃo por implantaÃÃo de cÃlulas tumorais por via intrabrÃnquica mostrou-se viÃvel, com alto Ãndice de pega e mortalidade cirÃrgica desprezÃvel, de execuÃÃo simples e fÃcil reprodutibilidade. A TCAR revelou-se um mÃtodo de imagem de alta acurÃcia no diagnÃstico, localizaÃÃo e mensuraÃÃo das lesÃes tumorais. O modelo mostrou-se eficaz na avaliaÃÃo de atividade antitumoral de drogas antineoplÃsicas como o paclitaxel, antiangiogÃnicas como a talidomida, e inibidores de tirosina quinase do EGFR como o gefitinib. / Lung cancer has been the main cause of death from cancer worldwide over the past decade in spite of the appearance of new chemotherapy drugs and targeted therapies. It is therefore necessary to clarify the molecular and biological changes involved in carcinogenesis and tumor growth and to develop experimental models for the study of the biology of lung tumors and the effects of antineoplastic drugs. The objective of the study was to develop a practical and easily reproducible lung tumor model using immunocompetent rats and to evaluate the activity of antineoplastic drugs. One hundred ninety-one female Wistar rats, with an average weight of 199Â23g, were randomly assigned to one of three experimental groups. All animals were anesthetized intraperitonially (ip) with 2.5% tribromoetanol (1ml/100g live weight), tracheostomized and intubated with a polyethylene catheter (16G) guided intrabronchially (ib) to the bottom of the lung for inoculation with Walker 256 tumor cells. Group 1 (n=32) established the ib cell implant technique and the tumor take rate with inoculation of 105 to 5Ã105 cells. Group 2 (n=16) evaluated tumor volume on the fifth day of implant with 4Ã105 cells and correlated chest findings from high-resolution computerized tomography (HRCT) and necropsy. Group 3 (n=143) evaluated the effect of antineoplastic drugs and validated the model in two stages. Stage 1 (n=72) evaluated tumor volume on the fifth day of implant with 4Ã105 cells, divided into 5 groups: control (CG), 0.9% NaCl (1ml/gavage); celecoxib (Gclx), 15, 30 and 60mg/kg/day/gavage; thalidomide (Gtld), 45mg/kg/d/sc; gefitinib (Ggfb), 25mg/kg/day/gavage; and thalidomide + gefitinib (Gtld + gfb). Stage 2 (n=71) evaluted the survival of the animals divided into six groups: Gc, Gclx, Gtld, Ggfb, Gtld + gfb, and Gpcl (paclitaxel) 8mg/kg ip. The overal take rate for implants of 4Ã105 cells was 96% (149/155), specifically 90% in the first experimental group, 100% in the second and 96% in the third. Surgical mortality was 4.2% (8/191); 21 animals were excluded due to absence of tumor in the lung, death from infection (pulmonary abscess) and other causes not related to the tumor. In Group 2, measures obtained with HRCT and necropsy were similar (r=0, 953, p<0.0001). In the first stage of Group 3 no difference in tumor volume was observed between treated animals and controls; in the second stage median survival time was significantly extended in animals treated with TLD, GFB and PCL (13, 13 and 29 days, respectively) compared to controls (11 days) (Log Rank test: p<0.001). In conclusion, the present lung tumor model with intrabronchial tumor cell implantation was shown to be feasible and was associated with high tumor take rates, minor surgical mortality, simple execution and easy reproducibility. HRCT was found to be a highly accurate method of diagnosis, localization and tumor measurement. The model was efficient in the evaluation of the antitumoral activity of the antineoplastic drug paclitaxel, the antiangiogenic drug thalidomide, and the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib, making it a valid model for testing new drugs in lung cancer.

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Uma série de compostos diamínicos contendo duas subunidades ftalimídicas abertas foram escolhidos como análogos da talidomida. Nossos resultados mostram que compostos contendo dois grupos ftalimídicos podem ser facilmente obtidos em elevada quantidade através da condensação de anidrido ftálico ou anidrido 3-nitroftálico com diferentes diaminas comercialmente disponíveis. O efeito destes compostos na produção de TNF-α, IL-12, IL-10 e NO, e na expressão de CD80 e CD86 em células J774A.1 estimuladas com LPS/IFN-γ foi investigado. O nível de mRNA para TNF-α, IL-12, IL-10 e iNOS em J774A.1 foi analisado por RT-PCR em tempo real. Células do sangue periférico humano (PBMC) foram usadas para avaliar a produção de TNF-α, IL-6, IFN-γ , CXCL9 e CXCL10. A produção de citocinas foi avaliada por ELISA, a produção de NO pelo método de Griess, e a expressão de CD80, CD86, CXCL9 e CXCL10 por citometria de fluxo. As células J774A.1 foram incubadas com diferentes concentrações dos compostos (entre 1 a 880 μM) e após 1h foram estimuladas com LPS (1 μg/ml) e IFN-γ (0,4 ng/ml) por 18h. PBMC humano foi incubado de forma similar e estimulado com LPS (2 μg/ml). Três compostos inibiram de forma elevada a produção de TNF-α , IL-12 e NO, conquanto que aumentaram a produção de IL-10. Além disto, inibiram a expressão de CD80, mas não de CD86. Os resultados analisados por RT-PCR em tempo real indicaram que esses compostos atuaram em eventos pós-transcricionais. Os compostos N, N'-Di-(2-carboxi-benzoil)-1,3-propanodiamina, N, N'-Di-(2-carboxi-3-nitro-benzoil)-1,2-etilenodiamina e N, N'-Di-(2-carboxi-3-nitro-benzoil)-1,6-hexanodiamina inibiram mais a produção de TNF-α do que a talidomida (IC50 de 55 μM, 5 μM, 6,1 μM e 220 μM, respectivamente) e também tiveram efeito inibitório na produção de IFN-γ, IL-6, CXCL9 e CXCL10. Os compostos não tiveram efeito na viabilidade celular avaliada por azul de Trypan e por MTT. Este trabalho mostra a síntese e caracterização de novos análogos da talidomida, obtidos em bom rendimento utilizando metodologia simples. Nossos resultados sugerem que a potencial atividade anti-inflamatória e imunorregulatória destes compostos diamínicos apresentam potencial aplicação no tratamento de ENL e outras doenças. / Thalidomide is used to treat various diseases including erythema nodosum leprosum (ENL), an inflammatory complication of leprosy. However, it has severe teratogenic activity and novel thalidomide analogues might be used to treat the disease without this severe side effect. A series of diamine compounds containing two hydrolyzed phthalimido structures were chosen as analogues of thalidomide. Our results show that compounds bearing two phthalimido units could easily be obtained in high yield by condensation of phthalic or 3-nitrophthalic anhydride with the different diamines comercially available. The effects of these compounds on production of TNF-γ, IL-12, IL-10 and NO, and on expression of CD80 and CD86 in LPS/IFN-γ stimulated J774A.1 cells were investigated. The level of TNF-, IL-12, IL-10 and iNOS mRNA in J774A.1 was analyzed by real time RT-PCR. Human peripheral blood (PBMC) was used to evaluate TNF-γ, IFN-α, CXCL9 and CXCL10 production. Cytokine production was evaluated by ELISA, NO production by the Griess assay, and CD80, CD86, CXCL9 and CXCL10 expression by cytometry. J774A.1 cells were incubated with different concentrations of the compounds (between 1 and 880 μM) and after 1h stimulated with LPS (1 μg/ml) and IFN-γ (0,4 ng/ml) for 18h. Human PBMC were similarly incubated with the compounds and stimulated by LPS (2 μg/ml). Three compounds greatly inhibited TNF-α, IL-12 and NO production while enhancing IL-10. In addition, CD80 expression was inhibited, but not CD86. The result analyzed by real time RT-PCR indicates that these compounds act in the blocking of post-transcriptional events. The compounds N, N'-Di-(2-carboxy-benzoyl)-1,3-propanediamine, N, N'-Di-(2-carboxy-3-nitro-benzoyl)-1,2-ethylenediamine e N, N'-Di-(2-carboxy-3-nitro-benzoyl)-1,6-hexanediamine inhibited TNF-α production by PBMC greater then thalidomide (IC50 de 55 μM, 5 μM, 6.1 μM and 220 μM, respectively) and also had a inhibitory effect on IFN-γ , IL-6, CXCL9 and CXCL10 production. The compounds had no effect on cell viability, evaluated by Trypan blue exclusion and MTT assay. This work describes the synthesis and characterization novel thalidomide analogues, prepared in good yields using simple methodology. Our results suggest that the potential anti-inflammatory and immunomodulatory activity of these diamine compounds is potentially applicable in treating ENL and other diseases.