O sorodiagnóstico da toxocaríase humana é geralmente baseado na detecção de anticorpos IgG anti-Toxocara spp. em amostras de soro pelo teste ELISA utilizando os antígenos de excreção-secreção de larvas de T. canis (TES). No entanto, observa-se uma ocorrência de reatividade cruzada com outras helmintíases nas áreas endémicas de poliparasitismo. Vários estudos têm mostrado que as glicanas presentes nos antígenos dos helmintos podem ser as responsáveis pela reatividade cruzada. Neste estudo, avaliamos o efeito da deglicosilação dos antígenos TES na sensibilidade e especificidade dos testes de ELISA e Western-blotting para detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE. Para a deglicosilação dos antígenos TES, estes foram tratados com diferentes concentrações de hidróxido de sódio (NaOH) ou metaperiodato de sódio (NaIO4) e foram testados 58 amostras de soro de pacientes com toxocaríase visceral, 75 amostras de soros de pacientes com outras helmintíases, e 95 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Nossos resultados mostraram que os antígenos TES foram totalmente deglicosilados com NaOH 100mM por 4 horas a 37°C (dTES), enquanto que o tratamento com NaIO4 não gerou bons resultados. A sensibilidade e especificidade dos antígenos TES e dTES na detecção de anticorpos IgG pelo teste de ELISA foi de 100%, com menor reatividade cruzada (5,3%) para os antígenos dTES, se comparada com os antígenos TES (13,3%). Todos os pacientes com toxocaríase mostraram anticorpos IgG contra as cinco frações dos antígenos TES (32, 45, 55, 70 e 120 kDa) e contra a única fração de 26kDa dos antígenos dTES, com sensibilidades e especificidades de 100% para ambos os antígenos. A reatividade cruzada, observada com as frações de 70 kDa, 55 kDa e 32 kDa dos antígenos TES, foi eliminada totalmente quando utilizaram-se os antígenos dTES. A detecção de anticorpos IgM pelo teste de ELISA mostrou reatividade inespecífica nos três grupos estudados, com sensibilidades de 39,7% e 34,5% e especificidades de 95,8% e 96,8%, para os antígenos TES e dTES, respectivamente, porém com ocorrência de reatividade cruzada de 24% e 28% para ambos os antígenos. Os três grupos estudados apresentaram reatividade contra quase todas as frações dos antígenos TES e dTES. A detecção de anticorpos IgE apresentou sensibilidades de 63,79% e 62,07% e uma especificidade de 100%, e uma reatividade cruzada de 26,6% e 53,3% para ambos os antígenos. A maioria dos pacientes com toxocaríase (74,1%) mostraram anticorpos contra as frações de 32, 55 e 70 kDa, em quanto que não houve reatividade nos pacientes com outras helmintíases ou nos indivíduos saudáveis. Estes resultados mostraram que a deglicosilação dos antígenos TES permite reduzir a ocorrência de reatividade cruzada nos pacientes com outras helmintíases, elevando o valor diagnóstico da detecção de anticorpos IgG. No entanto, este procedimento não permite melhorar a sensibilidade e especificidade na detecção de anticorpos IgM e não permite elevar a sensibilidade na detecção de anticorpos IgE pelo teste de ELISA. Por outro lado, os resultados discordantes na especificidade do Western-blotting para a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgE sugerem a presença de epítopos conformacionais presentes no estado nativo dos antígenos TES que estariam implicados na reação cruzada observada no teste de ELISA / Serodiagnosis of human toxocariasis is usually based on the detection of anti-Toxocara spp. IgG antibodies in serum samples by ELISA test using T.canis larvae excretory-secretory (TES) antigens. However, a cross-reactivity occurrence is observed in endemic areas of polyparasitism. Many studies have shown that the glycan structures, present in helminth antigens, can be the responsible for the cross-reactivity. In this study, we evaluated the deglycosylation of the TES antigens on the sensitivity and specificity of both the ELISA and Western-blotting for the detection of IgG, IgM, and IgE antibodies. For the deglycosylation of the TES antigens, they were treated with different concentrations of sodium hydroxide (NaOH) or sodium metaperiodate (NaIO4), and 58 serum samples of 58 patients with visceral toxocariasis, 75 serum samples of patients with other helminth infections, and 95 serum samples of healthy individuals. Our results show that the TES antigens were totally deglycosylated with 100 mM NaOH for 4 hours at 37°C (dTES), whereas not good results were obtained with sodium metaperiodate. The sensitivity and specificity of both TES and dTES antigens were 100% in detecting IgG antibodies by ELISA; the cross-reactivity observed with TES antigens (13.3%) was reduced (5.3%) when dTES antigens were used. All toxocariasis patients showed IgG antibodies against the five fractions of TES antigens (32, 45, 55, 70, and 120 kDa), but also with the 26-kDa single fraction of dTES antigens, with sensitivities and specificities of 100% for both antigens. The occurrence of cross-reactivity, observed mainly with the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, was totally eliminated when the dTES antigens were used. The detection of IgM antibodies by ELISA test showed unspecific reactivity in all studied groups, with sensitivities of 39.7% and 34.5%, and specificities of 95.8% and 96.8% for both antigens; the occurrence of cross-reactivity for both antigens were 24% and 28%, respectively. All studied groups have IgM antibodies against almost all fractions of TES antigens and the single fraction of dTES. The detection of IgE antibodies by ELISA test showed sensitivities of 63.8% and 62%, specificities of 100%, and occurrence of reactivity of 26.6% and 53.3% for TES and dTES antigens, respectively. The majority of the toxocariasis patients (74.1%) showed IgE antibodies against the 32-, 55-, and 70 kDa fractions of the TES antigens, whereas there was not reactivity in sera from patients with other helminth infections or healthy individuals. These results showed that the deglycosylation of the TES antigens reduces the occurrence of cross-reactivity in patients with other helminth infections, increasing the diagnostic value for the detection of IgG antibodies. However, this procedure does not improve the sensitivity nor reduces the occurrence of cross-reactivity in the detection of IgM antibodies. Likewise, this procedure does not improve the sensitivity in the detection of IgE antibodies by the ELISA test. On the other hand, the high specificity obtained in the detection of IgG, IgM, and IgE by Western-blotting suggest that conformational epitopes of the TES antigens may also be the responsible for the cross-reactivity in the ELISA test

O Vírus de Influenza aviária pertence à família Orthomyxoviridae. Nos últimos anos vários subtipos da gripe aviária de baixa patogenicidade têm causado surtos e epidemia em humanos e aves domésticas. As aves selvagens e migratórias participam da manutenção e transmissão interespécie dos 16 subtipos de hemaglutinina e 9 subtipos de Neuraminidase na natureza. Nosso estudo teve como objetivo subtipar as amostras positivas através de teste sorológico de inibição da hemaglutinação (HI) e técnica de Biologia Molecular. Foram positivas as amostras das espécies: Elaenia mesoleuca (2), Sporophila lineola (1) Sporophila caerulescen (1), Vireo olivaceus (3), Columbina talpacoti (3), Paroaria dominicana (2), foram coletadas das reservas experimentais de campo localizadas no estado de São Paulo-Brasil,durante os anos de 1997 e 1998. Tais amostras foram identificadas por teste preconizado HI(de acordo com WHO) usando 20 soros imunes anti-influenza do tipo A e um do tipo B e análise de RT-PCR com sequenciamento do gene Hemaglutinina e Neuraminidase. O teste HI demonstrou que 12 amostras apresentou estreita afinidade com com soros imune A/HongKong/1/68 (H3N2), A/Equine/Miami/63 (H3N8) and A/Duck/Ukraine/63 (H3N8). As análises de sequenciamento do gene hemaglutinina e Neuraminidase desses isolados revelaram uma alta homologia com os do subtipos H3N2. As análise filogenética e variabilidade genética em comparação com as seqüências de Genbank representando diversos países, mostraram que nossas amostras apresentou estreita homologia com os vírus do subtipos que circularam em Victoria (1990), Siena (1991) e Beijim (1989). A análise de amino ácido indicou que há mutações não sinônimas no gene da Hemaglutinina exclusiva de nossas amostras e as mutações da Neuraminidase são sinônimos, quando comparadas com amostras de AIV de outros paises. Nossas Amostras quando análisadas a NA, não apresentaram mutações nos aminoácidos y285t e r297n que conferem resistencia aos inibidores da Neuminidase. / Avian Influenza virus belongs to Orthomyxoviridae family. The last years several low pathogenic avian influenza subtypes have caused outbreaks and epidemic in human and poultry. The wild and migrating birds may be participating of maintenance and interspecies transmission of the sixteen subtypes of the Hemagglutinina and nine Neuraminidase in nature. Our study was aimed to subtype the positive samples for influenza A isolated from migrating and wild birds by molecular technique and Haemagglutination inhibition test (HI). The samples from species Elaenia mesoleuca (2), Sporophila lineola (1) Sporophila caerulescens (1), Vireo olivaceus (3), Columbina talpacoti (3), Paroaria dominicana (2), were collected in reserves and experimental field stations located in the São Paulo State - Brazil, during the years 1997 and 1998. The samples were identified by HI test (according WHO) using the 20 antibody patterns anti-influenza A type and one for the influenza type B and RT-PCR and Sequence analysis of Hemaglutinina and Neuraminidase gene. The HI test demonstrated that 12 samples presented an antigenic close relationship with A/HongKong/1/68 (H3N2), A/ Equine/Miami /63 (H3N8) and A/Duck/ Ukraine/ 63 (H3N8) antiserum.The sequencing analyses of Hemaglutinin and Neuraminidase gene of these 12 isolates revealed a high homology with H3N2. Phylogenetic analysis and genetic variability compared with genbank sequence representing several countries, showed that our current samples submitted close homology to that circulated in Victoria (1990), Siena (1991) and Beijim (1989). Amino acid analysis compared our samples with representative genbank samples all of mutation are synonymous.

A toxoplasmose, protozoose disseminada de baixa morbidade, apresenta número significativo de doença ocular, congênita ou do sistema nervoso central. O diagnóstico é sorológico por diferentes testes, mas limiares baixos e variação individual levam a frequentes problemas. Novos imunoensaios fluorescentes de fase sólida (FLISA) usam a quantificação direta de anticorpos. Aqui, desenvolvemos um FLISA multiplex (FLISAm) para a detecção simultânea de anticorpos IgG e IgM contra Toxoplasma gondii. Após padronização, a eficiência do FLISAm com conjugados comerciais foi feita inicialmente de forma isolada para cada imunoglobulina em 140 amostras de soro de universitários previamente analisadas pelo ELISA IgG/IgM. FLISA IgG mostrou boa concordância (Kappa=0,7088), com sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94,2%, enquanto FLISA IgM apresentou boa concordância (K=0,6026), menor sensibilidade de 55,5% e igual especificidade de 98,4%. Foram produzidos novos conjugados fluorescentes de maior especificidade e seu desempenho no FLISAm foi validado em 24 amostras e sua eficiência foi avaliada em 120 amostras conhecidas de soro de gestantes. FLISAm mostrou excelente concordância, tanto para a detecção de anticorpos IgG (K=0.8837, sensibilidade=100,0%, especificidade=87,5%), quanto para a detecção de anticorpos IgM (K=0,9187, sensibilidade=100%, especificidade=99,1%) com excelente reprodutibilidade. O teste desenvolvido é rápido, econômico, de fácil execução, alto rendimento e que pode ser utilizado como método de triagem de soroconversão em mulheres grávidas, útil em aplicações de grande número de amostras como o cuidado pré-natal. / Toxoplasmosis, a disseminated low morbidity protozoan disease, presented significant numbers of affected people, mainly ocular disease, fetal infections or encephalitis in immune deficient patients. Serology is the main diagnosis with commercial antibody assays, but individual variation or low thresholds cause many inconsistencies. New solid phase immunofluorescence assays (FLISA) allows direct antibody quantification in microplates. Here, we developed a multiplex FLISA (FLISAm) for simultaneous detection of IgG and IgM anti-Toxoplasma gondii antibodies. After standardization, the efficiency of this method was initially analyzed in isolated FLISA for each immunoglobulin with commercial conjugates in 140 serum samples of the students previously screened by IgG/IgM ELISA. IgG FLISA showed good concordance (Kappa=0.7088), 83,3% sensitivity and 94,2% specificity, while IgM FLISA also showed good concordance (Kappa=0,6026), lower 55,5% sensitivity and similar 98,4% specificity. New higher efficiency conjugated were prepared and tested in 120 serum samples of the pregnant woman in a same well conjunct IgG/IgM FLISAm. We also validate the FLISAm in 24 serum samples. Compared to isolated ELISA IgG/IgM, FLISAm demonstrated excellent concordance for IgG (Kappa=0.8837; sensitivity=100%; specificity=87,5%,) and IgM (Kappa=0,9187; sensitivity=100%; specificity=99,1%), with excellent reproducibility. The standardized FLISAm is quick, inexpensive, easily performed and high throughput and the assay can be used for screening serum conversion in pregnant women, useful in large numbers applications as antenatal care.

Esta tese compreende estudos sobre diagnóstico, caracterização antigênica e molecular de amostras do vírus da raiva e sobre o desenvolvimento de testes sorológicos para detecção de anticorpos contra o vírus rábico. O primeiro capítulo descreve dois casos de raiva no Estado do Rio Grande do Sul (RS). O primeiro trabalho do primeiro capítulo descreve a ocorrência de raiva em um canino no município de Tapes, leste do RS. Após a confirmação do diagnóstico, a amostra de vírus isolada foi submetida à caracterização antigênica e molecular. Tal amostra apresentava características compatíveis com amostras de vírus rábico isoladas de morcegos insetívoros Tadarida brasiliensis. Portanto, o primeiro caso de raiva canina no RS após 19 anos, ocorreu devido a um contato incidental entre um morcego não hematófago e o canino infectado. Assim, o status de região livre de raiva urbana pode ser mantido no Estado. O segundo trabalho do primeiro capítulo descreve a primeira ocorrência no RS de raiva em morcegos frugívoros da espécie Artibeus lituratus. Neste caso, a amostra isolada apresentou características de amostras isoladas de morcegos hematófagos Desmodus rotundus. A identificação de vírus rábico em um morcego frugívoro, com tal perfil, não representa fato novo na história recente da raiva, mas a descrição deste caso ilustra que a raiva em morcegos frugívoros no RS apresenta características semelhantes à raiva em morcegos frugívoros de outras regiões do Brasil e sugere que o mesmo foi contaminado devido ao contato com morcegos hematófagos. Com o objetivo de permitir o monitoramento sorológico da raiva em morcegos e a identificar novos potenciais reservatórios do vírus, no segundo capítulo desta tese é reportado o desenvolvimento de dois testes sorológicos para a detecção de anticorpos contra raiva. O primeiro teste desenvolvido é a inibição da imunoperoxidase (“immunoperoxidase inhibition assay”; IIA), que foi testada frente a 422 amostras de soros humanos. A IIA foi muito eficiente, tendo demonstrado uma acurácia de 97.63%. Esta técnica provavelmente poderá ser utilizada para detecção de anticorpos contra raiva em outras espécies, embora no presente estudo tenha sido avaliada apenas com soros humanos. Com o objetivo de pesquisar anticorpos contra raiva em diferentes espécies animais utilizando pequenos volumes de soro foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático do tipo “sandwich” (“sandwich enzyme linked immunosorbent assay”; S-ELISA). O S-ELISA foi inicialmente comparado com um teste padrão FAVN (Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test) e a seguir empregado na pesquisa de anticorpos em soros de diferentes espécies, incluindo morcegos, sagüis, raposas, felinos silvestres, guaxinis, quatis, bovinos, camundongos e humanos. Os resultados mostraram que o S-ELISA foi eficiente na detecção de anticorpos contra o vírus da raiva em diferentes espécies, com uma acurácia de 87,5%. A caracterização de amostras de vírus rábico em situações epidemiológicas específicas, assim como o desenvolvimento de testes sorológicos a fim de identificar anticorpos em distintas espécies e identificar novos possíveis reservatórios para raiva, contribuirão para o maior conhecimento da biologia da raiva na natureza, particularmente em nosso Estado, possibilitando assim a tomada de medidas de controle mais adequadas. / This thesis describes studies about diagnosis, antigenic and molecular characterization of rabies vírus strains and about serological assays development for antibodies against rabies virus detection. The first chapter describes two cases of rabies in State of Rio Grande do Sul (RS). This first work of the first chapter on this thesis, describes the canine rabies in Municipality of Tapes, east of RS. After the diagnosis confirmation, the rabies virus strain was submitted to antigenic and molecular characterization. The sample shown similar characteritics with rabies vírus isolates from insectivorous bats Tadarida brasiliensis. Thus, the first canine rabies in RS after 19 years occurred by an incidental contact between the contamined canine and a non-haematophagous bat. In view of that, the status of urban rabies free of the area should not be compromised. The second work of first chapter describes the first occurrence in RS of rabies in frugivorous bats Artibeus lituratus. In this case, the isolated sample shown characteristics similar to characteristics from haematophagous bats Desmodus rotundus. The rabies virus identification in a frugivorous bat with this profile, does not represent a new fact in the recent history of rabies, but the description of this case illustrates that the rabies in frugivorous bats in RS has similar characteristics to rabies in frugivorous bats in other regions of Brazil and suggests that it was contamined due to contact with haematophagous bats. With the purpose to allow the serological monitoring of rabies in bats and identify new potential reservoirs of the virus, in the second chapter of this thesis is reported the development of two serological tests for detection of antibodies against rabies. The first developed assay is the immunoperoxidase inhibition assay (IIA), that was tested with 422 sera from humans. The IIA was very efficient, with 97.63% of accuracy. This assay probably can be used to antibodies detection against rabies in other species, in despite of the present study, it was tested only with sera from humans. With the aim to research rabies antibodies in different animal species with small volume of serum, was developed the sandwich enzyme linked immunosorbent assay (S-ELISA). The S-ELISA was initially compared with the gold standard test Fluorescent Antibody Vírus Neutralization test and after used to search antibodies in sera from different species including bats, marmosets, foxes, wild felines, raccoons, coatis, bovines, mices and humans. The S-ELISA was efficient to detect antibodies in different species with 87.5% of accuracy. The characterization of rabies virus strains in specific epidemiological situations as well as the serological assays development to identify antibodies in distinct species and identify new potential rabies reservoirs for rabies, contribute to greater understanding of the biology of rabies in nature, particularly in our State, allowing the taking of appropriate control measures.

O estudo pretendeu abordar a imunidade humoral na Tuberculose. Foi um estudo de teste diagnóstico que avaliou um antígeno específico, constituinte da parede celular da micobactéria, denominado LIPOARABINOMANNAN (LAM), proveniente de Cambridge, MA, USA da Companhia Dyna-Gen. O objetivo principal do estudo foi a detecção de anticorpos IgG anti-LAM em casos de tuberculose pulmonar, extrapulmonar e formas combinadas da doença. A casuística total compreendeu 173 pacientes portadores de tuberculose, sendo a mesma confirmada por métodos bacteriológicos e/ou anatomopatológicos de biópsias de diversos órgãos em 114 casos (65,8%). Em 46 casos (26,5%) a doença se confirmou por rigorosos critérios clínicos, radiológicos e de seguimento após tratamento adequado. Cento e quinze pacientes eram do sexo masculino (66,5%) e 58 do sexo feminino (33,5%). Cento e trinta e um eram brancos (75,7%), 24 negros (13,9%) e 18 mistos (10,4%). O total de formas pulmonares foi de 88 casos (51%), sendo 81 (46,8%) formas bacilíferas e 7 casos (4,0%) não-bacilíferas. Dos casos com baciloscopia direta negativa, 3 apresentaram culturas positivas, 2 culturas negativas e em 2 casos a mesma não foi realizada. Formas extrapulmonares compreenderam 71 casos (41%) com predomínio de forma miliar, ganglionar, pleural e do SNC. A combinação de ambas as formas ocorreu em 14 casos (8,1%). Radiologicamente, houve predomínio de lesões escavadas (30,1%), consolidação (13,9%), padrão miliar (11%) e exame radiológico normal (11%), além de outros achados. Da série, 118 pacientes eram HIV negativos (68,2%) e 55 eram HIV positivos (31,8%). As principais comorbidades associadas foram Diabetes Melittus (DM), Alcoolismo, Cardiopatia e Neoplasia, entre outras. Exames culturais foram realizados em 145 pacientes, sendo que em 72 casos a cultura foi positiva (41,6%) e foi negativa em 10 casos (5,8%). Dos 72 exames culturais positivos, o teste do MycoDot foi positivo em 47 casos (65,2%) e negativo em 25 (34,7%). Em 10 exames culturais negativos, o mesmo foi positivo em 6 casos (60%) e negativo em 4 casos (40%). Em 63 exames culturais não realizados, o teste do MycoDot foi positivo em 46 casos e negativos em 17. Os resultados do teste MycoDot na série total foram: positivos em 120 pacientes (69,4%) e negativos em 53 pacientes (30,6%). As formas pulmonares bacilíferas, não bacilíferas, extrapulmonares e combinadas apresentaram sensibilidade de 74,1%, 85,7%, 63,4% e 64,3% respectivamente. O grupo controle foi de 77 indivíduos assim distribuídos: 41 sadios, 16 portadores de lesões residuais de tuberculose, 6 sadios com BCG prévia, 6 sadios sem BCG prévia e 8 com outras comorbidades. O resultado do teste MycoDot foi negativo em 73 casos (94,8%) e positivo em 4 casos (5,2%). A sensibilidade da casuística total foi de 69,4%, a especificidade foi de 94,8%, o valor preditivo positivo (VPP) foi de 96,8% e o valor preditivo negativo (VPN) foi de 57,9%. Dos pacientes HIV positivos a sensibilidade foi de 61,8% e a especificidade foi de 100%. Nos pacientes HIV negativos a sensibilidade foi de 72,9% e a especificidade foi de 94,7%. Concluiu-se que o Teste MycoDot é de fácil realização, baixo custo, podendo ser útil como uma ferramenta adicional para o diagnóstico da tuberculose. / This study evaluated the humoral immunity in tuberculosis. It was a study of diagnostic test using a specific antigen, designed Lipoarabinomannan (LAM) provenient of Cambridge, MA, USA, Dyna-Gen Company. This antigen is a cell wall component of mycobacteria. The major objective was to study anti-LAM IgG antibodies in cases of pulmonary, extrapulmonary and associated forms of tuberculosis. The casuistic was 173 patients with tuberculosis, confirmed by bacteriologic and/or anatomopathologic methods in 114 cases (68,8%). In the other cases, the tuberculosis was confirmed by clinical, radiological features and follow up of the patients after chemoterapy. The series presented 115 males, 58 females; 131 was caucasian, 24 black and 18 was non-caucasian. The total pulmonary forms was 88 cases (51%), 81 with positive AFB in sputum and 7 with negative AFB in sputum. Three have positive culture, two with negative cultures. Extrapulmonary tuberculosis was found in 71 cases (41%). The predominant forms of X-ray of the thorax was miliar and necrositing lesions. HIV-positive patients were 118 and negative 55. The MycoDot test results were: positive in 120 patients (69,4%) and negative in 53 patients (30,6%). In control group, MycoDot was negative in 73 cases (94,8%) and positive in 4 cases (5,2%). The final results were: sensitivity of 69,4%, specificity of 94,8%, the positive predictive value was 96,8% and the negative predictive value was 57,9%. In HIV-positive patients, the sensibility was 61,8% and the specificity was 100%. The conclusions were the MycoDot test is easy and ideal for use in the diagnosis of active tuberculosis in conjunction with the other methods.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania e compreende um grupo de doenças que apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas distintas. O diagnóstico é realizado em base epidemiológica, clínica e patológica, confirmadas por exames parasitológicos positivos e demonstração de hipersensibilidade retardada a antígeno de leishmânia. Os testes sorológicos para o diagnóstico, utilizados até o momento, apresentam várias limitações e por isso é de grande importância identificar proteínas recombinantes de leishmânia, para que sejam testadas como potenciais antígenos para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico da LTA. Neste estudo, foram utilizadas duas proteínas recombinantes de leishmânia altamente conservadas, Lb8E e Lb6H, derivadas de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), avaliando a sua capacidade para detectar anticorpos no soro de vários grupos de pacientes por teste imunoenzimático (ELISA). Os antígenos recombinantes reagiram com amostras de 83,3% e 100,0% (Lb6H) dos pacientes com LTA e 95,4% (Lb8E) e 89,4% (Lb6H) dos soros de pacientes de leishmaniose visceral (LV). Em amostras de indivíduos saudáveis, as reações com Lb8E e Lb6H foram altamente específicas. Soros de 219 pacientes com LTA infectados com diferentes espécies de leishmânia prevalentes no Brasil (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis e L. (V.) shawi) e amostras de pacientes com outras infecções parasitárias foram avaliados para a presença de anticorpos anti-rLb6H, obtendo-se sensibilidade de 100,0% nas 219 amostras de LTA e especificidade geral de 93,9% (considerando 68 indivíduos saudáveis e 213 pacientes com outras doenças infecciosas). Além disso, as amostras de outras doenças infecciosas indicaram provável ausência de reação cruzada, pois apenas uma minoria de amostras de pacientes com doença de Chagas possuía anticorpos contra rLb6H e essas respostas foram baixas. Enfim, os resultados obtidos sugerem que a técnica de ELISA utilizando o antígeno rLb6H pode ser consideradoa para uso na rotina do diagnóstico sorológico da LTA. / American tegumentary leishmaniasis (ATL) is caused by various species of protozoan of the genus Leishmania and comprises a group of diseases that present distinct clinical, histopathological and immunological characteristics. The diagnosis is performed based on epidemiological, clinical and pathological features, supported by positive parasitological tests and presence of delayed hypersensitivity to Leishmania antigens. The serological tests used to date have several limitations and therefore it is of great importance to identify recombinant proteins from Leishmania so that they can be tested as potential antigens for the development of techniques for the diagnosis of ATL. In this study, two highly conserved Leishmania recombinant proteins, Lb8E and Lb6H, derived from Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), were used, evaluating their ability to detect antibodies in the serum of several groups of patients by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Recombinant antigens detected 83.3% (Lb8E) and 100.0% (Lb6H) ATL patients, and 95.4% (Lb8E) and 89.4% (Lb6H) visceral leishmaniasis (VL) patients. These reactions with Lb8E and Lb6H were highly specific in healthy subjects. Sera from ATL patients infected with different species of Leishmania, prevalent in Brazil, (Leishmania (Leishmania) amazonensis, L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis and L. (V.) shawi) and samples from patients with other parasitic infections were evaluated for the presence of anti-rLb6H antibodies. In 219 ATL, the sensitivity was 100.0% e the general specificity, considering 68 healthy subjects and 213 patients with other infectious diseases. In addition, samples from other infectious diseases indicated a probable lack of cross-reactivity, as only a minority of samples from patients with Chagas disease had antibodies against rLb6H and all of these responses were low. Finally, the results suggest that the ELISA using rLb6H antigen may be considered for routine use for serological diagnosis of ATL.

Made available in DSpace on 2016-06-17T14:14:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Tese_Fred_Luciano_Neves_Santos.pdf: 7174621 bytes, checksum: af4e9021f0c8974198df6ec268ccfaf9 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-05T22:07:11Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Tese_Fred_Luciano_Neves_Santos.pdf.txt: 436440 bytes, checksum: 1d22503c32c1f332f780c4197a546123 (MD5) Tese_Fred_Luciano_Neves_Santos.pdf: 7174621 bytes, checksum: af4e9021f0c8974198df6ec268ccfaf9 (MD5) license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / O diagnóstico da doença de Chagas crônica (DCC) baseia-se em metodologias que usam em sua fase sólida antígenos brutos, semipurificados ou recombinantes, podendo resultar em baixa sensibilidade ou reação cruzada. Uma forma para resolver este problema é o uso de quimeras formadas por epítopos conservados e repetitivos de diferentes estruturas parasitárias em uma única molécula. O nosso objetivo foi caracterizar e avaliar o uso de quimeras em imunoensaios para o diagnóstico da DCC. As quimeras, IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 foram purificadas por meio de cromatografia e sua pureza avaliada por SDSPAGE. Ensaios de dicroísmo circular (DC) e espalhamento dinâmico da luz (EDL) foram usados para avaliação do raio hidrodinâmico das quimeras, avaliação de sua estabilidade e escolha do sistema tampão que oferecesse o menor estado de agregação molecular. Ensaios sorológicos para detecção de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi através de ELISA foram realizados utilizando um painel de 857 amostras positivas para a DCC e 689 negativas. Para avaliação de reação cruzada foram usadas 1079 amostras de diversas doenças endêmicas no país. A purificação foi eficiente uma vez que o SDS-PAGE indicou ausência de degradação das quimeras. As análises de DC e EDL mostraram que as quatro quimeras apresentaram menor tendência de agregação em tampão carbonato pH 9,6, sendo, assim, este o sistema para a sensibilização das placas. Os ensaios sorológicos revelaram valores elevados de sensibilidade (Sen) e especificidade (Esp) para a molécula IBMP-8.4 (Sen-99,3%; Esp- 100%). O desempenho para as demais moléculas foi satisfatório, ficando os valores de Sen e Esp acima de 94%. As moléculas IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 e IBMP-8.4 apresentaram respectivamente 0,46%, 0,85%, 0,46% e 0,37% de reação cruzada. Os resultados apontam que as quimeras atingiram os critérios de proficiência do Ministério da Saúde podendo, dessa forma, ser utilizados em ensaios diagnósticos para a DCC. Chronic Chagas disease (CCD) diagnosis is based on serological methods employing crude, semipurified or recombinant antigens, which eventually may result in low sensitivity or crossreactivity. An alternative method for solving this problem is the use of chimeric molecules composed by conserved and repetitive epitopes of distinct parasite structures. Our objective was to evaluate the use of chimeras in immunoassays for the diagnosis of CCD. The chimeras IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP-8.4 were purified by chromatography and their purity assessed by SDS-PAGE. Circular dichroism (CD) and dynamic light scattering (DLS) were used to assess the hydrodynamic radius of the chimeras, to evaluate their stability and to select the buffering system that offers the lowest state of molecular aggregation. Serological tests for detection of anti-Trypanosoma cruzi were performed by ELISA using a panel of 857 positive and 689 negative serum samples for CCD. Cross-reactivity was assessed by using 1079 serum samples from patients with unrelated diseases. The purification was efficient since SDS-PAGE indicated the absence of degradation of chimeric proteins. Analyses of CD and DLS showed that the four chimeras had low aggregation tendency in carbonate buffer, pH 9.6. Serological testing showed high values of sensitivity (Sen) and specificity (Spe) for IBMP-8.4 (Sen-99.3%; Spe-100%). The performance of other molecules was satisfactory, being the Sen and Spe values above 94%. Cross-reaction was observed in 0.46%, 0.85%, 0.46% and 0.37% of the samples tested against IBMP-8.1, IBMP-8.2, IBMP-8.3 and IBMP- 8.4, respectively. The results indicate that the chimeras reached the Brazilian Ministry of Health proficiency criteria and may thus be used in diagnostic assays for CCD.

A doença celíaca é uma desordem autoimune caracterizada pela intolerância ao glúten, provavelmente subdiagnosticada devido ao amplo espectro de apresentação clínica, e que se não tratada pode ocasionar graves complicações. Considerando o fato de que certas manifestações bucais podem ser indicativas da doença celíaca, os cirurgiões-dentistas podem desempenhar um importante papel na diagnose desta condição. Neste estudo, 52 celíacos entre 2 e 23 anos, além de um grupo controle composto por 52 indivíduos pareados por sexo e idade, foram sistematicamente avaliados quanto à presença de estomatite aftosa recorrente, defeitos do esmalte dental e ocorrência de cárie dental tanto na dentição decídua quanto na permanente, tendo também sido submetidos a análise salivar (pH, fluxo e capacidade tampão). Paralelamente, 10 molares decíduos de pacientes celíacos e 10 provenientes de um grupo controle sem a doença tiveram a composição química de seu esmalte analisada através da Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier e Espectroscopia por Energia Dispersiva de Raios-X. E, finalmente, 27 crianças com defeitos de formação no esmalte dental foram submetidas ao diagnóstico sorológico da doença celíaca. Foi observado que os defeitos específicos do esmalte dental são mais comuns entre os celíacos que em controles (57,7% vs 13,46%), bem como a estomatite aftosa recorrente (40,38% vs 17,31%). Contrariamente, uma menor frequência de lesões de cáries dentais foi observada no grupo de doentes celíacos (2,11 vs 3,9). A análise salivar mostrou maior ocorrência de baixo fluxo no grupo celíaco (36% vs 12%), enquanto o pH e a capacidade tampão foram estatisticamente semelhantes em ambos os grupos. A composição química, apesar de não apresentarem diferenças nas concentrações de cálcio e fósforo entre os grupos, revelou uma menor proporção Ca/P nos dentes decíduos dos celíacos (1,35 vs 1,58). E por fim, os testes sorológicos (anti-tTG IgA) não evidenciaram doença celíaca nas crianças portadoras de defeitos específicos do esmalte dental. / Celiac disease is an autoimmune disorder characterized by gluten intolerance, believed to be underdiagnosed owing to its wide spectrum of clinical presentation, and if untreated it can lead to severe complications. Considering that particular oral manifestations might be indicative of celiac disease, dentists could play a pivotal role in helping the diagnosis of this condition. In this study, a group of 52 Brazilian celiac patients aged 2 to 23 years, along with an age and sex-matched control group of 52 individuals, were systematically evaluated for the presence of recurrent aphthous stomatitis, dental enamel defects and caries in both deciduous and permanent dentition, and were also subjected to salivary analysis pH, stimulated saliva flow and buffering capacity. Concurrently, 10 deciduous molar teeth from celiac patients and 10 from a non-celiac control group had their enamel chemically analyzed using Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Energy Dispersive X-ray analysis. Finally, 27 healthy children with specific dental enamel defects underwent serologic screening for celiac disease. Specific dental enamel defects were found to be more common among celiac patients than in controls (57,7% vs 13,46%), as well as recurrent aphthous stomatitis (40,38% vs 17,31%). Conversely, a smaller frequency of dental caries was observed in the disease group (2,11 vs 3,9). Salivary analysis showed a higher frequency of reduced flow in the celiac group (36% vs 12%), while saliva consistency, pH and buffering capacity were statistically similar in both groups. Chemical composition, although presenting no statistical differences in calcium and phosphorus concentrations between the groups, revealed a lower proportion Ca/P in the deciduous teeth of celiac individuals (1,35 vs 1,58). Lastly, after serological testing (anti-tTG IgA), no celiac disease was found among the children with specific dental enamel defects.

Introdução: recente estudo brasileiro detectou a presença concomitante do Mycoplasma pneumoniae e Chlamydia pneumoniae em lesões ateromatosas coronárias estáveis e instáveis. O objetivo do presente estudo foi testar a associação entre títulos sorológicos de anticorpos anti-Chlamydia pneumoniae e anti-Mycoplasma pneumoniae e as Síndromes Isquêmicas Miocárdicas Instáveis. Métodos: foram incluídos de forma prospectiva, 138 pacientes divididos em 4 grupos: 34 pacientes com Síndrome Isquêmica Miocárdica Instável com supradesnível do segmento ST, 40 pacientes com Síndrome Isquêmica Miocárdica Instável sem supradesnível ST, 30 pacientes com aterosclerose crônica assintomática e 34 doadores de sangue sem doença coronária conhecida. Nos dois primeiros grupos, as amostras sorológicas foram colhidas durante o evento agudo e com seis meses de seguimento, enquanto nos outros dois (aterosclerose crônica e controle) as mesmas foram colhidas uma única vez. Em todas as amostras foram dosados anticorpos da classe IgG anti-Chlamydia pneumoniae e anti-Mycoplasma pneumoniae utilizando a técnica de imunoflorescência indireta.. Resultados: seis meses após a internação, os pacientes com síndrome isquêmica miocárdica instável com supradesnível ST apresentaram significativa redução dos títulos sorológicos, em relação às sorologias colhidas durante o evento coronário agudo, o que ocorreu tanto com a chlamydia (307,5+47,5 versus 650+115,7 p=0,0001) quanto com o mycoplasma (21,5+3,5 versus 36,5+5 p=0,0004). O grupo sem supradesnível ST não teve variação significativa dos níveis sorológicos em seis meses de seguimento (522,6+102,7 versus 576+84,1 p=0,27) para chlamydia e 27,6+5,8 versus 27,6 + 5,8 p >0,99 para mycoplasma. Foi realizada também uma comparação entre os níveis sorológicos de todos os grupos analisados, e observou-se que os grupos com síndrome isquêmica miocárdica instável (com e sem supra ST), tiveram valores sorológicos mais elevados do que os grupos aterosclerose crônica e controle, mas as diferenças não foram significativas. Os valores para chlamydia foram: 650+115,7 (com supra), 576+84 (sem supra), 373,3+65 (aterosclerose crônica) e 343,5+57,2 (controle), p=0,083; e os valores para mycoplasma foram: 36,5+5 (com supra), 27,6+5,8 (sem supra), 23+4,3 (aterosclerose crônica) e 26,7+3,3 (controle), p=0,171. Conclusões: o presente estudo demonstra associação entre títulos de anticorpos anti-Chlamydia pneumoniae e anti-Mycoplasma pneumoniae e a instabilização da placa coronária. Demonstra ainda a normalização dos mesmos títulos em um período de até seis meses, a partir do quadro agudo. / Objective of the study: to test the association of serum titers of anti-Chlamydia pneumoniae and anti-Mycoplasma pneumoniae antibodies and Acute Coronary Syndrome (ACS). The patients were divided into 4 groups: ACS with ST-segment elevation, ACS without ST-segment elevation, chronic asymptomatic atherosclerosis and blood donors without known coronary disease. Serum samples were collected during the acute event and after six months of follow-up. Six months after the acute event, patients with ACS with St-segment elevation showed a significant decrease of serum titers, when compared to the other one. That\'s show the association between anti-Chlamydia pneumoniae and anti-Mycoplasma pneumoniae antibody titers and acute coronary syndrome.

A doença de Chagas compromete o cólon em torno de 10% dos pacientes soro positivos, levando ao megacólon adquirido. O tratamento é cirúrgico, sendo a operação de Duhamel-Haddad a mais utilizada no Estado de Goiás, cuja execução pode levar a alterações do plexo nervoso vesical durante a dissecção do espaço retro-retal, ou ainda, a retirada do segmento colônico dilatado, levar a possíveis modificações da função miccional. O objetivo deste estudo foi avaliar através da urodinâmica se ocorrem alterações funcionais da bexiga no pós-operatório da cirurgia de Duhamel- Haddad, tendo como controle o próprio paciente, avaliado no pré-operatório. Foram estudados prospectivamente 16 pacientes (7 homens e 9 mulheres) no período de 2001 a 2002, cuja idade variou entre 30 e 71 anos. Para a realização deste exame, utilizou-se o aparelho Urosystem DS-5600 com cateter uretral de duas vias - 7 French e sonda retal com balão. A perfusão foi realizada com água destilada à temperatura ambiente e velocidade de 50 ml/min. Os parâmetros observados foram a fluxometria livre, cistometria e estudo miccional, utilizando-se os testes t-student e a regra de sinais de Descartes para a análise estatística. Os resultados deste estudo foram divididos em três grupos: 1- masculino e feminino; 2- feminino; 3- masculino. No primeiro grupo observou-se diminuição na pressão detrusora máxima. No segundo grupo, diminuição da pressão detrusora no fluxo máximo. No terceiro grupo, evidenciou-se aumento do fluxo urinário máximo e médio, diminuição do tempo de micção e pressão de abertura vesical (P < 0,05) / Acquired megacolon caused by Chagas disease is found in around 10% of chronic infected patients. Chagasic megacolon evolves with constipation and the advocated treatment is surgical. Duhamel-Haddad procedure has been one of the most used techniques in many centers. The necessity of rectal dissection and excision of the rectossigmoid dilated part may cause urinary malfunction. This study addressed urodynamic outcomes in patients submitted to surgical treatment of chagasic megacolon by the Duhamel-Haddad procedure. Sixteen patients (9 females), aged between 30 to 71 years old, were evaluated by urodynamic study in the pre and post operative period. Uroflowmetry, cystometry and pressure flow studies were analyzed. Statistical analysis was carried out applying the Student t-test. Each patient was considered his own control. There was an overall decrease of the maximum detrusor pressure. A decrease of the maximum urinary flow was found in the female group while in the male group an increase of the maximum urinary flow and a decrease of urinary flow time and opening pressure were observed (P < 0.05)