Mon travail de thèse consistait à étudier la signalisation oncogénique de la tyrosine kinase (TyrK) cytoplasmique Src dans les cellules de cancer colorectal (CCR) à un stade avancé par une approche globale de phosphoprotéomique quantitative de type SILAC puis d'évaluer l'efficacité du Nilotinib, un inhibiteur de la Tyrk oncogénique BCR-Abl, sur les propriétés invasives des cellules de CCR. Dans un premier temps, nos résultats ont confirmé le rôle clé joué par Src dans l'acquisition des propriétés invasives de la tumeur. Puis, l'approche phosphoprotéomique de type SILAC a permis de mettre en évidence 136 protéines substrats de Src parmi lesquelles nous retrouvons des protéines de signalisation, des protéines associées au cytosquelette ou des protéines du trafic vésiculaire. De manière intéressante, j'ai révélé l'implication d'un réseau de TyrK dans les propriétés invasives Src-dépendantes. Nos résultats suggèrent qu'une thérapie multi-TyrK pourrait s'avérer intéressante pour traiter les CCR à un stade avancé. En complément de l'analyse SILAC, j'ai initié une approche pharmacologique pour caractériser les TyrK impliquées dans l'invasion des cellules de CCR. De manière surprenante, j'ai observé que le Nilotinib inhibe l'activité invasive des cellules de CCR avec une efficacité comparable à celle observée sur la croissance des cellules de LMC (IC50=20nM). Des approches d'invalidation génétique et de mutagénèse couplées à des tests d'invasion in vitro et in vivo ont permis de démontrer que le Nilotinib exerce son activité anti-invasive en ciblant le récepteur au collagène DDR1. Mes résultats laissent présager un intérêt thérapeutique potentiel du Nilotinib dans le traitement du cancer colorectal métastasant. / My thesis work was devoted to decipher the oncogenic signaling of the cytoplasmic tyrosine kinase (TyrK) Src in advanced colorectal cancer (CRC) cells using SILAC quantitative phosphoproteomics and to evaluate the efficiency of the oncogenic BCR-Abl inhibitor, Nilotinib, on the CRC cell invasive activity. Firstable, our results confirmed the key role of Src in the induction of cell invasion. Then, the SILAC phosphoproteomic approach revealed 136 Src substrates among which signaling proteins, cytoskeleton associated proteins or vesicular trafficking associated proteins. Interestingly, I have identified a TyrK network involved in Src-dependent invasive properties. Taken together, our results suggest that a multi-TyrK therapy may be interesting in clinic for the treatment of advanced CRC. In addition to the SILAC analysis, a pharmacological approach was set up to characterize TyrK involved in CRC cell invasion. Surprisingly, I found that Nilotinib inhibits CRC cell invasive activity with a similar efficiency to the one observed on the growth of CML (IC50 = 20nM). Knock down and mutagenesis experiments together with in vitro and in vivo invasion assay revealed the collagen receptor DDR1 as the main Nilotinib target in its anti-invasive activity. Our results suggest that Nilotinib could be of therapeutic value in metastatic CRC.

Les porphyries érythropoïétiques (PE) : Porphyrie Erythropoïétique Congénitale -PEC- et Protoporphyrie Erythropoïétique -PPE- sont caractérisées par le déficit d’une des enzymes de la voie de biosynthèse de l’hème. Le traitement curatif des formes sévères de PE est la transplantation de moelle osseuse allogénique (TMOA). La PPE est parfois compliquée d’une insuffisance hépatique majeure nécessitant une greffe hépatique. Dans un modèle murin de PPE (Fechm1Pas/Fechm1Pas), nous avons démontré l’apparition progressive de lésions hépatiques dès la 2ème semaine de vie. Une TMO précoce (nouveau-né) a permis de prévenir l’apparition de ces lésions hépatiques et de corriger la photosensibilité cutanée démontrant l’efficacité de cette approche thérapeutique pour les formes sévères de PPE. La thérapie génique par greffe de cellules souches hématopoïétiques autologues corrigées représente une alternative à la TMOA en l’absence de donneur HLA-compatible. Nous avons développé des cellules souches pluripotentes induites (iPS) à partir de cellules épidermiques issues de modèles murins de PE et d’un patient PEC. La correction génique a été obtenue par transfert du gène lentiviral (ferrochélatase ou uroporphyrinogène III synthase (UROS). La pluripotence des cellules iPS a été caractérisée in vitro par la formation de corps embryoïdes et in vivo par la formation de tératomes. In vitro, la correction métabolique a été obtenue après différenciation des cellules iPS humaines en progéniteurs hématopoïétiques. Enfin dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés à une approche pharmacologique de la PEC. Nous avons montré que les mutations C73R et P248Q entraînaient une instabilité et une dégradation accélérée de l’UROS par la voie du protéasome. Le traitement de souris UrosP248Q par un inhibiteur du protéasome (Velcade®) a permis la correction de la photosensibilité cutanée. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives pour le traitement des porphyries érythropoïétiques. / Erythropoietic porphyrias (EP) : Congenital Erythropoietic Porphyria -CEP- and Erythropoietic Protoporphyria -EPP-) are characterized by a deficit of one enzyme implicated in heme biosynthetic pathway. The curative therapy for severe cases of EP is an HLA-compatible Bone Marrow Transplantation (BMT). EPP is sometimes complicated by a major hepatic failure requiring hepatic graft. In a murine model of EPP (Fechm1Pas/Fechm1Pas), we have demonstrated that hepatic lesions progressively appear 2 weeks after birth. Early BMT (in neonates) has made it possible to prevent hepatic lesions and correct skin photosensitivity, demonstrating the efficiency of this therapeutic approach in severe cases of EPP. The gene therapy by graft of corrected autologous hematopoietic stem cells represents an alternative to BMT when HLA-compatible donors are lacking. We have developed induced pluripotent stem cells (iPSC) from epidermic cells of murine models of EP and of one PEC patient. The gene correction was obtained by lentiviral gene transfer (ferrochelatase and uroporphyrinogen III synthase -UROS). The pluripotency of iPSC was characterized in vitro by the formation of embryoid bodies and in vivo by the formation of teratomas. In vitro, the metabolic correction was obtained after differentiation of human IPSC into hematopoietic progenitors. In the last part of this thesis, we have focused on a pharmacological approach of CEP. We have shown that C73R and P248Q mutations lead to instability and accelerated degradation of the UROS protein via the proteasome. Treating UrosP248Q mice with a proteasome inhibitor (Velcade®) has allowed the correction of skin photosensitivity. These works offer new prospects for the treatment of erythropoietic porphyrias.

Contexte. Synonymes de progrès thérapeutique, les thérapies ciblées anticancéreuses ne sont pas sans effet secondaire, en particulier dermatologique. Très peu de données sont disponibles quant à leur impact sur la qualité de vie. Le service de dermatologie de Gustave Roussy a consacré une partie de son activité de recherche à cette thématique. Inscrite dans ces travaux, notre thèse avait pour objectif principal de décrire les changements observés du point de vue de l'état émotionnel, de l'image corporelle et des interactions sociales avec l'apparition des atteintes cutanées, en s'intéressant à la place des représentations associées au traitement dans le processus d'ajustement des patients.Méthode. L'étude prospective comprenait quatre temps d'évaluation (initiation du traitement, un, deux et trois mois après) et associait deux modes d'évaluation : quantitatif (questionnaires) et qualitatif (entretiens semi-directifs). L'inclusion était proposée par les oncologues aux patients allant débuter une thérapie ciblée. Les analyses statistiques ont été menées avec le logiciel SPSS 14.0 ; l'analyse des entretiens a combiné méthode thématique et méthode par questionnement analytique, en recourant au modèle théorique de Pedinielli. Résultats. Sur 82 patients inclus dans la recherche biomédicale, 62 ont accepté de participer à l'étude psychologique. La partie quantitative a été complétée par 33 patients, pour moitié hommes (âge moyen 56 ans) soignés pour un cancer métastatique ; 84% a développé au moins un des symptômes suivants: rash cutané, syndrome main-pied, alopécie ou photosensibilité. Les changements observés ont été un inconfort physique et une gêne à la réalisation des activités du quotidien. Aucun signe de perturbation de la sphère émotionnelle, de l'image du corps et des relations sociales n'a été mis en évidence. La représentation d'un médicament contrôlant la maladie a émergé comme un des facteurs significativement associés aux variations de l'impact des toxicités cutanées sur la qualité de vie. La partie qualitative a concerné 41 patients (caractéristiques médicales et sociodémographiques très similaires à celles de l'échantillon quantitatif). Pour une majorité les symptômes dermatologiques ont été " gênants ", voire " perturbants " lorsqu'ils entraînaient douleurs, difficultés à la mobilité ou troubles du sommeil, mais sont restés " gérables, supportables ". Les représentations associées au traitement, très positives, sont apparues comme un élément soutenant dans l'ajustement des patients. Du discours des patients en souffrance psychologique sont ressorties une défiance vis-à-vis du regard d'autrui et une impossibilité d'amorcer le travail de renoncement nécessaire à l'intégration des transformations liées au cancer et à ses traitements. L'origine de cette souffrance serait un débordement des défenses psychiques par une angoisse de mort : la difficulté pour restaurer l'état d'équilibre psychique antérieur provenant de l'activation concurrentielle de deux dynamiques, l'une surnommée " substantielle ", l'autre " identitaire ".Discussion. Ces résultats rejoignent les données de la littérature en concluant à un impact d'intensité faible à modérée des toxicités cutanées sur la qualité de vie pour une majorité de patients. Contrairement à ce qui était attendu, il n'a pas été observé de changement sur le plan de l'état émotionnel, de l'image corporelle et des interactions sociales. L'investissement positif du traitement, la réappréciation des valeurs, le très bon état général des patients et l'optimisme ont été évoqués l'absence de perturbation. L'importance de l'encadrement médico-soignant a aussi été soulignée.Conclusion. Le développement croissant des thérapies ciblées appelle à une consolidation des mesures de prévention et de prise en charge des symptômes dermatologiques, ce qui nécessite un renforcement des actions de formation et de sensibilisation des acteurs de soin à cette problématique.

Le VEGF-A joue un rôle clé au cours de l’angiogenèse physiologique mais aussi de la néo-vascularisation tumorale essentielle à la croissance des tumeurs malignes. Le VEGF-A et ses récepteurs (VEGFR1/2) représentent une cible de première importance pour le développement de thérapies anti-tumorales, et un certain nombre de médicaments anti-angiogéniques (AAG) inhibant le VEGF-A ou ses récepteurs sont actuellement utilisés en clinique dans le traitement des carcinomes pulmonaires. Parmi les thérapies anti-angiogéniques ciblant le VEGF-A, on peut lister soit l’anticorps monoclonal anti-VEGF Bevacizumab (BVZ) ou bien les inhibiteurs pharmacologiques du domaine tyrosine kinase des VEGFR: les VEGFR-TKI. Seuls les patients porteurs d’adénocarcinomes pulmonaires peuvent bénéficier de thérapies AAG, les patients porteurs de carcinomes squameux présentant de sévères complications (hémorragies pulmonaires). Le sVEGFR1, est un variant tronqué du VEGFR1 qui ne contient que les premiers six motifs N-terminaux extracellulaires de type Ig du domaine extracellulaire et il est dépourvu des domaines transmembranaire et tyrosine kinase. Le sVEGFR1 a éte initialement considéré comme un facteur anti-angiogénique qui neutralise les fonctions du VEGF-A dans les cellules endothéliales. Les hauts niveaux ont été corrélés avec un mauvais pronostic et une mauvaise réponse aux thérapies dans plusieurs types de cancer. Nous avons montré in vitro dans 4 lignées cellulaires de SCC que le bevacizumab, ainsi que les inhibiteurs VEGF-TKI (Semaxanib, KI8751) augmentent les niveaux intra- et extra-cellulaires du sVEGFR1. Nous avons confirmé ces résultats in vivo dans des modèles murins de xénogreffes squameux induits par NCTU. De façon intérssante, l’augmentation du sVEGFR1 en réponse aux thérapies anti-angiogénique est spécifique aux modèles squameux et n’a pas été observée dans les modèles d’adénocarcinomes in vitro et in vivo. Sur le plan moléculaire, nous avons montré que le VEGF165 par l’intermédiaire de SOX2 régule l’expression du sVEGFR1 en réponse aux thérapiesAAG. De plus, nous avons identifié une boucle autocrine 1 intégrine / VEGFR1 / VEGFR2 par laquelle sVEGFR1 contrôle différentiellement la prolifération cellulaire et la survie, permettant notamment de distinguer les cellules SCC sensibles ou résistantes aux thérapies AAG. Enfin, dans une série de 77 cancers bronchiques non à petites cellules, nous avons montré que 11% et 44% des patients SCC expriment de bas ou de hauts nivaux de sVEGFR1 respectivement. Les hauts niveaux ont été corrélés avec des stades pTNM avancés. Dans l'ensemble, nos résultats sont la première preuve que les thérapies AAG augmentent l'expression du sVEGFR1 dans les cellules SCC. En outre, nos données mettent en évidence une fonction pro-tumorale inattendue de sVEGFR1 grâce à l'activation d'une boucle autocrine VEGFR/ β1 intégrine. Ces résultats pourraient aider à comprendre pourquoi les SCC répondent différemment aux AAG que les ADC et d'identifier les patients SCC qui pourraient etre éligibles à ces thérapies. / Vascular endothelial growth factors (VEGFs) and their receptors are regulators of physiological and pathological angiogenesis. In patients with squamous cell lung carcinoma (SCC), clinical trials evaluating anti-angiogenic therapies (AAG) have failed to identify strong benefits. Rather, these patients are at higher risk of bleeding complications when exposed to Bevacizumab (BVZ), a humanized monoclonal anti-VEGF-A antibody. The soluble VEGF receptor-1, namely sVEGFR1, is a truncated version of the cell membrane-spanning VEGFR1 that only retains the first six N-terminal Ig-like extracellular motifs of VEGFR1 owing to alternative splicing of its pre-mRNA. As a consequence, sVEGFR1 is mainly viewed as an anti-angiogenic factor that counteracts VEGF-A functions on endothelial cells. Moreover, high levels of sVEGFR1 were correlated with bad prognosis and bad response to therapies in many cancer types. Using various SCC cell lines, we showed that Bevacizumab as well as VEGFR-Tyrosine Kinase Inhibitors (Semaxanib, KI8751) increase the intra- and extra-cellular levels of sVEGFR1. We confirmed this up-regulation in NCTU-induced SCC murine tumorgrafts models treated with VEGFR-TKI (sunitinib) or anti-VEGFR2 (DC101). Of note, this effect was never observed in the lung adenocarcinoma histological sub-type (ADC), using either cell lines or a mouse model treated in the same conditions. At the molecular level, we identified the VEGF165 and SOX2 proteins as crucial upstream regulators of sVEGFR1 in response to AAG. Moreover, we unraveled an original and SOX2 proteins as crucial upstream regulators of sVEGFR1 in response to AAG. Moreover, we unraveled an original ines or a mouse model treato discriminate between AAG-sensitive or -resistant SCC cells. Finally, in a series of 77 Non Small Cell Lung Carcinoma, we provided the first description of a differential pattern of sVEGFR1 expression with 11% and 44% of SCC exhibiting no or high expression respectively, high levels of sVEGFR1 being correlated with advanced pTNM stages. As a whole, our results provide the first evidence that AAG therapies upregulate sVEGFR1 expression in SCC cells. In addition, our data highlight an unexpected pro-tumoral function of sVEGFR1 through the activation of a beta 1 integrin-dependent VEGFR autocrine loop. These results might help to understand why SCC are less responsive to anti-angiogenic drugs than ADC and to identify SCC patients eligible to these therapies.

Le syndrome de l’imposteur peut être source d’une grande souffrance. Soixante-deux à 70% de la population peuvent être amenés à douter, ne serait-ce qu’une fois, de la légitimité de leur statut. Ces questionnements s’orientent sur l’impression de tromper les autres, sur les attributions de sa situation et sur la peur de voir son incompétence mise à jour. Malgré sa prévalence, peu d’études s’intéressent au caractère pathologique de ce syndrome, et encore moins à chercher des outils d’accompagnement adaptés. Les objectifs de ce travail étaient de valider un outil d’évaluation en français, et d’améliorer la compréhension de la dimension cognitive de ce syndrome.L’étude 1 est une étude quantitative menée auprès de 549 participants. Elle propose la validation du concept du syndrome de l’imposteur et la réalité d’un syndrome pouvant être pathologique. Les résultats démontrent différents profils d’imposteurs pour lesquels les comorbidités et leur vécu se révèlent différents.L’étude 2 est une étude quantitative menée auprès de 1597 participants. Elle a permis la validation de la Clance Impostor Phenomenon Scale (CIPS) dans sa version francophone. Les résultats démontrent des bonnes qualités psychométriques du questionnaire. L’étude 3 est une étude quantitative menée auprès de 694 participants. Elle évalue les manifestations anxieuses inhérentes au syndrome de l’imposteur. Les analyses rendent compte de profils d’imposteurs différents. L’établissement d’un modèle d’émergence de ce syndrome a été suggéré afin d’interroger sa présence lors des périodes de grand stress de la vie. L’étude 4 est une étude quantitative menée auprès de 873 participants. Elle est axée sur l’intégration de l’acceptation inconditionnelle de soi comme outil pertinent de prise en charge des imposteurs. Elle propose de plus un profil cognitif de ces personnes au regard de la représentation de l’échec, des attitudes dysfonctionnelles et d’une faible acceptation inconditionnelle de soi. / The impostor phenomenon can represent a significant distress source. The literature suggests that 60-70% of the population questions their legitimacy at least once in their lives. These doubts focus on feelings of inadequacy or fraud, poor success attribution, and the fear of being exposed as an impostor. Few studies have explored the pathological aspects of the impostor phenomenon despite its prevalence. Moreover, to our knowledge too little research has been conducted to design adequate management tools. The research carried out for this thesis seeks to validate existing impostor phenomenon measures, the Clance Impostor Phenomenon Scale (CIPS), as well as better understand cognitive dimensions related to this syndrome.Study 1 was a quantitative study carried out on a sample of 549 participants. This study deals with the validation of the independent concept of impostor phenomenon as well as potential pathological aspects related to it. Results showed different impostor profiles both in intensity and impacts of this syndrome.Study 2 was a quantitative study carried out on 1,597-strong sample. The main objective was to validate an existing impostor phenomenon scale (CIPS) in French. The results demonstrated good psychometric validity for the French version.Study 3 was a quantitative study carried out on a sample of 694 participants. This study examined anxiety manifestations linked to the impostor phenomenon. The results demonstrated different profiles of impostors. A model was developed to help understand the manifestation of this syndrome during periods of severe stress and change.Study 4 was a quantitative study carried out on a sample of 873 participants. This study focused on unconditional self-acceptance as a useful method of appropriate therapeutic management linked to the impostor phenomenon. A cognitive profile of impostors was developed that helps account for irrational beliefs about failure, dysfunctional attitudes, and low unconditional self-acceptance.

Les thérapies ciblées telles que les inhibiteurs de la tyrosine kinase ont permis d'améliorer le traitement du cancer du sein en ciblant HER2. Cependant, il a été observé que le lapatinib était moins efficace chez les patients obèses ou en surpoids que chez les patients de poids normal.Nous avons d'abord reproduit l'effet de résistance des cellules de cancer du sein au lapatinib en présence de tissu adipeux tel qu’il a été observé pour d’autres thérapies. Les cellules tumorales qui surexpriment HER2 étaient partiellement résistantes au lapatinib mais également à d'autres inhibiteurs de la tyrosine kinase lorsqu'elles étaient en contact avec le milieu conditionné d’adipocytes. En implantant du tissu adipeux humain et des tumeurs humaines chez la souris, nous avons pu étudier la résistance du cancer du sein au lapatinib in vivo.Pour comprendre le mécanisme de cette résistance, nous avons exposé les adipocytes à plusieurs modulateurs du métabolisme. La cytotoxicité cellulaire induite par le lapatinib était plus faible pour les cellules tumorales exposées à un milieu conditionné d'adipocytes préalablement incubés avec les alpha-bloquants qu'à un milieu conditionné à partir d'adipocytes seuls. De la même manière, cette toxicité était inférieure pour les agonistes des récepteurs alpha adrénergiques, pour les bêtabloquants et pour les inhibiteurs de lipolyse. Au contraire, la cytotoxicité a été augmentée pour les cellules tumorales en contact avec le milieu conditionné d’adipocytes exposés aux agonistes du récepteur bêta-adrénergiques. Au niveau des cellules cancéreuses, l'arrêt du cycle cellulaire induit par le lapatinib était réduit pour les cellules tumorales exposées au milieu conditionné d’adipocytes en ce qui concerne le pourcentage de cellules dans la phase G0/G1. Ceci s’est vérifié en étudiant l'expression des gènes codant pour plusieurs protéines impliquées dans la progression du cycle cellulaire / Targeted therapies as tyrosine kinase inhibitors permitted an improvement of breast cancer therapies by targeting HER2. However, resistance has been observed in obèse patients for lapatinib treatment.We reproduced the effect of resistance of breast cancer cells to laaptinib in presence of adipose tissue as observed for other therapies. Tumor cells overexpressing HER2 was partly resistant to lapatinib but also for other tyrosine kinase inhibitors when in contact with adipocyte-conditioned medium. By impnating human adipose tissue nad human tumors in mice, we were able to study rhe resistance of breast tumor cells in vivo.In order to elucidate the mechanism of such resistance, we exposed the adipocytes to several metabolism modulators. The lapatinib-induced cell cytotoxicity was lower for the tumor cells exposed to the conditioned medium from adipocytes earlier exposed to alpha blockers than to the conditioned medium from adipocytes alone. In the same manner, the toxicity was lower for the agonists of alpha-adrenergic receptors , for beta-blockers and for the lipolysis inhibitors. At the opposite, the cytotoxicity was enhanced for tumor cells in contact with the conditioned medium of adipocytes exposed to the agonists of beta adrenergic receptors.At the tumor cell level, the laaptinib-induced cell cycle arrest was reduced for the tumor cells exposed to the conditioned medium regarding the G0/G1 phase. That was verified by the study of the expression of genes involved in the cell cycle progression

Le cancer du poumon est la première cause de mortalité liée au cancer en France et dans le monde. Il s’agit d’un cancer de mauvais pronostique, diagnostiqué généralement aux stades tardifs III ou IV et avec une survie à 5 ans faible, respectivement de 6 et 1%. Ce cancer comprend différents types histologiques, parmi lesquels les adénocarcinomes sont les plus fréquents et comptent pour 40% des diagnostics. L’analyse génétique par séquençage des tumeurs des patients en stade IV permet de mettre en évidence des mutations récurrentes, et généralement mutuellement exclusives, au niveau des gènes KRAS, EGFR, BRAF et ALK. L’identification de ces mutations permet dans le cadre de tests compagnons de décider de l’éligibilité du patient aux thérapies ciblées lorsqu’elles sont disponibles.Bien que ces thérapies ciblées représentent une véritable révolution dans la prise en charge des patients, une majorité de patients ne peuvent bénéficier de ces traitements car ils ne présentent pas au niveau tumoral de mutation activatrices actionnables (absence de mutation EGFR, BRAF et ALK, présence d’une mutation KRAS…). De plus, dans l’éventualité où ils peuvent être traités par une molécule orale, le bénéfice observé reste malheureusement de courte durée et tous finiront à terme par échapper au traitement, c’est le cas par exemple lors de mutations de l’EGFR.Ainsi, afin de mieux comprendre quels sont les mécanismes moléculaires associés aux phénomènes de résistances thérapeutiques observés en clinique, et dans l’objectif de proposer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients non éligibles aux thérapies ciblées, j’ai étudié, au niveau protéique, l’impact des mutations sur les réseaux d’interactions protéiques en utilisant la technique du BioID (proximity-dependent biotinylation identification). Plus particulièrement, je me suis intéressé aux mutations activatrices de l’EGFR, KRAS, BRAF et ALK. Les protéines de la famille RAS (HRAS, NRAS, KRAS) étant mutées dans plus de 30% des cancers, je me suis également intéressé aux réseaux d’interactions protéiques portés par ces trois isoformes afin de mettre en évidence des interactions protéiques spécifiques à l’isoforme KRAS.Au cours de ma thèse, j’ai montré que les réseaux d’interaction caractérisés par le BioID sont bien plus denses que ceux obtenus par la technique plus conventionnelle de purification par affinité, et qu’ils permettent de mettre en évidence des interacteurs spécifiquement dérégulés par l’apparition de mutations activatrices. Par ailleurs les modèles cellulaires HEK293 (cellules humaines embryonnaires de rein) et BEAS2B (cellules pulmonaires d’origine non-cancéreuses) ont montré un fort recouvrement des interacteurs identifiés, ce qui suggère que la stratégie employée est pertinente pour identifier des interacteurs spécifiques de mutations. Ce travail de thèse a permis d’identifier une série de plusieurs interacteurs spécifiques des formes mutante de KRAS, d’EGFR, de BRAF, de NRAS et de la fusion EML4-ALK. Treize interacteurs spécifiques de la forme mutée de KRAS ont été validés fonctionnellement dans des modèles cellulaires de cancers du poumon. Enfin, en utilisant les données de BioID, un modèle préliminaire de résistance de l’EGFR aux thérapies ciblées a pu être élaboré, lequel fait apparaitre les protéines CBL et IGF2R comme des protéines potentiellement impliquées dans l’acquisition des résistances aux thérapies ciblées.Ce travail de thèse propose ainsi de nouvelles perspectives quant à la détermination des mécanismes de résistance spécifiques aux thérapies ciblées et à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques chez les patients présentent des mutations activatrices. / Lung cancer is the leading cause of cancer-related death in France and in the world. It is a cancer of poor prognosis, diagnosed at the late stage III or IV, with a 5-years survival of 6% and 1%, respectively. This cancer encompass several histological types, and among them adenocarcinoma account for 40% of the diagnosis. Genetic sequencing of stage IV tumors highlights redundant mutations, and generally exclusives from each other’s, of KRAS, EGFR, BRAF and ALK genes. The identification of these mutations enable, within companion test, to make eligible patients for targeted therapies when molecules are available.Even though these targeted therapies represent a true revolution in patient’s care, the majority of them cannot benefit from these treatments because their tumors do not harbor activating mutations that are targetable (e.g. absence of EGFR, BRAF and ALK mutation, presence of KRAS mutation). Additionally, when they can be treated using an oral molecule, the benefit observed is unfortunately poor in terms of period of time, and all the patients will escape from the treatment. This is for example the case with EGFR mutations.To better understand the molecular mechanisms associated with the resistance events observed in the clinic, and to propose new therapeutics for patient not-eligible for targeted therapies, I studied at the proteome level, the impact these mutations on protein networks, using the BioID technology (proximity-dependent biotinylation identification). More particularly, I have been interested in the activating mutation of EGFR, KRAS, BRAF and ALK. Considering that proteins from the RAS family (HRAS, NRAS and KRAS) are mutated in around 30% of cancers, I have been also interested in the protein network of these proteins to highlight interaction specific to the KRAS isoform.During my thesis, I showed that the protein networks characterized using BioID are much more dense compared to those identified with the more conventional technic of AP-MS (Affinity-purification and mass spectrometry), and that they enable to identify interactors specifically deregulated upon activating mutation. Additionally, the HEK293 cell model (Human Embryonic Kidney) and BEAS2B cell model (non-cancerous lung cell line) showed a high overlapping degree of the interactors identified, suggesting that the strategy used is relevant to identify interactors specific to mutations. This thesis enabled to identify several interactors specific to the mutant KRAS, EGFR, BRAF, NRAS and EML4-ALk fusion. Thirteen interactors specific to the mutated-KRAS have been functionally validated in lung-cancer cell lines models. Finally, using BioID data I have been able to propose a model of EGFR resistance to targeted therapies. This model shows that CBL and IGH2R might be the EGFR partners responsible for therapeutic escape.Altogether, this thesis propose new perspective to determine resistance mechanisms and to identify new therapeutic targets for KRAS-mutated patients.

Les thérapies moléculaires ciblées ont changé la prise en charge des patients atteints de cancer, et en particulier dans le cancer colorectal (CCR). Il est important d’identifier des biomarqueurs de sensibilité ou de résistance à ces traitements. En premier, la signalisation en aval de l’EGFR au niveau tumoral pourrait conditionner la réponse au cétuximab dans les cancers colorectaux (CCR). Notre premier travail a évalué le niveau d’expression tumorale de phosphoprotéines de signalisation en aval de l’EGFR (p-MEK, p-ERK1/2, p-AKT, p-GSK3b, p-P70S6K) analysés par Bioplex phosphoprotein array chez 42 patients avec un CCR métastatique, traités par anti-EGFR. L’expression de p-P70S6K est plus faible chez les patients répondeurs (p=0,02). La survie sans progression (SSP) est supérieure en cas d’expression faible de p-P70S6K (p=0,0001) et p-MEK (p=0,0006). p-MEK et p-P70S6K ont une expression plus élevée chez les KRAS mutés et apparaissent comme deux marqueurs pronostiques indépendants de KRAS (HR 0,34, p=0,01 et HR 0,42, p=0,03). Ainsi, le niveau d’expression des phosphoprotéines en aval de l’EGFR pourrait prédire la réponse et la SSP dans les CCR traités par anti-EGFR, indépendamment du statut KRAS. Il est difficile dans certain cas d’avoir accès au tissu tumoral. L’ADN circulant (cADN) dans les stades avancés de cancer peut aider à la caractérisation moléculaire des tumeurs, en tant que biopsie. Notre deuxième travail a étudié la faisabilité, la sensibilité et la spécificité d’une technique de spectrométrie de masse (Sequenom) pour détecter des mutations (238 mutations parmi 19 oncogènes) à partir du tissu tumoral et du cADN de 105 patients ayant un cancer avancé. La concentration médiane de cADN était de 17ng/ml de plasma (0,5-1600), soit 3 fois le niveau chez les volontaires sains. En analyse multivariée, la concentration de cADN, l’albumine et l’état général étaient des facteurs prédictifs indépendants de la survie globale des patients. De plus, il existait une concordance élevée des statuts mutationnels (KRAS, BRAF et PIK3CA) entre le tissu tumoral et le cADN dans plusieurs types tumoraux (CCR, sein, mélanome): un taux de concordance de 70% pour le gène KRAS et de 100% pour le gène BRAF ont été retrouvés dans le CCR. Notre Étude suggère que l’analyse du cADN pourrait être un matériel utilisable pour la recherche de mutations, notamment dans le suivi des patients ayant un cancer du colon traités par thérapies ciblées. Notre travail a donc montré l’intérêt de poursuivre l’étude de facteurs moléculaires qui pourraient prédire la réponse ou la résistance à des thérapies ciblées utilisées dans les cancers du colon, au niveau du tissu tumoral (phosphoprotéines) ou au niveau du sang (cADN). / Especially in CRC, it is important to identify molecular targeted therapies biomarkers. First, additional markers of resistance to KRAS mutations could predict resistance to anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibodies in advanced colorectal cancer (CRC). In our first study, in a series of 42 patients with advanced CRC treated with cetuximab/panitumumab, for whom KRAS status was previously determined, we retrospectively analyzed the intratumor expression of EGFR downstream signaling phosphoproteins of the RAS/MAPK and PI3K/AKT pathways (pERK1/2, pMEK1, pAKT, pP70S6K and pGSK3beta) using Bio-Plex phosphoprotein array. The expression of all the phosphoproteins was higher in KRAS mutated tumors than in WT tumors. The expression of pP70S6K was lower in responders than in nonresponder patients. In multivariate analysis, PFS was shorter for patients with high pMEK1 or pP70S6K expression, independently of KRAS status, as OS for patients with high pP70S6K expression. Our results suggest the importance of EGFR downstream signaling phosphoproteins expression in addition to KRAS status to define the subgroup of patients who will not benefit from anti-EGFR therapy. We hypothesized that circulating plasma DNA (cpDNA) in advanced cancer patients is largely derived from tumor, and can be utilized for tumor mutation sequencing when repeat biopsy is not feasible. In our second study, we utilized the Sequenom MassArray System and OncoCarta panel for somatic mutation profiling. Matched samples, acquired from the same patient but at different time points were evaluated; these comprised formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) archival tumor tissue (primary and/or metastatic) and cpDNA. The feasibility, sensitivity, and specificity of this high-throughput, multiplex mutation detection approach was tested utilizing specimens acquired from 105 patients with solid tumors referred for participation in Phase I trials of molecularly targeted drugs. The median cpDNA concentration was 17 ng/ml (range: 0.5-1600); this was 3-fold higher than in healthy volunteers. In multivariate analyses, cpDNA concentration, albumin, and performance status remained independent predictors of OS. We also observed high detection concordance for critical "hot-spot" mutations (70% for KRAS, 100% for BRAF) in matched cpDNA and archival tumor tissue. This multiplex sequencing assay can be utilized to detectsomatic mutations from plasma in advanced cancer patients, when safe repeat tumor biopsy is not feasible and genomic analysis of archival tumor is deemed insufficient. Our work did show the importance to search for molecular markers to predict response to targeted therapies, both in tumor tissu (phosphoproteins) and in blood (cpDNA).

La fibrillation atriale affecte 2-3% des européens et nord-américains, les tachycardies ventriculaires sont liées à un risque important de mort subite. Les approches minimalement invasives comme l’Ablation par Cathéter Radiofréquence (RFCA) ont révolutionné le traitement de ces maladies, mais le taux de réussite de la RFCA est limité par le manque de techniques d’imagerie pour contrôler cette ablation thermique.Le but de cette thèse est de proposer de nouvelles approches ultrasonores pour des traitements cardiaques minimalement invasifs guidés par échographie.Pour cela nous avons d’abord validé la précision et la viabilité clinique de l’Élastographie par Ondes de Cisaillement (SWE) en tant que modalité d’imagerie quantitative et temps réel pour l’ablation thermique in vivo. Ensuite nous avons implémenté la SWE sur un transducteur intracardiaque et validé la faisabilité d’évaluer l’ablation thermique in vitro et in vivo sur cœur battant de gros animal. Puis nous avons développé un transducteur intracardiaque dual-mode pour effectuer l’ablation et l’imagerie ultrasonores avec les mêmes éléments, sur le même dispositif. Les lésions thermiques induites par Ultrasons Focalisés de Haute Intensité (HIFU) et contrôlées par la SWE ont été réalisées avec succès in vivo dans les oreillettes et les ventricules chez le gros animal. Finalement la SWE a été implémentée sur un dispositif d’imagerie et thérapie ultrasonores transœsophagien et la faisabilité de cette approche a été démontrée in vitro et in vivo. Ces approches originales pourraient conduire à de nouveaux dispositifs cliniques pour des traitements plus sûrs et contrôlés d’un large éventail d’arythmies et maladies cardiaques. / Atrial fibrillation (AF) affects 2-3% of the European and North-American population, whereas ventricular tachyarrhythmia (VT) is related to an important risk of sudden death. AF and VT originate from dysfunctional electrical activity in cardiac tissues. Minimally-invasive approaches such as Radio-Frequency Catheter Ablation (RFCA) have revolutionized the treatment of these diseases; however the success rate of RFCA is currently limited by the lack of monitoring techniques to precisely control the extent of thermally ablated tissue.The aim of this thesis is to propose novel ultrasound-based approaches for minimally invasive cardiac ablation under guidance of ultrasound imaging. For this, first, we validated the accuracy and clinical viability of Shear-Wave Elastography (SWE) as a real-time quantitative imaging modality for thermal ablation monitoring in vivo. Second we implemented SWE on an intracardiac transducer and validated the feasibility of evaluating thermal ablation in vitro and in vivo on beating hearts of a large animal model. Third, a dual-mode intracardiac transducer was developed to perform both ultrasound therapy and imaging with the same elements, on the same device. SWE-controlled High-Intensity-Focused-Ultrasound thermal lesions were successfully performed in vivo in the atria and the ventricles of a large animal model. At last, SWE was implemented on a transesophageal ultrasound imaging and therapy device and the feasibility of transesophageal approach was demonstrated in vitro and in vivo. These novel approaches may lead to new clinical devices for a safer and controlled treatment of a wide variety of cardiac arrhythmias and diseases.

Le lymphome est un cancer des ganglions lymphatiques, lieu de prolifération et différenciation des cellules immunitaires en particulier des lymphocytes B qui sont des cellules productrices d'anticorps. Les lymphomes résultent de l’accumulation de mutations génétiques dans le génome d’une cellule B normale contribuant à la transformation en cellule B maligne. Cette cellule B dite transformée prolifère alors pour engendrer un clone de cellules B malignes qui s’accumulent au niveau des ganglions lymphatiques, formant alors une tumeur appelée ‘lymphome B’ (pour cancer lymphoïde issu de la transformation maligne des lymphocytes B). Le ganglion lymphatique normal a une structure histologique qui se décompose ainsi, du centre à la périphérie : le centre germinatif, la zone du manteau et la zone marginale. Les lymphomes B sont classés en différents sous-types histologiques en fonction de leur origine topographique au niveau du ganglion lymphatique et de leurs caractéristiques bio cliniques spécifiques. Parmi ces sous-types, une forme particulièrement agressive peut être distinguée : le lymphome à cellules du manteau. Ce sous-type de lymphome est caractérisé par des rechutes successives et une survie qui est généralement courte (médiane de survie de 4 à 5 ans) même si certains patients, avec des formes plus indolentes de lymphomes à cellules du manteau, présentent des survies prolongées (médiane de survie de 7 à 10 ans). Des biomarqueurs prédictifs de la courte survie manquent aujourd’hui, ce qui rend difficile la prise en charge optimisée des patients. Ce projet s’intéresse à cette question. Plus précisément, nous nous proposons de rechercher des mutations génétiques associées à la résistance thérapeutique. Notre approche sera basée sur le séquençage ciblé à haut débit du génome de cellules B tumorales issus de patients présentant des cas classiques du lymphomes à cellules du manteau mais aussi des cas plus particuliers comme ceux présentant des résistances thérapeutiques précoces, par exemple. Par cette approche dite de ‘cartographie’ à l’échelle du génome, nous espérons identifier des nouveaux prédicteurs moléculaires de la survie chez ces patients atteints de lymphome à cellules du manteau et également apporter de nouvelles connaissances dans l’interconnexion entre la génétique et l’épigénétique dans cette maladie. / Lymphoma is a cancer of the lymph nodes which are organs in which immune cells, particularly the antibody producing B cells, proliferate and differentiate before circulating in the blood and tissues to fight infection. B cell lymphoid cancers – ‘B cell lymphoma’ arise as a consequence of the occurrence of gene mutations in B cells. By affecting the functions of key B cell genes, these mutations drive the malignant transformation of the affected B cells which then begin to divide abnormally eventually destroying normal lymph node organization and function. The lymph node is divided into distinct micro-anatomical compartments or zones which are called (from the inner to outer most compartment – germinal centre, mantle zone, and marginal zone). B cell lymphoma classification follows this general organization and classifies tumours depending on the compartment of origin of the particular tumour B cell population. This classification thus defines lymphoma according to a ‘histological subtype’ with defined clinic-biological features. Among these subtypes, mantle cell lymphoma (MCL) is a particularly aggressive form of B lymphoid cancer. This type of lymphoma is characterised by successive relapses and short survival (median is 4 to 5 years), although some patients can show long survival. Predictive biomarkers of this clinical behavior are lacking. This project aims to address this question. More specifically we propose to perform whole ‘exome’ sequencing – i.e. sequencing of all protein coding sections of all known protein coding genes in the genome – of the tumour B cell DNA from patients who show refractory or early relapsing disease compared to patients who show relatively long survival. By doing this genome scale study we hope to identify new gene mutations that can serve as molecular predictors of survival and bring new knowledges in the understanding between genetics and epigenetics in MCL.