Les thérapies ciblées ont amélioré la survie des patients atteints de mélanome cutané métastatique, toutefois certains patients échappent au traitement. La réponse au traitement met en jeu des paramètres dépendants du patient, de la biologie de la tumeur, et de la survenue de mécanismes de résistance largement étudiés.Le but de ce travail est d’étudier deux marqueurs mesurables en pratique clinique lors du suivi des patients, pour leur potentiel prédictif de réponse aux inhibiteurs de BRAF en monothérapie, l’un biologique et l’autre pharmacologique : la charge allélique mutée (CAM), définie par le rapport muté/total, des oncogènes BRAF et NRAS, et la concentration plasmatique de vemurafenib (CPV).Nous rapportons pour la première fois la prévalence et les mécanismes du déséquilibre allélique des oncogènes BRAF et NRAS, défini par une CAM élevée (>60%) ou faible (≤30%), par opposition à une CAM « hétérozygote » équilibrée (entre 30 et 60%). Des arguments in vitro et in vivo soutiennent l’hypothèse qu’une CAM BRAFV600E >60% puisse être associée à une meilleure réponse aux inhibiteurs de BRAF. La CAM de NRAS ne semble pas être un marqueur pronostique au moment du diagnostic de mélanome, toutefois sa valeur prédictive sur la réponse aux inhibiteurs de MEK sera intéressante à étudier.Nous montrons pour la première fois l’impact du dosage de la CPV lors du suivi des patients traités en monothérapie. Une CPV basse serait prédictive d’une progression ; ainsi, la CPV semble être un marqueur prédictif original de réponse, pour lequel la valeur seuil ainsi que les mécanismes pharmacogénétiques impliqués restent à déterminer. / Targeted therapies have improved survival in patients with metastatic cutaneous melanoma, but some patients escape treatment. Response to treatment involves parameters dependent of the patient, the tumor biology, and the occurrence of resistance mechanisms extensively investigated. The aim of this work is to study two measurable markers in clinical practice in patient monitoring, for their predictive potential of response to BRAF inhibitors monotherapy; the first one is biological and the other one is pharmacological: mutant allele burden (MAB), defined by the ratio mutant/total, of BRAF and NRAS oncogenes, and plasma vemurafenib concentration (PVC).We report for the first time the prevalence and the mechanisms of BRAF and NRAS oncogenic allelic imbalance, defined by a high (>60%) or a low (≤30%) MAB, as opposed to a balanced “heterozygous” MAB (30 to 60%). In vitro experiments and in vivo data support the hypothesis that a BRAFV600E MAB >60% may be associated with a better response to BRAF inhibitors. NRAS MAB does not seem to be a baseline prognostic marker, but its predictive value of response to MEK inhibitors will be interesting to investigate.We demonstrated for the first time the impact of CPV assay during the monitoring of patients treated with monotherapy. A low CPV would be predictive of progression; thus, CPV appears to be an original predictive marker of response, for which the threshold value and the involved pharmacogenetic mechanisms remain to be determined.

Contexte. Synonymes de progrès thérapeutique, les thérapies ciblées anticancéreuses ne sont pas sans effet secondaire, en particulier dermatologique. Très peu de données sont disponibles quant à leur impact sur la qualité de vie. Le service de dermatologie de Gustave Roussy a consacré une partie de son activité de recherche à cette thématique. Inscrite dans ces travaux, notre thèse avait pour objectif principal de décrire les changements observés du point de vue de l'état émotionnel, de l'image corporelle et des interactions sociales avec l'apparition des atteintes cutanées, en s'intéressant à la place des représentations associées au traitement dans le processus d'ajustement des patients.Méthode. L'étude prospective comprenait quatre temps d'évaluation (initiation du traitement, un, deux et trois mois après) et associait deux modes d'évaluation : quantitatif (questionnaires) et qualitatif (entretiens semi-directifs). L'inclusion était proposée par les oncologues aux patients allant débuter une thérapie ciblée. Les analyses statistiques ont été menées avec le logiciel SPSS 14.0 ; l'analyse des entretiens a combiné méthode thématique et méthode par questionnement analytique, en recourant au modèle théorique de Pedinielli. Résultats. Sur 82 patients inclus dans la recherche biomédicale, 62 ont accepté de participer à l'étude psychologique. La partie quantitative a été complétée par 33 patients, pour moitié hommes (âge moyen 56 ans) soignés pour un cancer métastatique ; 84% a développé au moins un des symptômes suivants: rash cutané, syndrome main-pied, alopécie ou photosensibilité. Les changements observés ont été un inconfort physique et une gêne à la réalisation des activités du quotidien. Aucun signe de perturbation de la sphère émotionnelle, de l'image du corps et des relations sociales n'a été mis en évidence. La représentation d'un médicament contrôlant la maladie a émergé comme un des facteurs significativement associés aux variations de l'impact des toxicités cutanées sur la qualité de vie. La partie qualitative a concerné 41 patients (caractéristiques médicales et sociodémographiques très similaires à celles de l'échantillon quantitatif). Pour une majorité les symptômes dermatologiques ont été « gênants », voire « perturbants » lorsqu'ils entraînaient douleurs, difficultés à la mobilité ou troubles du sommeil, mais sont restés « gérables, supportables ». Les représentations associées au traitement, très positives, sont apparues comme un élément soutenant dans l'ajustement des patients. Du discours des patients en souffrance psychologique sont ressorties une défiance vis-à-vis du regard d'autrui et une impossibilité d'amorcer le travail de renoncement nécessaire à l'intégration des transformations liées au cancer et à ses traitements. L'origine de cette souffrance serait un débordement des défenses psychiques par une angoisse de mort : la difficulté pour restaurer l'état d'équilibre psychique antérieur provenant de l'activation concurrentielle de deux dynamiques, l'une surnommée « substantielle », l'autre « identitaire ».Discussion. Ces résultats rejoignent les données de la littérature en concluant à un impact d'intensité faible à modérée des toxicités cutanées sur la qualité de vie pour une majorité de patients. Contrairement à ce qui était attendu, il n'a pas été observé de changement sur le plan de l'état émotionnel, de l'image corporelle et des interactions sociales. L'investissement positif du traitement, la réappréciation des valeurs, le très bon état général des patients et l'optimisme ont été évoqués l'absence de perturbation. L'importance de l'encadrement médico-soignant a aussi été soulignée.Conclusion. Le développement croissant des thérapies ciblées appelle à une consolidation des mesures de prévention et de prise en charge des symptômes dermatologiques, ce qui nécessite un renforcement des actions de formation et de sensibilisation des acteurs de soin à cette problématique. / Background. Considered as a significant therapeutic progress in cancer, targeted agents are not without side effects, particularly dermatological ones. Very little information is presently available about their consequences on patients' quality of life, that is why the dermatological team of Gustave Roussy has developed a prospective research. Integrated into this work, our thesis aimed to describe the psychosocial changes occurring with cutaneous toxicities and to explore the implication of treatment representations in the patient's adjustment process.Methods. The study included four phases of evaluation (treatment initiation, one, two and three months after) and used two methods: a quantitative one (questionnaires) and a qualitative one (semi-structured interviews). The inclusion was proposed by oncologists to patients who were about to start a targeted therapy. Statistical analyzes were conducted with SPSS 14.0 software; analyzes interviews combined thematic approach and analytical questioning methods and referred to the Pedinielli's theoretical model.Results. Eighty- two patients gave their consent for biomedical research, 62 of them agreed to participate to the psychological study. The quantitative part was completed by 33 patients (50% men, mean age 56 years) treated for a metastatic cancer; 84% developed at least one of the following symptoms: skin rash, hand-foot syndrome, alopecia or photosensitivity. The observed changes were characterized by a physical discomfort and difficulties in the activities of daily life. No sign of disturbance was noted in emotional domain, body image or social relations. The representation of a drug controlling the disease was significantly associated with a lower impact of skin problems on the quality of life. The qualitative part included 41 patients (medical and sociodemographic characteristics very similar to those of the quantitative sample). For most people, dermatological side effects were "boring", "uncomfortable", sometimes "impressive" or "disturbing" when they were associated with pain, mobility difficulties or sleeping troubles, but remained "manageable, bearable". The very positive treatment representations appeared as a supporting element in patients' adjustment. Psychological distress seemed appear when patients feared being stared by others and failed to engage themselves in the renouncement work which is needed to adjust oneself to the transformations related to cancer and its treatments. In such situation psychological distress was supposed to come from an overflow of the psychic defences by a fear of death; the difficulty to restore mental balance would be explained by the activation of two competitive dynamics, which struggle for the organism and the identity survival.Discussion. These results are consistent with the literature data. The skin toxicities impact on quality of life is mild to moderate for a majority of patients. Contrary to our expectations, there was no evidence of change in the domains of emotions, body image and social interactions. The positive investment of treatment, a reassessment of values, the very good physical state of patients and the influence of optimism in patients state of mind have been cited to explain not only the absence of disturbance, but also the very low levels of anxiety, sadness and fatigue generally reported. The importance of the caregiving provided by health professionals was also highlighted: anticipating difficulties, giving information about side effects and effectively managing problems secure patients.Conclusions. The growing development of targeted therapies implies strengthening prevention and management of dermatological side effects. Moreover, it requires to aware and to train more health professionals to this problem, recalling the singular dimension of each patient which can not being reduced to the medical observable.

Le but était d'évaluer l'aide à l'arrêt et d'identifier des facteurs psychosociaux du sevrage chez les fumeurs requérant a priori une aide spécifique : précaires, femmes enceintes et petits fumeurs (moins de 10 cigarettes/jour). La base de données nationale Consultation De Tabacologie (CDT) contient les dossiers de fumeurs reçus en CDT. 682 femmes enceintes consultent en 2004-2006. 80,5% fume plus de 10 cigarettes/jour. 59,8% est perdu de vue. Une faible dépendance et l'usage de patchs prédisent l'arrêt. Selon les motifs d'arrêt de 13746 consultants en 2006-2007, des réseaux sociaux non-fumeurs se développent, motivant l'arrêt via des thèmes tels "incitation ou pression des autres" (20,9% d'arrêts à 1 mois de suivi), "montrer l'exemple" (20,7%), "entourage non-fumeur" (20,3%). 5,6% des 587 femmes enceintes sont sevrées, sans effet prédictif de la grossesse ni d'autres motifs (coût, santé, image négative du tabagisme, entourage). Le coût du tabac ne prédit pas l'arrêt des chômeurs ou peu éduqués qui sacrifient parfois des besoins primaires pour le tabac. 259 fumeurs heureux de fumer (69,3% peu éduqués) et réfractaires à toute aide vont en CDT sur injonction médicale. 10,4% arrêtent de fumer. 36594 adultes consultent en 2007-2008. 13,3% des 6001 petits fumeurs sont sevrés versus 14,5% de gros fumeurs. Les petits fumeurs reçoivent moins de pharmacothérapie bien qu'elle double leur taux d'arrêt, surtout chez ceux ayant plusieurs fois tenté l'arrêt. Les thérapies cognitivo-comportementales n'aident l'arrêt des femmes enceintes et petits fumeurs qu'avec le patch. Nous proposons des pistes pour adapter la prise en charge de fumeurs pour qui les mesures actuelles sont peu efficaces.

Le VEGF-A est l'un des facteurs de croissance les plus importants au cours de la néo-angiogénèse tumorale. Ce rôle en a fait une cible de choix pour le développement de thérapies. Ainsi, différents médicaments le ciblant (Bevacizumab, AvastinR) ou ciblant ses voies de signalisation (inhibiteurs des récepteurs VEGFR) sont actuellement utilisés en clinique, notamment dans les adénocarcinomes pulmonaires. Cependant, malgré des résultats initiaux prometteurs, un grand nombre de patients apparaissent d'emblée résistants ou échappent à ces thérapies, voir même développent des tumeurs plus agressives. A ce jour, il n'existe aucun moyen d'identifier les patients susceptibles de répondre à ces thérapies. Récemment, de nouveaux variants d'épissage du VEGF-A issus d'un épissage alternatif différentiel au niveau du dernier exon ont été identifiés, les isoformes VEGFxxxb. A l'inverse des VEGFxxx, ces variants sont anti-angiogéniques. Si les effets paracrines des isoformes du VEGF-A sur les cellules endothéliales ont été bien caractérisés, bien peu d'études se sont penchées sur leurs effets autocrines sur les cellules tumorales qui expriment à leur surface les récepteurs VEGFR1 et VEGFR2. Dans ce contexte, le but principal de notre étude était de déterminer le statut d'expression et les fonctions biologiques de l'isoforme VEGF165b dans les tumeurs primaires et dans des modèles cellulaires dérivés de Carcinomes Pulmonaires Non à Petites Cellules (CBnPCs). Nos résultats identifient des profils d'expression variables du VEGF165b chez les patients atteints de CBnPCs, et montrent que de hauts niveaux intratumoraux de VEGF165b sont associés à un envahissement ganglionnaire. De plus, nos résultats identifient une boucle autocrine au travers de laquelle l'activation des récepteurs VEGFR1/VEGFR2 par le VEGF165b conduit à l'apparition de cellules tumorales présentant un phénotype plus invasif. Finalement, nous montrons que le traitement des cellules tumorales par le Bevacizumab (BVZ) mais aussi par les sels de platine auquel il est associé en clinique augmente l'expression du VEGF165b, la signalisation autocrine qu'il active et conduit à l'apparition de cellules tumorales plus agressives et résistantes à l'apoptose induite par le cisplatine. Ces résultats sont la première démonstration de la capacité du VEGF165b à signaliser sur les cellules tumorales. Dans une seconde étape de notre travail, nous avons étudié le rôle que pourraient jouer les intégrine β1 et β3 dans le maintien de la signalisation induite par le VEGF165b dans les cellules de CBnPCs. Nous montrons que le VEGF165b active l'intégrine β1. Cette activation aboutit à un réarrangement du cytosquelette d'actine en fibres de stress, ce qui pourrait favoriser la migration de ces cellules. De manière intéressante, le BVZ est capable d'induire ce même phénotype par un mécanisme nécessitant l'expression du VEGF165b, de l'intégrine β1, mais aussi de l'intégrine β3. La formation de ces fibres de stress est associée à l'activation de voies de signalisation d'aval mettant en jeu la phosphorylation des protéines FAK et cofiline. De plus, nous mettons en évidence l'existence de complexes entre la neuropiline 2 et l'intégrine β1 dans les cellules de CBnPCs qui seraient susceptibles de participer à l'activation de ces voies. Ainsi, le VEGF165b et le BVZ apparaissent capable de signaliser à travers les intégrines β1 et β3 dans les cellules de CBnPCs, suggérant un rôle de ces intégrines dans la réponse des cellules tumorales aux thérapies anti-angiogéniques. En conclusion, nos résultats identifient un rôle du variant VEGF165b dans la progression des CBnPCs et la réponse aux thérapies anti-angiogéniques et aux chimiothérapies, ce qui suggère que le VEGF165b pourrait être un marqueur réponse au BVZ dans les CBnPCs. / VEGF-A is one of the most important factors during tumor neoangiogenesis. This role has made it a prime target for the development of therapies. Thus, various drugs targeting VEGF-A (Bevacizumab, Avastin®) or its signaling pathways (VEGFR inhibitors) are currently used in clinical practice, especially in lung adenocarcinomas treatment. However, despite promising initial results, many patients are refractory or escape these therapies, and sometimes, even develop more aggressive tumors. To date, there is no means to identify patients who are likely to respond these treatments. Recently, new splicing variants of VEGF-A resulting from an alternative splicing at the last exon, were identified and called VEGFxxxb. Unlike VEGFxxx, these variants are antiangiogenic. If paracrine effects of VEGF-A isoforms on endothelial cells have been well characterized, few studies have examined their autocrine effects on tumor cells expressing VEGFR1 and VEGFR2. In this context, the main aim of our study was to determine the expression status and biological functions of VEGF165b in primary tumors and derived cell models of non small cell lung carcinoma (NSCLC). Our results identify variable expression profiles of VEGF165b in NSCLC patients, and show that high levels of intratumoral VEGF165b are associated with lymph node metastases. Furthermore, our results identify an autocrine loop through which the VEGFR1/VEGFR2 activation by VEGF165b leads to the appearance a more invasive phenotype on tumor cells. Finally, our results show that treatment of tumor cells by Bevacizumab (BVZ) but also platinum salts, with which it is associated clinics, increases VEGF165b expression and autocrine signaling, which leads to appearance of tumor cells that are more aggressive and resistant to cisplatin-induced apoptosis. These results are the first evidence of the VEGF165b ability to signalize on tumor cells. In a second stage of our work, we investigated the potential role of β1 and β3 integrins in maintaining VEGF165b signaling in NSCLC cells. We show that VEGF165b activates beta1 integrin. This activation leads to a rearrangement of the actin cytoskeleton in stress fibers, which may promote tumor cell migration. Interestingly, BVZ is able to induce this same phenotype by a mechanism requiring the expression of VEGF165b , beta1 integrin and beta3 integrin. The formation of these stress fibers is associated with the activation of downstream signaling pathways involving proteins phosphorylation of FAK and cofilin. In addition, we highlight the existence of neuropilin-2/β1 integrin complexes in NSCLC cells, which are likely to participate in these pathways activation. Thus, VEGF165b and especially BVZ appear able to signal through beata1 and beta3 integrins NSCLC cells, suggesting a role of these integrins in tumor cells response to antiangiogenic therapies. In conclusion, our results are the first evidence of a role of VEGF165b in NSCLC progression and response to antiangiogenic therapies and chemotherapies; they suggest that VEGF165b could be a marker of response to BVZ in NSCLC.

La surexpression du récepteur EGFR a un rôle majeur dans le développement des carcinomes des voies aérodigestives supérieures (VADS) et son inhibition par les anticorps anti-EGFR (cetuximab) induit un effet anti-tumoral mais pourrait également avoir un effet anti-angiogénique. Cependant, les effets de ces agents sur l'angiogenèse et les cellules endothéliales (CE) n'ont pas réellement été évalués. L'objectif de ce travail est d'étudier l'angiogenèse induite par les molécules libérées par les cellules tumorales des VADS (Cal27, FaDu) dans les milieux de culture en présence ou non de cetuximab, appelés milieux conditionnés (CM). Le cetuximab n'a pas d'effet direct significatif sur les CE. Il induit une diminution de la sécrétion de VEGF par les cellules tumorales mais paradoxalement, les CM obtenus induisent un effet pro-angiogénique. L'analyse de la composition des CM ne permet pas d'identifier de molécule clé responsable de cet effet, le cetuximab diminuant à la fois la sécrétion tumorale des facteurs pro- et anti-angiogéniques. Pour expliquer ce paradoxe et en accord avec la littérature, nous avons mis en évidence une libération de microvésicules par nos cellules tumorales (TMV), TMV exprimant EGFR et TF, et une régulation de cette libération et de leur contenu par le cetuximab. Ces TMV peuvent interagir avec les CE et le cetuximab favoriserait cette interaction. La caractérisation de ces TMV et leur rôle dans le processus angiogénique en réponse ou non au cetuximab permettront dans le futur de comprendre la réelle activité des anticorps anti-EGFR sur l'angiogenèse / Overexpression of EGFR has a major role in the development of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and its inhibition by anti-EGFR antibodies (cetuximab) induced an anti-tumor effect but could also induce an anti-angiogenic effect. However, the effects of these agents onto angiogenesis and endothelial cells (EC) have not really been evaluated. The objective of this work is to study angiogenesis induced by mediators released by head and neck squamous carcinoma cells (Cal27, FaDu) in culture media with or without cetuximab exposure, known as conditioned media (CM). Cetuximab has no significant direct effect on EC. It induces a decrease in the secretion of VEGF by tumor cells but, paradoxically, the CM induces a pro-angiogenic effect. The analysis of the composition of the CM does not allow us to identify a key molecule responsible for this effect because cetuximab decreases the secretion of both pro- and anti-angiogenic factors by tumor cells. To explain this paradox and in agreement with the literature, we highlighted the release of microvesicles by our tumor cells (TMV), TMV which express EGFR and TF, and regulation of this release and the content of TMV after cetuximab exposure. These TMV may interact with the EC and cetuximab increases this interaction. Further characterization of TMV and studying their role in the angiogenic process in response to cetuximab will allow us in the future to understand the real activity of anti-EGFR antibodies onto angiogenesis

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez la femme et constitue un véritable problème de santé publique. Les progrès de la biologie moléculaire ont permis la caractérisation des principales voies de signalisation et ont mis en évidence l'implication majeure de la signalisation cellulaire dans les processus de cancérogenèse. Des cibles moléculaires ont ainsi été identifiées et ont permis le développement de thérapeutiques dites ciblées, telles que les anticorps monoclonaux ou encore les inhibiteurs de kinase. Malgré ces avancées considérables qui ont permis l'amélioration de la prise en charge des patientes, on constate l'apparition de résistances aux traitements. Ce travail avait pour objectifs d'identifier de nouveaux biomarqueurs et de déterminer leur signification clinique, leur intérêt théranostique ainsi que leur impact sur la réponse aux traitements. Dans un premier temps nous avons étudié les mutations activatrices du gène PIK3CA. Ces mutations sont retrouvées dans 25% des cancers du sein et sont impliquées dans la résistance au trastuzumab, aux anti-œstrogènes et aux inhibiteurs de mTOR. 149 échantillons de tumeurs de sein infiltrantes ont été analysés par une technique de PCR-HRM (High Resolution Melting) et 118 échantillons par une technique de PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). Les résultats des 2 techniques étaient concordants (k=0,845 ; p<0,001) et une relation entre mutations du gène PIK3CA et grade SBR a été mise en évidence, les tumeurs de grade SBR III étant moins fréquemment mutées que les autres (p=0.025 en HRM et p=0.009 en ARMS). Dans un second temps, notre travail a consisté en l'exploration fonctionnelle des voies de signalisation PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases et P38MAPKinase. Pour cela nous avons analysé le niveau d'expression des phosphoprotéines p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1/2, p-P90RSK, p-IGF1R ainsi que p-P38MAPK par immuno-analyse multiplexe. Cette partie a comporté 3 études. Une première étude rétrospective sur 45 échantillons de tumeurs mammaires invasives congelées a mis en évidence des niveaux d'expression de P38 et de p-P38 plus élevés dans les tumeurs RE+. La deuxième étude était une étude prospective visant à déterminer des biomarqueurs de réponse à l'association trastuzumab-évérolimus chez des patientes présentant un cancer du sein précoce traitées en préopératoire. Cette étude a révélé une augmentation statistiquement significative du niveau d'expression de p-MEK1 (p=0.012), p-ERK1/2 (p=0.003) et p-P38MAPK (p<0.001) dans le bras de traitement associant l'évérolimus au trastuzumab qui pourrait s'expliquer par la suppression par l'évérolimus d’une boucle de rétrocontrôle négatif contrôlant l'activation de la voie RAS/RAF/MAPKinases. Dans le bras de traitement évaluant le trastuzumab seul, aucune variation du niveau d'expression des phosphoprotéines n'a été mise en évidence, y compris en aval du récepteur HER2, ce qui soulève l'hypothèse d'un mécanisme d'action prédominant immunologique du trastuzumab. La troisième étude qui comparait l'impact du trastuzumab in vitro et en situation clinique confirme la différence des mécanismes d'action mis en jeu en fonction des conditions cellulaires et cliniques. Dans son ensemble, ce travail a mis en évidence que la détermination du statut mutationnel du gène PIK3CA et du niveau d’expression des phosphoprotéines pourrait être utile à une meilleure caractérisation moléculaire des cancers du sein et à l’optimisation de la personnalisation des prescriptions de thérapies ciblées / Breast cancer is the most frequently diagnosed cancer in women and is a real public health problem.Advances in molecular biology have allowed the characterization of the major signaling pathways and revealed their major implication in carcinogenesis processes. Molecular targets have been identified and have enabled the development of targeted therapies, such as monoclonal antibodies, or kinase inhibitors. Despite these considerable advances that have improved the care of patients, emerging of resistance to treatments has been observed. The aim of this work was to identify new tumor biomarkers and determine their clinical significance, their theranostic interest and their impact on the response to targeted therapies. Initially, we studied the activating mutations of the PIK3CA gene. These mutations are found in 25% of breast cancers and are involved in resistance to trastuzumab, antiestrogens and mTOR inhibitors. We analyzed 149 invasive breast tumor samples for PIK3CA gene mutations by PCR-HRM (High Resolution Melting) and 118 by PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System). The results achieved with the 2 techniques were consistent (k = 0.845; p <0.001) and a relationship between PIK3CA mutations and grade SBR was highlighted with a lower occurrence of mutations in SBR grade III tumors (p=0.025 in HRM and p=0.009 in ARMS). Secondly, we investigated the functional alteration of PI3K/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPKinases and P38MAPKinase signaling pathways. We have analyzed the expression level of phosphoproteins p-AKT, p-GSK3ß, p-S6 kinase, p-MEK1, p-ERK1 / 2, p-P90RSK, p-IGF1R and p-p38MAPK by multiplex immunoanalysis. This part includes 3 studies. The first study was a retrospective study of 45 frozen samples of invasive breast tumors in which we observed that the level of expression of P38 and p-P38 was higher in the ER + tumors. The second study was a prospective study to identify biomarkers of response to trastuzumab-everolimus association in patients with early breast cancer treated preoperatively. This study showed a statistically significant increase of the expression level of p-MEK1 (p = 0.012), p-ERK1/2 (p = 0.003) and p-p38MAPK (p<0.001) in arm treated by trastuzumab associated with everolimus. It could be explained by the repression of a negative feedback loop involving S6K, PI3K and RAS by everolimus, leading to the activation of RAS/RAF/MAPKinases signaling pathway. In the control arm investigating trastuzumab alone, no significant variations of the level of expression of phosphoproteins was demonstrated, raising the hypothesis of the implementation of a predominant immunological mechanism of action for Trastuzumab. The third study that compared effect of trastuzumab in vitro and in clinical setting confirms that trastuzumab has different modes of action when evaluated in cells and in clinical conditions. As a whole, this work showed that determining the mutation status of PIK3CA and the expression level of phosphoproteins could be useful to refine the molecular characterization of breast cancers and optimize the criteria used to personalize the prescription of targeted therapies

L'oncogène ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) est une tyrosine kinase constitutivement active, impliquée dans divers cancers, tels que les lymphomes anaplasiques à grandes cellules (LAGC), ou certains carcinomes bronchiques. Ces tumeurs sont traitées par chimiothérapie, ce qui n'est pas un traitement optimal (30% de rechutes, abaissement de la qualité de vie). Dans ce contexte, de nombreux inhibiteurs spécifiques de la tyrosine kinase ALK tels que le Crizotinib ont été développés et ont prouvé leur efficacité à la fois dans des modèles in vitro, in vivo ainsi que chez les patients. Néanmoins, le succès de cette thérapie ciblée est limité par l'apparition de résistances. Il est donc essentiel de mettre au jour de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de contrecarrer ces résistances. Récemment, l'autophagie, un processus catabolique intracellulaire de dégradation lysosomale, a été proposée comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des cancers résistants aux inhibiteurs de tyrosine kinase. Le premier objectif de mon projet de thèse a été de caractériser ce processus autophagique dans les LAGC ALK+, en réponse à différents traitements. Nous avons montré que (1) l'autophagie était activée dans des lignées de LAGC en réponse à l'inhibition de ALK, (2) que cette autophagie jouait un rôle cytoprotecteur dans ce modèle et (3) que les traitements par chimiothérapies de ces cellules n'induisaient pas de réponse autophagique. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à la régulation potentielle de l'autophagie par les microARNs. Nous avons montré que plusieurs microARNs, dont le miR-7, étaient sous-exprimés en réponse au traitement par le Crizotinib et que la réexpression ectopique de ce miR-7 permettait une potentialisation de l'effet du Crizotinib, par l'induction d'autophagie cytotoxique dans notre modèle. Nous avançons également l'hypothèse que le " switch " autophagique de la cytoprotection à la cytotoxicité, que nous observons pourrait s'expliquer par la régulation de l'expression de plusieurs protéines cibles de miR-7 telles que Bcl-2 ou c-Raf. Ainsi, l'ensemble de nos résultats nous permettent de mieux comprendre le rôle et la régulation de l'autophagie induite en réponse à l'inhibition de ALK dans les LAGC ALK+, et pourrait à terme contribuer à l'amélioration des thérapies actuelles de divers cancers dépendants de l'oncogène ALK. / The ALK oncogene (Anaplastic Lymphoma Kinase) is a constitutively activated tyrosine kinase implied in various cancers including Anaplastic Large Cell Lymphomas (ALCL), or some lung adenocarcinomas. The current operative treatment is standard chemotherapy, which is not optimal (30% of relapses, low quality of life). In this context, new specific ALK inhibitors such as Crizotinib have been developed, and have showed their efficiency in vitro, in vivo and in patients. However, the emergence of resistant mutations has been described. Thus, the identification of alternative therapies targeting new pathways appears as mandatory to counteract those resistances. In this context, autophagy, an intracellular catabolic lysosomal process, has been described as a new therapeutic target in the treatment of cancers resistant to tyrosine kinase inhibitors. The first aim of my project was to characterize the autophagic process in ALK+ ALCL, upon different treatments. We showed that (1) autophagy was activated in ALK+ ALCL cell lines in response to ALK inhibition (2) that this autophagy played a cytoprotective role in our model and (3) that treatment with chemotherapies did not trigger an autophagic response. In a second part of the project, we focused on the potential regulation of autophagy by microRNAs. We showed that several microRNAs including miR-7 were down-regulated upon Crizotinib treatment and that ectopic re-expression of this miR-7 potentiates the effects of Crizotinib by induction of cytotoxic autophagy in our model. We hypothesized that this switch in the role of autophagy from cytoprotection to cytotoxicity observed in our model, could be explained by the regulation of several protein targets of miR-7 such as Bcl-2 or c-Raf. Altogether, these results enable a better understanding of the role and regulation of autophagy induced upon ALK inhibition in ALCL, and could in the longer term, contribute to improvement of current therapies of cancers involving the ALK oncogene.

Les biomarqueurs sanguins peuvent être utilisés pour définir le pronostic des patients ou permettre de déterminer les altérations moléculaires des cancers, et peut-être pouvoir guider les traitements de thérapies ciblées.Les cellules tumorales circulantes sont le reflet de la cascade métastatique et de la progression tumorale. La détection et la caractérisation des CTC est un domaine clé de la recherche dans le cancer. Cependant, il n’existe pas de méthode standard pour la détection des CTC, et le premier objectif de notre étude a été de comparer deux systèmes de détection des CTC basé sur l’expression de l’antigène EpCAM (CellSearch), ou la taille des cellules (ISET). Nos résultats montrent qu’il existe une bonne corrélation pour la détection des CTC dans les cancers du sein ou de la prostate, mais pas dans les cancers bronchiques. Ces résultats suggèrent qu’il est nécessaire de développer d’autres techniques de détection des CTC pour l’énumération et la caractérisation pour permettre une médecine de précision.A ce jour il n’existe aucun marqueur validé pour prédire l’efficacité des antiangiogéniques. Les CEC et CEP sont des marqueurs prometteurs. Dans notre étude, nous avons fait l’hypothèse que les CEC et les CEP pouvaient être pronostic de la survie des patients inclus dans les études de phases précoces. Nos résultats montrent qu’un taux élevé de CEP est associé à un mauvais pronostic, et que les CEP pourraient permettre de mieux sélectionner les patients. En conclusion, les marqueurs sanguins comme les CTC, les CEC ou les CEP peuvent être utilisés comme des facteurs pronostiques ou permettre une caractérisation moléculaire, et être une partie intégrante des programmes de médecine de précision. / Non-inasive biomarkers detected in the blood could be use for risk) stratification or molecular classification in advanced cancer patients, and could be a guide for molecular targeted therapies. Circulating tumor cells reflect the metastatic cascade and the cancer progression. The detection and molecular characterization of circulating tumor cells (CTCs) are a key area of translational cancer research. However, there is no universal method to detect CTC, and the primary objective of our study was to compare CTC detection systems based on the expression of the EpCAM antigen (CellSearch assay) or on cell size (ISET assay). Our results showed concordant results in CTC detection in breast and prosatet cancer patients, but not in lung cancer patients. These results suggest that we need to develop other CTC-detection techniques CTC for enumeration and characterization in order to to contribute to guiding specific targeted.To date, no biomarker has been validated for the prediction of efficacy of antiangiogenic agents in patients with advanced cancer. CEC and CEP counts have recently emerged as a potential candidate. In our study, we hypothesised that CEC and CEP are prognostic in patients enrolled in phase I. Our results showed that High CEP levels are associated with poor prognostics and could provide a new tool for patient selection in early anticancer drug trials.In conclusion, non invasive biomarkers such as CTC or CEC, CEP detectable in the blood could be used in the clinic as prognostic factors or surrogates for traditional tumor biopsies, and be a major component of precision medicine.

Le carcinome à cellules rénales (CCR) se caractérise par une résistance importante aux thérapies. Notre hypothèse était que des voies signalétiques prolifératives, anti-apoptotiques et/ou angiogéniques sont mises en jeu dans la résistance aux thérapies. Il s’agissait de mesurer la sensibilité de lignées cellulaires de CCR humain à différentes classes thérapeutiques in vitro et in vivo. Une étude pilote a été réalisée sur la base de xénogreffes de la lignée A498 chez la souris nude, puis exploitée pour des analyses sur biopuces à protéines afin d’identifier les voies de signalisation induites par le sunitinib. In vitro, les lignées cellulaires de CCR se sont révélées sensibles aux thérapies indépendamment du statut VHL. In vivo, la lignée A498 est apparue résistante au sunitinib. L’approche par biopuces a montré que plusieurs protéines de l’angiogenèse sont modulées sous l'effet du traitement, notamment l’angiogénine. Il n’y a pas de modification de l’expression des protéines de l’apoptose testées. Les formes phosphorylées d’Akt sont également augmentées dans les tumeurs traitées, de même que Lim1 alors que la forme phosphorylée de NFκB est diminuée. Ce travail a ainsi identifié de potentielles cibles impliquées dans les mécanismes de résistance et devraient permettre de définir de nouvelles options thérapeutiques dans le cancer du rein. / The renal cell carcinoma is characterized by a high resistance to therapies. Our working hypothesis was that proliferative signaling pathways, anti-apoptotic and / or angiogenic are involved in resistance to therapies. Thus, as part of this thesis, we measured the sensitivity to chemotherapy and targeted therapies in kidney cancer cell lines in vitro as well in vivo.A pilot study was conducted on the basis of the A498 cell line xenografts in nude mice, and then used for analysis on proteome arrays to identify the signaling pathways induced by sunitinib. In vitro, the cell lines of RCC were sensitive to therapy regardless of the VHL status. In vivo, the line A498 appeared resistant to sunitinib. The approach using the proteome array has shown that several angiogenesis proteins are modulated as a result of treatment, including angiogenin. There was no change in the expression of proteins of apoptosis. Phosphorylated forms of Akt were also increased in the treated tumors, as well as Lim1 whereas the phosphorylated form of NFkB was reduced. This work has identified potential targets involved in resistance mechanisms and should define new therapeutic options in renal cancer.

La mise en évidence de cellules initiatrices de cancer dans les glioblastomes et l'existence de cellules souches cancéreuses (CSCs) étayent la présomption que l'échec des stratégies anti-tumorales classiques puisse être attribué à un problème de cible cellulaire. Dans le contexte des thérapies ciblées, l'émergence des nanomédecines offre des perspectives pour la délivrance de principes actifs vers les CSCs ou leur microenvironnement (ou niche) en vue d'une meilleure efficacité, spécificité et sécurité biologique. Douées d'autorenouvellement et capables de générer des clones néoplasiques radio et chimiorésistants, les CSCs n'ont toutefois pas de marqueur exclusifs connus sinon des marqueurs associés permettant d'enrichir ces populations et de potentiellement établir un ciblage notamment locorégional au sein de ces tumeurs. En nous focalisant sur l'épitope AC133, marqueur de CSCs associé à des glycosylations de la protéine CD133 ou prominine-1, l'objectif de cette thèse a été: i) de comprendre la situation biologique traduite par l'expression d'AC133 (témoin d'initiation de tumeurs, d'agressivité tumorale ou d'hypoxie) ii) de développer une nanomédecine reconnaissant l'épitope AC133, iii) de déterminer, au regard de sa distribution au niveau de protrusions membranaires, le rôle fonctionnel de CD133/AC133. A partir de modèles in vitro et in vivo de glioblatomes humains implantés dans le cerveau de souris immunodéprimées (SCID), nos résultats établissent qu'AC133 est un témoin de non exposition chronique à une pression partielle élevée en oxygène (21% O2 versus 3% O2). Dans ce contexte la stratégie shRNA knockdown démontre que HIF-1α est un des régulateurs de l'expression d'AC133. L'absence d'AC133 à 21% O2 au sein de populations non triées de cellules de glioblastomes n'est pas reliée à l'initiation de tumeur mais en revanche associée à une perte d'agressivité tumorale. La cible AC133 a donc été choisie pour développer des nanocapsules lipidiques (NCLs) capables de reconnaitre des CSCs. A l'aide d'un polymère bifonctionnel, le DSPE-PEG2000-maleimide et de l'anticorps monoclonal AC133, une lipo-immunoglobuline (DSPE-PEG2000-maleimide- AC133), a été synthétisée puis post-insérée dans des NCLs permettant l'obtention d'immuno-NCLs. Ces nano-objets ont démontré leur fonctionnalité par leur spécificité de liaison à des cellules Caco-2 exprimant constitutivement AC133. Enfin, dans une dernière étude focalisée sur le rôle de AC133/CD133 dans l'endocytose, nous démontrons par siRNA knockdown sur des cellules Caco-2 que AC133/CD133 inhibe l'internalisation cellulaire de transferrine et de NCLs. De manière intéressante, l'augmentation de la concentration extracellulaire en fer, connue pour diminuer l'expression du récepteur de la transferrine, régule également négativement celle d'AC133, indiquant un rôle d'AC133/CD133 dans l'endocytose et dans le métaboslime du fer. L'ensemble de ce travail de thèse a donc permis de développer de nouveaux nano-outils et de mieux appréhender leur utilité pour l'application de nanomédicines visant à éliminer et/ou modifier leur comportement de CSCs AC133 positives.