Neste trabalho foi estudado o potencial imunorregulador da crotoxina (CTX) obtida do veneno de C. d. terrificus, em modelo experimental de colite induzida pelo TNBS em camundongos. A CTX foi capaz de diminuir a perda de peso, o score clínico e histológico, síntese de MPO e citocinas pró-inflamatórias. Menor número de neutrófilos e macrófagos com fenótipos M1 e M2 na lâmina própria foi observado nos grupos TNBS/CTX em relação ao TNBS. A CTX induziu TGF-b e IL-10, PGE2 e LXA4. A neutralização in vivo dessas citocinas ou o bloqueio da síntese desses eicosanoides indica que estas moléculas exercem papel relevante na ação moduladora da CTX no quadro inflamatório. As análises das diferentes populações celulares da lâmina própria, linfonodos e Placas de Peyer mostraram que não houve diferença nos linfócitos CD4+Tbet+ entre os grupos TNBS e TNBS/CTX. No entanto, a CTX promoveu aumento de CD4+FoxP3+ e diminuição de CD4+RORg+. Estes resultados indicam que a CTX é capaz de modular a resposta inflamatória aguda intestinal melhorando o quadro clinico observado nos animais. / In this work it was analyzed the immunomodulatory effect of crotoxin (CTX) isolated from C.d. terrificus snake venom, on the experimental model of colitis induced by TNBS in mice. The CTX was able to inhibit the weight loss, clinical and histological score, MPO synthesis and pro-inflammatory cytokines. Lower number of neutrophils and macrophage (M1 and M2) in lamina propria was observed in TNBS/CTX mice compared with the TNBS group. In contrast, the CTX induced increased TGF-b, IL-10, PGE2 and LXA4. The in vivo neutralization of these cytokines or eicosanoids synthesis indicates that these molecules exert significant role in the modulatory effect of CTX. The analyzes of distinct cell populations from lamina propria, lymph nodes and Peyers pathes showed no difference in CD4+Tbet+ between TNBS or TNBS/CTX mice. However, CTX induced an increase of CD4+FoxP3+ and decreased CD4+RORgt+. Together, these results indicate that CTX is able to modulate intestinal acute inflammatory response induced by TNBS improving the clinical status of the mice.

IL-1 is a pro-inflammatory cytokine which play an important role in the activation and regulation of host defence and immune responses to inflammation or injury. IL-1 is able to bind and activate IL1-RI and IL1-RII, which are found on many cells types. The role of the IL-1 signalling in the deployment of Th cell subsets, especially Th17 cells is well known. However, the specific cells which are responsible for the expression of IL-1 signalling in the immune defense and in the development of the Th cell lineage in response to infection, is still largely unclear. Therefore in this thesis, IL1-RI conditional knockout mice specifically in hematopoietic cells (IL1-RI vaviCre+) were generated. Using IL1-RI vaviCre+ mice in comparison with IL1-RI global knockout mice (IL1-RI-/-) would determine whether the expression IL-1 signalling from hematopoietic cells is responsible for the immune defense and in the development of the Th1, Th2 and Th17 cells against gastrointestinal helminth Trichuris muris (T.muris) infections. The generation of IL1-RI vaviCre+ mice have been investigated at the genomic and proteomic level in order to confirm that the Il1-rI gene is inactivated in hematopoietic cells. The characterisation of IL1-RI vaviCre + mice at the genomic level confirmed that the Il1-rI gene was obliterated successfully. At protein level the characterisation of IL1- RI vaviCre + mice confirmed that IL1-RI was dysfunctional in hematopoietic cells. Additionally, the development of the immune cells was investigated in IL1-RI vaviCre + and IL1-RI-/- mice. Our findings demonstrated that the lymphocyte development was not affected by the deletion of the IL1- RI gene. This data indicated that IL1- RI vaviCre + and IL1-RI-/- mice are vital in vivo models. In high dose infection, both IL1-RI vaviCre + and IL1-RI -/- mice were able to clear the infections due to their ability to generate a Th2 response. Both IL1-RI vaviCre + and IL1-RI -/- mice infected with low dose of T.muris were susceptible to infections and showed high levels of Th1 cytokines. Thus, we hypothesised that IL1-RI signalling in hematopoietic cells was not required for worm expulsion and the generation of Th2 and Th1 response. Interestingly, low dose T.muris infection showed a clear reduction in the Th17 cytokines IL22 and IL17 in both IL1-RI vaviCre + and IL1-RI -/- mice, suggesting that IL-1 signalling expressed from hematopoietic cells is responsible for the development of Th17 cells and secretion of IL17 and IL22. IL1- RI vaviCre + and IL1-RI -/- mice infected with low dose of T.muris also showed an increase in inflammation in the colon and decreased of goblet cell hyperplasia. It is well known that IL22 plays an important role in preventing tissue damage and repair. Thus, in this study IL22 global knockout mice (IL22 -/-) were used to determine if the change in crypt lengths and goblet cell hyperplasia in IL1-RI vaviCre + and IL1-RI -/- was due to an absence of IL22. Our finding showed that IL22 -/- mice infected with low dose of T.muris had increased crypt length and a reduction in goblet cells. The similar phenotype in crypt length and goblet cell hyperplasia between IL22 -/-, IL1-RI vaviCre + and IL1-RI -/- mice suggested that a lack of IL22 in IL1-RI vaviCre + and IL1-RI -/- mice is responsible for the change in mice phenotype. It also provides more evidence for the role of IL-1 signaling in hematopoietic cells in the generation of Th17 cells and in the production of its cytokine IL22.IL1-RII is an inhibitor of IL1-RI, thus, in this study IL1-RII global knockout mice (IL1-RII -/-) mice was used in comparison with IL1-RI -/- mice to verify the role of IL-1 signaling in the development of Th17 cells. Our finding showed an overexpression of IL17 and IL22 in IL1-RII -/- compared with IL1-RI -/- mice and a higher level of IL17 in IL1-RII -/- mice compared with IL1-RII flox/flox mice. This data confirmed that IL-1 signaling is important for the development of Th17 cells and the production of its cytokine IL17 and IL22.

La maladie de Crohn (Crohn’s disease; CD) et la colite ulcéreuse (Ulcerative colitis ;CU) représentent deux formes distinctes de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), qui sont associées à une réponse immunitaire aberrante des tissus intestinaux à la flore intestinale. Les phagocytes mononucléés (MNPs) qui dialoguent, via les cytokines qu'ils produisent, avec les cellules immunitaires innées et adaptatives sont impliqués dans l’induction, la perpétuation et le maintien de la réponse inflammatoire des MICI. Chez la souris, les MNPs sont stratifiées en cellules dendritiques conventionnelles (cDCs), macrophages (M) et cellules dérivées de monocytes, une entité qui regroupe dans le tissu des cellules dendritiques dérivées de monocytes (Mo-DC), des M dérivés de monocytes et des « monocyte-like ». Toutefois, la diversité phénotypique, moléculaire et fonctionnelle des monocytes et des MNPs ainsi que la plasticité des monocytes restent à élucider dans les MICI. Les anticorps bloquant les cytokines IL12 et IL23 contrôlent la pathogénicité et la plasticité des cellules Th17, réduisant l'inflammation intestinale chez les patients atteints de MII. Cependant, il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. L’étude approfondie de la plasticité des cellules T et du site tissulaire où elle pourrait se produire ne sont toujours pas clarifiés. Dans le premier chapitre, nous avons révélé l’existence de deux sous-populations distinctes de CD14+MNPs dans le colon de patients atteints de CU. Les cellules de type « inflammatory monocyte-like » CD14+CD163-CD64+ (P3) à l’opposé des CD14+CD163+CD64+ M (P4) s'accumulent dans le côlon inflammatoire. Nos résultats ont de plus établi un lien entre les P3 MNPs, l’IL12, l’IL1β et la détection de cellules Th17 mémoires produisant de l'IFN et de l'IL8, qui contribueraient collectivement à la pathogenèse de la CU. De plus, deux sous-populations CD14+ MNPs similaires sur le plan fonctionnel et moléculaire a ceux trouvés en CU, ont été détectées dans le côlon de patients atteints de CD. En revanche, dans le deuxième chapitre, nous fournissons des évidences que la sous-population monocytaire Slan+ pourrait contribuer à l’immunopathogenèse de la CD, mais pas à celle de la CU. La fréquence, le phénotype et la fonction des cellules Slan+ ont été examinés dans le sang, les ganglions mésentériques (MLN) et le côlon de patients atteints de MICI. Nous proposons que les cellules pro-inflammatoires CD14hiCD172α+Slan+ discriminent les tissus de CD et CU. En effet, elles ne s'accumulent que dans les MLNs et la muqueuse colique des patients atteints de CD. Dans le troisième chapitre, nous avons montré que les MLNs de CD et de CU, qui sont des tissus difficiles d'accès pour leur étude fonctionnelle en recherche, peuvent également être distingués par la distribution et le profil moléculaire des cellules T mémoire effectrices CXCR3-CCR6+ (Th17TEM). Nos données suggèrent également que la plasticité de Th17 se produit dans les MLNs avant leur migration vers l'intestin. Cette étude pourrait avoir des implications pour améliorer notre compréhension de la maladie. Enfin, il a été démontré qu’à l’homéostasie chez la souris, les monocytes sont continuellement recrutés dans la muqueuse intestinale où ils se différencient progressivement en M anti-inflammatoires. Ce processus de maturation est interrompu dans le contexte d'une inflammation. Les signaux environnementaux qui régulent la « cascade » de maturation d’un monocyte classique tissulaire demeurent inconnus chez l'homme. Dans le quatrième chapitre, nous avons récapitulé in vitro la cascade de différenciation des monocytes humains de «CD163- P3-like» en «CD163+P4-like» et avons montré leurs similitudes moléculaires avec les CD14+ MNP tissulaires. La manipulation de cette voie de différentiation pourrait ouvrir des pistes thérapeutiques pour restaurer l'homéostasie intestinale dans les MICI. En conclusion, une meilleure compréhension des sous-populations de MNPs, leurs fonction et plasticité dans la pathogenèse des MICI aidera à identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et contribuera à augmenter les connaissances pour la mise au point de traitements personnalisés. / Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC), the two forms of inflammatory bowel diseases (IBD), are associated with dysregulated immune response in the intestinal tissue. It is mediated by mononuclear phagocytes (MNPs) that dialogue via the cytokine they produce with innate and adaptive immune cells. In mice, MNPs are stratified into conventional dendritic cells (DCs), macrophages (M) and monocyte-derived cells that regroup tissue monocyte-derived DCs, monocyte-derived M and monocytes-like cells. However, the phenotypic, molecular and functional diversity of MNPs and their plasticity remain to be elucidated in IBD patients. Therapies in IBD employ antibodies that block IL12 and IL23, thus control Th17 pathogenicity and plasticity and decrease intestinal inflammation. However, no cure exist nowadays for the treatment of IBD. In-depth study of T cell plasticity and the tissue where it occurs remain to be investigated. In the first chapter, we revealed the existence of two distinct CD14+ MNP subsets in colon of UC patients. Only, CD163-CD64+ inflammatory monocyte-like cells (P3) but not anti-inflammatory CD163+CD64+ M (P4) accumulate in inflamed UC colon. Our findings further established a link between monocyte-like CD14hiCD172α+ CD163- MNPs, IL12, IL1β and the detection of colonic memory Th17 cells that produce IFN and IL8, which might all contribute to UC pathogenesis. Two CD14+ MNP subsets, resembling their counterparts in UC mucosa at the functional and molecular level, were also detected in CD colon. In contrast, in the second chapter, we provide evidence that Slan+ monocyte subset may contribute to CD but not UC immunopathogenesis. Frequency, phenotype, and function of Slan+ cells were examined in blood, colon, and mesenteric lymph nodes (MLN) of patients with IBD. We showed that pro-inflammatory CD14hiCD172α+Slan+ cells are a distinguishing feature between CD and UC, as they only accumulate in MLNs and colonic mucosa of CD patients. In the third chapter, we showed that MLNs of CD and UC, tissues that were hard to access for research use, can also be distinguished by frequencies of CXCR3−CCR6+ Th17 effector memory T cells (TEM) and their molecular profile. Our data further suggested that Th17 plasticity is taking place in MLN, before T cell homing to gut tissues. This investigation has clear implications in furthering our understanding of the disease. Finally, it has been demonstrated that monocytes are continuously recruited into murine gut mucosa and progressively differentiate into macrophages under homeostatic conditions, a maturation process interrupted in the context of inflammation. However, the environmental cues that regulate tissue inflammatory monocyte “waterfall” remain to be investigated in humans. In the fourth chapter we recapitulated in vitro human monocyte differentiation cascade, from CD163- inflammatory monocyte-like cells (P3) towards anti-inflammatory CD163+ macrophages (P4) and showed their molecular similarities to tissue CD14+ MNPs. Manipulating this pathway might open therapeutic avenues to restore tissue homeostasis. In conclusion, a better understanding of MNP subsets, function and plasticity in IBD pathogenesis would help identify novel therapeutic targets and shed light for the development of personalized treatments.

Die Myasthenia Gravis (MG) ist ein Prototyp einer Antikörper-vermittelte Autoimmunerkrankung. Die Autoantikörper richten sich hauptsächlich gegen den Acetylcholinrezeptor (AChR). Welche Bedeutung TH17-Zellen für die Pathogenese der MG haben, konnte bisher noch nie direkt gezeigt werden. Mithilfe des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG) sollte die Rolle der TH17-Zellen im Rahmen dieser Arbeit analysiert werden. Eine signifikante Anzahl tAChR-spezifischer CD4+ T-Zellen, die IL17 exprimieren, konnte nach der Immunisierung mit torpedo AChR in CFA in Wildtyp-Mäusen (WT) beobachtet werden. Die IL17ko Mäuse entwickelten weniger oder keine EAMG Symptome, obwohl weder die Frequenz tAChR-spezifischer CD4+ T-Zellen, die IL2, IFNgamma oder IL21 sezernierten noch der prozentuale Anteil der FoxP3+ Treg-Zellen einen Unterschied aufwiesen. Im Gegensatz dazu waren die Level pathogener anti-muriner AChR Antikörper statistisch geringer in IL17ko Mäusen, während bei anti-tAChR Antikörpertitern kein Unterschied festzustellen war. Ähnliche Resultate erbrachten TCRbeta/delta ko Mäuse rekonstituiert mit entweder WT oder IL17ko CD4+ T-Zellen. Die Depletion von Treg-Zellen mithilfe von DEREG Mäusen in der frühen Erkrankungsphase zeigte keine signifikanten Unterschiede bezüglich der analysierten Parameter. Zusammenfassend lässt sich hier festhalten, dass die Frequenz und Differenzierung Antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen sowie der Antikörpertiter gegen den tAChR nicht durch die IL17-Defizienz im EAMG Modell beeinflusst wird. Auch hat eine frühe Treg-Zell-Depletion keinen Einfluß auf die Erkrankungsstärke. Allerdings scheint das Durchbrechen der B-Zell Toleranz, das zur Produktion von pathogenen Anti-mAChR-spezifischen Antikörpern und somit zu einer Induktion der Erkrankung führt, abhängig von IL17-produzierenden CD4+ T-Zellen zu sein. Der Einsatz von Anti-IL17-Antikörpern könnte insofern auch für die MG eine Therapieoption darstellen. / Myasthenia gravis (MG) is an antibody-mediated autoimmune disease. The autoantibodies are directed against the acetylcholine receptor (AChR). The importance TH17 cells have for MG pathogenesis has never been directly demonstrated. Therefore, the analysis of TH17 cells in the Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis (EAMG) animal model was the aim of this work. Here, it is shown that in wildtype mice (WT) significant numbers of IL17-producing tAChR-specific CD4+ T cells could be observed after immunization with torpedo AChR in CFA. IL17ko mice developed less or no EAMG symptoms, although frequencies of tAChR-specific CD4+T cells secreting IL2, IFNgamma or IL21 as well as percentage of FoxP3+ Treg cells were similar. In contrast, pathogenic anti-murine AChR antibody levels were significantly lower in IL17ko mice, while anti-tAChR antibody levels were equal. Similar results were obtained by the reconstitution of TCR beta/delta ko mice with CD4+ T cells of either WT or IL17ko origin. For the depletion of Treg cells using DEREG mice in the initial phase of the disease no significant differences could be detected in terms of the analyzed parameters. In summary, this thesis demonstrates, that frequencies and differentiation of antigen specific CD4+ T cells as well as the level of anti-tAChR specific antibody titers are not affected by IL17-deficiency in the EAMG model. Likewise, an early Treg cell depletion seems to have no impact on disease severity. However, breaking of B cell tolerance resulting in pathogenic anti-murine AChR specific antibodies and subsequent disease induction, seems to be dependent on IL17 producing CD4+ T cells. In this respect, the application of anti-IL17 antibodies could also become a MG therapy option.

Les thérapies anticancéreuses ont apporté un gain largement reconnu en matière de réduction de la charge tumorale, de survie des patients et d’amélioration de leur qualité de vie, dans un certain nombre de cancers. Hélas, ces thérapies exercent un effet immunosuppresseur en détruisant les effecteurs ou en bloquant l’activité de certains facteurs biologiques impliqués dans le recrutement des acteurs du système immunitaire. D’autre part, plusieurs travaux ont permis de démontrer que ces traitements pouvaient avoir un effet contraire en générant ou en favorisant l’induction d’une réponse immunitaire anti-tumorale, soit par effet direct sur le recrutement et l’activation des effecteurs de l’immunité, soit en potentialisant les interactions cellulaires par des mécanismes biologiques. Ces derniers faisant intervenir les cytokines, la stimulation des TLR, l’augmentation des interactions entre cellules du SI; ce qui permet de passer d’une anergie immunologique vers un véritable système d’éradication des cellules cancéreuses.Dans notre laboratoire, nous avons essayé d’évaluer l’implication du système immunitaire dans la réponse thérapeutique induite par des agents cytotoxiques conventionnels. Ici, nous décrivons les effets d’un inhibiteur de cyclines kinases multi-cibles « CDKi PHA-793 887 » testé dans un essai de phase I mené sur deux sites en Europe. C’est le constat inattendu que 6 des 15 patients, traités par ce médicament (PHA-793887) ont développé de graves infections bactériennes et virales et que 6 d’entre eux ont présenté la réactivation du virus de l’herpès qui nous a conduit à étudier ces effets sur le système immunitaire et en particulier sur le dialogue entre cellules dendritiques (CD) et cellules natural killer (NK). Ce travail met en évidence que ce médicament inhibe le signalling des récepteurs toll-like (TLR) réduisant par conséquent l’interaction CD/NK in vitro. Enfin la stimulation des cellules des patients sous traitement démontre une réduction importante de ce signalling ex-vivo. Ainsi, cet effet immunosuppresseur inattendu a permis une réactivation virale chez 40% des patients. La deuxième partie de ce travail, concerne les effets du cyclophosphamide (CTX) utilisé à faible dose. L’injection d'une faible dose chez la souris ou d’un dosage métronomique chez l'homme, promeut la différenciation des cellules lymphocytaires vers Th17 (sécrétant de l’interleukine-17 (IL-17)) et Th1 (sécrétant de l’interféron-γ (IFN)). Ceux-ci ont été retrouvés dans le sang et dans des ascites carcinomateuses de patients. Ainsi, le CTX pourrait participer à la génération de réponses anti-tumorale via la différenciation Th 17 comme cela fut suggéré par de récentes études précliniques montrant l’existence d’une corrélation étroite entre le taux des lymphocytes Th17 infiltrant la tumeur et la destruction tumorale. / Cancer therapies have made a gain widespread recognition in the reduction of tumor burden, patient survival and improved quality of life in a number of cancers. Unfortunately, these therapies exert an immunosuppressive effect by killing effectors or blocking the activity of certain biological factors involved in recruiting of the immune system. On the other hand, several studies have shown that these treatments could have the opposite effect by generating or promoting the induction of antitumor immune response, either by direct effect on the recruitment and activation of effectors immunity, either by potentiating cellular interactions by biological mechanisms. The latter involving cytokines, TLR stimulation, increased interactions between cells of the IS; which toggles between immunological anergy to a real system to eradicate cancer cells. In our laboratory, we tried to evaluate the involvement of the immune system in the therapeutic response induced by conventional cytotoxic agents. Here, we describe the effects of an inhibitor of cyclin kinases multi-target "CDKIs PHA-793887" tested in a phase I trial conducted at two sites in Europe. This unexpected finding is that 6 of 15 patients treated with this drug (PHA-793887) developed severe bacterial and viral infections and six of them showed reactivation of the herpes virus that has led us to study these effects on the immune system and in particular on the dialogue between dendritic (DCs) and natural killer (NK) cells. This work shows that this drug inhibits the signaling of toll-like receptor (TLR) thereby reducing the interaction DC / NK in vitro. Finally, stimulation of the cells of treated patients demonstrated a significant reduction of this signaling ex vivo. Thus, this immunosuppressive effect has an unexpected viral reactivation in 40% of patients. The second part of this work concerns the effects of metronomic dose of cyclophosphamide (CTX). The injection of a low dose in mice or metronomic dosing in humans, markedly promotes the differentiation of CD4+ T helper 17 (Th17) cells that can be recovered in both blood and tumor beds. However, CTX does not convert regulatory T cells into Th17 cells and promotes cell differentiation into Th17 lymphocytes (secreting interleukin-17 (IL-17)) and Th1 (secreting interferon-γ (IFN)). These were found in blood and in ascites carcinoma patients. Thus, CTX may participate in the generation of antitumor responses through Th 17 differentiation as was suggested by recent preclinical studies showing the existence of a correlation between the rate of Th17 lymphocytes infiltrating the tumor and tumor destruction.

Le récepteur de mort CD95 participe à de nombreuses fonctions physiologiques en transmettant des signaux apoptotiques. Son ligand membranaire, CD95L, est principalement exprimé à la surface des lymphocytes et contrôle ainsi l’homéostasie cellulaire et l’élimination des cellules infectées ou transformées. Certaines situations pathologiques conduisent à une expression ectopique du CD95L par d’autres types cellulaires,associé à son clivage par des métalloprotéases (cl-CD95L). La forme soluble ainsi libérée perd sa capacité à transmettre l’apoptose mais déclenche l’activation de voies non-apoptotiques induisant l’inflammation dans des maladies inflammatoires chroniques comme le lupus érythémateux systémique (LES) ou encore les formes métastatiques du cancer du sein. Dans ces deux pathologies, de fortes quantités de cl-CD95L sont détectées dans le sérum de ces patients et ont été associés à la progression des pathologies. Dans le LES, nous établissons que cl-CD95L contribue au processus inflammatoireen favorisant la transmigration endothéliale des lymphocytes Th17. Cette migration cellulaire dépendante de CD95 nécessitele recrutement de la PLCγ1 sur le domaine juxta-membranaire de CD95 qui induitl’activation du signal calcique. Pour identifier d’autres partenaires moléculaires de CD95, une analyse protéomique a été réalisée et a permis d’identifier une association entre CD95 et la machinerie traductionnelle. Cette interaction nécessite le recrutement d’eIF4A1 au niveau du domaine juxta-membranaire de CD95. Nous avons par ailleurs montré que dans des lignées cancéreuses mammaires, eIF4A1 participe à la traduction de certaines protéines comme la sérine-thréonine kinase Akt pour faciliter l’activation de la voie de signalisation PI3K et la migration cellulaire induite par CD95. Cette étude a donc mis en évidence l’implication d’un nouveau domaine de CD95 dans l’induction des signaux non-apoptotiques. Ce domaine juxta-membranaire a été nommé CID pour « calcium inducing domain ». De plus, ce domaine fusionné à un peptide perméant provenant de la protéine TAT appelé TAT-CIDa montré son efficacité pour inhiber la migration lymphocytaire chez les souris lupiques et offre de nouvelles perspectives pour le développement de traitements améliorants les symptômes inflammatoires du LES. / The death ligand CD95L, mainly expressed by immune cells, contributes to the elimination ofinfected and transformed cells. In pathological contexts, CD95L can be expressed by others cell types such as endothelial cells.CD95L can be cleaved by metalloproteases to generate a soluble CD95L (cl-CD95L) failing to trigger the apoptotic signaling pathwaybutinducing non-pro-apoptotic signaling pathways. cl-CD95L promotes inflammation in chronic inflammatory disorders such as systemic lupus erythematosus (SLE) and increases risks of metastatic dissemination in breast cancer patients. In SLE patients, we established that high amounts of cl-CD95L fuels inflammation by promoting endothelial transmigration of activated Th17 cells. This CD95-drivencell migration requires PLCγ1 recruitment by CD95 and the subsequentimplementation of the calcium signal. To identify in an exhaustive fashion, all molecular partners of CD95, a global proteomic analysis was undertaken. This TAP-Tag approach highlighted a strong association between the translational machinery and CD95. This analysis was confirmed by a two-hybrid approach revealingthat the translation initiation factor eIF4A1 directly interactedwith CD95.In breast cancer cells, we established that eIF4A1 was instrumental in the translation of certain genes such as Akt contributing to the implementation of the CD95-mediated PI3K signaling pathway and cell migration. In this study, we identifiedthe CD95 domaininvolved in the induction of the non-apoptotic signaling pathway. This domain was named CID for “calcium inducing domain”.Moreover, wegenerated a therapeutic molecule consisting of theCID fused to the cationic cell-penetrating HIV TAT domain. TAT-CID prevented the accumulation of Th17 cells in inflamed organs of lupus-prone mice and could turn out to be an original therapeutic molecule to alleviate clinical symptoms in SLE patients.

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative causée par la destruction des neurones dopaminergiques. La cause sous-jacente de cette perte neuronale est inconnue. La maladie de Parkinson peut se développer tôt dans la vie (forme juvénile autour de 40 ans) ou sporadiquement (après l’âge de 60 ans).PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) et Parkin sont des gènes liés à la forme juvénile de la maladie de Parkinson. Ils influencent la réponse inflammatoire et la dysfonction mitochondriale. PINK1 et Parkin ont été impliqués dans la régulation négative de la présentation de protéines mitochondriales (MitAP). Ces protéines répriment la présentation de protéines mitochondriales sur les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) à la suite d’un stress. MitAP est dépendant de la formation de vésicules mitochondriales (MDVs). La formation des MDVs est dépendante des protéines de trafic telles que de Snx9, Rab9, et Rab7. La diminution des niveaux d’expression de ces protéines induit une inhibition de MitAP. L'instabilité mitochondriale augmente également la fuite d'ADN mitochondrial dans le cytosol (à travers un mécanisme inconnu), ce qui entraîne l'activation du capteur d'ADN cytosolique tel que cGAS / STING. L’implication de MitAP dans l’auto-immunité a été démontrée. En effet, les souris PINK1 KO infectées par une bactérie intestinale Gram négatif, développe des lymphocytes T autoréactifs spécifiques aux antigènes mitochondriaux et des symptômes de type Parkinson. Des données récentes ont par ailleurs appuyé cette hypothèse en démontrant la présence de lymphocytes T autoréactifs spécifiques de l’alpha-synucléine, une protéine dont le dysfonctionnement est fortement associé à la maladie. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que les patients qui souffrent de la maladie de Parkinson ont un niveau plus élevé de MitAP. L’augmentation de MitAP, notamment au niveau des cellules présentatrices d’antigènes (CPA), entraînerait une autoréactivité mitochondriale et aussi une dérégulation inflammatoire causée par une augmentation de la production de MDVs. Cette production accrue de MDV entraînerait une augmentation des fuites d'ADN mitochondrial détecté par la voie cGAS/STING et induirait l’augmentation de la production de cytokines pro-inflammatoires impliquées dans la polarisation des lymphocytes T vers un phénotype auto-immun. Ici, nous montrons que les patients possèdent dans le sang, des lymphocytes T autoréactifs spécifiques aux antigènes mitochondriaux et que ces cellules expriment spécifiquement l’IL-17 (un marqueur des lymphocytes Th17 et Tc17, des types de lymphocytes qui est sont fortement liés aux maladies auto-immunes). Par ailleurs, nous montrons qu’en absence de PINK1, le traitement par endotoxine bactérienne (LPS) ou par la bactérie EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli) des CPA a comme conséquence une surproduction d’un ensemble de cytokines pro-inflammatoires. Ces cytokines (IL-6, IL-23 et IL-1β) sont impliquées dans la polarisation des cellules Th17. Nous démontrons également que les CPA PINK1 KO traitées par le LPS induisent une polarisation biaisée des lymphocytes T vers un phénotype Th17. Nous démontrons également, dans une lignée de CPA déficientes pour des gènes associés à la biogenèse des MDVs, des niveaux d’expression réduits de cytokines pro-inflammatoires après infection par l’EPEC ou traitement avec le LPS. Ces données soulignent l’importance de la voie MitAP dans la pathophysiologie de la maladie Parkinson à travers la régulation de l’auto-immunité et de l’inflammation. / Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disease caused by the destruction of dopamine neurons, yet, the underlying cause of this neuronal loss is still unknown. Parkinson's disease can be juvenile or early onset (before age 40) and sporadically (after the age of 60). PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1) and Parkin are genes implicated in the juvenile form of PD that have also been shown to influence inflammatory responses and mitochondrial dysfunction. PINK1 and Parkin negatively regulate mitochondrial antigen presentation (MitAP). These proteins suppress the presentation of mitochondrial proteins on Major Histocompatibility Complex (MHC) Class I following stress. MitAP is dependent on the formation of mitochondrial vesicles (MDVs). These MDVs utilize traffic proteins such as Snx9, Rab9, and Rab7. Decreased levels of expression of any of these proteins inhibit MitAP. Mitochondrial instability also increases mitochondrial DNA leakage into the cytosol (through and unknown mechanism) resulting in activation of cytosolic DNA sensors like cGAS/STING. MitAP's implication in autoimmunity has been demonstrated in PINK1 KO mice infected with gram-negative intestinal bacteria resulting in auto-reactive T-cells specific to mitochondrial antigens and Parkinson's-like symptoms. In PD patients, auto-reactive T cells specific for alpha-synuclein, a protein whose dysfunction is associated with PD, have been found, suggesting that auto-reactive T-cells are present in PD. Thus, we hypothesized that PD patients would have increased levels of MitAP in antigen presenting cells (APCs) resulting in mitochondrial self-responsiveness as well as an inflammatory deregulation. This increased production of MDVs would result in an increase mtDNA leakage and ultimately be detected by the cGAS/STING pathway inducing the production of proinflammatory cytokines. Ultimately, these proinflammatory cytokines would induce the polarization of T-cells towards an autoimmune phenotype (Th17). Here, we show that APCs deficient in genes associated with MDVs biogenesis have reduced expression levels of pro-inflammatory cytokines after infection with Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) or the bacterial endotoxin LPS. We determine that in the absence of STING there is a strong inhibition of MitAP and cytokine expression in raw 264.7 macrophages after LPS treatment. Furthermore, we validate that in the absence of PINK1, LPS or EPEC treated BMDCs overproduce a set of pro-inflammatory cytokines (IL-6, IL-23 and IL-1β) that induce a biased polarization of T-cells to a Th17 phenotype. Finally, we observed mitochondrial antigen specific T-cells expressing IL-17 (a marker of Th17 and Tc17 lymphocytes, the types of lymphocytes that are strongly related to autoimmune diseases) in PD patients. This data highlights the importance of the MitAP pathway in the pathophysiology of Parkinson's disease through the regulation of autoimmunity and inflammation.

Type 1 diabetes mellitus (T1D) is an organ-specific autoimmune disease characterised by autoimmune destruction of insulin-producing beta cells in the islets of Langerhans. It is a long-term process initiated months or even years prior to the clinical onset. The main role in the pathogenesis is played by T lymphocytes but other cell types are involved as well. The presence of autoantibodies in the circulation is typical even before the disease onset. Nowadays, intensive research is focused on finding individuals at risk and developing an effective prevention. During my postgraduate studies I was involved mainly in the research of T1D prediction and prevention. We investigated the relationship of established autoimmune markers - autoantibodies - and the cellular reactivity to GAD65 and IA2 autoantigens. We discovered that the reaction to autoantigens is very individual and it is influenced by the patient's autoantibody profile. These results could be relevant in planning antigen-specific immunointervention studies and improving their efficacy. We also made an attempt to improve specificity and sensitivity of a beta cell destruction marker (specifically demethylated DNA), which would enable better understanding of the beta cell decline and identification of individuals at risk of T1D development. In...

T lymphocytes are distinguished by the expression of αβ TCR or γδ TCR on their cell surface. The kinetic differences in the effector functions classifies γδ T cells as innate-like lymphocytes and αβ T cells as adaptive lymphocytes. Although distinct, αβ and γδ T cell lineages produce a common array of cytokines to mount an effective immune response against a pathogen. The production of cytokine IL-17 is a shared characteristic between the γδ T (Tγδ17) cells and the CD4 T (Th17) cells. γδ T cells develop into Tγδ17 cells in the thymus whereas CD4 T cells differentiate into Th17 cells in response to antigens in the peripheral lymphoid tissues. γδ T cells exported from the thymus, as pre-made effectors, are the early IL-17 producers compared with the late IL-17 producing Th17 cells. In this thesis we describe how TGFβ-SMAD2 dependent pathway selectively regulates Th17 cell differentiation but not Tγδ17 cells generation. We further illustrate the requirement of WNT-HMG box transcription factor (TF) signaling for the thymic programming of Tγδ17 cells. Cytokine TGFβ in co-operation with IL-6 induces the differentiation of Th17 cells. Conversely, TGFβ signaling also regulates the differentiation and maintenance of CD4+FOXP3+ regulatory T cells. The mechanism by which TGFβ signals synergize with IL-6 to generate inflammatory versus immunosuppressive T cell subsets is unclear. TGFβ signaling activates receptor SMADs, SMAD2 and SMAD3, which associate with a variety of nuclear factors to regulate gene transcription. Defining relative contributions of distinct SMAD molecules for CD4 T cell differentiation is critical for mapping the versatile intracellular TGFβ signaling pathways that tailor TGFβ activities to the state of host interaction with pathogens. We show here that SMAD2 is essential for Th17 cell differentiation and that it acts in part by modulating the expression of IL-6R on T cells. While mice lacking SMAD2 specifically in T cells do not develop spontaneous lymphoproliferative autoimmunity, Smad2-/- T cells are impaired in their response to TGFβ in vitro and in vivo and they are more pathogenic than controls when transferred into lymphopenic mice. These results demonstrate that SMAD2 is essential for TGFβ signaling in CD4+ T effector cell differentiation and that it possesses functional capabilities distinct from SMAD3. Although SMAD2 is essential for the differentiation of Th17 cells, TGFβ signaling via SMAD2 is not required for the thymic programming of innate Tγδ17 cells. Among different γδ T cells, Vγ2+ (V2) γδ T cells are the major IL-17 producing subsets. We demonstrate that Sry-high mobility group (HMG) box TFs regulate the development of V2 Tγδ17 cells. We show that the HMG box TF, SOX13 functions in a positive loop for the intrathymic generation of V2 Tγδ17 cells. SOX13 regulates the programming of Tγδ17 cells by controlling the expression of B-lymphoid kinase (BLK) in developing immature V2 γδ T cells. BLK is an Src-family kinase expressed by all Tγδ17 cells. Furthermore, we show another HMG box TF, TCF1, the nuclear effector of canonical WNT signaling, is the primary negative regulator of IL-17 production by all γδ T cells. We propose that the antagonism of SOX13 and TCF1 determines the generation of IL-17 producing γδ T cells. We also show that extrinsic cues from αβ T cells do not affect the generation of IL-17 producing γδ T cells. Using OP9-DL1 culture system, we demonstrate that the progenitors of V2 Tγδ17 cells are the c-Kit+ early thymic precursors.

Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) a causé la mort d'environ 40,4 millions de personnes à travers le monde. Malgré les progrès de la thérapie antirétrovirale, qui a transformé le panorama de l'épidémiologie du VIH, le virus continue de représenter un défi sanitaire significatif à l'échelle mondiale, tel que démontré par les 1,3 million de nouveaux cas à la fin de 2022, augmentant le nombre à 39 millions de personnes vivant avec le VIH à ce jour. Les effets nuisibles du VIH-1 vont au-delà du développement du syndrome d'immunodéficience acquise, exacerbant notamment l'inflammation chronique et augmentant le risque de maladies cardiovasculaires chez les personnes infectées. Bien que la thérapie antirétrovirale ait joué un rôle significatif dans la gestion du virus mondialement, l’absence persistante d’un remède définitif et les problèmes liés à l’inflammation chronique et à la dérégulation du système immunitaire soulignent la nécessité cruciale de poursuivre la recherche. Cette thèse a étudié la relation entre l'infection par le VIH-1, la dérégulation immunitaire de la muqueuse intestinale, l'expression des cytokines, et l'inflammation systémique, avec un focus sur le risque de développement des maladies cardiovasculaires chez les personnes âgées recevant la thérapie antirétrovirale. Plus précisément, les dynamiques immunitaires complexes impliquant les cellules épithéliales intestinales, les cellules Th17, la cytokine pro-inflammatoire interleukine (IL)-32 au sein des tissus lymphoïdes associés au tube digestif, et l'existence de cellules intestinales dans la périphérie ont été évaluées. Nous avions pour objectif de comprendre comment le VIH-1 perpétue l'inflammation chronique et d’identifier de nouvelles cibles potentielles pour des interventions afin d'atténuer les conséquences à long terme pour les personnes avec VIH. Le premier projet s'est concentré sur le suivi de l'expression des isoformes de l'IL-32 dans le côlon des personnes avec VIH traités par thérapie antirétrovirale par rapport aux individus non infectés. Nous avons associé l'IL-32β à une diminution de l'expression de la cytokine caractéristique des Th17, l'IL-17A. Ce déséquilibre est proposé comme un facteur important contribuant à l'inflammation et à la compromission potentielle de l'intégrité de la barrière intestinale. La recherche met en évidence le rôle de l'IL-32 dans la promotion de l'inflammation par son interaction avec d'autres cytokines pro-inflammatoires, ce qui pourrait conduire à des dommages tissulaires et augmenter le risque de maladies cardiovasculaires. Le deuxième projet a été inspiré par les preuves dans la littérature que l'IL-32 présente des effets antiviraux. Nous avons exploré d'autres cytokines et facteurs qui modulent l'expression de l'IL-32 dans les cellules épithéliales intestinales et leur impact sur la remontée du VIH dans les cellules T CD4+ des personnes avec VIH traités par thérapie antirétrovirale. Nos résultats indiquent que l'IL-22 et le récepteur nucléaire PPARγ peuvent réguler à la hausse l'expression de l'IL-32 et réduire la réplication du VIH. Cependant, l'IL-26 a montré des effets antiviraux sans affecter la capacité des IEC à exprimer l'IL-32. Enfin, l'inactivation de l'IL-32 dans les cellules épithéliales intestinales par CRISPR/Cas9 n'a pas affecté leur capacité à promouvoir la réactivation du réservoir de VIH. Ainsi, nos résultats soutiennent un modèle dans lequel l'IL-32 exprimé par les cellules épithéliales intestinales contribue à la dérégulation immunitaire et à l'inflammation, plutôt qu'à des réponses antivirales au niveau de la barrière muqueuse. Le troisième projet a examiné les implications systémiques de l'inflammation chronique et de la dérégulation immunitaire chez les personnes avec VIH traités par thérapie antirétrovirale, reliant ces conditions au risque des maladies cardiovasculaires. Nos résultats révèlent la présence atypique de cellules épithéliales CD326+ à des fréquences relativement élevées dans le sang périphérique des personnes avec VIH, la recirculation dérégulée des cellules intestinales exhibant un phénotype de cellules résidentes tissulaires, ainsi qu’une sous-population de cellules T CD4+ exprimant le marqueur de cellules épithéliales CD326. De plus, nous avons observé que la fréquence d'un sous-groupe de cellules T CD4+, exprimant le marqueur Th17 CCR6 et démunis de la molécule de homing intestinal Itgβ7, était fortement associée à un risque accru de maladie cardiovasculaire, suggérant un lien direct entre les altérations immunitaires et les maladies cardiovasculaires dans l'infection par le VIH traitée par thérapie antirétrovirale. Cette dernière partie de ma thèse souligne la nécessité de mener des études plus ciblées sur des traitements qui vont au-delà de la suppression virale efficace pour aborder la dérégulation immunitaire et réduire l'incidence des maladies cardiovasculaires, améliorant ainsi la qualité de vie d'une communauté vieillissante de personnes avec VIH. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) has claimed around 40.4 million lives worldwide. Despite advancements in antiretroviral therapy (ART), which have transformed the landscape of HIV epidemiology, the virus continues to pose a significant health challenge worldwide, evidenced by approximately 1.3 million new cases by the end of 2022, bringing the total to 39 million people with HIV (PWH) nowadays. HIV-1's harmful effects extend beyond the development of AIDS, notably exacerbating chronic inflammation and elevating the risk of cardiovascular diseases (CVD) among infected individuals. While ART has been significant in managing the virus on a global scale, the ongoing absence of a definitive cure and the persistent issues related to immune system dysregulation and inflammation highlight the critical need for continued research. This dissertation investigated the relationship between HIV-1 infection, gut mucosal immune dysregulation, cytokine expression, and systemic inflammation, with a focus on CVD risk in aging individuals receiving ART. Specifically, the complex immune dynamics involving intestinal epithelial cells (IEC), Th17 cells, the pro-inflammatory cytokine Interleukin (IL)-32 within the gut-associated lymphoid tissues (GALT), and the existence of circulating gut cells were evaluated. We aimed to address how HIV-1 perpetuates chronic inflammation and identify new targets for potential interventions to mitigate the long-term health consequences for PWH. The first project focused on monitoring the expression of IL-32 isoforms in the colon of ART-treated PWH compared to uninfected individuals and associated IL-32β with a decrease in Th17 hallmark cytokine IL-17A expression. This imbalance is proposed as a significant factor contributing to inflammation and potential compromise of gut barrier integrity. The research highlights the role of IL-32 in promoting inflammation through its interaction with other pro-inflammatory cytokines, which could lead to tissue damage and elevate CVD risk. The second project was inspired by the evidence in the literature that IL-32 exhibit antiviral effects and explored additional cytokines and factors that modulate IL-32 expression within IECs and their impact on HIV outgrowth in CD4+ T-cells of ART-treated PWH. Our findings indicate that IL-22 and the nuclear receptor PPARγ can upregulate IL-32 expression and reduce HIV outgrowth. However, IL-26 exhibited antiviral effects without affecting the capacity of IEC to express IL-32. Finally, CRISPR/Cas9-mediated IL-32 knockout in IEC did not affect IEC’s capacity to promote HIV reservoir reactivation. Thus, our results support a model in which IL-32 expressed by IEC contributes to immune dysregulation and inflammation, rather than antiviral responses at mucosal barrier level. The third project delved into the systemic implications of chronic inflammation and immune dysregulation in PWH, linking these conditions to CVD risk. Our results reveal the atypical presence at relatively high frequencies in the peripheral blood of ART-treated PWH of CD326+ EC, together with dysregulated gut-homing, or resident immune cell phenotypes, as well as a subpopulation of CD4+ T-cells expressing the IEC marker CD326. Also, we observed that the frequency of a subset of CD4+ T-cells, expressing the Th17 marker CCR6 and lacking the gut-homing molecule Itg7, was strongly associated with a higher CVD risk, suggesting a direct connection between immune alterations and CVD in ART-treated HIV infection. This final part of my thesis stresses the need for more focused studies of treatments that extend beyond effective viral suppression to address immune dysregulation and reduce CVD incidence, thereby improving the quality of life of an aging community of PWH.