Chez l’homme, de nombreux médicaments ne sont toxiques que chez un petit nombre de patients traités. Divers facteurs de susceptibilité, génétiques et autres (doses quotidiennes, stress inflammatoire, réaction immune, maladie hépatique,…), favoriseraient la survenue de ces toxicités de type idiosyncratique, non prévisibles par des études chez l’animal. Leur prédiction et la caractérisation des mécanismes impliqués représentent donc un challenge majeur. Dans ce travail, nous avons étudié in vitro l’influence d’un stress inflammatoire sur le potentiel cytotoxique, cholestatique et stéatosique de trois médicaments connus par leurs effets de type idiosyncratique au niveau du foie, le diclofenac (DCF), la trovafloxacine (TVX) et l’amiodarone (AMD) en utilisant comme modèles expérimentaux les cellules humaines HepaRG différenciées, métaboliquement compétentes, et pour comparaison les cellules HepaRG non différenciées, les cellules HepG2, les hépatocytes humains primaires ainsi qu’un autre modèle cellulaire eucaryote la levure Saccharomyces cerevisiae. Nos résultats montrent que les cellules HepaRG différenciées sont moins sensibles au DCF que les cellules métaboliquement non compétentes et que cette toxicité implique la voie intrinsèque de l’apoptose, associée à la génération de ROS et d’un stress du réticulum endoplasmique. Elle est aggravée par le TNF-α via la voie apoptotique extrinsèque. La toxicité de DCF est aussi augmentée lors d’un co-traitement avec TVX et encore plus en présence de TNF-α. En revanche, cette cytokine ne potentialise pas les effets cholestatiques des 2 molécules, caractérisés notamment par une dilatation des canalicules biliaires et une inhibition de l’activité de certains transporteurs d’acides biliaires (BSEP, NTCP). Un stress inflammatoire induit par le lipopolysaccharide bactérien aggrave aussi les effets cytotoxiques et stéatosiques de l’AMD via une production de ROS, une inhibition de l’oxydation des acides gras et une accumulation des triglycérides, aboutissant à un contexte de stéatohépatite. De plus, une aggravation de la toxicité de DCF a également été observée dans Saccharomyces cerevisiae portant une mutation au niveau de certains transporteurs de la phase III, tel que Pdr5, et surtout après co-traitement avec la N-acétyl-cystéine via une voie qui pourrait être dépendante des perturbations des ponts di-sulfure au niveau de certaines protéines clés (transporteurs, protéines de signalisation ou facteurs de transcription, ...). Au total, tous ces résultats suggèrent que des facteurs environnementaux tel qu’un stress inflammatoire, et génétiques peuvent moduler la réponse toxique à des médicaments non seulement en induisant des stress oxydants et du réticulum endoplasmique mais aussi en modifiant leur métabolisme et donc les interactions entre médicaments, et certaines voies de signalisation essentielles. / In human, many drugs are toxic for only rare patients. Genetic and various other factors (daily doses, inflammatory stress, immune reaction, liver diseases) are thought to favor such idiosyncratic toxicity that is not predictable in animals. Its prediction and mechanisms involved are very challenging. In this work, we have investigated in vitro the influence of an inflammatory stress on cytotoxic, cholestatic and steatotic effects of 3 drugs which are known to cause idiosyncratic hepatotoxicity, i.e. diclofenac (DCF), trovafloxacin (TVX) and amiodarone (AMD), using as experimental models, metabolically competent differentiated HepaRG cells, and for comparison, undifferentiated HepaRG cells, HepG2 cells, primary human hepatocytes as well as a non hepatic eukaryotic cell, the yeast Saccharomyces cerevisiae. Our results show that differentiated HepaRG cells were less sensitive than their undifferentiated counterparts and that toxicity involved intrinsic apoptosis., associated with ROS generation and endoplasmic reticulum stress and was aggravated with TNF-α via extrinsic apoptosis.. DCF toxicity was augmented by co-treatment with TVX and further by co-addition of TNF-α. By contrast, this cytokine did not potentiate cholestatic effects of either drug, typified by dilatation of bile canaliculi and inhibition of some bile acids transporters (BSEP, NTCP). An inflammatory stress induced by the bacterial lipopolysaccharide aggravated cytotoxicity and steatosis induced by AMD, via ROS generation, fatty acid oxidation and triglycerides accumulation leading to a steatohepatitis-like state. Moreover, DCF toxicity was also augmented in S. cerevisiae containing mutations of transporters of phase III, such as Pdr5, and especially after co-treatment with N-acetyl cysteine, via a pathway that is probably dependent on alterations of di-sulfure bounds in critical proteins (transporters, signaling proteins, transcription factors). Together, all the results suggest that environmental factors, such as inflammatory stress or genetic factors can modulate the toxic response to drugs by inducing oxidative and endoplasmic reticulum stress as well as by modifying metabolism, drug-drug interactions and key signaling pathways.

La toxicité des antidépresseurs inhibiteurs de recapture de la sérotonine (IRS) dont le citalopram est le représentant le plus sélectif, est réputée faible. Or les IRS ont été rendus responsables de syndromes sérotoninergiques, de convulsions, d’anomalies électrocardiographiques, voire de troubles respiratoires et de décès. L’implication de cette classe pharmacologique au cours des intoxications médicamenteuses volontaires (IMV) apparait peu documentée par des données récentes en France. Ainsi, la morbidité des IMV impliquant un IRS aux urgences (SAU) et les symptômes les plus fréquemment observés à la suite d’une exposition toxique aux IRS sont peu décrits. De même, les mécanismes toxiques impliqués dans les décès ne sont clairs. Objectifs : Nous avons mené ces travaux dans le but de : 1- mieux connaitre l’épidémiologie des IMV dans un SAU et y préciser l’implication des IRS ; 2- explorer une éventuelle sur-morbidité liée aux IRS dans les IMV polymédicamenteuses ; 3-comprendre les mécanismes de décès induits par de fortes doses de citalopram et les moyens de les prévenir. Méthodes: Nous avons conduit une étude observationnelle des IMV admises au SAU durant 4 ans, avec appariement des patients ayant ingéré un IRS versus des patients intoxiqués non exposés à un IRS. Nous avons également mené une étude expérimentale chez le rat Sprague-Dawley pour connaitre la dose létale médiane (MLD) du citalopram et explorer la toxicité neurologique, respiratoire et systémique impliquée dans le décès consécutif à l’administration de citalopram. Des dosages de sérotonine plasmatiques et plaquettaires ont été effectués afin de caractériser le rôle de la toxicité sérotoninergique. Résultats : Les IRS étaient impliqués dans 16% des IMV au SAU, soit en 2e position après les benzodiazépines. L’attribution des symptômes observés aux effets sérotoninergiques était rarement faite (dans environ un cas sur cinq) par les médecins urgentistes en charge des patients. La survenue d’un syndrome sérotoninergique et de convulsions était plus fréquente dans le groupe de patients intoxiqués par IRS que chez les témoins appariés. Un allongement du QT a été noté chez un patient et aucune toxicité respiratoire n’a été décelée. Le recours à la ventilation mécanique était plus important du fait de troubles de la conscience, sans augmentation pour autant du nombre d’admission en réanimation en comparaison aux témoins. L’étude expérimentale nous a permis de montrer que les décès induits par le citalopram étaient toujours précédés de convulsions, et que la prévalence des convulsions étaient dose-dépendante, significativement plus fréquente pour les fortes doses de citalopram (80 et 120% de la MLD) comparativement aux autres groupes (60% de la MLD et témoins). De même, le citalopram induisait une baisse dose-dépendante de la sérotonine plaquettaire et une élévation dose-dépendante de la sérotonine plasmatique. L’incidence du syndrome sérotoninergique était, par contre, comparable. Le citalopram n’induisait ni hypoxémie, ni hypercapnie, ni hyperlactatémie ; mais il était responsable d’un allongement du temps inspiratoire et d’un « braking expiratoire » mimant un phénomène adaptatif à l’hypoxémie. Par ailleurs, le prétraitement par diazépam ou cyproheptadine des rats intoxiqués avec une dose létale de citalopram prévenait les convulsions et le décès. Conclusions : La toxicité des IRS et du citalopram en particulier, semble essentiellement neurologique, tant chez l’homme que chez l’animal. Le syndrome sérotoninergique et les convulsions devraient être rassemblés en marqueurs de la toxicité sérotoninergique. Il est nécessaire de sensibiliser les médecins urgentistes à cette toxicité, en utilisant les critères de Hunter, plus simples et probablement plus spécifique. La place des antidotes restent à définir, mais, selon notre modèle expérimental, ils pourraient être efficaces pour réduire cette toxicité spécifique. / Toxicity of the serotonin-reuptake inhibitors (SRI) including citalopram, the most selective one, is considered as relatively low. However SRI may be responsible for serotonin syndrome, seizures, electrocardiographic abnormalities, respiratory failure, and even death. Implication of SRI in deliberate drug poisonings has not been assessed by recent data in France. Morbidity of SRI-related poisonings as well as the most common resulting presentations in the emergency department (ED) remains poorly described. Moreover, mechanisms of SRI-attributed death remain unclear. Objectives: We conducted these clinical and experimental studies: 1-to better understand the epidemiology of drug poisonings in one ED in Paris area and analyze SRI involvement; 2- to investigate a possible over-morbidity related to SRI in multidrug poisonings and describe the most common SRI-related complications; 3- to understand mechanisms of death induced by elevated doses of citalopram and its possible prevention. Methods: We conducted an observational study during 4 years in an ED matching patients who ingested at least one IRS with patients who did not. We also conducted an experimental study in the Sprague-Dawley rat to determine the median lethal dose (MLD) of citalopram and investigate citalopram-related neurological, respiratory, and systemic toxicity as well as mechanisms of citalopram-induced death. Platelet and plasma serotonin were measured to ensure the serotoninergic mechanism. Results: SRI were involved in 16% of the drug poisonings admitted to the ED, ranking at the second place after the benzodiazepines. Attribution of the observed signs and symptoms to the serotonin toxicity was rarely performed by the emergency physicians in charge, in only one out of five cases. Onset of serotonin syndrome and seizures were more frequent in SRI-exposed patients than in their matched controls. QT prolongation was observed in one patient while no direct respiratory toxicity was reported. Mechanical ventilation was more frequently used in SRI-exposed patients due to impaired consciousness, despite no resulting increased admission rate to the intensive care unit in comparison to the controls. Based on our rat study, citalopram-induced death always occurred after seizures which were dose-dependent, with a greater prevalence at the two highest doses of citalopram (80 and 120% of the MLD) than in the other groups (60% of control and the MLD). Citalopram-induced decrease in platelet serotonin and increase in plasma serotonin were dose-dependent. However, incidence of serotonin syndrome appears similar in all the groups. Citalopram did not induce hypoxemia, hypercapnia or hyperlactacidemia, but resulted in a slight prolongation in the inspiratory time and an "expiratory braking" that could be attributed to an adaptive phenomenon to hypoxemia. Pretreatment with diazepam and cyproheptadine prevented rats treated with lethal-doses of citalopram from seizures and death. Conclusions: SRI and citalopram in particular are mainly responsible for neurological toxicity, both in humans and rats. Serotonin syndrome and seizures should be grouped as markers of serotonin toxicity. Emergency physicians should become more aware of this specific toxicity. Using the simpler and probably more specific Hunter criteria may be useful in the ED. The exact indications of antidotes remain to be defined, but our experimental model seems to support their effectiveness to prevent IRS-related specific serotonin toxicity.

L’objectif de ces travaux de thèse repose sur la conception de nanoparticules pour l’upconversion (UCNPs) visant à réaliser de l’imagerie médicale par fluorescence. L’intérêt de ces nano-objets s’appuie sur l’excitation et l’émission conjointe dans le domaine du proche infrarouge, permettant de travailler dans la fenêtre thérapeutique des tissus. Une première partie présente l’élaboration des nanoparticules sphériques de NaYF 4 , dont le taux de dopage a permis de mettre en avant les conversions possibles grâce aux phénomènes optiques d’upconversion (IR → NIR, IR → visible et IR → UV). De plus, l’étude d’hydrophilisation, primordiale pour des applications médicales, a montré un fort intérêt pour l’enrobage par échange de ligands et plus particulièrement par des molécules dendritiques. Dès lors que les nano-objets ont été validés et stabilisés dans un milieu aqueux, ces derniers ont été testés in vitro et ont permis de montrer une cytotoxicité faible. La dernière partie a permis d’adapter l’équipement IVIS SPECTRUM® à nos conditions optimales d’utilisation des UCNPs. Cette installation a validé la preuve de concept de nos UCNPs in vivo, permettant ainsi d’être imagées chez le petit animal. Ce dispositif, encore unique en Europe ouvre ainsi la voie pour des études plus approfondies de l’utilisation des UCNPs pour la détection de tissus spécifiques, tels que les tissus tumoraux. / The aim of this PhD work deals with the design of upconverting nanoparticles (UCNPs) to perform medical imaging by fluorescence. The interest of these nano-objects is based on both excitation andemission in the near infrared range, allowing the work in the therapeutic window of tissue. The first part presents the development of spherical nanoparticles of NaYF 4 , which the doping concentration has highlighted the transitions permits through upconversion phenomena (IR → NIR, IR → visible and IR → UV). In addition, the hydrophilization part, necessary for medical application, has shown a strong interest in the coating by ligand exchange and particularly by dendritic molecules. Since the nanoparticles have been validated and stabilized in aqueous medium, they were tested in vitro and have shown low cytotoxicity. The last part was to adapt the IVIS SPECTRUM® equipment to our optimal conditions of use of UCNPs. This installation has validated the proof of concept of our UCNPs in vivo, which is to image in small animals. This device, also unique in Europe, opens the way for further use of UCNPs studies for the detection of specific tissues such as tumor tissues.

De par sa localisation anatomique, ses connexions anatomiques et fonctionnelles, l’hippocampe est une structure impliquée dans la mémoire (encodage et stockage de l’information) et dans la régulation des émotions. La prolifération des cellules au niveau du gyrus denté, les nouvelles connexions synaptiques et la modulation de l’efficacité des synapses déjà existantes par la Long Term Potentiantion (LTP) et la Long Term Depression (LTD) participent aux fonctions mnésiques. Le rétro-feedback négatif qu’exerce l’hippocampe sur l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien permet une régulation de la réaction à un stress auquel est soumis l’organisme. La dépression est en outre considérée comme étant un état de stress pour l’organisme.La prolifération de progéniteurs neuronaux, la plasticité neuronale, sont des caractéristiques essentielles du fonctionnement de l’hippocampe. L’effet des traitements antidépresseurs, aussi bien médicamenteux que l’électro-convulsivo-thérapie (ECT) soulignent l’importance de cette caractéristique.Concernant plus particulièrement une forme de dépression dite endogène, la mélancolie, de nombreux facteurs génétiques sont retrouvés comme étant des facteurs de vulnérabilité. Des évènements traumatiques, particulièrement dans l’enfance, sont à l’origine de l’expression de cette vulnérabilité.Des troubles de la mémoire sont retrouvés de manière inconstante en lien avec la dépression. Le caractère répétitif de la dépression, qui est une maladie récurrente, pourrait expliquer que ces troubles mnésiques ne soient retrouvés qu’après plusieurs épisodes dépressifs, il s’agirait d’un caractère cumulatif, quantitatif. Ou bien, les spécificités liées à la mélancolie seraient à l’origine d’une plus grande neuro-toxicité de cette forme de dépression et expliqueraient que les troubles de la mémoire soient liés à ce type d’épisode, de manière cette fois qualitative.Voulant étudier le poids respectif de ces deux hypothèses, l’une impliquant d’étudier des sujets ayant des temps de vie passés en dépression variables et donc des âges variables, et la fonction testée étant la mémoire qui est altérée avec le vieillissement, nous avons tout d’abord étudié l’impact de l’âge. L’âge n’est pas un facteur indépendant pouvant expliquer une moins bonne récupération de la fonction mnésique après un épisode dépressif majeur lorsque sont pris en compte le niveau de performance mnésique de base et les symptômes persistants.L’étude du poids de l’hypothèse qualitative et quantitative a montré que le temps de vie passé en dépression est corrélé à la performance en mémoire déclarative différée et à la taille de l’hippocampe droit, le score de mélancolie ne l’est pas. En revanche temps de vie passé en dépression et score de mélancolie sont corrélés.La dépression apparaît donc être toxique par un mécanisme cumulatif de chaque épisode qui représente un état de stress pour l’organisme avec une hyper activation de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien et une sécrétion accrue de cortisol. Mais du fait des facteurs de vulnérabilité génétique, qui sont liés au type endogène de dépression, et à la théorie de l’embrasement, des évènements de stress de moins en moins importants précédant un épisode dépressif majeur, ce pourrait être les mêmes sujets qui sont à la fois soumis à des épisodes dépressifs à caractéristique mélancolique et à un trouble dépressif multi-récurrent. Il s’agit cependant d’une corrélation statistique entre temps de vie passé en dépression et atteinte de l’hippocampe, les mécanismes biologiques de causalité expliquant ce constat ne sont pas connus. Seule une partie de la population pourrait être exposée à une vulnérabilité génétique et à un grand nombre d’épisodes dépressifs, ou bien les épisodes dépressifs pourraient prendre une caractéristique mélancolique après un certain nombre de récurrence. Des recherches dans ce domaine sont à développer. / Through its cerebral localization, its anatomical and functional connectivity, the hippocampus is involved in memory (coding and storing) and in emotion regulation. Cell proliferation in the dentate gyrus, new synaptic connections and the modulation of the efficiency of existing synaptic connections by the Long Term Potentiation and Long Term Depression, participate in memory function. Negative retro feedback that the hippocampus has on the hypothalamic-pituitary-adrenal axis allows a regulation of the reaction of the organism to stress it undergoes. Depression can in fact be considered as a state of stress for the organism.Neuron progenitor proliferation and neuronal plasticity are essential characteristics of the hippocampus ‘functioning. The effect of antidepressant therapeutics, medicinal ones as well as electro convulsive therapy, underlies the importance of this characteristic.Concerning more precisely an endogenous subtype of depression, melancholia, numerous genetic factors have been found as being vulnerability factors. Traumatic events, especially during childhood, are at the origin of the expression of this vulnerability.Memory impairments are found inconstantly in relation to depression. The repetitive character of depression, which is pathology with a high rate of recurrence, could explain that these impairments are only found after several depressive episodes. This is a cumulative or quantitative hypothesis. Or, specificities linked to melancholia could make this subtype more neurotoxic and could explain that memory impairments would be linked to melancholia. This is a qualitative hypothesis.Willing to explore the influence of each of these hypotheses, but one of them requiring studying subjects with different lifetimes being depressed and different ages, we first studied the impact of age on memory impairment. Age is not an independent factor explaining worse memory recovery after a depressive episode once remaining symptoms and memory at baseline are controlled for.Studying the respective influence of the quantitative hypothesis and the qualitative hypothesis we found that the lifetime being depressed is correlated to delayed verbal memory impairment and size of the right hippocampus, whereas the score at scale of melancholia is not. However, lifetime being depressed and the rate of melancholia are correlated.Depression appears to be neurotoxic through a cumulative mechanism, each depressive episode being a stress for the organism with a hyper activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and a hyper secretion of cortisol. But taking into account the genetic vulnerability factors, which are linked to endogenous subtype of depression, and the kindling hypothesis with smaller and smaller stressful life events preceding a depressive episode, it could be the same subjects that both have depressive episodes with melancholic characteristics and depression with a high rate of recurrence. This is only a statistic correlation between lifetime being depressed and hippocampal atrophy, biological mechanisms explaining causality for this correlation are not yet known. Only a part of the subjects could be exposed to genetic vulnerability and high recurrence of the depressive episodes or depressive episodes could become melancholic after several recurrences. Further research on this topic is needed. Moreover, looking at the high cost of depression and the high influence of life conditions during childhood, maternal care and traumas, special attention must be payed to them.

La Maladie d’Alzheimer (MA) est un des challenges sanitaires les plus importants du XXIème siècle. En effet, elle touche 35,6 millions de personnes en 2010, et en atteindra probablement quatre fois plus en 2050.Cependant, peu d’éléments sont à ce jour connus concernant les mécanismes de toxicité de cette maladie. Il semble néanmoins acquis que l’agrégation du peptide amyloïde Aβ est l’élément déclenchant une cascade d’événements cellulaires aboutissant à trois types de lésions : les dégénérescences neurofibrillaires, les plaques amyloïdes et une atrophie corticale, révélatrice d’une importante mort neuronale.Différents modèles transgéniques d’étude de la toxicité du peptide Aβ ont été créés au cours des vingt dernières années. Cependant, aucun modèle de levure n’a encore vu le jour, alors que cet organisme est utilisé depuis de nombreuses années pour l’étude des protéines amyloïdes.J’ai donc cherché à créer ce modèle de toxicité au cours de ma thèse. L’adressage d’une protéine de fusion Aβ-GFP à la voie de sécrétion permet de rendre son expression toxique chez la levure. J’ai démontré que le trafic intracellulaire était un élément important pour la génération d’espèces toxiques. Les orthologues de PICALM, facteur de prédisposition à la MA, sont impliqués dans la toxicité, montrant une conservation des mécanismes de toxicité avec l’Homme. Les constructions semblent avoir la capacité de traverser les membranes afin d’atteindre des cibles cellulaires comme la mitochondrie.Le modèle ainsi construit nous permettra de mettre en place une étude de la relation entre la structure et la toxicité du peptide Aβ et mieux comprendre les mécanismes cellulaires régissant la MA. / Alzheimer’s Disease (AD) is one of the most important sanitary challenges of the XXIst century. Indeed, 35.6 million people are affected in 2010, and there will be probably four times more in 2050. However, little is known about the mechanisms of toxicity of this disease. Nevertheless, it seems that aggregation of the Aβ peptide is the triggering factor of a cascade of cellular events that leads to three characteristic lesions: neurofibrillary tangles, amyloid plaques and a cortical atrophy, revealing an important neuronal death. Different transgenic models for the study of the Aβ peptide toxicity have been created during the past twenty years. However, no yeast model has yet seen the light of day, whereas this organism is used for several years to study amyloid proteins.Therefore I worked to create this model during my thesis. Addressing an Aβ-GFP fusion to the secretory pathway enable this construction to become toxic in yeast. I proved intracellular pathways are important for generation of toxic species. PICALM orthologs, an AD predisposing factor, are involved in toxicity, showing conservation in the mechanisms of toxicity between yeast and man. The constructions seem to be able to cross membranes and reach cytoplasmic targets as mitochondria.Thus, this model will allow us to set a study of the relationship between structure and toxicity of the Aβ peptide and better understand the cellular mechanisms governing AD

Les protéines alpha-synucléine (α-syn) et leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) sont deux protéines ayant un rôle majeur dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson (MP) et interviennent aussi bien dans les formes dites sporadiques que dans les formes familiales. La mutation G2019S du gène codant pour LRRK2 est la mutation la plus fréquente. Cette mutation induit une augmentation de l’activité kinase de LRRK2 qui conduit à sa toxicité. Plusieurs hypothèses convergent vers l’idée que LRRK2 et l’α-syn interagiraient pour conduire à la dysfonction et/ou la mort des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire (SNc) dans la MP. Dans la première partie de cette étude, différentes formes sauvage (WT) ou mutée (G2019S) de LRRK2 ont été surexprimées spécifiquement dans les neurones de la SNc via l’utilisation de vecteurs lentiviraux (LV) et adéno-viraux associés (AAV). La question principale de cette étude était d’évaluer si l’expression spécifiquement neuronale de LRRK2 induisait la dégénérescence des neurones DA de la SNc. Nous avons généré des constructions comportant uniquement la partie C-terminale de LRRK2 (ΔLRRK2) en aval du domaine LRR. In vitro, le fragment ΔLRRK2G2019S présente une activité kinase supérieure au fragment ΔLRRK2WT avec une augmentation d’activité comparable à la forme entière de LRRK2. In vivo, six mois après l’injection (PI) de ΔLRRK2 WT ou G2019S dans la SNc, les mesures du nombre de neurones montrent que seul le fragment ΔLRRK2G2019S induit une mort neuronale significative (30%) comparé à la forme ΔLRRK2WT, uniquement lorsque l’expression est générée via des vecteurs AAV. Ces résultats suggèrent que l’expression purement neuronale d’un fragment contenant le domaine kinase de LRRK2 est suffisante pour induire une dégénérescence de la SN. Dans la seconde partie du projet, nous avons étudié l’hypothèse que ΔLRRK2G2019S via son activité kinase amplifiée, pourrait augmenter la toxicité le l’α-syn mutée A53T. Pour répondre à cette question, les vecteurs AAV codant pour ΔLRRK2 G2019S ou une forme inactive de la kinase (ΔLRRK2G2019S/D1994A), et celui codant pour l’α-syn A53T ont été co-injectés dans la SNc. Les analyses réalisées à 6 et 15 semaines PI montrent que ΔLRRK2G2019S augmente la mort neuronale induite par l’α-syn A53T d’une manière kinase dépendante. Tous ces résultats supportent l’hypothèse que l’existence d’une interaction fonctionnelle entre LRRK2 et l’α-syn pourrait jouer un rôle fondamental dans la physiopathologie de la MP offrant des possibilités de stratégie de neuroprotection ciblant l’interaction LRRK2/α-syn. / Alpha-synuclein (α-syn) and leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) proteins are likely to play crucial roles both in sporadic and familial forms of Parkinson’s disease (PD). The most prevalent mutation in LRRK2 is the G2019S substitution which induces neurotoxicity through a marked increase of its kinase activity. A possible interplay between LRRK2 and α-syn may be involved in the dysfunction and/or in the death of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra (SNc) in PD. In the first part of the study, we evaluated whether the overexpression of LRRK2G2019S using lentiviral vectors (LVs) and adeno-associated virus (AAV2/9), which can overexpress transgenes selectively in neurons could trigger neurodegeneration in the SNc, in other words, whether cell-autonomous mechanisms are sufficient to trigger the degeneration of DA neurons. We generated constructs corresponding to the C-terminal domain of LRRK2 (ΔLRRK2) containing the kinase domain. Results of assays performed in vitro indicated that ΔLRRK2 retains biochemical properties of full length LRRK2. Six months after the stereotaxic injection of LV-ΔLRRK2G2019S in the SNc, the number of DA neurons was unchanged, however, the infection of the SNc with AAV-ΔLRRK2G2019S but not with AAV-ΔLRRK2WT induced a significant ~30% loss of DA neurons. These results suggested that neuronal overexpression of the mutant kinase domain of LRRK2 was sufficient to trigger neurodegeneration in the SNc in the adult brain. In the second part of the study, we aimed at studying whether ΔLRRK2G2019S could increase the neurotoxicity of a mutant form of α-syn (A53T mutation) in vivo in DA neurons. We used a co-infection approach with AAV vectors encoding the α-synA53T, and ΔLRRK2 G2019S alone or with the D1994A mutation (ΔLRRK2G2019S/D1994A) that inactivates the kinase activity of LRRK2. AAVs were stereotaxically co-injected into the rat SNc and histological evaluation was performed at 6 and 15 weeks (early and late time points) post-infection. Results showed that ΔLRRK2G2019S increased the toxicity of α-synA53T in a kinase-dependent manner. Altogether, the present study supports the hypothesis that a functional interaction between LRRK2 and α-syn may play a key role in PD pathogenesis. The new “double hit” model we developed in rats may be of interest to test novel neuroprotective strategies targeting LRRK2/α-syn in vivo.

Connaître le mécanisme d’action (MechoA) des substances est une première étape clé pour l’évaluation de risque (éco)toxicologique. Les MechoAs désignent les interactions moléculaires entre les xénobiotiques et le matériel biologique, entraînant des effets toxiques.Des informations de MechoA ont été collectées pour des centaines de molécules chez différentes espèces, principalement le rat et le poisson. Une première méthode pour prédire les MechoAs à partir de la structure a été développée à l’aide de calculs quantiques. Elle a résulté en 70% de classifications correctes.Par la suite, une deuxième méthode de prédiction utilisant des alertes structurales a été développée, et utilise 6 MechoAs généraux incluant 23 MechoAs détaillés. Cette méthode a obtenu 92% de classifications correctes, tout en étant simple et rapide à mettre en œuvre. Nous l’avons comparée avec d’autres méthodes disponibles et notre arbre de décision a obtenu les meilleures statistiques. Cette méthode est en cours d’implémentation dans un logiciel, et sera disponible gratuitement.Des expériences en laboratoire ont aussi été effectuées et ont permis de consolider les données pour des substances mal caractérisées, en mesurant le logP, la solubilité aqueuse et la toxicité aigüe pour les daphnies. / A knowledge of the mechanism of action (MechoA) of substances is a crucial first step in (eco)toxicological risk assessment approaches. MechoAs refer to molecular interactions between xenobiotics and biological material, leading to an adverse outcome. MechoA information has been gathered for hundreds of molecules in several species, mainly rats and fish. A first method to predict MechoAs from the structure has been developed using quantum calculations. This resulted in 70% correct classifications. A second method to predict MechoAs using structural alerts was developed, using a classification with 6 general MechoAs including 23 detailed MechoAs. This method achieved 92% correct classifications, while being simple and fast to use. We compared this method with other available methods and our decision tree showed the best statistics. This method is currently being implemented into a software, and it will be made freely available as we consider it as a useful support in risk assessment. Some laboratory studies have also been performed and have consolidated data for substances which were not well characterised, measuring logKOW, water solubility and acute toxicity to daphnids.

Les nanoparticules d'oxyde de fer sont utilisées dans plusieurs domaines notamment en Biomédecine comme agents théranostiques en Cancérologie et aussi comme agents de contraste en Imagerie par Résonance Magnétique. Avec l'augmentation de la production et de l'utilisation de ces NPs de fer, il y a une évidente augmentation de l'exposition humaine et environnementale à ces NPs, et qui peut présenter un risque. Le sujet de ma thèse porte sur l'étude de l’impact physiopathologique et de la toxicité des nanoparticules de fer (NPs de fer) en utilisant un modèle cellulaire de neuroblastome et un modèle d'étude animal, le rat Wistar. L’objectif des travaux de recherche de la partie in vitro est d’évaluer les effets cytotoxiques et génotoxiques ainsi que les effets sur l’expression des protéines cellulaires suite à l’exposition des cellules SH-SY5Y à des concentrations croissantes des NPs de fer. Nous avons montré que les NPs de fer induisent des perturbations cellulaires d’une manière dépendante de la taille et de la concentration. L'analyse protéomique suivie par l'annotation des gènes avec l’ontologie et l'analyse des voies de signalisation a mis en évidence les effets des NPs de fer sur le cytosquelette, l'apoptose et le développement du cancer. Les objectifs de nos travaux de recherche réalisés in vivo consistent à étudier les effets physiopathologiques des NPs de fer administrées par trois voies différentes, intraveineuse, intranasale et orale, à savoir leur impact sur le comportement émotionnel et cognitif ainsi que sur l’homéostasie des neurotransmetteurs et des éléments traces. Les résultats ont montré que les NPs de fer n’induisent pas de modification concernant l’anxiété, la locomotion, l’apprentissage et la mémoire chez le rat quelle que soit la voie d’administration. Cependant, ces NPs provoquent une perturbation des niveaux des catécholamines et des éléments traces au niveau cérébral. Les effets les plus marqués ont été observés suite à l’instillation intranasale des NPs et se manifestent par une diminution de taux du fer sérique, la thrombocytose et la présence des foyers inflammatoires au niveau hépatique. L’analyse comparative des trois voies d’administration a montré que la voie intraveineuse est la moins toxique. Enfin, l’étude protéomique des protéomes du cerveau, du foie et du poumon a permis d’évaluer la toxicité des NPs de fer au niveau protéique et moléculaire. Les résultats obtenus présentent un support important pour l’estimation et la compréhension des effets potentiellement adverses de ces NPs qui présentent une certaine toxicité non négligeable de point de vue moléculaire et physiopathologique. Ainsi, leur utilisation dans le domaine biomédicale doit être prise avec beaucoup de précaution pour éviter au maximum tout risque lié à leur exposition afin d’améliorer leur biocompatibilité et ainsi augmenter leurs avantages. / Iron Oxide Nanoparticles (IONPs) are used in several fields notably in Biomedicine as theranostic agents in Oncology and also as contrast agents in Magnetic Resonance Imaging. With the increase in the production and use of IONPs, there is a clear increase in human and environmental exposure to these NPs, which may pose a risk. The subject of my thesis is the study of the physiopathological impact and toxicity of iron oxide nanoparticles using a cell model of neuroblastoma and an animal study model, the Wistar rat. The aim of the research work of the in vitro part is to evaluate the cytotoxic and genotoxic effects as well as the effects on the expression of cellular proteins following the exposure of SH-SY5Y cells to increasing concentrations of iron NPs. We have shown that iron NPs induce cellular perturbations in a size and concentration dependent manner. Proteomic analysis followed by ontological gene annotation and signaling pathway analysis revealed the effects of IONPs on cytoskeleton, apoptosis and cancer development. The aims of our research carried out in vivo are to investigate the pathophysiological effects of iron NPs administered by three different routes, intravenous, intranasal and oral, also their impact on emotional and cognitive behavior as well as neurotransmitter and trace element homeostasis. The results showed that IONPs do not induce any changes in anxiety, locomotion, learning and memory in rats regardless of the administration route. However, these NPs cause a disruption of catecholamine and trace element levels in the brain. The most marked effects have been observed following intranasal instillation of NPs and are manifested by a decrease in serum iron levels, thrombocytosis and the presence of inflammatory foci in the liver. The comparative analysis of the three routes of administration showed that the intravenous route is the least toxic. Finally, the proteomic study of the proteomes of the brain, liver and lung has made it possible to evaluate the toxicity of the NPs of iron at the protein and molecular level. The obtained results provide an important support for the estimation and understanding of potentially adverse effects of these NPs, which have a certain toxicity that is not negligible from a molecular and physiopathological point of view. Thus, great care must be taken regarding their use in the biomedical field to minimize any risk related to IONP exposure in order to improve their biocompatibility and thus increase their benefits.

Ce travail de thèse avait pour objectif d’étudier différents vieillissements des copolymères d’éthylène et de norbornène (ENC), utilisés comme conditionnement de produits pharmaceutiques. Grâce à la stratégie analytique adoptée qui a fait appel à différentes techniques de caractérisation, telles que les techniques séparatives comme la chromatographie d’exclusion stérique, la chromatographie liquide haute performance à polarité de phases inversée, les techniques spectrales dont la spectroscopie infra rouge à transformée de Fourier et la spectroscopie UV, les techniques d’analyse thermique à travers l’analyse thermogravimétrie et la calorimétrie différentielle à balayage, puis d’une étude de toxicité des produits de dégradations, nous avons pu mettre en évidence différents types de modifications dans le volume du matériau après vieillissement. La modification principale dans la masse du matériau, observée à la dose réglementaire de stérilisation (25 kGy), est la scission des chaînes du polymère qui s’accompagne de la création de composés de basses masses molaires, donc de migrants potentiels risquant d’influencer la sécurité d’emploi des ENC. Puis pour des doses élevées de rayonnement (150 kGy) et pendant 500h d’exposition UV, on a la réticulation des chaînes.La présence de l’additif (l’antioxydant phénolique l’Irganox 1010®) empêche la création des CBMM après vieillissements. Cependant, en absence d’additif, les vieillissements génèrent de nouveaux CBMM.Toutefois, l’étude de toxicité montre une certaine toxicité à 150 kGy du grade ENC / The aim of this thesis work was to study different ages of copolymers of ethylene and norbornene (ENC), used as packaging of pharmaceutical products. Thanks to the analytical strategy adopted using different characterization techniques, such as separation techniques such as size exclusion chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, spectral techniques including infrared spectroscopy transforming of Fourier and UV spectroscopy, thermal analysis techniques through thermogravimetric analysis and differential scanning calorimetry, and then a toxicity study of degradation products, we were able to highlight different types of modifications in the volume of the material after aging. The main modification in the bulk of the material, observed at the prescribed sterilization dose (25 kGy), is the cleavage of the polymer chains, which is accompanied by the creation of compounds with low molar masses, and therefore potential migrants, which are likely to influence ENC job security. Then for high doses of radiation (150 kGy) and for 500h UV exposure, there is the crosslinking of the chains. The presence of the additive (the phenolic antioxidant Irganox 1010®) prevents the creation of MBMM after aging. However, in the absence of an additive, aging generates new CBMMs. However, the toxicity study shows some toxicity at 150 kGy of the ENC.

La pollution atmosphérique, et plus particulièrement la pollution particulaire d’origine anthropique constitue l'un des facteurs de risque environnemental les plus importants impliqués dans l’augmentation croissante de la morbi-mortalité liée aux pathologies respiratoires et cardio-vasculaires. Au coeur du domaine qu’englobent les activités pyrotechniques, que ce soit dans le domaine professionnel, civil ou militaire, les fumigènes sont référencés comme producteur important de particules et jouent donc un rôle non négligeable dans l’augmentation de cette pollution particulaire, exposant leurs utilisateurs aux différents aérosols émis.L’objectif général de cette étude exploratoire a été d’apporter des connaissances sur les caractéristiques physico-chimiques ainsi que sur la toxicité pulmonaire in vitro de particules émises lors d’activités pyrotechniques, et plus précisément de particules issues d’armes de petit calibre et de fumigènes.La caractérisation physico-chimique a démontré les particules de tir possédaient une granulométrie assez grossière (entre 3 et 7,5 μm) et étaient composées majoritairement d’éléments métalliques ; contrairement aux particules de fumigène qui appartiendraient à la classe granulométrique des particules fines (< 0,95 μm) et qui seraient majoritairement composées de molécules organiques différentes selon le type de fumigène. L’évaluation de la toxicité a été réalisée par une approche in vitro en utilisant des cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) exposées aux particules de tir et de fumigènes. Une étude de mutagénicité a été conduite à partir d’extraits organiques des particules de fumigènes. Parmi les particules testées, les particules de tir et du fumigène 1 ont induit une cytotoxicité. Les particules de fumigène 1 ont également induit un stress oxydant (augmentation de l’expression de l’ARNm de HO-1), une initiation de la réponse inflammatoire (augmentation de l’expression de l’ARNm d’IL-6 et IL-8) et des effets mutagènes.Les résultats de cette étude comparative ont démontré que les particules issues d’armes de poing et de fumigènes avaient une granulométrie, une concentration atmosphérique ainsi qu’une composition chimique différentes ; caractéristiques physico-chimiques responsables d’effets mutagènes et cytotoxiques différents ainsi que d’altérations des propriétés oxydantes et inflammatoires intrinsèques. Cette étude a mis en évidence la nécessité d’évaluer la toxicité des particules issues d’activités pyrotechniques en développant des moyens expérimentaux adaptés, depuis la collecte des particules jusqu’à l’évaluation de leurs impacts sanitaires. / Air pollution, and particulary anthropogenic particulate matter, is one of the most important risk factors involved in the high rate of morbidity and mortality related to respiratory and cardiovascular diseases. In pyrotechnic field, be it professional, civil or military activities, smokes constitue an important particle producer playing a major role in particulate matter emmergence and thereby exposing users to the various emitted aerosols.The main purpose of this exploratory study was to provide knowledge on the physicochemical characteristics of particles emitted during pyrotechnic activities, more specifically particles from gunfire and smokes, and to assess their pulmonary toxicity in vitro.On the first hand, the physicochemical characterization demonstrates that firing particles had a rather coarse granulometry (3 to 7.5 μm) and were mainly composed of metallic elemets, despite smoke particles belong to the category of fine particles (< 0,95 μm) and are predominantly composed of different organic molecules according to the smoke type.On the other hand, in order to assess the pulmonary toxicity of particles, we exposed human alveolar epithelial cells (A549) in vitro to particles coming from either gunfire and to two of the four different smokes (smoke 1 and 4). The results of this study showed that some of these particles (gunfire and smoke 1 particles) induced a mutagenic effects from organic extracts, as well as cytotoxicity. Moreover, particles of smoke 1 were also able to give rise to an oxidative stress (increased HO-1 mRNA expression) and to initiate an important inflammatory response characterized by pro-inflammatory cytokine upregulation (increase in IL-6 and IL-8 mRNA expression).The results of this comparative study demonstrated that particles from gunfire and smoke have different particle sizes and chemical composition. These physicochemical characteristics are responsible for different mutagenic and cytotoxic effects as well as alterations of the intrinsic oxidizing and inflammatory properties. This study also made it possible to understand the different methods of toxicological evaluation of smoke particles.