Orientador: José Paes de Almeida Nogueira Pinto / Banca: Márcio Garcia Ribeiro / Banca: Vera Lúcia Mores Rall / Resumo: A carne bovina pode ser um importante veículo de vários patógenos para os humanos, com destaque à Escherichia coli produtora de Shiga-toxina (STEC), associada com diarreia em animais e humanos. Neste estudo, investigou-se em bovinos abatidos no estado de São Paulo, a prevalência dos diferentes patótipos de E. coli diarreiogênica e o perfil de virulência dos isolados de STEC. De um total de 431 animais, STEC foi identificada em 116 (26,9%) amostras de fezes, das quais 111 (25,8%) STEC eae- e 5 (1,2%) STEC eae+. O patótipo EPEC foi detectado em 20 (4,6%) amostras de fezes dos animais testados. Os demais patótipos de E. coli diarreiogênica não foram identificados. Dos 95 isolados de STEC analisados quanto ao perfil de virulência, todos albergavam stx2, enquanto que 28 (29,5%) continham stx1. Os genes iha e saa, que codificam adesinas, foram encontrados em 93,7% (89/95) e 66,3% (63/95), respectivamente. O gene espP, que codifica uma protease que auxilia na colonização intestinal, foi detectado em 61,1% (58/95) e a hemolisina ehxA em 54,7% (52/95). Também foram identificados em menores frequências os genes subAB, nleE e nleB. STEC está amplamente disseminada nos rebanhos bovinos de São Paulo, carreando genes comumente isolados de patógenos humanos, o que reforça a importância da inspeção e fiscalização nos abatedouros / Abstract: Beef can be an important vehicle for various pathogens to humans, especially Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC), associated to human and animal diarrhea. In this study, the prevalence of different pathotypes of diarrheagenic E. coli, and virulence profiles of STEC were investigated among feces of cattle slaughtered in São Paulo state, southeast of Brazil. From a total of 431 animals, STEC was identified from 116 (26,9%) samples, being 111 (25,8%) STEC eae- and 5 (1,1%) STEC eae+. EPEC pathotype was detected among 20 (4,6%) of animals. The other pathotypes of diarrheagenic E. coli were not identified. Of the 95 STEC isolates assessed for virulence profile, all harbored stx2, while 28 (29,5%) contained stx1. Iha and saa, genes encoding adhesins, were found at 93,7% (89/95) and 66,3% (63/95), respectively. EspP, gene which encoding a protease related with intestinal colonization, was detected in 61,1% (58/95) and ehxA hemolysin was present in 54,7% (52/95). SubAB, nleE and nleB genes were also detected in lower rates. STEC is widespread in cattle herds of São Paulo, containing commonly isolated genes from human pathogens, which reinforces the importance of inspection and surveillance in the slaughterhouses / Mestre

INTRODUÇÃO: O blefaroespasmo essencial é uma distonia focal caracterizada por contrações involuntárias, espasmódicas e bilaterais dos músculos protratores das pálpebras. O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível em adultos de países desenvolvidos e a elevação da pressão intra-ocular é o maior fator de risco para o desenvolvimento da doença. A contração voluntária forçada das pálpebras pode causar aumentos da pressão intra-ocular de até 90 mmHg. Uma vez que pacientes com blefaroespasmo essencial apresentam contrações palpebrais freqüentes e de forte intensidade, eles poderiam compor um grupo de risco para o desenvolvimento do glaucoma. MÉTODOS: Vinte e oito pacientes com blefaroespasmo essencial e 28 pacientes de grupo controle, formado por indivíduos com doenças palpebrais ou no seu pós-operatório, foram submetidos a um exame oftalmológico completo. No grupo de pacientes com blefaroespasmo, a avaliação foi realizada em 8 a 11 dias após o tratamento com toxina botulínica. Efetuou-se exame de refração e medida de melhor acuidade visual corrigida com tabela de Snellen, biomicroscopia em lâmpada de fenda, tonometria de aplanação, campo visual computadorizado, teste de sobrecarga hídrica e biomicroscopia de fundo para avaliação da papila óptica. RESULTADOS: 1) A prevalência de glaucoma nos pacientes com blefaroespasmo foi significativamente maior do que nos indivíduos do grupo controle, sendo diagnosticada em 14,3% e 3,6% dos casos, respectivamente (p=0,008). 2) A pressão intra-ocular foi significativamente maior nos pacientes com blefaroespasmo (15,80 ± 3,80 mmHg) do que nos indivíduos do grupo controle (13,90 ± 2,75 mmHg) (p= 0,004). 3) O pico da pressão intra-ocular na prova de sobrecarga hídrica foi significativamente maior nos pacientes com blefaroespasmo essencial (18,82 ± 4,47 mmHg) do que nos indivíduos do grupo controle (16,27 ± 2,69 mmHg) (p=0,0421). DISCUSSÃO: Diversos estudos descreveram a influência da compressão palpebral sobre a pressão intra-ocular. A prova de sobrecarga hídrica tem sido considerada uma ferramenta indireta para se avaliar a capacidade do fluxo de drenagem do trabeculado, além de exibir correlação com os picos de pressão intra-ocular que muitas vezes não são detectados em exames de rotina. Os pacientes com blefaroespasmo essencial apresentaram pressões intra -oculares e picos de pressão intra-ocular na prova de sobrecarga hídrica mais elevados do que os pacientes do grupo controle, o que poderia indicar um baixo fluxo de drenagem. Estas altíssimas variações de pressão intra -ocular a que estes indivíduos são submetidos constantemente, em pacientes com menor fluxo de drenagem poderiam causar um aumento crônico da pressão intra -ocular e o desenvolvimento do glaucoma. CONCLUSÕES: Os resultados observados sugerem que estes pacientes compõem um grupo de risco para o desenvolvimento de glaucoma e esta doença deve ser pesquisada de maneira sistemática na avaliação inicial e durante o seguimento desses casos / INTRODUCTION: Essential blepharospasm is a focal distonia characterised by involuntary, spasmodic, bilateral contractions of eyelid protractors. Glaucoma is the most important cause of irreversible blindness in adults in developed countries and high intraocular pressure is the major risk factor for development of the disease. Voluntary forced eyelid closure can produce an intraocular pressure increase of 90 mmHg. As patients with essential blepharospasm present frequent and strong eyelid contractions, they could be at risk for glaucoma development. METHODS: Twenty eight patients with essential blepharospasm and 28 patients of a control group, with eyelid diseases or in the post-operative period, were submitted to a complete ophthalmic examination. In the group of patiens with blepharospasm, the evaluation was done between 8 to 11 days after botulinum toxin treatment. We performed refractometry and best corrected visual acuity with Snellen chart, slitlamp biomicroscopy, applanation tonometry, automated perimetry, water drinking test and dilated funduscopy to evaluate optic discs. RESULTS: 1) Prevalence of glaucoma in patients with blepharospasm (14,3%) was higher than in the individuals from control group (3,6%) (p=0,008). 2) Intraocular pressure was higher in patients with blepharospasm (15,80 ± 3,80 mmHg) than in the individuals from control group (13,90 ± 2,75 mmHg) (p=0,004). 3) Intraocular pressure peaks in the water drinking test were higher in patients with essential blepharospasm (18,82 ± 4,47 mmHg) than in the individuals from control group (16,27 ± 2,69 mmHg) (p=0,0421). DISCUSSION: Several studies reported the influence of eyelid compression over intraocular pressure. The water drinking test has been considered as an indirect tool to measure outflow facility and it has good correlation with intraocular pressure peaks which are frequently missed in routine examinations. Patients with essential blepharospasm had higher mean intraocular pressures and intraocular pressure peaks in the water drinking test than patients from control group, which could indicate low outflow facility. These high intraocular pressure variations in patients with low outflow facility could increase the intraocular pressure chronically and lead to development of glaucoma. CONCLUSION: Our results suggest that patients with essential blepharospasm be at higher risks for development of glaucoma and this disease should be always investigated at presentation and during follow-up of these cases

Introdução: A toxina botulínica tipo A é uma das principais modalidades de tratamento para pacientes com espasticidade. Uma nova preparações de toxina botulínica sorotipo tipo A, Prosigne®, foi lançada sugerindo ter a mesma eficácia que Botox®. No entanto, não há ensaios clínicos randomizados comparando essas formulações no tratamento da espasticidade. Objetivos: O objetivo deste estudo foi comparar a eficácia ea segurança do Prosigne® com Botox® no tratamento da espasticidade. Métodos: Foi realizado um estudo duplo-cego, randomizado e cruzado com 57 pacientes com espasticidade clinicamente significativas. Os pacientes foram avaliados no início do estudo, 4 e 12 semanas após a injeção de Prosigne® ou Botox®. Resultados: Os principais resultados foram avaliados pelas mudanças na Escala de Ashworth Modificada (EAM), Medida de Independência Funcional MIF) e Pediatric Evaluation of Disability Inventory (PEDI) e os efeitos adversos relacionados ao uso da toxina botulínica. Ambas as toxinas foram significativamente eficazes em diminuir o grau de espasticidade, em adultos e crianças. Não houveram diferenças significativas entre os tratamentos Prosigne® e Botox® em relação aos escores MAS, e FIM PEDI. Da mesma forma, a incidência de efeitos adversos foi similar entre os dois grupos. Conclusão: Nossos resultados sugerem que Prosigne® e Botox® são comparáveis em relação a sua eficácia e segurança no tratamento de três meses da espasticidade. / Background: Botulinum toxin type A is one of the main treatment choices for patients with spasticity. Prosigne® a new released botulinum toxin serotype A may have the same effectiveness as Botox®. However, there are no randomized clinical trials comparing these formulations in spasticity treatment. Objective: The aim of our study was to compare the efficacy and safety of Prosigne® with Botox® in the treatment of spasticity. Methods: We performed a double-blind, randomized, crossover study consisting of 57 patients with clinically meaningful spasticity. The patients were assessed at baseline, 4 and 12 weeks after Prosigne® or Botox® administration. Results: The main outcomes were changes in the patients’ Modified Ashworth Scale (MAS), Functional Independence Measure (FIM) and Pediatric Evaluation of Disability Inventory (PEDI) scores and adverse effects related to the botulinum toxin. Both of the toxins were significantly effective in relieving the level of spasticity in adults and children. There were no significant differences found between the Prosigne® and Botox® treatments regarding their MAS, FIM and PEDI scores. Likewise, the incidence of adverse effects was similar between the two groups. Conclusion: Our results suggest that Prosigne® and Botox® are both efficient and comparable with respect to their efficacy and safety for the three month treatment of spasticity.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-04-24T12:40:25Z No. of bitstreams: 1 Jaciel Benedito de Oliveira.pdf: 6502737 bytes, checksum: eae13572b4b7a1ea6da18471ee00392a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-24T12:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jaciel Benedito de Oliveira.pdf: 6502737 bytes, checksum: eae13572b4b7a1ea6da18471ee00392a (MD5) Previous issue date: 2017-05-03 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Intraglandular injection of botulinum toxin type A (BTX-A) into the submandibular glands is clinically considered an effective therapeutic tool for the treatment of sialorrhoea. However, there are few data in the literature that discuss its influence on the glandular tissue, oral saliva and microbiota, as well as its systemic metabolism. Thus, the objective of the present study was to measure salivary and serum serum electrolytes, to verify the salivary proteins, to perform the mycological diagnosis of the oral cavity of rats and their profile of sensitivity in vitro to antifungals, to analyze the serum biochemistry, to proceed with the histopathological study of the livers and kidneys, in addition to observing the presence of apoptosis through the TUNEL technique and the histological characteristics of the submandibular-sublingual complex parenchyma of rats treated with BTX-A intraglandular injection. Wistar rats were divided into five groups: control group (n = 7), without any treatments; BTX-A groups 12 days (n = 7) and 35 days (n = 6), whose submandibular glands of the right submandibular-sublingual complexes received 2.5 U BTX-A (Prosigne®), with samples analyzed 12 and 35 days after application; and GEL groups 12 and 35 days (n = 6 animals each), whose right salivary glands received injection of 0.125 mg gelatin of bovine origin, with parameters analyzed 12 and 35 days after treatment, respectively. The data collected were submitted to statistical analysis. BTX-A promoted atrophy of serous acyles with cytoplasmic vacuolations. The appearance of apoptosis was most evident in the BTX-A treated groups and analyzed at 12 days. The lymph nodes of the BTX-A treated groups showed reactivity. There were few changes in salivary proteins and ions. Fungi of the genres Candida spp. and Aspergillus spp., Behaved as opportunists in the groups treated with BTX-A, besides being resistant to the antifungal agents tested. Histopathological alterations in the kidneys were verified, but without hepatic alterations. / A injeção intraglandular de toxina botulínica tipo A (BTX-A) nas glândulas submandi-bulares é considerada clinicamente uma ferramenta terapêutica eficaz para o tratamento da sialorreia. Porém, são poucos os dados na literatura que discutem sua influência sobre o tecido glandular, saliva e microbiota oral, assim como seu metabolismo sistêmico. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi mensurar os eletrólitos da saliva e soro sanguíneo, verificar as proteínas salivares, realizar o diagnóstico micológico da cavidade oral de ratas e seu perfil de sensibilidade in vitro a antifúngicos, analisar a bioquímica sérica, proceder com o estudo histopatológico dos fígados e rins, além de observar a presença de apoptose através da técnica de TUNEL e as características histológicas do parênquima dos complexos submandibulares-sublinguais de ratas tratadas com injeção intraglandular BTX-A. Foram utilizadas ratas Wistas, divididas em cinco grupos: grupo controle (n = 7), sem quaisquer tratamentos; grupos BTX-A 12 dias (n = 7) e 35 dias (n = 6), cujas glândulas submandibulares dos complexos submandibulares-sublinguais direitos receberam injeção de 2,5 U BTX-A (Prosigne®), com amostras analisadas 12 e 35 dias após a aplicação; grupo GEL 12 dias e GEL 35 dias (n = 6 animais cada), cujas glândulas salivares direitas receberam injeção de 0,125 mg gelatina de origem bovina, e com parâmetros analisados 12 e 35 dias após o tratamento, respectivamente. Os dados coletados foram submetidos a análise estatística. A BTX-A promoveu uma atrofia dos ácinos serosos com vacuolizações citoplasmáticas. O aparecimento de apoptose foi mais evidente nos grupos tratados com BTX-A e analisados com 12 dias. Os linfonodos dos grupos tratados com BTX-A apresentaram reatividade. Observou-se poucas alterações nas proteínas e íons salivares. Os fungos dos gêneros Candida spp. e Aspergillus spp., se comportaram como oportunistas nos grupos tratados com BTX-A, além de serem resistentes aos agentes antifúngicos testados. Verificou-se alterações histopatológicas nos rins, porém sem alterações hepáticas.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Cholera is a disease that became endemic in Brazil Northeastern after the pandemic initiated in Peru in 1991. Choleratoxin causes a potent intestinal secretion effect, resulting in significant loss of hydro-electrolyte balance and hypovolemic lock in patients with cholera. We postulate that the administration of substrates, such as amino acids and di-peptide-based glutamine, may increase intestinal sodium and water absorption, resulting in partial decrease of hydro-electrolyte loss in this disease. The aim of this work is to study the phar-macodinamic of Na+ and/or H+-dependent substrates in the rabbit normal small bowel and in the pre-treated with choleratoxin. The administration of substrates with sodium-dependent absorption could, partially, counterbalance the water and electrolyte losses. Others substrates such as di- and tri-peptides presenting mechanisms of proton-dependent absorption also reveal similar properties. The above facts encouraged the development of this comparative study about the ef-fect of cholera toxin on jejunum and ileum absorptive functions. The proximal jejunum and distal ileum loops were isolated in vivo and injected with 5 ml of cholera toxin (1 mg/ml) in saline (experimental group) or equal volume of saline alone (control group). After 1 hour of toxin incubation, the jejunum and ileum loops were excised, freed of their serosa membrane and opened. The fragments were mounted in perfusion chambers with temperature and oxygen control. The mucosal side was perfused with glucose-free physiological solution (substituted by manitol) and the serosas side by physiological solution with glucose. After stabilization, substrates from 1x10-5 to 1.7x10-3 M were cumulatively added. The electric parameters of short circuit current (icc), transepitelial potential difference (VTE) and transepitelial resistance (RTE) were measured in Ussing chambers be-fore and during the period of substrate addition. It was observed that: 1) the presence of cholera toxin increased significantly those parameters, except for RTE, in ileum fragments; 2) the addition of substrates presenting sodium-dependent absorption onto cholera toxin pre-incubated fragments always provoked an increase of RTE larger than that observed with control fragments. The same oc-curred with VTE, except for reduction of icc; and 3) the di-peptide alanyl-glutamine did not alter the RTE but increased significantly the icc both in normal and pre-incubated preparations. These results indicate a probable link between the transport mechanisms of Na+-dependent substrates and the regulatory mechanisms of the paracellular resistance, phenomena not observed in H+-dependent substrate absorption. / A cÃlera à uma doenÃa que se tornou endÃmica no Nordeste do Brasil apÃs a pandemia iniciada no Peru em 1991. A toxina do Vibrio cholerae (TC) causa potente aÃÃo secretÃria no intestino delgado, podendo levar a desequilÃbrio hidro-eletrolÃtico e choque hipovolÃmico nos pacientes com cÃlera. Postulamos que a administraÃÃo de substratos, tais como aminoÃcidos e di-peptÃdeos à base de glutamina, possa aumentar a absorÃÃo de sÃdio e Ãgua no intestino, reduzindo parcialmente as perdas hidro-eletrolÃticas na doenÃa. Este trabalho tem como objetivo estudar a farmacodinÃmica da absorÃÃo de substratos Na+ e/ou H+-dependentes no intestino delgado de coelho normal e naquele prÃ-tratado com a TC. A administraÃÃo de substratos com mecanismos de absorÃÃo Na+-dependentes pode contrabalanÃar parcialmente as perdas hÃdricas e eletrolÃticas. Outros substratos, tais como os di- e tri-peptÃdeos, que apresen-tam mecanismos de absorÃÃo prÃton-dependentes, tambÃm possuem propriedades se-melhantes. Estas reflexÃes nos levaram a estudar os efeitos da toxina de cÃlera sobre os parÃmetros elÃtricos de dois segmentos intestinais (jejuno e Ãleo). AlÃas de jejuno proximal e de Ãleo distal foram isoladas in vivo e injetadas com 5 ml de toxina de cÃle-ra (1 mg/ml) em soluÃÃo fisiolÃgica (grupo experimental) ou igual volume de soluÃÃo fisiolÃgica (grupo controle). ApÃs 1 hora de incubaÃÃo com a toxina, as alÃas foram retiradas, dissecadas da membrana serosa e abertas. Os fragmentos planos foram mon-tados em cÃmaras de perfusÃo com temperatura e oxigenaÃÃo controladas. O lado mu-coso foi perfundido por soluÃÃo sem glicose (substituÃda por manitol), enquanto que o lado seroso por soluÃÃo glicosada. ApÃs estabilizaÃÃo, foram adicionados cumulativa-mente substratos em concentraÃÃes que variam de 1x10-5 a 1,7x10-3 M. Os parÃmetros elÃtricos corrente de curto-circuito (icc), diferenÃa de potencial transepitelial (VTE) e resistÃncia transepitelial (RTE) foram medidos em cÃmaras de Ussing, antes e durante o perÃodo de adiÃÃo de substratos. Foi observado que: 1) a toxina de cÃlera aumentou significativamente estes parÃmetros, com exceÃÃo da RTE, nos fragmentos de Ãleo; 2) a adiÃÃo de substratos de absorÃÃo Na+-dependentes nos fragmentos prÃ-incubados com toxina de cÃlera sempre provocou um aumento da RTE significativamente maior do que aquele observado nos fragmentos controle, o mesmo ocorrendo com relaÃÃo à VTE, mas com reduÃÃo da icc; e 3) o di-peptÃdeo alanil-glutamina nÃo causou alteraÃÃo na RTE, mas aumentou significativamente a icc tanto nas preparaÃÃes normais como nas prÃ-incubadas. Esses resultados indicam uma possÃvel ligaÃÃo entre os mecanismos de transporte de substratos Na+-dependentes e os mecanismos reguladores da resistÃncia paracelular, fenÃmeno nÃo observado na absorÃÃo do substrato H+-dependente.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:15:55Z No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-19T13:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Edailson A. Correa.pdf: 7761566 bytes, checksum: 1872d5e4f92092f139b776f75cc18e5e (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-06-08 / Venom components from snakes of the Bothrops genus have a wide range of biological actions that are not yet fully identified or understood. Of these compounds, phospholipases A2 have shown different potential for biotechnological applications. The objectives of this study were to isolate and biochemically and biologically characterize a Lys49 phospholipase A2 from Bothrops neuwiedi urutu venom. The protein was obtained with an elevated degree of purity after two chromatographic steps, the first being anion exchange (DEAE column) and the second reverse phase in a C18 column. The degree of purity and relative molecular mass were assessed by SDS-PAGE, obtaining a typical molecular mass of an svPLA2 of approximately 14 kDa, which was later confirmed by Mass Spectrometry, obtaining a mass value (m/z) of 13,733 Da. Analysis of the phospholipase activity, carried out on the substrate 4N3OBA showed that the isolated PLA2 is enzymatically inactive. The analyses using the Edman degradation method and that of the peptide fragments allowed for the identification of 108 of the toxin’s amino acid residues; high identity was observed with other phospholipases present in the venom of other species of snakes of the Bothrops genus. The data confirmed that it is a novel PLA2-Lys49 isoform from B. n. urutu venom, called BnuTX-I. The modeling in the dimeric form of the molecular structure of the toxin showed about 99.15% homology with PLA2-homologue 1 from Bothrops jararacussu (PDB code: 3I03) and identified the tertiary structure and active site. Biological assays in murine models revealed that both BnuTX-I and the venom were able to induce edema and myotoxic responses. Hemorrhagic activity was only observed for the venom. The antimicrobial and parasitic assays with the venom and BnuTX-I showed, mostly, the growth inhibition of P. aeruginosa strains and L. amazonensis promastigote forms with a CC50 of 22.91 μg/mL and a selectivity index (SI) of 0.44. As for the cytotoxic effects of BnuTX-I in murine macrophages, the toxin presented cytotoxicity at different concentrations (μg/mL), and the production of IL 1β cytokines was observed. The results allowed for the identification and characterization of a new myotoxin isoform with potential for future biotechnological applications. / Os componentes do veneno de serpentes do gênero Bothrops apresentam uma variada gama de ações biológicas ainda não completamente identificadas ou esclarecidas. Dos compostos, as fosfolipases A2 vêm demonstrando diferentes potenciais para aplicações biotecnológicas. Os objetivos deste estudo foram isolar e caracterizar bioquímica e biologicamente uma fosfolipase A2 Lys49 do veneno da serpente Bothrops neuwiedi urutu. A proteína foi obtida com elevado grau de pureza após duas etapas cromatográficas, sendo a primeira de troca aniônica (coluna DEAE) e a segunda de fase reversa em coluna C18. O grau de pureza e a massa molecular relativa foram avaliados por SDS-PAGE, obtendo-se uma massa molecular típica de svPLA2 de aproximadamente 14 kDa, que foi posteriormente confirmada por Espectrometria de Massa obtendo-se o valor de massa (m/z) de 13.733 Da. A análise da atividade fosfolipásica, realizada sob o substrato 4N3OBA, mostrou que a PLA2 isolada é enzimaticamente inativa. As análises pelo método de degradação de Edman e dos fragmentos peptídicos permitiram a identificação de 108 resíduos de aminoácidos da toxina, sendo observada elevada identidade com outras fosfolipases presentes no veneno de outras espécies de serpentes do gênero Bothrops. Os dados confirmaram tratar-se de uma isoforma inédita de PLA2-Lys49 do veneno de B. n. urutu, denominada BnuTX-I. O modelamento, na forma dimérica, da estrutura molecular da toxina mostrou homologia com cerca de 99,15% com a PLA2-homóloga 1 de Bothrops jararacussu (código PDB: 3I03), bem como a identificação das estruturas terciária e do sítio ativo. Os ensaios biológicos mostraram, em modelos murinos, que tanto a BnuTX-I quanto o veneno foram capazes de induzir respostas edematogênica e miotóxica. A atividade hemorrágica foi observada somente para o veneno. Os ensaios antimicrobianos e parasitários realizados com veneno e BnuTX-I mostraram majoritariamente a inibição do crescimento das cepas de P. aeruginosa e de formas promastigota de L. amazonensis com CC50 de 22,91 μg/mL e com índice de seletividade (IS) de 0,44. Quanto aos efeitos citotóxicos, da BnuTX-I sobre macrófagos murinos, observou-se que a toxina apresentou citotoxidade em diferentes concentrações (μg/mL) e produção de citocinas IL 1β. Os resultados possibilitaram a identificação e caracterização de uma nova isoforma de miotoxina com pontecial para futuras aplicações biotecnológicas.

Envenenamentos por animais peçonhentos são frequentes e quase 35% dos acidentes são ocasionados por escorpiões, especialmente por Tityus serrulatus. A peçonha do escorpião amarelo Tityus serrulatus tem despertado o interesse médico e científico por ser uma mistura complexa de mucopolissacarídeos, inibidores de proteases, histamina, neurotoxinas, entre outros componentes. As neurotoxinas são as principais responsáveis pelos sintomas do envenenamento, por possuírem alta afinidade e seletividade para canais iônicos sensíveis à voltagem. Além de induzirem a liberação de neurotransmissores, as neurotoxinas também são capazes de estimular a liberação de citocinas, principalmente nos casos de envenenamento de maior gravidade. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização de uma nova toxina, denominada Ts19 fragmento I (Ts19 frag I) presente nas frações VII e VIII obtidas por cromatografia da peçonha de Tityus serrulatus em CM-celulose-52. Entre os componentes preponderantes destas frações estão a Ts4, um peptídeo não tóxico que induz reações alérgicas, e a Ts3-KS, que interage com canais para sódio e foi capaz de induzir a liberação de IL-6. As frações VII e VIII foram aplicadas em coluna de fase reversa C18 (4,6 x 250 mm) e os picos 19, 22 (Ts19 frag I) e 23 foram recromatografados em coluna C18 (2,1 x 250 mm). O sequenciamento por degradação de Edman permitiu a determinação de 57 resíduos de aminoácidos da Ts19 frag I, incluindo 6 resíduos de cisteína. Esta proteína mostrou compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras toxinas que atuam em canais para K+ depositadas em bancos de dados. Sua massa molar íntegra de 6.571,3165 Da foi determinada por espectrometria de massas. Os ensaios funcionais em células de linhagem de macrófagos peritoneais demonstraram que a Ts19 frag I (50 ?g/mL) estimulou a liberação de óxido nítrico, IL-6 e não foi citotóxica na dose utilizada. Um ensaio para verificar a atividade hemolítica da Ts19 frag I também foi realizado e nas concentrações de 25 ?g/mL e 50 ?g/mL esta não demonstrou atividade citolítica. Nas frações VII e VIII também foram encontradas a Ts2, como um contaminante do pico 22, e a Ts19 frag II, cujo precursor é a Ts19 frag I. A Ts19 frag II presente no pico 19 foi sequenciada e mostrou-se contaminada com a Ts19 frag I. / Poisonings by venomous animals are frequent and almost 35 % of the accidents are caused by scorpions, especially by Tityus serrulatus. The venom of the yellow scorpion Tityus serrulatus has aroused scientific and medical interest, since it is a complex mixture of mucopolysaccharides, protease inhibitors, histamine, neurotoxins and other components. The neurotoxins are the main responsible for the symptoms of poisoning by having high affinity and selectivity for voltage-sensitive ion channels. In addition to inducing neurotransmitter release, neurotoxins are also able to stimulate the release of cytokines, especially in cases of severe poisoning. The objectives of this study focused on the isolation and characterization of a novel toxin, named Ts19 fragment I (Ts19 frag I) present in fractions VII and VIII obtained by chromatography of Tityus serrulatus venom on CM-cellulose-52 column. Among the predominant components of these fractions are Ts4, a non-toxic peptide that induces allergic reactions, and Ts3-KS, which interact with sodium channels and was able to induce the release of IL-6. Fractions VII and VIII were applied to C18 reverse phase column (4.6 x 250 mm) and the peaks 19, 22 (Ts19 frag I) and 23 were rechromatographed on C18 (2.1 x 250 mm) column. Sequencing by Edman degradation allowed the determination of 57 amino acid residues of Ts19 frag I, including six cysteine residues. This protein showed to share a high degree of sequence identity with other toxins acting on K+ channels deposited in databases. Its full molar mass of 6.571,3165 Da was determined by mass spectrometry. The functional assays in cell line of peritoneal macrophages showed that Ts19 frag I (50 ?g/mL) stimulated the release of nitric oxide, IL-6 and was not cytotoxic in the dose used. A test to verify the hemolytic activity of Ts19 frag I was also performed and concentrations of 25 ?g/mL and 50 ?g/mL of toxin showed no cytolytic activity. In the fractions VII and VIII were also found Ts2, as a contaminant of the peak 22, and Ts19 frag II, whose precursor is the Ts19 frag I. The Ts19 frag II present in peak 19 was sequenced and showed to be contaminated with Ts19 frag I.

C. perfringens é uma bactéria anaeróbia presente no intestino delgado do homem e animais em equilíbrio e, sob a ação de alguns fatores predisponentes como mudança brusca de alimentação ou super alimentação, stress no manejo ou alto parasitismo intestinal, há a proliferação do microrganismo com a consequente produção de potentes toxinas que provocam a morte do animal. Dentre as toxinas principais destaca-se a toxina alfa, importante fator de virulência, produzida por todos os tipos de C. perfringens, sendo os pertencentes ao tipo A os maiores produtores. A fim de caracterizar o microrganismo em suspeitas de enterotoxemia em ruminantes, trabalhamos com 61 amostras de intestino delgado de bovinos e 12 de ovinos como grupo estudo e no grupo controle composto de animais hígidos levados ao abate, 73 amostras de intestino delgado de bovinos e 24 de ovinos. Foram realizados procedimentos de isolamento e tipagem molecular de C. perfringens e quantificação celular, detecção molecular da toxina &beta;2, além de avaliações moleculares qualitativa (PCR convencional) e quantitativa (PCR em tempo real) do gene da toxina alfa dos diferentes isolados. Em 29 amostras do grupo estudo bovino (47,54%) e em 4 (33,33%) do grupo estudo ovino isolou-se o microrganismo, em contrapartida no grupo controle bovino não houve isolamento do bacilo e 5 amostras do grupo controle ovino (20,83%) foram positivas. Houve diferença estatisticamente significante somente entre os grupos de bovinos (p<0,05). Todos os isolados (100%) foram classificados como tipo A, e os resultados das quantificações celulares de C. perfringens revelaram que todos os bovinos controle apresentaram <10 UFC/g de conteúdo enquanto que o grupo estudo apresentou mediana de 104 UFC/g com variações de <10 UFC/g até 108 UFC/g. Nos ovinos, a mediana no grupo controle foi 101 UFC/g assim como no grupo estudo, entretanto com clara separação de valores entre os grupos. Tanto na PCR convencional quanto na PCR em tempo real para detecção do RNAm da toxina alfa foi observado limiar de detecção de 102 cópias de cDNA por reação, porém provavelmente devido aos valores das amostras estarem próximos ao limite da sensibilidade analítica da reação, não foi observada boa reprodutibilidade da última. Já na reação molecular convencional, observou-se a presença de detecção de RNAm da toxina alfa em 60,52% dos isolados o que revela alguma diferença da presença do transcrito entre as culturas, já que nas cepas restantes não foi detectada a presença do RNAm em questão. A pesquisa do gene da toxina &beta;2 revelou sua presença em 54,55% dos isolados de C. perfringens corroborando com a afirmativa de que o gene está amplamente distribuído entre os ruminantes. A metodologia aplicada para avaliação da expressão do gene da toxina alfa nos isolados mostrou que há diferenças dos níveis de transcrição porém não permitiu quantificar esses valores. A tipagem molecular corrobora com outros estudos quanto à importância epidemiológica do tipo A nos quadros de enterotoxemia em ruminantes, e os dados da quantificação celular permite-nos concluir que animais sadios possuem um nível basal de C. perfringens <10 UFC/g de conteúdo que não possibilita o seu isolamento. / C. perfringens is an anaerobe present in small intestine of man and animals in equilibrium, and under some predisposing factors such as sudden feeding change or super feeding, rough management or high intestinal parasitism, the microorganism multiplies with the consequent production of potent toxins that can cause animal death. Amongst the main toxins, alpha toxin is an important virulence factor, that is produced by all C. perfringens types, and those belonging to type A are its higher producer. Aiming to characterize the microorganism in ruminants suspect of enterotoxaemia, we evaluated 61 bovine small intestinal samples and 12 sheep small intestines as the study group, and for the control group composed by higid animals led to slaughterhousing, 73 bovine small intestines and 24 ovine samples. We performed microbiological culture and molecular typing of C. perfringens isolates, cellular quantification, molecular detection of 2 toxin, and qualitative and quantitative molecular evaluations of alpha toxin from different isolates by means of conventional PCR and real time PCR, respectively. In 29 samples from the bovine study group (47.54%) and in 4 (33.33%) from ovine study group the microorganism was isolated, however in the bovine control group there was no isolation success and 5 samples from sheep control group (20.83%) were positive. There was statistically significant difference only between bovine groups (p<0,05). All isolates (100%) were classified as type A, and C. perfringens cellular quantification results showed that every control bovine presented <10 CFU/g of intestinal contents while the study group presented a median of 104 CFU/g with results ranging from <10 CFU/g to 108 CFU/g. In sheep, the median value in the control group was 101 CFU/g as in the study group, but with a clear division of values between the groups. We observed the threshold detection of 102 cDNA copies per reaction in both conventional and real time PCR reactions for alpha toxin mRNA detection, however since the samples quantification values were close to the analytical sensitivity of the test, we could not observe the reproducibility in the last technique. In the conventional PCR reaction, alpha toxin mRNA was detected in 60.52% of the isolates. This result reveals some difference in the transcript presence among the cultures, since we could not detect the presence of the described mRNA in the other isolates. Beta2 toxin gene was detected in 54.55% of C. perfringens isolates corroborating with the affirmative that this gene is widely distributed among ruminants. The methodology presented herein for the evaluation of alpha toxin gene expression showed that there are differences in the transcription levels, however it didnt allow to quantify these values. Molecular typing results agree with other studies regarding the epidemiological importance of type A in the enterotoxaemia processes in ruminants, and the cellular quantification data allow us to conclude that healthy animals show a basal level of C. perfringens <10 CFU/g of intestinal content that doesnt allow its isolation.

Um total de 123 isolados de Pasteurella multocida provenientes de suínos foi avaliado através da PCR para pesquisa de genes codificadores de capsula, toxina dermonecrótica e outros fatores de virulência. As amostras foram caracterizadas como tipo capsular A (78,8 %) e tipo capsular D (21%). Nenhum dos isolados foi positivo para presença de toxina dermonecrótica. Os genes codificadores dos fatores de virulência pesquisados foram observados nas freqüências de 93,5 % para nanB, 92,7% para psl, 91,9% para oma87 e nanH, 87,8% para sodA,87% para hghA,83,7% para ompH, 82,9% para sodC, 79,7% para ptfA e exbBD tonB,73,2% para hgbB, 14,6% para pfhA e 4,9% para tbpA. Estes achados são compatíveis com o descrito na literatura internacional. / A total of 123 Pasteurella multocida strains from swine was evaluated through PCR to detect capsular, dermonecrotic toxin codifying genes and others virulence factors. The strains were identified as capsular type A (78.8 %) and capsular type D (21%). None of isolates were positive to dermonecrotic toxin gene. The virulence factors genes were detected in the following frequency: 93.5 % to nanB, 92.7% to psl, 91.9% to oma87 and nanH, 87.8% to sodA, 87% to hghA, 83.7% to ompH, 82.9% to sodC, 79.7% to ptfA and exbBD tonB, 73.2% to hgbB, 14.6% to pfhA and 4.9% to tbpA. These findings were in accordance with international literature.

Introdução: A Distonia Cervical (DC) é o tipo mais comum de distonia focal primária e atualmente o tratamento padrão ouro consiste na aplicação periódica de toxina botulínica nos músculos afetados. Considerando que cada formulação de toxina botulínica é farmacologicamente distinta, nesta pesquisa foi realizada a comparação de dois tipos de toxina botulínica tipo A (TBA) disponíveis no Brasil: Dysport® (Abobotulinumtoxin A) e Prosigne® (Lanzhou botulinum toxin type A). Metodologia: Foi conduzido um estudo prospectivo, randomizado e duplo cego com dois braços em uso de substância ativa, Dysport® e Prosigne®. Foram recrutados 34 pacientes do ambulatório de toxina botulínica (ATXB) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP) de maio de 2010 a junho de 2011, foram incluídos apenas pacientes com diagnóstico de distonia cervical idiopática. Cada indivíduo foi acompanhado por um período de 13 meses, sendo que nesse período foram submetidos a 5 aplicações de TBA com intervalo de 3 meses entre cada procedimento. Como instrumento para aferir a melhora dos movimentos involuntários, aplicamos a Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (TWSTRS), escala completa com subescalas de gravidade, incapacidade e dor, antes da primeira aplicação e um mês após, e antes da última aplicação e um mês após. Após cada aplicação os pacientes foram submetidos à entrevista estruturada para aplicação da escala de melhora global Clinician Interview-Based Impression of Change (CIBIC) e colher dados sobre tempo de duração do efeito benéfico da toxina e efeitos colaterais apresentados. Para análise estatística foram utilizados o teste t para amostras pareadas, o teste não-paramétrico de Mann-Whitnney, o teste não paramétrico de Friedman e o teste do qui quadrado. Resultados: Foram recrutados 14 indivíduos para o grupo Dysport® e 20 indivíduos para o grupo Prosigne®, a média de idade foi de 57,21 anos no primeiro grupo e 51,95 no segundo (p = 0,239). Após a primeira aplicação houve uma redução média nos valores da TWSTRS de 12,78 pontos no grupo sendo tratado com Dysport® e 9,98 pontos no grupo sendo tratado com Prosigne® (p = 0,38). Após a última aplicação a redução desses valores foi de 11,87 pontos no primeiro grupo e 11,35 no segundo (p = 0,86). Em relação à escala CIBIC a grande maioria dos pacientes referiu algum grau de melhora após as aplicações, sem diferença estatística entre os dois braços do estudo. Também não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao tempo de duração da melhora após aplicações. Disfagia foi o efeito colateral mais comum, ocorrendo em 27,27 % das aplicações, seguido por dor local e fraqueza muscular. Não houve diferença significativa entre os grupos em relação à incidência de efeitos colaterais. Conclusão: Nossos dados mostram que as toxinas botulínicas Dysport® e Prosigne® tem perfil de eficácia similar para o tratamento da distonia cervical idiopática. Além disso, ambas as toxinas são equivalentes em relação à segurança e tolerabilidade. / Introduction: Cervical dystonia (CD) is the most frequent type of primary focal dystonia and treatment with botulinum toxin is currently the gold standard. Considering that each botulinum toxin brand is pharmacologically distinct, in this paper we compared two botulinum toxins available in Brazil: Abobotulinumtoxin A (Dysport®) and Lanzhou botulinum toxin type A (Prosigne®). Methodology: We conducted a prospective, randomized, double blind trial with one group being treated with Dysport® and the other Prosigne®. We recruited 34 patientes from Ribeirao Preto Medical Schools (HCFMRP) botulinum toxin clinic (ATXB) from may 2010 to june 2011, only patients with idiopathic CD were included in the trial. Each individual was followed during a 13 month period, during which 5 TBA injection sessions were conducted with 3 month intervals between them. To assess objective improvement we used the Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (TWSTRS), full scale and severity, disability and pain subscales, before and after the first and fifth treatment sessions. After each treatment session we assessed improvement with the Clinician Interview Based Impression of Change (CIBIC) scale and asked about side effects and duration of improvement. For statistical analysis we used the following tests: t test for paired samples, Mann-Whitneys non parametrical test, Friedmans non parametrical test and qui square test. Results: Fourteen patients were randomized to receive Dysport® and twenty to receive Prosigne®. Mean age in Dysport® group was 57.21 years and in Prosigne® group was 51.95 (p = 0.23). After first injection, mean TWSTRS values reduced 12.78 points in Dysport® group and 9.98 in Prosigne® group (p = 0.38). After last injection the reduction in TWSTRS values was 11.87 points for Dysport® and 11.35 points for Prosigne® (p = 0.86). CIBIC scores showed that the majority of patients reported some level of improvement after injections without statistical differences between groups. Dysphagia was the commonest adverse effect, occurring after 27.27 % of all injections, followed by local pain and muscle weakness. Once again there were no statistical difference between groups regarding adverse effects. Conclusion: Our data showed similar efficacy and safety profiles when comparing both toxins, Dysport® and Prosigne®.