Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo. / The diphtheria vaccine currently used in Brazil (DTP), despite its history of high efficacy in the prevention of diphtheria, is associated with episodes of toxicity and vaccine reactogenicity in the vaccinee, resulting from the presence in the vaccine of residual proteins derived from the production process or detoxification. Strategies for the development of new vaccines more effective and economically viable against diphtheria have been the subject of intense investigation. The alternative proposed by our group is the use of the vaccine against tuberculosis (Mycobacterium bovis BCG Moreau sub strain) as a vector for the gene that encodes the 58.3 kDa fragment B of the diphtheria toxin (DTB). In our project the dtb gene was cloned into the bifunctional vector pUS977 for cytoplasmic expression and recombinant BCG (rBCG) clones, selected after transformation of BCG, were tested for expression of the DTB polypeptide and antigenicity against polyclonal antibodies anti- diphtheria toxoid by immunoblotting. The integrity and identity of the DNA sequence encoding the dtb gene carried by the plasmid construct pUS977dtbPW8 was confirmed by DNA Sequencing and Analysis of Similarity. The immunogenicity of the rBCG expressing the DTB was investigated in BALB/c mice and the results revealed a specific seroconversion (IgG). Also, infectivity and microbicidal activity were analyzed in the intracellular environment by infecting human monocytes (THP-1 cell line) with rBCG. The data obtained indicated intracellular survival within 12 days. In this context, splenocytes collected from mice at days 30 and 60 after immunization were removed and assayed for live bacteria. The results showed that rBCG persisted viable up to 60 days in the absence of selective pressure and cell viable counts did not change significantly during testing. Additionally, the rBCG subjected to six consecutive sub-cultures in vitro showed no significant difference in the ability to express the DTB, thus demonstrating the functional stability of the recombinant vaccine. The structural stability of the construct pUS977dtbPW8 was also confirmed by PCR detection of the dtb gene in rBCG colonies. Also, it was possible to have a preliminary evaluation of the neutralizing capacity of sera from mice immunized with BCGr 30 and 60 days after immunization. The cytotoxic action of diphtheria toxin, between dilutions 1/ 4 and 1/16, was neutralized by mice sera in an in vitro assay using VERO cells. Finally, in our study it was possible to evaluate the potential of BCG as a vector for expression of an antigen of Corynebacterium diphtheriae in vitro and in vivo.

INTRODUÇÃO: O objetivo do presente estudo é apresentar dados morfométricos da fenda palpebral e da função do músculo levantador da pálpebra superior, ao longo de 6 meses de seguimento, após a aplicação da toxina botulínica tipo A, em pacientes com retração palpebral nas fases aguda e crônica da orbitopatia distireoidiana. MÉTODOS: Estudo prospectivo, no qual foram incluídos 24 indivíduos, divididos em dois grupos, agudos (n=12) e crônicos (n=12). Foram submetidos à aplicação de toxina botulínica na dose de 5 UI/0,1 ml em uma das pálpebras superiores e seguidos por 6 meses. A avaliação palpebral foi registrada por meio de captação de imagens com uma câmera filmadora de vídeo conectada a um microcomputador. Os valores médios obtidos nos diferentes momentos analisados foram comparados entre os dois grupos. RESULTADOS: A maioria dos pacientes apresentou melhora da retração da pálpebra superior, com redução média de 3,05 mm no grupo agudo e 3,81 mm no grupo crônico. Esta redução foi significativa até 1 mês no grupo agudo e até 3 meses no grupo crônico. Houve diminuição da função do músculo levantador e da diferença entre as áreas lateral e medial da fenda palpebral nos olhos tratados em ambos os grupos. No olho contralateral, houve aumento significativo da fenda palpebral até 2 semanas após a aplicação. Não houve diferença na freqüência dos efeitos colaterais entre os 2 grupos. CONCLUSÕES: A injeção de 5 unidades foi eficaz na redução da retração e da função do músculo levantador e na melhora do contorno palpebral superior, nos pacientes na fase aguda e crônica da orbitopatia distireoidiana, embora esta melhora tenha sido menos duradoura no grupo agudo / INTRODUCTION: The objective of this study is to compare morphometric data of the eyelid fissure and the levator muscle function after transcutaneous injection of botulinum toxin type A with six-month follow-up in patients with upper eyelid retraction from acute and chronic dysthyroid orbitopathy. METHODS: This was a prospective study that included 24 individuals with dysthyroid orbitopathy, divided into two groups, acute (n=12) and chronic (n=12). They were given a 5 UI/0,1 ml dose of botulinum toxin in the upper eyelid and examined periodically for 6 months. Clinical eyelid examination was performed and recorded using a video camera connected to a microcomputer. Mean values taken at different follow-up points were compared for the two groups. RESULTS: Most patients experienced marked improvement in upper eyelid retraction, with a mean reduction of 3.05 mm in acute group and 3.81 mm in chronic group. This reduction was significantly smaller during 1 month in acute group and during 3 months in chronic group. Reduction in levator function and in the difference between lateral and medial lid fissure measurements was observed in both groups. Measurements of the contralateral eye increased up to 2 weeks after the application. No difference was observed between the study groups with regard to the observed side effects. CONCLUSIONS: A single 5-unit botulinum toxin injection improved upper eyelid retraction, reduced levator function, and produced an adequate lid contour in patients with acute and chronic dysthyroid orbitopathy. The effect lasts longer in patients with chronic disease than in patients with acute disease.

INTRODUÇÃO: A paralisia facial é constrangedora tanto do ponto de vista funcional quanto estético. Esta pesquisa teve por objetivo verificar o efeito da terapia miofuncional em pacientes com paralisia facial de longa duração associada à aplicação de toxina botulínica. MÉTODOS: Foram tratados vinte e cinco pacientes, divididos em dois grupos. Os pacientes do grupo A receberam quatro sessões de terapia miofuncional antes da aplicação de toxina botulínica e os pacientes do grupo B simultaneamente à aplicação. A terapia foi composta por manobras isométricas e isotônicas passivas, intra e extraorais, além de exercícios de resistência. RESULTADOS: Após a terapia miofuncional os pacientes apresentaram aumento significativo da mobilidade do lado paralisado da face, do índice de satisfação do paciente com a face, do Índice Funcional da Face (IFF) e do Índice de Bem-Estar Social (IBES). O grupo de pacientes que realizaram a terapia miofuncional previamente, apresentou freqüência significativamente maior de dificuldade para falar, enquanto o grupo que realizou a terapia miofuncional a partir da data da aplicação de toxina botulínica, apresentou freqüência significativamente maior de dificuldade para mastigar. A terapia miofuncional promove simetria facial; satisfação dos pacientes com a face, funcionalidade oromiofacial, qualidade de vida e deve ser realizada antes e após aplicação de toxina botulínica para reduzir os possíveis efeitos adversos. / INTRODUCTION: The facial paralysis is constraining so much of the functional point of view as aesthetic. This research had for goal verified the myofunctional therapy effect in patients with long-standing facial paralysis associate to the botulinum toxin application. METHODS: Twenty-five patients were treated, divided into two groups. The patients from the group A received four sessions of myofunctional therapy before the toxin botulinum application and the patients from the group B received it simultaneously to the application. The therapy was composed by isometric and passive isotonic maneuvers, inside and outside oral, and resistance exercises. RESULTS: After the myofuncional therapy the patients presented significant increase of the mobility of the paralyzed side, of the patient satisfaction index with the face, Functional Index of the Face (IFF) and of the Index of Social Welfare (IBES). The group of patient that accomplished the myofuncional therapy previously presented significantly larger frequency of talking difficulty, while the group that accomplished the miofuncional therapy from the toxin botulínica application date presented significantly larger frequency of chewing difficulty. The myofuncional therapy promotes facial symmetry; patients satisfaction with the face, myofuncional functionality, life quality, and should be accomplished before and after toxin botulínica application to reduce the possible adverse effects.

A toxina tetânica é uma proteína sintetizada pelo bacilo Clostridium tetani que após destoxificação através da ação do formol, continua apresentando propriedades antigênicas e imunogênicas, obtendo a denominação toxóide tetânico. A síntese dessa proteína ocorre quando esse bacilo encontra-se na sua forma vegetativa e em meio de cultura específico relativamente complexo contendo glicose e peptonas. O efeito simultâneo de diferentes níveis de glicose (Go) e N-Z Case TT® (NZo) como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente, na produção de toxina tetânica foi investigada nesta primeira parte do trabalho em cultivo estático por meio de planejamento fatorial em estrela com cinco níveis e avaliado por metodologia de superfície de resposta, com a finalidade de otimização do processo. O valor mais alto de toxina tetânica encontrado, correspondente a Go = 9,7 g/L e NZo = 43,5 g/L, foi 79% maior que aqueles obtidos em condições padrões de cultivo (Go = 8,0 g/L e NZo = 25,0 g/L). Também foram realizados cultivos de C. tetani utilizando o processo descontínuo alimentado com diferentes protocolos para a correção da concentração de glicose no meio de cultivo ao longo do tempo em diferentes concentrações iniciais de N-Z Case TT®. Dois grupos de ensaios foram executados: a) experimentos realizados com a correção da concentração de glicose para 3,0 g/L nos instantes 16, 56 e 88 h e b) experimentos com correção inicial da concentração de glicose para 3,0 g/L e após esta cair para 1-1,5 g/L. O primeiro protocolo de correção da concentração de glicose e NZo = 50,0 g/L foram as melhores condições para obtenção de toxina tetânica. Nestas condições, o título de toxina tetânica foi 300% maior que aqueles obtidos em cultivos padrão. / The tetanus toxin is a neurotoxin synthesized by the bacillus Clostridium tetani that, after detoxification with formaldehyde, still exhibits antigenic and immunologic properties, hence its denomination of tetanus toxoid. Such a neurotoxin is produced by cultivations of the microorganism in vegetative form on a relatively complex specific medium containing glucose and peptone. The simultaneous effects of the starting levels of glucose (Go) and N-Z Case TT® (NZo) as carbon and nitrogen sources, respectively, on the production of tetanus toxin, have been investigated in this work in static cultivations by means of a five-levels star-shaped experimental design and evaluated by Response Surface Methodology (RSM) for optimization purposes. The highest final average yield of tetanus toxin, achieved at Go = 9.7 g/L and NZo = 43.5 g/L, was 79% higher than that obtained with standard cultivations (Go = 8.0 g/L and NZo = 25.0 g/L). Also, there were carried out cultivations of C. tetani using fed-batch process at different protocols to correct the glucose concentration in the cultivation medium along the time at different initial N-Z Case TT® concentrations (NZo). Two series of runs were performed: a) experiments with the correction of the glucose concentration to 3.0 g/L in the times 16, 56 and 88 hours and b) experiments with initial correction of the glucose concentration to 3.0 g/L and after it to drop to 1-1,5 g/L. The former protocol to correct the glucose concentration and NZo = 50.0 g/L were the best condition to obtain tetanus toxin. In these conditions, the yield of tetanus toxin was 300% higher than that obtained with standard cultivations.

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daniele Priscila.pdf: 2574355 bytes, checksum: 6ecd817b9f806a21743e5671cf9f96c5 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Cutaneous aging is a complex biological phenomenon that depends on a number of intrinsic, responsible for chronological aging and the extrinsic factors, which is responsible for cutaneous photo aging. Another important factor that must be taken into account is the appearance of wrinkles caused by repeated movements of the facial muscles. Currently there is a huge demand for anti-aging products and one of the strategies that is most commonly employed for this end, is the application of botulinum toxin Type A which is regarded as the principal treatment for the mitigation of wrinkles. Another active substance which functions in the same way as botulinum toxin A, is acetyl hexapeptide-3, which is marketed under the name of Argireline. This anti-aging agent acts in a similar way to botulinum toxin by smoothing out the expressive lines and wrinkles caused by repeated movements. Both the active agents are responsible for the release of acetylcholine at the neuromuscular junction. One of the main differences between these active agents is in their form of application since, whereas botulinum toxin A is administered by injection, acetyl hexapeptide-3 is used in the form of a cream for topical application. Given the fact that the two active agents are hydrophilic neuropeptides of high molecular mass, their ability to penetrate the skin is improbable. Thus, the purpose of this study was to develop, characterize and evaluate systems comprising nanocarriers that are able to allow or improve the permeation of these active agents through the skin. Acetyl hexapeptide-3 was encapsulated in liposomes and botulinum toxin was encapsulated through two systems, liposomes and polymeric nanoparticles. The evaluation of the acetyl-hexapeptide-3 showed an encapsulation efficiency of 95%. The vesicles showed a zeta potential of -31 mV. The results demonstrated that the active agent had a good cutaneous permeation and its encapsulation did not affect the permeation through the skin. The botulinum toxin Type A were successfully encapsulated into nanoparticles by multiple emulsion method and solvent evaporation. The nanoparticles had an average size of approximately 570 nm and a zeta potential of -7,40 mV, which is characteristic of the polyester used. The multilamellar liposomes were obtained through a method that involved hydrating the lipid film and showed an average size of approximately 1370 nm and a zeta potential of -37 mV. It was possible to demonstrate by means of infrared fourier transform spectroscopy, the presence of botulinum toxin Type A in the polymeric nanoparticles and the liposomes. The in vitro assays that were carried out suggested that the liposomes that contained the botulinum toxin Type A had an effect on the neurotransmitters in the assays that were conducted, whereas it was not possible to identify the same effect in the nanoparticles that contained the botulinum toxin.These results showed that the encapsulation of botulinum toxin A can be an alternative for the topical application of botulinum toxin Type A in a non-invasive way and with a good deal of comfort to the patient. With regard to acetyl hexapeptide-3, it can be claimed that this active agent when released shows the same degree of penetration through the skin as the encapsulated active agent. This suggests that the penetration of acetyl hexapeptide-3 does not undergo any alteration when encapsulated in liposomes. Thus, the active agent can be applied topically in this way. / O envelhecimento cutâneo é um fenômeno biológico complexo que depende da combinação de fatores intrínsecos, responsáveis pelo envelhecimento cronológico e extrínsecos, responsáveis pelo fotoenvelhecimento cutâneo. Outro fator importante a ser considerado é o aparecimento de rugas causadas pelos movimentos faciais repetitivos. Atualmente é grande a procura por produtos antienvelhecimento e, uma das estratégias mais empregada para esse fim é a aplicação da toxina botulínica do tipo A, que é considerada a principal atenuante de rugas. Outro ativo empregado com a mesma função da toxina botulínica é o acetil hexapeptídeo-3, comercialmente conhecido como Argireline. Este agente antienvelhecimento age de forma similar à toxina botulínica, reduzindo as linhas e rugas de expressão, ambos atuam na liberação da acetilcolina na junção neuromuscular. Uma das principais diferenças entre esses ativos está em sua forma de aplicação, enquanto a toxina botulínica é aplicada por meio de injeções intramusculares, o acetil hexapeptídeo-3 é empregado na forma de creme para aplicação tópica. Considerando que os dois ativos são neuropeptídios hidrofílicos de elevada massa molar, sua penetração através da pele é improvável. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver, caracterizar e avaliar sistemas constituídos por nanocarreadores capazes de permitir ou melhorar a permeação destes ativos através da pele. O acetil hexapeptídeo-3 foi encapsulado em lipossomas e a toxina botulínica foi encapsulada em dois sistemas, lipossomas e nanopartículas poliméricas. A avaliação do acetil exapeptídeo-3 mostrou uma eficiência de encapsulação de 95%. As vesículas apresentaram um potencial zeta de -31 mV. Os resultados demonstraram que o ativo apresentou boa permeação cutânea e sua encapsulação não afetou a permeação através da pele. A toxina botulínica foi encapsulada com sucesso em nanopartículas poliméricas, pelo método de emulsão múltipla e evaporação do solvente. As nanopartículas apresentaram tamanho médio de aproximadamente 570 nm e potencial zeta de –7,40 mV, característico do poliéster utilizado. Os lipossomas multilamelares obtidos por hidratação do filme lipídico apresentaram diâmetro médio de aproximadamente 1370 nm e potencial zeta de -37mV. Foi possível demonstrar, por meio dos espectros de infravermelho com Transformada de Fourier, a presença da toxina botulínica tipo A nas nanopartículas poliméricas e nos lipossomas. Os ensaios realizados in vitro indicaram que os lipossomas contendo a toxina botulínica tipo A apresentaram efeito sobre os neurotransmissores nos ensaios realizados, entretanto não foi possível identificar o mesmo efeito nas nanopartículas contendo a toxina botulínica. Esses resultados mostraram que a encapsulação da toxina botulínica A pode ser uma alternativa para sua aplicação tópica, de forma não invasiva e com muito conforto ao paciente. Quanto ao acetil hexapeptídeo-3, pôde-se constatar que este ativo na forma livre apresentou a mesma penetração através da pele do que o ativo encapsulado, o que indica que a penetração do acetil hexapeptídeo-3 não sofre alteração quando encapsulado em lipossomas. Desta forma o ativo pode ser aplicado de forma direta.

Diante da importância das lectinas no sistema imunológico avaliamos o papel da Nattectina, lectina tipo C identificada no veneno de Thalassophryne nattereri, no desenvolvimento das respostas imunes inata e específica. A Nattectina induziu peritonite em camundongos, caracterizada pelo influxo de neutrófilos e macrófagos, acompanhada da liberação de PGE2, LTB4, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-6, KC, MCP-1, IL-10 e IL-12p70. A resposta imune específica induzida pela Nattectina foi caracterizada pela produção de anticorpos específicos IgG, IgG1 e principalmente IgG2a com síntese de IL-10 e IFN-<font face=\"symbol\">g pelas células esplênicas re-estimuladas in vitro. A incubação de células dendríticas imaturas com a Nattectina gerou maturação destas células com aumento da expressão de moléculas MHC classe II, CD40, CD80, CD86 e expressão de MMP-2 e MMP-9 distribuídas no núcleo e no citoplasma celular, produção das citocinas IL-10 e IL-12p70 e eficiente apresentação antigênica. Concluímos que a Nattectina é capaz de induzir inflamação e resposta imune específica do tipo Th1 mediante a ativação de células dendríticas. / Due to the importance of the lectins in the immunological system we evaluated the role of Nattectin a C-type lectin identified in the venom of Thalassophryne nattereri on development of the innate and specific immune responses. Nattectin induced a significant cellular recruitment into peritoneal cavity of mice, mainly by influx of neutrophils, followed by macrophages, with synthesis of PGE2, LTB4, IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-6, KC, MCP-1, IL-10, and IL-12p70. The specific immune response induced by Nattectin was characterized by the production of specific antibodies IgG, IgG1 and mainly IgG2a with IL-10 and IFN-<font face=\"symbol\">g synthesis by splenic cells. Incubation of immature dendritic cells with Nattectin resulted in maturation with up-regulation of MHC class II, CD40, CD80, CD86, and expression of MMP-2 e MMP-9 distributed in nucleus and cytoplasm. Mature dendritic cells produced and release IL-10 and IL-12p70 and present the antigen efficiently. We concluded that Nattectin is able to induce inflammation and Th1 specific immune response through the activation of dendritic cells.

A toxina tetânica é uma proteína sintetizada pelo bacilo Clostridium tetani que após destoxificação através da ação do formol, continua apresentando propriedades antigênicas e imunogênicas, obtendo a denominação toxóide tetânico. A síntese dessa proteína ocorre quando esse bacilo encontra-se na sua forma vegetativa e em meio de cultura específico relativamente complexo contendo glicose e peptonas. O efeito simultâneo de diferentes níveis de glicose (Go) e N-Z Case TT® (NZo) como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente, na produção de toxina tetânica foi investigada nesta primeira parte do trabalho em cultivo estático por meio de planejamento fatorial em estrela com cinco níveis e avaliado por metodologia de superfície de resposta, com a finalidade de otimização do processo. O valor mais alto de toxina tetânica encontrado, correspondente a Go = 9,7 g/L e NZo = 43,5 g/L, foi 79% maior que aqueles obtidos em condições padrões de cultivo (Go = 8,0 g/L e NZo = 25,0 g/L). Também foram realizados cultivos de C. tetani utilizando o processo descontínuo alimentado com diferentes protocolos para a correção da concentração de glicose no meio de cultivo ao longo do tempo em diferentes concentrações iniciais de N-Z Case TT®. Dois grupos de ensaios foram executados: a) experimentos realizados com a correção da concentração de glicose para 3,0 g/L nos instantes 16, 56 e 88 h e b) experimentos com correção inicial da concentração de glicose para 3,0 g/L e após esta cair para 1-1,5 g/L. O primeiro protocolo de correção da concentração de glicose e NZo = 50,0 g/L foram as melhores condições para obtenção de toxina tetânica. Nestas condições, o título de toxina tetânica foi 300% maior que aqueles obtidos em cultivos padrão. / The tetanus toxin is a neurotoxin synthesized by the bacillus Clostridium tetani that, after detoxification with formaldehyde, still exhibits antigenic and immunologic properties, hence its denomination of tetanus toxoid. Such a neurotoxin is produced by cultivations of the microorganism in vegetative form on a relatively complex specific medium containing glucose and peptone. The simultaneous effects of the starting levels of glucose (Go) and N-Z Case TT® (NZo) as carbon and nitrogen sources, respectively, on the production of tetanus toxin, have been investigated in this work in static cultivations by means of a five-levels star-shaped experimental design and evaluated by Response Surface Methodology (RSM) for optimization purposes. The highest final average yield of tetanus toxin, achieved at Go = 9.7 g/L and NZo = 43.5 g/L, was 79% higher than that obtained with standard cultivations (Go = 8.0 g/L and NZo = 25.0 g/L). Also, there were carried out cultivations of C. tetani using fed-batch process at different protocols to correct the glucose concentration in the cultivation medium along the time at different initial N-Z Case TT® concentrations (NZo). Two series of runs were performed: a) experiments with the correction of the glucose concentration to 3.0 g/L in the times 16, 56 and 88 hours and b) experiments with initial correction of the glucose concentration to 3.0 g/L and after it to drop to 1-1,5 g/L. The former protocol to correct the glucose concentration and NZo = 50.0 g/L were the best condition to obtain tetanus toxin. In these conditions, the yield of tetanus toxin was 300% higher than that obtained with standard cultivations.

Pulchellina é uma proteína inativadora de ribossomo (RIP) isolada de sementes de Abrus pulchellus fragmento que codifica a cadeia A da pulchellina (PAC) foi clonado e inserido no vetor pGEX-5X para expressar a cadeia A recombinante (rPAC) como uma proteína de fusão em Escherichia coli. A análise da seqüência de aminoácidos mostrou que a rPAC apresenta uma alta identidade seqüencial (&#62 86%) com a cadeia A da abrina-c. A habilidade que a rPAC possui para depurinar rRNA em ribossomos de levedura também foi demonstrada em testes in vitro. Objetivando verificar a atividade tóxica do produto heterólogo, nós promovemos a associação in vitro da rPAC com a cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC). Ambas as cadeias foram incubadas na presença de um sistema de redução/oxidação, originando um heterodímero ativo (rPAB). O rPAB apresentou uma massa molecular aparente de aproximadamente 60 kDa, similar a pulchellina nativa. As atividades tóxicas do rPAB e da pulchellina nativa foram comparadas através da injeção intraperitonial em camundongos, usando diferentes diluições de cada proteína. O rPAB foi capaz de matar 50% dos animais testados com doses de 45&#956g.kg-1. Nossos resultados mostraram que o heterodímero recombinante apresenta tanto toxicidade quanto um padrão conformacional similar a pulchellina nativa. Estudos usando cultura de tecidos também foram realizados com o objetivo de investigar a presença da pulchellina em calos obtidos a partir de sementes de A. pulchellus. Segmentos de cotilédones de sementes imaturas foram inoculados em meio MS suplementado com diferentes concentrações de auxina, citocinina e sacarose para promover a indução dos calos. A expressão da pulchellina nos calos foi monitorada através de RT-PCR e testes de atividade biológica. Os calos obtidos após 35 dias foram congelados, macerados e submetidos a extração de RNA total e proteínas. Um fragmento específico de DNA que codifica a cadeia A da pulchellina foi amplificado a partir do RNA total sugerindo a síntese da proteína nos calos. Isto foi confirmado no extrato bruto de calos, que mostrou atividade hemaglutinante contra sangue de coelho e uma alta toxicidade quando injetado via intraperitoneal em camundongos.O extrato bruto também foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-4B. A fração retida na coluna apresentou duas bandas protéicas quando analisadas em gel de poliacrinamida, sob condições desnaturantes, apresentando um padrão similar ao obtido com a pulchellina de semente. / Pulchellin is a type 2 ribosome-inactivating protein (RIP) isolated from seeds of the Abrus pulchellus tenuiflorus plant. The DNA fiagment encoding Pulchellin A-chain (PAC) was cloned and inserted in pGEX-5X to express the recombinant pulchellin Achain (rPAC) as a fusion protein in Escherichin coli. The deduced amino acid sequence analyses of the rPAC presented a high sequential identity (&#62 86%) with the A-chain of abrin-c. The ability of the rPAC to depurinate rRNA in yeast ribosome was also demonstrated in vitro. Intending to validate the toxic activity we promoted the in vitro association of the rPAC with the recombinant pulchellin binding chain (rPBC). Both chains were incubated in the presence of a reducedloxidized system, yielding an active heterodimer (rPAB). The rPAB showed an apparent molecular mass of about 60 D a similar to the native pulchellin. The toxic activities of the rPAB and native pulchellin were compared by intraperitoneal injection in mice using different dilutions. The rPAB was able to kill 50% of the tested mice with doses of 45&#956g.kg-1. Our results indicated that the recombinant heterodimer presented toxic activity and a conformational pattern similar to pulchellin. Studies using tissue cultures were also performed to investigate the presence of the pulchellin in callus established from seed explants of A. pulchellus. Cotyledon segments of immature seeds were inoculated in basal medium MS supplemented with different concentrations of auxin, citokinin and sucrose in order to determine the best callus induction. The pulchellin expression was monitored in callus cultures by RT-PCR and biological activity. The calli obtained aRer 35 days were freeze dried, macerated and submitted to extraction of total RNA and proteins. A specific DNA fragment codifying the A-chain pulchellin was amplified from callus RNA suggesting the synthesis of the protein. This was confirmed in the calli crude extract that showed haemagglutinating activity against rabbit blood cells and a high intraperitoneal toxicity to mice. The crude extract was also submitted to affinity chromatography on a Sepharose-4B column. The retained protein, showed to be composed by two main bands in polyacrylamide gel electrophoresis, in denaturating conditions, with a similar pattern to the results obtained with seeds pulchellin.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-07-26T14:07:16Z No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_BOLLA_FREIRE_COMPLETO.pdf: 1568704 bytes, checksum: 506aa656de55aafd680c5b42ed011bf3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T14:07:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_BRUNO_BOLLA_FREIRE_COMPLETO.pdf: 1568704 bytes, checksum: 506aa656de55aafd680c5b42ed011bf3 (MD5) Previous issue date: 2016-03-31 / Introduction: Stroke is the main cause of acquired adult disability and responsible for motor disorders, which the most common is spasticity. The spasticity increase involuntary muscle activity and promote adaptations in muscle morphology and functional performance. The aim of present study is to analyze the effects of botulinum toxin type a (BTA) for spasticity treatment associated with physiotherapy on muscle arquitecture and functional performance of plantiflexors in stroke survivors. Materials and methods: Randomized and controlled clinical trial with sample composed by 20 stroke survivors with ankle spasticity allocated in two groups: intervention group (BTA + physiotherapy) and placebo group (saline solution + physiotherapy). The muscle arquitecture of medial gastrocnemius was measured by fascicle length, penation angle and muscle thickness with ultrasonography, an isokinetic dynamometer was used to measure the force of plantiflexors and was used the fast gait 8 m, Time Up and Go (TUG) and Sit-to-Stand (STS) to mesure funcional performance. All subjects realized a physiotherapy program for 12 weeks. The intervention group used BTA on medial gastrocnemius and soleus muscle; placebo group used saline solution 0.9% on same muscles. Results: Intervention group showed ankle spasticity decrease after 4 and 12 weeks. Two groups showed no significant difference on fascicle length, penation angle and muscle thickness. Similar results were observed in plantiflexors force. Intervention group and placebo group showed execution time decrease in fast gait 8 m test, TUG and STS test after 12 weeks compared to pre-intervention; however, there was observed no difference between groups. Conclusion: Ankle spasticity decrease caused by BTA does not changed arquitecture muscle parameters or better performance in gait and basic functional mobility. Physiotherapy was enough to promote gain in fast gait and basic functional mobility. / Introdu??o: O acidente vascular cerebral ? a maior causa de incapacidade motora adquirida em adultos, respons?vel por diversas complica??es neuromotoras, entre essas a mais frequente ? a espasticidade. A espasticidade causa um aumento da atividade muscular de forma involunt?ria que por sua vez resulta em adapta??es na morfologia muscular e no desempenho funcional. O objetivo desse estudo ? avaliar os efeitos da aplica??o de toxina botul?nica tipo A (TBA) para o tratamento da espasticidade associada a interven??o de fisioterapia nos par?metros de arquitetura muscular e desempenho funcional dos plantiflexores em indiv?duos com espasticidade p?s-AVC. Materiais e m?todos: Ensaio cl?nico randomizado e controlado em que a amostra foi composta por 20 indiv?duos com espasticidade em tornozelo alocados em dois grupos: grupo interven??o (TBA + fisioterapia) e grupo placebo (solu??o salina + fisioterapia). Foi avaliada ? arquitetura muscular do gastrocn?mio medial atrav?s do comprimento de fasc?culo, ?ngulo de pena??o e espessura muscular por meio de ecografia, tamb?m foi mensurado a for?a dos plantiflexores por meio de dinamometria isocin?tica e o desempenho funcional no teste de caminhada r?pida 8 m, Time Up and Go (TUG) e Sit-to-Stand (STS). Todos os participantes realizaram um programa de fisioterapia por 12 semanas em que um grupo aplicou TBA no m?sculo gastrocn?mio medial e s?leo e, o outro grupo aplicou solu??o salina 0,9% nos mesmos m?sculos. Resultados: O grupo interven??o apresentou redu??o da espasticidade no tornozelo ap?s quatro e 12 semanas. Os dois grupos n?o obtiveram diferen?a significativa no comprimento de fasc?culo, ?ngulo de pena??o e espessura muscular. Da mesma forma, n?o houve diferen?a significativa na for?a dos plantiflexores. O grupo interven??o e o grupo placebo obtiveram redu??o do tempo de execu??o ap?s 12 semanas no teste de caminhada r?pida 8 m, TUG e STS comparado ao momento pr?-interven??o, por?m sem diferen?a entre os grupos. Conclus?o: A redu??o do n?vel de espasticidade nos plantiflexores causada pela TBA n?o modificou os par?metros de arquitetura muscular e n?o promoveu um melhor desempenho na marcha ou mobilidade funcional b?sica. A fisioterapia foi suficiente para melhorar o desempenho na marcha e mobilidade funcional b?sica.

The genetically modified cotton to produce toxins from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) has the objective of offering plant resistance against lepidopteran larvae. The cotton crop cultivated in the Semiarid region can be subjected to the condition of water stress. Thus, this work investigated the expression of the Cry1Ac toxin in two varieties of Bt-cotton Acala 90B and NuOpal cultivated under the conditions of irrigated and water stress. In addition, the oviposition and feeding preference of adults and larvae of the cotton leafworm, Alabama Argillacea (Hübner), caged on these plants were studied. Cotton plants were cultivated under controlled conditions of irrigation to obtain water stress treatment in microparcels inside an open-sided greenhouse. Higher levels of Cry1Ac expression was found on top leaves of Bt-cotton for both varieties under water stress condition, and similar levels between plants with and without water stress in the other plant parts such as bracts, flower petals, and boll. Adults of A. argillacea did not exhibited preference for oviposition between Bt and non-Bt cotton plants. Likewise, 3- and 10-d-old A. argillacea larvae did not show food preference under a choice test comparing leaves of non-Bt and Bt-cotton plants. Otherwise, adults of A. argillacea showed lower oviposition on plants under water stress, and their larvae did not complete development fed non-Bt varieties cultivated under water stress condition. These results indicated that adults and larvae of A. argillacae do not recognize Bt-cotton plants to lay eggs and to feed, respectively. Further, cotton plants under water stress showed greater Cry1Ac toxin concentration on top leaves, interfered with the oviposition of A. argillacea irrespective of plant genotypes Bt and non-Bt, and with the larval development on non-Bt plants. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O algodoeiro geneticamente modificado para a produção de toxinas da bactéria Bacillus thuringiensis (=Bt) tem como principal objetivo oferecer a planta resistência contra larvas de lepidópteros. O cultivo do algodoeiro Bt no Semiárido pode estar submetido a diferentes condições edafoclimáticas, principalmente, ao estresse hídrico. Assim, este estudo investigou a produção da toxina Cry1Ac em algodoeiro Bt variedades Acala 90B e NuOpal com plantas submetidas ou não ao estresse hídrico e a preferência para oviposição e alimentação de Alabama Argillacea (Hübner) confinadas sobre essas plantas. Plantas de algodão foram cultivadas em microparcelas em casa telada e submetidas ao controle de irrigação para a obtenção de plantas com estresse hídrico. A produção de Cry1Ac foi maior em folhas de plantas Bt de ambas as variedades submetidas ao estresse hídrico, e similar nas demais partes como brácteas, pétalas e casca de maçãs. Mariposas de A. argillacea não apresentaram preferência para ovipositar entre plantas de algodão Bt e não-Bt. Da mesma forma, as larvas com três ou 10 dias de idade não apresentaram preferência para alimentar em folhas de variedades não-Bt comparadas a Bt, em testes com chance de escolha. Por outro lado, mariposas de A. argillacea preferiram ovipositar em plantas sem estresse hídrico e larvas não completaram o desenvolvimento em plantas não-Bt sob estresse hídrico de ambas as variedades. Estes resultados mostram que tanto mariposas quanto as larvas de A. argillacea não foram capazes de reconhecer plantas de algodão Bt para ovipositar e alimentar, respectivamente. Também, que plantas de algodoeiro submetidas ao estresse hídrico apresentam diferenças quanto à quantidade da toxina Cry1Ac nas folhas, interferiram com a preferência de oviposição de A. argillacea, bem como com o seu desenvolvimento larval.