C. perfringens é uma bactéria anaeróbia presente no intestino delgado do homem e animais em equilíbrio e, sob a ação de alguns fatores predisponentes como mudança brusca de alimentação ou super alimentação, stress no manejo ou alto parasitismo intestinal, há a proliferação do microrganismo com a consequente produção de potentes toxinas que provocam a morte do animal. Dentre as toxinas principais destaca-se a toxina alfa, importante fator de virulência, produzida por todos os tipos de C. perfringens, sendo os pertencentes ao tipo A os maiores produtores. A fim de caracterizar o microrganismo em suspeitas de enterotoxemia em ruminantes, trabalhamos com 61 amostras de intestino delgado de bovinos e 12 de ovinos como grupo estudo e no grupo controle composto de animais hígidos levados ao abate, 73 amostras de intestino delgado de bovinos e 24 de ovinos. Foram realizados procedimentos de isolamento e tipagem molecular de C. perfringens e quantificação celular, detecção molecular da toxina &beta;2, além de avaliações moleculares qualitativa (PCR convencional) e quantitativa (PCR em tempo real) do gene da toxina alfa dos diferentes isolados. Em 29 amostras do grupo estudo bovino (47,54%) e em 4 (33,33%) do grupo estudo ovino isolou-se o microrganismo, em contrapartida no grupo controle bovino não houve isolamento do bacilo e 5 amostras do grupo controle ovino (20,83%) foram positivas. Houve diferença estatisticamente significante somente entre os grupos de bovinos (p<0,05). Todos os isolados (100%) foram classificados como tipo A, e os resultados das quantificações celulares de C. perfringens revelaram que todos os bovinos controle apresentaram <10 UFC/g de conteúdo enquanto que o grupo estudo apresentou mediana de 104 UFC/g com variações de <10 UFC/g até 108 UFC/g. Nos ovinos, a mediana no grupo controle foi 101 UFC/g assim como no grupo estudo, entretanto com clara separação de valores entre os grupos. Tanto na PCR convencional quanto na PCR em tempo real para detecção do RNAm da toxina alfa foi observado limiar de detecção de 102 cópias de cDNA por reação, porém provavelmente devido aos valores das amostras estarem próximos ao limite da sensibilidade analítica da reação, não foi observada boa reprodutibilidade da última. Já na reação molecular convencional, observou-se a presença de detecção de RNAm da toxina alfa em 60,52% dos isolados o que revela alguma diferença da presença do transcrito entre as culturas, já que nas cepas restantes não foi detectada a presença do RNAm em questão. A pesquisa do gene da toxina &beta;2 revelou sua presença em 54,55% dos isolados de C. perfringens corroborando com a afirmativa de que o gene está amplamente distribuído entre os ruminantes. A metodologia aplicada para avaliação da expressão do gene da toxina alfa nos isolados mostrou que há diferenças dos níveis de transcrição porém não permitiu quantificar esses valores. A tipagem molecular corrobora com outros estudos quanto à importância epidemiológica do tipo A nos quadros de enterotoxemia em ruminantes, e os dados da quantificação celular permite-nos concluir que animais sadios possuem um nível basal de C. perfringens <10 UFC/g de conteúdo que não possibilita o seu isolamento. / C. perfringens is an anaerobe present in small intestine of man and animals in equilibrium, and under some predisposing factors such as sudden feeding change or super feeding, rough management or high intestinal parasitism, the microorganism multiplies with the consequent production of potent toxins that can cause animal death. Amongst the main toxins, alpha toxin is an important virulence factor, that is produced by all C. perfringens types, and those belonging to type A are its higher producer. Aiming to characterize the microorganism in ruminants suspect of enterotoxaemia, we evaluated 61 bovine small intestinal samples and 12 sheep small intestines as the study group, and for the control group composed by higid animals led to slaughterhousing, 73 bovine small intestines and 24 ovine samples. We performed microbiological culture and molecular typing of C. perfringens isolates, cellular quantification, molecular detection of 2 toxin, and qualitative and quantitative molecular evaluations of alpha toxin from different isolates by means of conventional PCR and real time PCR, respectively. In 29 samples from the bovine study group (47.54%) and in 4 (33.33%) from ovine study group the microorganism was isolated, however in the bovine control group there was no isolation success and 5 samples from sheep control group (20.83%) were positive. There was statistically significant difference only between bovine groups (p<0,05). All isolates (100%) were classified as type A, and C. perfringens cellular quantification results showed that every control bovine presented <10 CFU/g of intestinal contents while the study group presented a median of 104 CFU/g with results ranging from <10 CFU/g to 108 CFU/g. In sheep, the median value in the control group was 101 CFU/g as in the study group, but with a clear division of values between the groups. We observed the threshold detection of 102 cDNA copies per reaction in both conventional and real time PCR reactions for alpha toxin mRNA detection, however since the samples quantification values were close to the analytical sensitivity of the test, we could not observe the reproducibility in the last technique. In the conventional PCR reaction, alpha toxin mRNA was detected in 60.52% of the isolates. This result reveals some difference in the transcript presence among the cultures, since we could not detect the presence of the described mRNA in the other isolates. Beta2 toxin gene was detected in 54.55% of C. perfringens isolates corroborating with the affirmative that this gene is widely distributed among ruminants. The methodology presented herein for the evaluation of alpha toxin gene expression showed that there are differences in the transcription levels, however it didnt allow to quantify these values. Molecular typing results agree with other studies regarding the epidemiological importance of type A in the enterotoxaemia processes in ruminants, and the cellular quantification data allow us to conclude that healthy animals show a basal level of C. perfringens <10 CFU/g of intestinal content that doesnt allow its isolation.

Os objetivos deste estudo foram: caracterizar, comparar e correlacionar, em indivíduos com distonia laríngea, antes e após 30 e 120 dias da aplicação da toxina botulínica tipo A no músculo tireoaritenoideo unilateralmente, os parâmetros vocais perceptivo-auditivos e visuais e o impacto vocal na qualidade de vida. Participaram do estudo 16 indivíduos com diagnóstico de distonia laríngea, sendo 11 de gênero feminino e cinco de gênero masculino, com idade média de 57 anos e dois meses, sendo que 68,75% deles apresentaram tremor vocal associado. Todos foram submetidos à aplicação da toxina botulínica tipo A (Dysport®), no músculo tireoaritenoideo unilateralmente, guiado por eletromiografia, gravação do sinal vocal e preenchimento do protocolo de qualidade de vida, Índice de Desvantagem Vocal, antes da injeção da toxina botulínica, no primeiro retorno de seguimento, em média, após 36 dias, e no segundo retorno, coincidente com o dia da nova aplicação de toxina botulínica, que foi em média, 137 dias. Os resultados para análise perceptivo-auditiva e visual de sinais e sintomas vocais, realizada por dois juízes especialistas em voz, revelou, na comparação entre a pré-aplicação e o primeiro retorno, diminuição da severidade da oscilação de intensidade, quebras de voz (sonoridade) e tremor vocal (p=0,002), portanto sem alterações no segundo retorno. No grau de severidade da qualidade da voz, voz tensa-estrangulada, rugosidade, soprosidade e astenia não foram observadas alterações nos três tempos. Para esta análise, notou-se concordância excelente e muito boa (0,71 a 0,99) intrajuízes. Na comparação entre a pré-aplicação e o primeiro retorno, para o Índice de desvantagem vocal, verificou-se diminuição dos valores para o escore total (p=0,039) e para o domínio emocional (p=0,035). Quanto à comparação entre a pré-aplicação e segundo o retorno, houve redução significativa para o domínio funcional (p=0,03) unicamente. De modo que, entre a análise perceptivo-auditiva e visual, do grau de severidade da qualidade vocal e o escore total do índice de desvantagem vocal, evidenciou-se correlação moderada na pré-aplicação e segundo retorno e fraca no primeiro retorno. Portanto, concluiu-se que o tratamento com toxina botulínica para os indivíduos com distonia laríngea mostrou-se eficiente na diminuição de sinais e sintomas vocais, bem como no impacto vocal na qualidade de vida, gerando mudanças na função fonatória e facilitando a comunicação após 30 dias da aplicação, com retorno dos sintomas vocais para a maioria dos indivíduos após 120 dias. / The purpose of this study was to characterize, compare, and correlate the laryngeal dystonia in individuals before, after 30, and 120 days after the application of botulinum toxin type A in the unilateral thyroarytenoid muscle the perceptual vocal and visual parameters and the vocal impact in quality of life. 16 individuals with diagnosed laryngeal dystonia participated in the study, 11 being of the female gender and five of the male gender, with an average age of 57 years and two months, being that 68.75% of individuals having presented associated vocal tremor. All individuals were subjected to: the application of botulinum toxin type A (Dysport®) via electromyography in the unilateral thyroarytenoid muscle, a recording of the vocal sound waves, filling out a survey about his/her quality of life and an Voice Handicap Index (VHI) before the botulinum toxin injection, in the first follow-up on average 36 days after, and in the second follow-up concurrent with the new botulinum toxin application visit, which was on average after 137 days. The results for the perceptual auditory and visual analysis of vocal sound waves and symptoms, conducted by two adjudicating voice specialists, revealed in the comparison between the pre-application and the first follow-up a decrease in the severity of the oscillation intensity, voice breaks (sonority), and vocal tremor (p=0.002), however, revealed no changes in the second follow-up. During the three visits, no changes were observed in grading the severity of voice quality in tense-strangled voice, roughness, breathiness and asthenia. For this analysis, a very good and excellent agreement between the adjudicators was noted (0.71 to 0.99). Comparing the pre-application and the first follow-up, for the index of vocal disability, a decrease in the values of total score (p=0.039) and of emotional mastery (p=0.035) was observed, whereas comparing the pre-application and the second follow-up, there was a significant decrease only for functional mastery (p=0.03). In this way, between perceptual auditory and visual analysis, grading the severity of vocal quality and the total score of the Voice Handicap Index, a moderate correlation was evident in the pre-application and second follow-up and a faint correlation was evident in the first follow-up. Therefore, it can be concluded that the treatment with botulinum toxin for individuals with laryngeal distonia who participated in this study proved effective in the decrease of symptoms, as well as in a vocal impact of quality of life which created changes in the phonatory function and facilitated communication after 30 days of the application, with a return of vocal symptoms for the majority of individuals after 120 days.

EPEC atípicas (EPECa) são isoladas de surtos diarréicos em crianças, adultos e animais em países industrializados e em desenvolvimento. Hemolisinas são toxinas que atuam sobre a membrana de eritrócitos e de diversos tipos celulares. Tal grupo de toxinas é reconhecido como importante fator de virulência envolvido na patogênese bacteriana, por isso o objetivo foi avaliar a expressão de enterohemolisina em isolados de EPECa e analisar características fenotípicas como interferência do meio de cultivo e adesão a componentes de matriz extracelular. Observou-se prevalência de 5,4% de isolados enterohemolíticos, e variações na expressão da toxina foram associadas à concentrações de lactose e caseína nos meios de cultivo. Além disso, verificou-se forte associação entre produção de enterohemolisina e ligação à fibronectina celular. / Atypical EPEC (aEPEC) are isolated from diarrheal outbreaks in children, adults and animals in industrialized and developing countries. Hemolysins are toxins that act on the red cell membrane and various cell types. This group of toxins is recognized as an important virulence factor involved in the bacterial pathogenesis. The aim of this study was the evaluation of the enterohemolysin expression in aEPEC isolates as interference of the culture media and adhesion to components of extracellular matrix. The prevalence of enterohemolytic isolates was 5.4%, and variations in toxin expression were associated with lactose and casein concentrations in culture media. Moreover, it was found association between production of enterohemolysin and adhesion to cellular fibronectin.

INTRODUÇÃO: O blefaroespasmo essencial é uma distonia focal caracterizada por contrações involuntárias, espasmódicas e bilaterais dos músculos protratores das pálpebras. O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível em adultos de países desenvolvidos e a elevação da pressão intra-ocular é o maior fator de risco para o desenvolvimento da doença. A contração voluntária forçada das pálpebras pode causar aumentos da pressão intra-ocular de até 90 mmHg. Uma vez que pacientes com blefaroespasmo essencial apresentam contrações palpebrais freqüentes e de forte intensidade, eles poderiam compor um grupo de risco para o desenvolvimento do glaucoma. MÉTODOS: Vinte e oito pacientes com blefaroespasmo essencial e 28 pacientes de grupo controle, formado por indivíduos com doenças palpebrais ou no seu pós-operatório, foram submetidos a um exame oftalmológico completo. No grupo de pacientes com blefaroespasmo, a avaliação foi realizada em 8 a 11 dias após o tratamento com toxina botulínica. Efetuou-se exame de refração e medida de melhor acuidade visual corrigida com tabela de Snellen, biomicroscopia em lâmpada de fenda, tonometria de aplanação, campo visual computadorizado, teste de sobrecarga hídrica e biomicroscopia de fundo para avaliação da papila óptica. RESULTADOS: 1) A prevalência de glaucoma nos pacientes com blefaroespasmo foi significativamente maior do que nos indivíduos do grupo controle, sendo diagnosticada em 14,3% e 3,6% dos casos, respectivamente (p=0,008). 2) A pressão intra-ocular foi significativamente maior nos pacientes com blefaroespasmo (15,80 ± 3,80 mmHg) do que nos indivíduos do grupo controle (13,90 ± 2,75 mmHg) (p= 0,004). 3) O pico da pressão intra-ocular na prova de sobrecarga hídrica foi significativamente maior nos pacientes com blefaroespasmo essencial (18,82 ± 4,47 mmHg) do que nos indivíduos do grupo controle (16,27 ± 2,69 mmHg) (p=0,0421). DISCUSSÃO: Diversos estudos descreveram a influência da compressão palpebral sobre a pressão intra-ocular. A prova de sobrecarga hídrica tem sido considerada uma ferramenta indireta para se avaliar a capacidade do fluxo de drenagem do trabeculado, além de exibir correlação com os picos de pressão intra-ocular que muitas vezes não são detectados em exames de rotina. Os pacientes com blefaroespasmo essencial apresentaram pressões intra -oculares e picos de pressão intra-ocular na prova de sobrecarga hídrica mais elevados do que os pacientes do grupo controle, o que poderia indicar um baixo fluxo de drenagem. Estas altíssimas variações de pressão intra -ocular a que estes indivíduos são submetidos constantemente, em pacientes com menor fluxo de drenagem poderiam causar um aumento crônico da pressão intra -ocular e o desenvolvimento do glaucoma. CONCLUSÕES: Os resultados observados sugerem que estes pacientes compõem um grupo de risco para o desenvolvimento de glaucoma e esta doença deve ser pesquisada de maneira sistemática na avaliação inicial e durante o seguimento desses casos / INTRODUCTION: Essential blepharospasm is a focal distonia characterised by involuntary, spasmodic, bilateral contractions of eyelid protractors. Glaucoma is the most important cause of irreversible blindness in adults in developed countries and high intraocular pressure is the major risk factor for development of the disease. Voluntary forced eyelid closure can produce an intraocular pressure increase of 90 mmHg. As patients with essential blepharospasm present frequent and strong eyelid contractions, they could be at risk for glaucoma development. METHODS: Twenty eight patients with essential blepharospasm and 28 patients of a control group, with eyelid diseases or in the post-operative period, were submitted to a complete ophthalmic examination. In the group of patiens with blepharospasm, the evaluation was done between 8 to 11 days after botulinum toxin treatment. We performed refractometry and best corrected visual acuity with Snellen chart, slitlamp biomicroscopy, applanation tonometry, automated perimetry, water drinking test and dilated funduscopy to evaluate optic discs. RESULTS: 1) Prevalence of glaucoma in patients with blepharospasm (14,3%) was higher than in the individuals from control group (3,6%) (p=0,008). 2) Intraocular pressure was higher in patients with blepharospasm (15,80 ± 3,80 mmHg) than in the individuals from control group (13,90 ± 2,75 mmHg) (p=0,004). 3) Intraocular pressure peaks in the water drinking test were higher in patients with essential blepharospasm (18,82 ± 4,47 mmHg) than in the individuals from control group (16,27 ± 2,69 mmHg) (p=0,0421). DISCUSSION: Several studies reported the influence of eyelid compression over intraocular pressure. The water drinking test has been considered as an indirect tool to measure outflow facility and it has good correlation with intraocular pressure peaks which are frequently missed in routine examinations. Patients with essential blepharospasm had higher mean intraocular pressures and intraocular pressure peaks in the water drinking test than patients from control group, which could indicate low outflow facility. These high intraocular pressure variations in patients with low outflow facility could increase the intraocular pressure chronically and lead to development of glaucoma. CONCLUSION: Our results suggest that patients with essential blepharospasm be at higher risks for development of glaucoma and this disease should be always investigated at presentation and during follow-up of these cases

Técnicas espectroscópicas vibracionais Raman e infravermelho foram utilizadas no estudo conformacional de algumas proteínas de interesse biológico, no que se refere a aspectos estruturais de seus esqueletos polipeptídicos e microambientes de cadeias laterais de certos resíduos de aminoácidos. O trabalho foi dividido em dois grupos, de acordo com os sistemas em estudo: a) Toxina &#947; do veneno de escorpião brasileiro Tityus serrulatus. A análise vibracional revelou que o esqueleto polipeptídico dessa proteína consiste de diferentes estruturas secundárias, com predominância de folhas &#946;, seguida por estruturas do tipo não regular e &#945;-hélice, com alguma evidência de dobras &#946;. Conformação gauche-gauche-gauche foi detectada para os segmentos CCSSCC das quatro pontes dissulfeto. A intensidade do dubleto Raman da Tyr a 853 e 828 cm-1 indicou que 4 dentre 5 resíduos de Tyr encontram-se expostos na superficie molecular. Também há indicações de que os 3 resíduos de Trp apresentem localização externa. Sob o ponto de vista qualitativo, as características conformacionais da toxina no estado sólido amorfo e em solução são virtualmente as mesmas. b) Fosfolipases A2 de pâncreas de porco e de Crotalus durissus terrificus. Mudanças confarmacionais foram detectadas para as moléculas de fosfolipase como consequência de diferentes condições experimentais tais como mudança de estado físico, presença de certas espécies iônicas e interação com um análogo de substrato e com o próprio substrato. Características conformacionais discrepantes foram observadas para a forma sólida amorfa e forma cristalina da fosfolipase pancreática. Transições conformacionais foram detectadas para a transformação zimogênio &#8594; fosfolipase A2 e diferentes conteúdos estruturais foram calculados para a forma tóxica e atóxica dessa enzima. Todas essas mudanças conformacionais envolveram basicamente a arquitetura do esqueleto polipeptídico, não afetando a conformação das cadeias laterais dos resíduos de amino ácidos. As pontes dissulfeto apresentaram consistentemente uma conformação ggg a qual não foi perturbada por nenhuma das condições experimentais empregadas. A ocorrência externa de resíduos de triptofano constituiu uma característica comum para os sistemas ensaiados, assim como a localização predominante de residuos de tirosina em microambientes hidrofílicos, provavelmente na superficie molecular. / Raman and infrared spectroscopies were used to investigate conformational features of some proteins of biological interest, in what concerns structural aspects of their polypeptide backbones and microenvironments of certains amino acid residue side-chains. The work has been divided in two groups as related to the systems studied: a) Toxin &#947; from the venom of Brazilian scorpion Tityus serrulatus. The vibrational analysis has revealed that the protein polypeptide backbone consists of different secondary structures, with predominance of &#946;-sheet, followed by unordered structure and &#945;-helix, with some evidence of &#946;-turns. A gauche-gauche-gauche (ggg) conformation for the CCSSCC fragments of the four dissulfide bridges has been detected. The intensity of the Tyr Raman doublet at 853 and 828 cm-1 indicated that 4 out of the 5 Tyr residues are exposed at the molecular surface. External localization of the 3 Trp residues has also been indicated. Under a qualitative point of view, conformational features of the toxin the amorphous solid state and in solution were virtually the same. B) Crotalus durissus terrificus and porcine pancreatic phospholipases A2. Conformational changes were detected for the phospholipases molecules as a consequence of different conditions such as change of physical state, presence of certain ionic species and interaction with a model substrate analog and with the substrate itself. Amorphous and crystalline solid pancreatic phospholipases presented discrepant conformational features. Conformational transitions were detected for the pancreatic zymogen &#8594; phospholipase A2 transformation and different secondary structures contents were observed for the toxic and the non toxic phospholipase melecules. All those structural changes heve been shown to involve primarily the architecture of the polypeptide backbone rather than the conformation of amino acid residue side-chains. Disulfide bridges have shown consistently a ggg conformation which has not been disturbed by any of the experimental conditions employed. The external occurrence of tryptophan residues has been a common feature for the systems assayed, as well as the predominant localization of tyrosine residues in hydrophylic environments, probably at the molecular surface.

A Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU) é a principal doença associada à infecção com linhagens de Escherichia coli produtoras de toxina de Shiga (Stx), doença para qual não há uma vacina ou tratamento específico. A toxina Stx é formada por uma subunidade A enzimaticamente ativa e uma B pentamérica responsável pela ligação da toxina na célula hospedeira. Neste trabalho propomos o uso de Bacillus subtilis, uma bactéria não patogênica e formadora de esporos, como veículo vacinal para a expressão de formas atóxicas da Stx2, sob o controle de um promotor induzível por estresse (PgsiB). Camundongos BALB/c imunizados com células vegetativas ou esporos das linhagens vacinais de B. subtilis, por diferentes vias, induziram baixos níveis de anticorpos anti-Stx em soro (IgG) e fezes (IgA). Avaliamos também o potencial imunogênico da Stx gerada em linhagens recombinates de E. coli, mas os anticorpos gerados não foram capazes de neutralizar a toxina nativa. Os resultados indicam que formas alternativas de expressão e/ou o uso de adjuvantes são necessárias para gerar formulações vacinais eficazes contra a SHU. / The Hemolytic Uremic Syndrome (HUS) is the main disease associated with infections with Shiga toxin (Stx) - producing Escherichia coli strain and no effective vaccine or treatment exist. The Stx toxin consist of an enzymatically active A subunit and a pentameric B subunit responsible toxin binding to host cells. In this work we propose the use of Bacillus subtilis, a harmless spore form bacteria as a vaccine vehicle for the expression atoxic forms of Stx2, under the control of stress inducible (PgsiB) promoter. BALB/c mice immunized with vegetative cells and spores of the B. subtilis vaccine strain using different immunization routes elicited low specific antibody levels at serum (IgG) or fecal extracts (IgA). We also investigated the immunogenic potencial of StxB purified from recombinant E. coli strain, but the induced anti-StxB antibodies did not neutralize the native toxin. The results indicate that alternative expression system or the incorporation of the adjuvants are required for the generation of vaccine formulation active against HUS.

As toxinas LT são expressas por linhagens de Escherichia coli enterotoxigênicas e possuem marcantes efeitos adjuvantes. No entanto, não se conhece se a exposição prévia à toxina afeta sua atividade adjuvante durante imunizações subsequentes. Assim, o presente estudo avaliou o impacto da imunidade pré-existente nas propriedades inflamatórias e adjuvantes da LT quando inoculada pela via subcutânea. Como antígeno modelo, empregou-se a proteína NS1 do vírus dengue e duas abordagens experimentais distintas: (i) incubação in vitro de LT com anticorpos anti-LT e com o receptor gangliosídio (GM1) antes da administração em camundongos não imunizados em conjunto com a proteína NS1 do vírus dengue; (ii) imunização com NS1 coadministrada à LT em camundongos previamente expostos à LT. Foram avaliados os efeitos inflamatórios locais e os efeitos adjuvantes por meio da resposta imunológica humoral anti-NS1. Nossos resultados indicam que a imunidade prévia contra a LT não afeta seu potencial inflamatório e atividade adjuvante. Além disto, a exposição ao receptor GM1 reduziu as reações inflamatórias locais sem, no entanto, reduzir os efeitos adjuvantes de LT. / LT toxins are expressed by enterotoxigenic Escherichia coli strains and display strong adjuvant effects. Nonetheless, the impact of preexisting immunity on the on LT adjuvant activities is still unknown. Thus, the present study evaluated the impact of pre-existing immunity in the inflammatory and adjuvant properties of LT after subcutaneous administration. the NS1 of dengue virus was employed as a model antigen and two experimental approaches were evaluated: (i) in vitro incubation of LT with LT-specific antibodies and the ganglyoside receptor (GM1) before administration to naïve mice in combination with NS1; (ii) immunization with NS1 co-administered with LT in mice previously exposed to LT. The local inflammatory effects induced by LT were evaluated as wel as the adjuvant effects by means of NS1-specific humoral response. Our results indicate that the LT pre-existing immunity does not affect the inflammatory and adjuvant activities of the toxin. In addition, exposure to GM1 reduced the local inflammatory reactions without affecting the toxin adjuvant effects.

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A distonia é uma síndrome que consiste de contrações musculares involuntárias que resultam em movimentos distorcidos e repetitivos e/ou posturas anormais. O tratamento pode ser por farmacoterapia, com drogas anticolinérgicas ou com a injeção de toxina botulínica no grupo de músculos afetados. O objetivo do trabalho foi avaliar a deglutição nos pacientes com distonia laríngea, antes e após o tratamento com a toxina botulínica. Nossa hipótese foi que a toxina botulínica modificaria a deglutição dos pacientes com distonia laríngea. Foram avaliados 17 indivíduos adultos, acima de 18 anos de idade, com diagnóstico clínico de distonia laríngea antes e após o tratamento com o uso de toxina botulínica do tipo A, e 20 indivíduos adultos saudáveis como controles. Os participantes foram submetidos à anamnese fonoaudiológica e avaliação videofluoroscópica da deglutição. Os pacientes com distonia foram avaliados antes e 30 dias após a injeção de toxina botulínica, guiada por eletromiografia. Na videofluoroscopia foram avaliadas 6 deglutições de 5mL, sendo 3 na consistência líquida (sulfato de bário 100%, e 3 na consistência pastosa (3g do espessante alimentar ThickenUp Clear, em 50 mL de sulfato de bário (100%) oferecidas em uma colher. A ordem das deglutições foi aleatória. Foram estudadas as fases oral e faríngea da deglutição, com registro de 30 quadros por segundo. Os pacientes com distonia laríngea apresentaram aumento de resíduos na região oral e em valécula e maior número de deglutições. Os pacientes apresentaram tempo de trânsito faríngeo (TTF) menor do que os controles (p<0,01), para os bolos nas consistências líquida e pastosa. O TTF foi menor após aplicação do que antes da aplicação da toxina botulínica, quando da deglutição do bolo pastoso. Portanto, concluiu-se que os pacientes com distonia laríngea, comparado a controles, têm trânsito mais rápido pela faringe, aumento de resíduos na região oral e em valécula e maior número de deglutições para o mesmo volume.Trinta dias após a aplicação da toxina botulínica foi observado diminuição da duração do trânsito pela faringe, com o bolo pastoso, e resposta tardia do movimento do osso hióide em relação à chegada do bolo na faringe. / Dystonia is a syndrome consisting of involuntary muscle contractions that result in distorted and repetitive movements and/or abnormal postures. Treatment may be by pharmacotherapy with anticholinergic drugs or with the injection of botulinum toxin in the affected muscle group. The aim of this study was to evaluate swallowing in patients with dystonia before and after treatment with botulinum toxin. Our hypothesis was that botulinum toxin modify the swallowing of patients with spastic dystonia. Seventeen adult subjects over the age of 18 years with clinically diagnosed dystonia were evaluated before and after treatment with botulinum toxin type A and compared to 20 healthy adults as controls. Participants underwent phonologic anamnesis and videofluoroscopy assessment of swallowing. Patients with dystonia were assessed before and 30 days after injection of botulinum toxin, guided by electromyography. In fluoroscopy, 6 swallows were evaluated of 5ml: 3 in a liquid consistency (100% barium sulfate) and 3 in a pasty consistency (3g of food thickener, ThickenUp Clear) in 50 mL of 100% barium sulfate, offered on a spoon. The oral and pharyngeal phases of swallowing were studied from swallows of random order, with registration of 30 frames per second. Patients with dystonia showed an increase of residue in the oral region and vallecula and greater number of multiple swallows. Patients had less pharyngeal transit time (PTT) than controls (p<0.01) for boluses of liquid and pasty consistencies. PTT was lower after the application of botulinum toxin than before with the swallowing of a pasty bolus. It was concluded that patients with dystonia, compared to controls, have more rapid transit through the pharynx, increased residues in the oral region and vallecula and a greater number of swallows for the same volume. Thirty days after the botulinum toxin, it was observed a shorter pharyngeal transit time with paste bolus, and delayed hyoid movement response to bolus presence in pharynx.

L'ocratoxina A (OTA) és un metabolit secundari tòxic produït essencialment per fongsdels gèneres Aspergillus i Penicillium, sota diverses condicions. La seva presència en elcos humà es deguda a la ingestió de petites quantitats provingudes d'un ampli ventalld'aliments, tant d'origen vegetal com animal. Després dels cereals, el vi és l'element en ladieta europea que més contribueix a l'ingesta d'OTA.L'OTA és una potent toxina que afecta principalment els ronyons, on pot provocar tantlesions agudes com cròniques. A part de la nefrotoxicitat, estudis toxicològics ambanimals han demostrat que també te propietats genotòxiques, carcinogèniques iimmunosupressives. A més, es sospita que és la causa d'una malaltia mortal per alshumans observada en l'Europa de l'Est i coneguda com la 'Nefropatia Endèmica delsBalcans', així com de la formació de tumors en el tracte urinari d'humans.Breument, els objectius del present treball són: (i) fer una valoració del nivell decontaminació per OTA en begudes espanyoles derivades del raïm i estudiar la possibleinfluència de diverses variables en el contingut d'OTA de vins i productes derivats; (ii)estudiar la micoflora de diverses vinyes espanyoles durant quatre anys consecutiusmitjançant mostrejos de camp, per tal d'aclarir on, quan i fins a quin punt existeix OTAen aquest país; (iii) identificar i estudiar l'efecte de diversos factors ecofisiològics i de lesseves interaccions en fongs potencialment productors d'OTA aïllats de raïm devinificació, per tal de trobar les condicions que puguin minimitzar o prevenir el seucreixement i la formació de la toxina. Es van dur a terme estudis addicionals perinvestigar, en primer lloc, els efectes in vitro de l'aplicació de fungicides en raïm, i totseguit, l'efecte del diferents tractaments fungicides en raïm al camp. També s'haaconseguit visualitzar la colonització i els primers estadis d'infecció d'Aspergilluscarbonarius en raïm, amb l'ajut de la microscopia de fluorescència làser confocal, epi- iestereomicroscopia, desprès de transformar aquest fong amb el gen de la proteïna defluorescència verda (gfp).S'ha vist que prop d'un 20 % dels vins espanyols analitzats contenien OTA, la majoria aconcentracions per sota dels límits establerts per la UE, i que els Aspergillus negres sónels responsables de la producció d'aquesta toxina en aquest país, sobretot Aspergilluscarbonarius. Malgrat el domini de les espècies de l'agregat A. niger en el raïm, i degut ala seva modesta capacitat de produir la toxina i a les baixes quantitats produïdes, la sevacontribució al problema de l'OTA és ínfima. Les espècies uniseriades foren descartadesen aquest aspecte, doncs no es va detectar toxina en cap de les soques aïllades.Els Aspergillus negres foren presents en el raïm des del quallat fins a la collita, en lamajoria de vinyes. Tanmateix, la seva incidència augmentà amb la maduració del raïm,doncs les altes temperatures i humitat afavoriren el desenvolupament i producció d'OTAd'aquests fongs. Es va demostrar l'habilitat d'A. carbonarius de créixer en l'interval 10-45 ºC i 0,88-0,995 d'activitat d'aigua (aw), amb l'òptim al voltant de 30 ºC i a les mésaltes aw. Les condicions de temperatura favorables per a la producció d'OTA foren mésrestringides, essent 20 ºC i les altes aw les condicions òptimes. També s'estudiaren altresfactors ecofisiològics com el país d'origen de les soques, les condicions de fotoperiode, l'alternança de temperatures, etc., doncs el coneixement dels factors que donen lloc a laproducció d'OTA pot ajudar a dissenyar estratègies per limitar la seva formació.En la part final d'aquesta tesi s'han suggerit diverses maneres de prevenir i controlar elsAspergillus negres i la seva micotoxina. Com que s'ha vist que la producció d'OTA perAspergillus negres és òptima poc temps desprès de la seva inoculació, la reducció deltemps de collita i transport al celler serà decisiva per reduir els nivells d'aquesta toxina.També s'ha de procurar minimitzar els danys en la pell del raïm, doncs s'ha vist que lesobertures fomenten la entrada del fong que es troba colonitzant la superfície,probablement afavorint la màxima producció d'OTA. L'execució d'altres mesurespreventives com el control de fongs patògens i d'insectes durant el creixement del raïm -es varen fer assaigs amb diversos fungicides in vitro i in vivo-, i d'altres bones pràctiquesagronòmiques, poden ajudar a reduir la contaminació per OTA del raïm.Com a conclusió general, s'ha vist que diversos factors poden ajudar a prevenir eldesenvolupament dels fongs ocratoxigènics, però és necessari aplicar un sistema demètodes combinats per tal de controlar el creixement i subseqüent producció d'OTA peraquests microorganismes. Les mesures preventives són sempre preferibles a les accionscorrectores, i junt amb un degut control de l'OTA en els derivats del raïm, asseguraranuna adequada protecció del consumidor. / La ocratoxina A (OTA) es un metabolito secundario tóxico producido esencialmente porhongos de los géneros Aspergillus y Penicillium, bajo diversas condiciones. Su presenciaen el cuerpo humano es debida a la ingestión de pequeñas cantidades provenidas de unamplio abanico de alimentos, tanto de origen vegetal como animal. Después de loscereales, el vino es el elemento en la dieta europea que más contribuye a la ingesta diariade OTA.La OTA es una potente toxina que afecta principalmente los riñones, dónde puedeprovocar tanto lesiones agudas como crónicas. A parte de la nefrotoxicidad, estudiostoxicológicos en animales han demostrado que también tiene propiedades genotóxicas,carcinogénicas e inmunosupresivas. Además, se sospecha que es la causa de unaenfermedad mortal para los humanos observada en la Europa del Este y conocida como la'Nefropatía Endémica de los Balcanes', así como de la formación de tumores en el tractourinario de humanos.Brevemente, los objetivos del presente trabajo son: (i) valorar el nivel de contaminaciónpor OTA en bebidas españolas derivadas de la uva y estudiar la posible influencia devarias variables en el contenido de OTA de vinos y productos derivados; (ii) estudiar lamicoflora de distintos viñedos españoles durante cuatro años consecutivos mediantemuestreos de campo, para esclarecer dónde, cuándo y hasta que punto existe OTA en estepaís; (iii) identificar y estudiar el efecto de varios factores ecofisiológicos y de susinteracciones en hongos potencialmente productores de OTA aislados de uva devinificación, para encontrar las condiciones que puedan minimizar o prevenir sucrecimiento y la formación de OTA. Se llevaron a cabo estudios adicionales parainvestigar en primer lugar los efectos in vitro de la aplicación de fungicidas en uva,seguido del efecto de diferentes tratamientos fungicidas en uva en el campo. También seha conseguido visualizar la colonización y los primeros estadios de infección deAspergillus carbonarius en uva, gracias a la microscopia de fluorescencia láser confocal,epi- y estereomicroscopia, después de transformar este hongo con el gen de la proteína defluorescencia verde (gfp).Se vio que aproximadamente un 20 % de los vinos españoles analizados contenían OTA,la mayoría a concentraciones por debajo de los límites establecidos por la UE, y que losAspergillus negros son los responsables de la producción de esta toxina en este país,sobretodo Aspergillus carbonarius. Pese al dominio de las especies del agregado A. nigeren la uva, y debido a su modesta capacidad de producir la toxina y a las bajas cantidadesproducidas, su contribución al problema de la OTA es ínfima. Las especies uniseriadasfueron descartadas en este aspecto, ya que no se detectó toxina en ninguna de les cepasaisladas.Se detectaron Aspergillus negros en la uva desde el cuajado hasta la cosecha, en lamayoría de viñedos. No obstante, su incidencia aumentó con la maduración de la uva,pues las altas temperaturas y humedad favorecieron el desarrollo y producción de OTApor estos hongos. Se demostró la capacidad de A. carbonarius de crecer en el intervalo10-45 ºC y 0,88-0,995 de actividad de agua (aw), con el óptimo alrededor de 30 ºC y a lasmás altas aw. Las condiciones de temperatura favorables para la producción de OTAfueron más restringidas, siendo 20 ºC y las altas aw las condiciones óptimas. También seestudiaron otros factores ecofisiológicos como el país de origen de las cepas, lascondiciones de fotoperiodo, la alternancia de temperaturas, etc., pues el conocimiento delos factores que dan lugar a la producción de OTA pueden ayudar a diseñar estrategiaspara limitar su formación.En la parte final de esta tesis se han sugerido varias maneras de prevenir y controlar losAspergillus negros y su micotoxina. Como que se ha visto que la producción de OTA porlos Aspergillus negros es óptima poco tiempo después de su inoculación, la reducción deltiempo de cosecha y transporte a la bodega será decisivo para reducir los niveles de estatoxina. También se ha de procurar minimizar los daños en la piel de la uva, pues se havisto que las aperturas fomentan la entrada del hongo que se encuentra colonizando lasuperficie, probablemente permitiendo la máxima producción de OTA. Laimplementación de otras medidas preventivas como el control de hongos patógenos y deinsectos durante el crecimiento de la uva -se ensayaron varios fungicidas in vitro e invivo-, y de otras buenas prácticas agronómicas, pueden ayudar a reducir la contaminaciónpor OTA de la uva.Como conclusión general, se ha visto que varios factores poden ayudar a prevenir eldesarrollo de los hongos ocratoxigénicos, pero es necesario aplicar un sistema de métodoscombinados para controlar el crecimiento y subsiguiente producción de OTA por estosmicroorganismos. Las medidas preventivas son siempre preferibles a las accionescorrectoras, y junto con un debido control de la OTA en los derivados de la uva,aseguraran una adecuada protección del consumidor. / Ochratoxin A (OTA) is a toxic secondary metabolite produced by moulds belongingessentially to the Aspergillus and Penicillium genera, under diverse conditions. Itspresence in the human body is due to the ingestion of small quantities present in a widerange of food commodities, both of vegetable and animal origin. Next to cereals, wine inthe European diet is the second major source of OTA.OTA is a potent toxin affecting mainly the kidneys, in which it can cause both acute andchronic lesions. Besides nephrotoxicity, toxicological studies on animals havedemonstrated that it has mainly, genotoxicity, carcinogenicity and immunosuppressiveproperties. Furthermore, it is suspected to be a possible cause of the fatal human diseaseknown as Balkan endemic nephropathy observed in South Eastern Europe, and of theurinary tract tumours in humans.Briefly, the objectives of the present project are: (i) to assess the level of OTAcontamination in Spanish grape-based beverages and to study the possible influence ofseveral variables in the OTA content of wines and derivatives; (ii) to survey themycoflora of several Spanish vineyards during four-year consecutive field samplings, inorder to clarify where, when and to what extent OTA occurs in this country; (iii) toidentify and study the effect of various ecophysiological factors and their interactions onpotential ochratoxigenic fungi isolated from wine grapes, in order to find out theconditions that might minimize or prevent their growth and OTA formation. Additionalstudies to investigate, first the impact of application of fungicides to grapes in vitro, andlater the effect of different fungicide treatments on grapes in the field, were carried out.Visualization of Aspergillus carbonarius grape colonization and early infection was alsoachieved with epi-, stereo- and confocal fluorescence microscopy, after thetransformation of this fungus with the reporter green fluorescent protein gene (gfp).It has been shown that nearly 20 % of the Spanish wines tested contained OTA, most ofthem at concentrations below the EU limits, and that black aspergilli are responsible forthe production of this toxin in this country, mainly A. carbonarius. Despite A. nigeraggregate species were dominant in grapes, because of their modest ability and lowamounts produced, their contribution to the OTA problem is rather small. Uniseriatespecies were discarded as a source of OTA in the surveyed regions, as no toxin wasdetected in any of the isolates.Black aspergilli were present on grapes from setting to harvest in most of the vineyards.However, their occurrence increased with grape maturity in the field, related to the factthat high temperature and humidity favoured black aspergilli development and OTAproduction. It was shown the growing ability of A. carbonarius in the range 10-45 ºC and0.88-0.995 of water activity (aw), with an optimum around 30 ºC and at the highest aw.Temperature conditions for OTA production were more restrictive, with optimumdetected at 20 ºC and at the highest water availability. Other ecophysiological factorssuch as the country of origin of the strains, photoperiod conditions, alternation oftemperatures, etc. were also studied, as understanding the factors leading to OTAsynthesis will enable strategies to limit its formation.Several effective ways for prevention and control of black aspergilli and their dangerousmycotoxin have been suggested in the final part of this thesis. As OTA production byblack aspergilli has been shown to occur optimally very early after inoculation,minimizing the harvesting and transport time to wine cellars might be crucial to reducethe toxin levels. Attention should also be paid in minimizing damages on grape skin, as itwas shown that openings trigger the entrance of the fungi colonizing the berry surface,probably enabling production of maximum amounts of OTA. The implementation ofother preventive measures such as controlling pathogenic fungi and insects during grapegrowing -some fungicides have been tested in vitro and in vivo-, and other goodagricultural practices, may help in the reduction of OTA contamination in grapes.As a general conclusion, several factors were found to help in the prevention ofochratoxigenic fungi development, but it may be necessary to apply a multiple barrierapproach to control the growth and subsequent OTA production of these microorganisms.Prevention measures are always preferable to corrective actions, and together with aproper control of OTA in grape-derivatives, should ensure the adequate protection of theconsumer.