Toxoplasma gondii é um parasito do filo Apicomplexa que infecta uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os humanos. O parasito invade a célula hospedeira por penetração ativa, com a participação das proteínas de suas organelas secretoras durante esse processo. Até o momento, somente um número limitado de proteínas secretoras tem sido descoberto, além disso, as moléculas efetoras envolvidas na invasão e sobrevivência do parasito não estão completamente compreendidas. A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína adesiva secretada, multifuncional, que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de ligação à integrina, que está envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo sinalização e sobrevivência celular. Pela primeira vez, nós demonstramos pelas técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural que há uma intensa marcação para uma proteína OPN-like nos grânulos densos de taquizoítos de T. gondii extracelulares. O western blotting e o RT-PRC confirmaram a expressão de OPN-like nos taquizoítos. Nossos resultados também mostram que após a invasão dos macrófagos, a proteína OPN-like está localizada na membrana do vacúolo parasitóforo. Esses dados sugerem que os grânulos densos secretam uma proteína OPN-like, e nós podemos especular que essa proteína participa durante o processo de interação do parasito com as células hospedeiras. . / Toxoplasma gondii is an apicomplexan parasite infecting a broad host range, including humans. The parasite invades host cell by active penetration with the participation of its secretory organelles proteins during this process. Until now, only a limited number of secretory proteins have been discovered, and the effectors molecules involved in parasite invasion and survival are not well understood. Osteopontin (OPN) is a multifunctional secreted adhesive glycophosphoprotein containing the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) integrin-binding domain, which is involved in various physiological and pathological events including cell signaling and survival. For the first time we demonstrated by immunofluorescence and immunoelectron microscopy approaches that there is an intense labeling for an OPN-like protein in the dense granules of extracellular T. gondii tachyzoites. Western blotting and RTPCR confirmed this protein expression in tachyzoites. Our results also showed that after macrophage invasion the OPN-like protein is localized at the parasitophorous vacuole membrane. These data suggest that dense granules secrete an OPN-like protein, and we can speculate that this protein participates during the parasite interaction process with host cells.

Foram colhidas, de março a junho de 2004, amostras de sangue de 108 carneiros e 920 matrizes de 32 propriedades comerciais de ovinos do Distrito Federal, totalizando 1028 amostras. Os soros foram submetidos à reação de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando-se as diluições 1:64 e 1:50 como ponto de corte para, respectivamente, T. gondii e N. caninum. A prevalência observada para T. gondii foi de 38,22% (26,81% < IC 0,95 < 49,62%). Os títulos variaram de 64 a 65536, e o título com maior freqüência foi 2048 (21,15%). Para N. caninum, a prevalência foi de 8,81% (7,08% < IC 0,95 < 10,53%), com títulos variando de 50 a 51200, sendo o título mais freqüente 50 (21,11%). Ovinos reagentes a ambos os parasitas corresponderam a 4,67%. A análise dos possíveis fatores de risco não foi possível, pois todas as propriedades possuíam ao menos um animal positivo para T. gondii e a maioria (87,50%) das propriedades foram positivas para N. caninum. A prevalência para T. gondii foi significativamente maior entre os machos que entre as fêmeas. Utilizando-se reação em cadeia pela polimerase e enzimas de restrição para o locus SAG2, em uma amostra de cérebro dentre 11 colhidas em um abatedouro da região foi identificado T. gondii tipo I. Os resultados demonstram que as infecções pelos dois parasitas estão presentes e disseminadas no rebanho ovino do Distrito Federal. / From March to June 2004, serum samples from 108 rams and 920 ewes were collected from 32 herds within Distrito Federal, Brazil. The samples were tested by Immunofluorescent Antibody Test, using sera diluted 1:64 and 1: 50 as cut-off values for the detection of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum, respectively. The observed prevalence for T. gondii infection was 38.22% (26.81%<IC 0,95<49.62%). The titers encountered ranged from 64 to 65536, with the most prevalent titer being 2048 (21.15%). The observed prevalence for N. caninum infection was 8.81% (7.08%<IC 0,95<10,53%). The titers ranged from 50 to 51200, being 50 the most frequent titer value (21.11%). The reactant sera to both pathogens corresponded to 4.67% of the samples. The risk factors for T. gondii and N. caninum infections were not determined because of the absence of negative herds for T. gondii infection and the high proportion of herds positive for N. caninum infection (87.50%). The prevalence for T. gondii infection was significantly higher among males than in females. By using the polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism of locus SAG2 on 11 brain samples collected in a regional slaughterhouse, only one sample was positive and proved to be archetype I. The results show that infection by both parasites is widespread in the ovine population from Distrito Federal.

O Toxoplasma gondii apresenta uma estrutura populacional clonal. A análise genotípica do locus SAG2 foi realizada para determinar a ocorrência de diferentes linhagens de T. gondii (tipos I, II e III) em gatos domésticos. Amostras de soro de 237 gatos de 15 municípios no estado de São Paulo foram testadas para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii através do teste de aglutinação modificado (MAT). Anticorpos (MAT &ge; 25) foram encontrados em 84 (35,4%) dos 237 gatos. Com os tecidos (cérebro, coração, língua e musculatura esquelética) de 71 gatos positivos foram realizados bioensaios em camundongos (cinco camundongos por grupo) sendo obtidos 47 isolados. A análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela PCR revelou que 34 isolados (72,4%) eram do tipo I, 12 (25,5%) eram do tipo III e um (2,1%) apresentava infecção mista (tipo I e tipo III). Não houve isolado do tipo II. A maioria dos isolados do tipo I (23/34) causou o óbito de todos os camundongos infectados e a maioria dos isolados do tipo III (7/12) não levou ao óbito nenhum camundongo infectado. Foram encontrados cistos no cérebro dos camundongos infectados em todos os 47 isolados. A determinação genotípica também foi feita diretamente das amostras primárias dos gatos (homogeneizados de tecidos) usando a nested-PCR-RFLP. A caracterização do locus SAG2 foi bem sucedida em 80,4% (37/46) das amostras testadas. Os genótipos obtidos das amostras primárias foram idênticos aos dos isolados correspondentes. O genótipo misto foi confirmado pelo seqüenciamento direto de DNA dos produtos da PCR obtidos do isolado e da amostra primária do gato. Amostras dos cinco camundongos infectados com este isolado foram seqüenciadas. Três camundongos se infectaram com o genótipo tipo III, um com o genótipo tipo I e o outro com o genótipo misto, demonstrando que infecções mistas podem originar diferentes padrões de infecção em um hospedeiro. / Toxoplasma gondii has a clonal population structure. Genotypic analysis of the SAG2 locus was performed to determine the occurrence of the different lineages of T. gondii (types I, II and III) in domestic cats. Antibodies to T. gondii were determined in serum samples of 237 cats from 15 counties in São Paulo state, Brazil, by the modified agglutination test (MAT). Antibodies (MAT &ge; 25) were found in 84 (35.4%) of 237 cats. Tissues (brain, heart, tongue and skeletal muscle) of 71 of the positive cats were bioassayed in mice (five mice per group). Forty-seven isolates were obtained. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) in PCR-amplified SAG2 products revealed that 34 isolates (72.4%) were type I, 12 (25.5%) were type III and one (2.1%) was mixed with type I and type III. There was no type II isolate. Most of the type I isolates (23/34) killed all infected mice and most of the type III isolates (7/12) killed no infected mice. Tissue cysts were found in mice infected with all 47 isolates. The genotype determination was also made directly from primary samples from cats (tissue homogenates) using nested-PCR-RFLP analysis. Characterization of the SAG2 locus was successful in 80.4% (37/46) of the samples tested. Genotypes obtained from primary samples were the same as those from the corresponding isolates. The mixed genotype was confirmed by direct DNA sequencing of PCR products from the isolate and from the cat primary sample and samples from the five mice infected with this isolate were sequenced. Three had type III genotype, one had type I, and one had type I + type III, demonstrating that mixed infections can originate different patterns of infection in a host.

A toxoplasmose, protozoose disseminada de baixa morbidade, apresenta número significativo de doença ocular, congênita ou do sistema nervoso central. O diagnóstico é sorológico por diferentes testes, mas limiares baixos e variação individual levam a frequentes problemas. Novos imunoensaios fluorescentes de fase sólida (FLISA) usam a quantificação direta de anticorpos. Aqui, desenvolvemos um FLISA multiplex (FLISAm) para a detecção simultânea de anticorpos IgG e IgM contra Toxoplasma gondii. Após padronização, a eficiência do FLISAm com conjugados comerciais foi feita inicialmente de forma isolada para cada imunoglobulina em 140 amostras de soro de universitários previamente analisadas pelo ELISA IgG/IgM. FLISA IgG mostrou boa concordância (Kappa=0,7088), com sensibilidade de 83,3% e especificidade de 94,2%, enquanto FLISA IgM apresentou boa concordância (K=0,6026), menor sensibilidade de 55,5% e igual especificidade de 98,4%. Foram produzidos novos conjugados fluorescentes de maior especificidade e seu desempenho no FLISAm foi validado em 24 amostras e sua eficiência foi avaliada em 120 amostras conhecidas de soro de gestantes. FLISAm mostrou excelente concordância, tanto para a detecção de anticorpos IgG (K=0.8837, sensibilidade=100,0%, especificidade=87,5%), quanto para a detecção de anticorpos IgM (K=0,9187, sensibilidade=100%, especificidade=99,1%) com excelente reprodutibilidade. O teste desenvolvido é rápido, econômico, de fácil execução, alto rendimento e que pode ser utilizado como método de triagem de soroconversão em mulheres grávidas, útil em aplicações de grande número de amostras como o cuidado pré-natal. / Toxoplasmosis, a disseminated low morbidity protozoan disease, presented significant numbers of affected people, mainly ocular disease, fetal infections or encephalitis in immune deficient patients. Serology is the main diagnosis with commercial antibody assays, but individual variation or low thresholds cause many inconsistencies. New solid phase immunofluorescence assays (FLISA) allows direct antibody quantification in microplates. Here, we developed a multiplex FLISA (FLISAm) for simultaneous detection of IgG and IgM anti-Toxoplasma gondii antibodies. After standardization, the efficiency of this method was initially analyzed in isolated FLISA for each immunoglobulin with commercial conjugates in 140 serum samples of the students previously screened by IgG/IgM ELISA. IgG FLISA showed good concordance (Kappa=0.7088), 83,3% sensitivity and 94,2% specificity, while IgM FLISA also showed good concordance (Kappa=0,6026), lower 55,5% sensitivity and similar 98,4% specificity. New higher efficiency conjugated were prepared and tested in 120 serum samples of the pregnant woman in a same well conjunct IgG/IgM FLISAm. We also validate the FLISAm in 24 serum samples. Compared to isolated ELISA IgG/IgM, FLISAm demonstrated excellent concordance for IgG (Kappa=0.8837; sensitivity=100%; specificity=87,5%,) and IgM (Kappa=0,9187; sensitivity=100%; specificity=99,1%), with excellent reproducibility. The standardized FLISAm is quick, inexpensive, easily performed and high throughput and the assay can be used for screening serum conversion in pregnant women, useful in large numbers applications as antenatal care.

As formas sintomáticas de toxoplasmose são um grave problema de saúde pública e ocorrem em cerca de 10 a 20% das pessoas infectadas. Com o objetivo de melhorar o diagnóstico molecular de toxoplasmose sintomática em pacientes brasileiros, este estudo avaliou o desempenho da PCR em tempo real (qPCR) na detecção do DNA de T. gondii testando dois conjuntos de iniciadores moleculares (B1 e REP-529) para diagnóstico molecular. A metodologia foi testada em 807 amostras clínicas com diagnóstico clínico conhecido, ELISA e PCR convencional (cPCR) em um período de 9 anos. Todas as amostras foram de pacientes com suspeita clínica de diferentes formas da toxoplasmose. De acordo com a curva mínima de limite de detecção (no CT), o REP-529 apresentou maior sensibilidade para detectar DNA de T. gondii do que B1. Ambos os conjuntos de iniciadores moleculares foram avaliados retrospectivamente usando o DNA de 515 amostras clínicas diferentes. Os 122 pacientes com resultado negativo na PCR em tempo real, provavelmente por terem infecção crônica, demonstraram alta especificidade (REP-529, 99,2% e B1, 100%). Das 393 amostras com ELISA positivo (IgG), 146 apresentaram diagnóstico clínico de toxoplasmose e cPCR positivo. As sensibilidades de REP-529 e B1 foram de 95,9% e 83,6%, respectivamente. A comparação dos desempenhos do REP-529 e B1 foi analisada prospectivamente em 292 amostras. Assim, a partir de um total de 807 amostras de DNA analisadas, 217 (26,89%) apresentaram PCR positivo, pelo menos em um conjunto de iniciadores e com toxoplasmose sintomática confirmada pelo diagnóstico clínico. O REP-529 foi positivo em 97,23%, enquanto o B1 amplificou apenas 78,80%. Depois de comparar várias amostras em um laboratório brasileiro de referência, este estudo concluiu que o conjunto de iniciadores REP-529 apresentou melhor desempenho do que B1. Essas observações foram baseadas após o uso de casos com diagnóstico clínico definido, ELISA e cPCR. / Symptomatic forms of toxoplasmosis are a serious public health problem and occur in around 10-20% of the infected people. Aiming to improve the molecular diagnosis of symptomatic toxoplasmosis in Brazilian patients, this study evaluated the performance of real time PCR (qPCR) in detecting T. gondii DNA testing two primer sets (B1 and REP-529) for molecular diagnosis. The methodology was assayed in 807 clinical samples with known clinical diagnosis, ELISA, and conventional PCR (cPCR) results in a 9-year period. All samples were from patients with clinical suspicion of several features of toxoplasmosis. According to the minimum detection limit curve (in CT), REP-529 had greater sensitivity to detect T. gondii DNA than B1. Both primer sets were retrospectively evaluated using 515 DNA from different clinical samples. The 122 patients without toxoplasmosis (with negative real-time PCR) provided high specificity (REP-529, 99.2% and B1, 100%). From the 393 samples with positive ELISA (IgG), 146 had clinical diagnosis for toxoplasmosis and positive cPCR. REP-529 and B1 sensitivities were 95.9% and 83.6%, respectively. Comparison of REP-529 and B1 performances was further analyzed prospectively in 292 samples. Thus, from a total of 807 DNA analyzed, 217 (26.89%) had positive PCR with, at least one primer set and with symptomatic toxoplasmosis confirmed by clinical diagnosis. REP-529 was positive in 97.23%, whereas B1 amplified only 78.80%. After comparing several samples in a Brazilian referral laboratory, this study concluded that REP-529 primer set had better perform than B1 one. These observations were based after using cases with defined clinical diagnosis, ELISA, and cPCR.

O objetivo deste estudo foi o isolamento de Toxoplasma gondii de ovinos e caprinos e posterior caracterização genotípica desses isolados. Amostras de soros ovinos (495) de 36 Municípios do Estado de São Paulo e de caprinos (143) de seis Municípios dos Estados da Bahia (10), Paraíba (12), Rio Grande do Norte (7) e São Paulo (114) foram testadas, através do Teste de Aglutinação Modificado (MAT&ge;25) à presença de anticorpos anti-T. gondii. Dos animais amostrados, 24,2% e 32,2% dos ovinos e caprinos respectivamente, apresentaram-se positivos com títulos que variaram de 25 a 3200 em ambas espécies. Dentre os ovinos houve associação (p<0,001) entre sexo, idade e sistema de produção com a presença de anticorpos anti-T. gondii. Os caprinos apresentaram associação entre idade, sistema de produção, e raça com a soropositividade. Para o isolamento do agente o bioensaio em camundongos foi realizado utilizando-se pool de tecidos de ovinos (cérebro, coração e diafragma) e caprinos soropositivos (cérebro, coração e diafragma e masseter). Dos 82 bioensaios realizados com amostras de ovinos, 16 isolados (19,5%) foram obtidos. Houve associação entre o título de anticorpos anti-T. gondii e o isolamento do agente (p<0,001) com maior quantidade de isolados obtidos de animais com títulos mais altos. Para a caracterização genotípica das amostras utilizou-se a análise de polimorfismo de comportamento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela PCR, que as identifica em genótipos I, II e III. Amostras do tipo I (87,5% dos ovinos e 100 % dos caprinos) e do tipo III (12,5% dos isolados de ovinos) foram obtidas e não houve o encontro de isolados tipo II ou mistas. Nos tecidos dos animais com títulos de anticorpos superiores a 400, e dos quais não se obteve o isolamento do agente pelo bioensaio (21 amostras de ovinos), foi realizada a nested-PCR das amostras primárias (homogeneizado de tecidos), não sendo obtida nenhuma amplificação. Amostras do tipo III não causaram óbitos nos camundongos e as tipo I causaram óbitos em 51,0% e 83,4% dos isolados de ovinos e caprinos, respectivamente. Houve associação entre a sobrevida dos camundongos infectados com o genótipo I de caprinos e ovinos (p<0,001). / The aim of this study was to analyze the SAG2 locus of Toxoplasma gondii isolated from sheep and goats in order to determine the frequency of occurrence of the three different lineages (types I, II and III). Serum samples of sheep (495) from 36 counties in São Paulo State and goat (143) from six counties in States of Bahia (10), Paraíba (12), Rio Grande do Norte (7) and São Paulo (114) were analyzed by the modified agglutination test (MAT&ge;25) for the detection of antibodies anti-T. gondii. Occurrence of antibodies anti-T. gondii was 24.2% and 32.2% in sheep and goats, respectively. The titers varied from 25 to 3200 in both species. Among sheeps, association of seropositivity (p<0,001) with sex, age, production system and presence of antibodies anti-T. gondii was observed. Association was also observed between the frequency of seropositive goats and age, production system and breed. For T. gondii isolation, pool of tissues of each seropositive sheep (brain, heart and diaphragm) and goat (brain, heart, diaphragm and masseter) were bioassayed in mice. From a total of 82 bioassay performed with sheep samples, 16 isolates (19.5%) were obtained. Association between antibodies anti-T. gondii titers and isolation was observed (p<0.001). Considering the goats, 12 isolates (42.6%) were obtained from 26 bioassays. For the genotypic characterization (genotype I, II and III), the restriction fragment length polymorphism (RFLP) was performed on fragments of the locus SAG2 amplified by PCR. Samples of type I (87.5% from sheep and 100% from goats) and type III (12.5% from sheep) was observed. Neither type II nor mixed samples were observed. In tissues samples from animals with antibodies titers above 400 in which T. gondii was not isolated (21 sheep sample), nested-PCR was performed and no amplification was observed. Mortality was not observed in the mice infected by the isolates type III. The isolates of type I from sheep and goats, respectively, killed 51.0% and 83.4% of the infected mouse. Association was also observed between mortality rate in infected mice and genotype I of sheep and goat (p<0.001).

Apesar de o protozoário Toxoplasma gondii ser considerado a única espécie válida para o gênero, são reconhecidas três linhagens clonais, denominadas Tipo I, Tipo II e Tipo III, predominantes em países da Europa ocidental e Estados Unidos. Com a pesquisa de amostras deste parasito provenientes de outras regiões do mundo, como no caso do Brasil, várias outras configurações genotípicas diferentes das dos arquétipos mencionados acima vêm sendo encontradas. Neste trabalho, quarenta galinhas/galos (Gallus domesticus) de criação livre de oito propriedades rurais de áreas limítrofes ao Pantanal da Nhecolândia no estado do Mato Grosso do Sul foram eutanasiadas e amostras de sangue, cérebro e coração foram coletadas. O sorodiagnóstico foi realizado através do Teste de Aglutinação Modificado (MAT) e, com um pool de órgãos dos animais positivos, foi realizado bioensaio em camundongos. Foram obtidos, após o bioensaio, 11 isolados de T. gondii. O DNA foi extraído dos tecidos dos camundongos infectados e a tipificação dos isolados foi realizada utilizando 12 marcadores PCR-RFLP, genericamente denominados SAG1, 5´3´SAG2, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3. Vinte e sete galinhas (67,5%) foram sorologicamente positivas para T. gondii e 13 (32,5%) foram negativas. Das amostras soropositivas, 7 (25,9%) foram positivas na diluição 1:5, 3 (11,1%) em 1:10, 2 (7,4%) em 1:20, 3 (11,1%) em 1:320, 1 (3,7%) em 1:640, 3 (11,1%) em 1:1280, 2 (7,4%) em 1:2560, 4 (14,8%) em 1:5120 e 2 (7,4%) em 1:10240. Quanto à genotipagem, cinco genótipos foram revelados nos 11 isolados de galinhas de cinco propriedades do município de Aquidauana e uma propriedade do município de Rio Verde do Mato Grosso, incluindo um genótipo misto encontrado em um isolado (TgCkBr198) que demonstrou um complexo cujos padrões são uma combinação de 2 alelos observados em oito loci. Dois genótipos foram descritos pela primeira vez, considerando os 140 isolados de galinhas de diferentes regiões brasileiras avaliadas em estudos anteriores. Os resultados corroboram com estudos anteriores sobre os isolados de T. gondii no Brasil, confirmando sua diversidade e atipicidade. / Despite the protozoan Toxoplasma gondii is considered the only valid species for the genus, three clonal lineages are recognized, known as the Type I, Type II and Type III, which predominate in Western European countries and the USA. The search for samples of this parasite from other regions of the world, as in the case of Brazil, has revealed different genotypes other than the archetypes above mentioned. In this study, forty free range chickens (Gallus domesticus) of eight farms from areas belonging to the Pantanal Nhecolândia in the state of Mato Grosso do Sul were euthanized and samples of blood, brain and heart were collected. The serodiagnosis was performed using the technique of modified agglutination test (MAT) and a pool of organs of seropositive animals was used to perform the bioassay in mice. It was obtained 11 isolates of T. gondii. DNA was extracted from tissues of infected mice and characterization of isolates was performed using 12 PCR-RFLP markers, known generically SAG1, 5\'3\'SAG2, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, C29-2, L358, PK1, Apico and CS3. Twenty-seven chickens (67.5%) were serologically positive for T. gondii and 13 (32.5%) were negative. Among the seropositive samples, 7 (25.9%) were positive at 1:5 dilution, 3 (11.1%) in 1:10, 2 (7.4%) in 1:20, 3 (11.1%) at 1:320, 1 (3.7%) at 1:640, 3 (11.1%) in 1:1280, 2 (7.4%) in 1:2560, 4 (14.8%) on 1:5120 and 2 (7.4%) at 1:10240. With regard to genotyping, five genotypes were found within 11 isolates from chickens from five properties in the municipality of Aquidauana and one property of the municipality of Rio Verde of Mato Grosso, including a mixed genotype found in one isolate (TgCkBr198) that showed a complex pattern which is a combination of 2 alleles observed at eight loci. Two genotypes have been described for the first time, considering the 140 isolates from chickens in different Brazilian regions evaluated in previous studies. The results corroborate with previous studies on the isolates of T. gondii in Brazil, confirming their diversity and atypicality.

Foi realizada a pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, através do teste de aglutinação modificado (MAT), em 68 amostras de soros de capivaras de seis municípios no estado de São Paulo. Anticorpos (MAT?25) foram encontrados em 51 (75%) capivaras examinadas. Dentre estas realizou-se o bioensaio em camundongos, com tecidos do cérebro, coração e língua, de 40 capivaras, sendo obtidos 36 isolados (90%). Não houve associação entre o número de isolados e idade das capivaras (p=0,21), sexo (p=0,58) ou tipo de criação (p=0,62), isto é, criadouros e vida livre, bem como a freqüência de isolamentos e os títulos de anticorpos (p=0,99). A análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP) sobre produtos do locus SAG2 amplificados pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) revelou que 20 isolados (55,5%) pertenciam ao genótipo I, 14 (38,9%) ao genótipo III e dois (5,6%) que apresentaram genótipo misto (tipos I e III). Não foi encontrado isolado tipo II. A proporção de isolados tipo I entre as capivaras de vida livre foi maior (p=0,049) do que entre as capivaras provenientes de criadouros. Por outro lado, entre as capivaras de criadouros, a proporção de isolados tipo III foi maior (p=0,041). A maioria dos isolados tipo I (12/20) causou óbito em todos os camundongos infectados e, em nenhum grupo com este isolado, 100% dos camundongos sobreviveram. A maioria dos isolados tipo III (8/14) não matou nenhum camundongo infectado. A freqüência de óbitos em camundongos com genótipo I (86%) foi maior do que o tipo III (44,9%) (p<0,001), enquanto a sobrevida dos camundongos com genótipo III foi significativamente maior que a dos camundongos com genótipo I (p<0,001). Foram encontrados cistos nos cérebros dos camundongos infectados em todos os 36 isolados. A análise genotípica também foi realizada diretamente dos tecidos de 35 das 36 capivaras (homogeneizados de tecidos) das quais houve isolamento pelo bioensaio, usando nestedPCR-RFLP no locus SAG2. Foram caracterizadas 22 amostras (62,8%), 21 delas idênticas aos dos isolados correspondentes. Em uma amostra genótipo misto foi obtido dos tecidos primários e tipo I no isolado. Os genótipos mistos foram confirmados pelo seqüenciamento de DNA dos produtos da nestedPCR obtidos das amostras primárias das capivaras. / Antibodies to Toxoplasma gondii were assayed by the modified agglutination test (MAT) in serum samples of 68 capybaras from six counties in São Paulo state, Brazil. Antibodies (MAT?25) were found in 51 (75%) capybaras examined. Tissues (brain, heart and tongue) of 40 of the seropositive capybaras were bioassayed in mice and 36 (90%) isolates were obtained. There was no statistical association between number of isolates and age (p=0.21), gender (p=0.58) and type of rearing (p=0.62), as well as no association with frequency of isolations and antibody titer distribution (p=0.99). Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis in PCR-amplified SAG2 locus products revealed that 20 isolates (55.5%) were genotype I, 14 (38.9%) were genotype III and two (5.6%) were mixed genotypes (types I and III). Type II isolate was not found. The proportion of type I isolates in the group of wildlife capybaras was higher (p=0.049) than in the captive rearing group. On the other hand, the proportion of type III isolates was significantly higher in the captive rearing group (p=0.041). Most of the type I isolates (12/20) killed all infected mice and none of those groups had 100% of surviving mice. Most of the mice infected with genotype III isolate survived. The mortality rate in mice infected with genotype I (86%) was higher than the type III (44.9%) (p<0.001) and mice infected with type III isolates survived for longer periods than type I isolates (p<0.001). Tissue cysts were found in mice infected with all 36 isolates. Genotyping was also done directly from the tissue homogenates from the 35 of 36 capybaras using nested-PCR-RFLP analysis on the SAG2 locus. Twenty?two samples (62.8%) were characterized and in 21 the genotypes found were the same as those from the corresponding isolates. In one sample, mixed genotype was detected directly from the primary sample and type I from the mice isolate. The mixed genotype was confirmed by direct DNA sequencing of the nestedPCR products from the capybaras primary samples.

A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial. O Toxoplasma gondii infecta o Homem e a maioria dos animais homeotérmicos. A ingestão de oocistos esporulados é uma das formas de transmissão desse protozoário. Oocistos de T. gondii podem esporular na água do mar e manter a infectividade por até seis meses. Moluscos bivalves podem filtrar e reter oocistos de T. gondii da água do mar em condições experimentais. O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de T. gondii em ostras (Crassostrea rhizophorae) e mariscos (Mytella guayanensis) em condições naturais. Um total de 300 ostras e 300 mariscos foram adquiridos no Mercado de Peixes do município de Santos no estado de São Paulo no período de 05/03/2008 a 29/08/08 e divididos em 60 grupos de cinco ostras e 20 grupos de 15 mariscos. Para o isolamento do parasita, cinco camundongos foram inoculados oralmente com homogenados dos tecidos de cada grupo de ostras ou mariscos. Para a detecção molecular, o DNA dos tecidos dos mariscos foi extraído pelo método de fenol-clorofórmio e o das ostras, pelo método de isotiocianato de guanidina, Em seguida, foi realizada a nested-PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) baseada na amplificação de um fragmento de 155pb do gene B1 de T. gondii. A genotipagem das amostras de T. gondii detectadas foi feita usando a PCR-RFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de DNA gerados por Enzimas de Restrição) usando os marcadores SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, CS3 e Apico. Não houve isolamento do parasita pelo bioensaio em camundongos. Nos grupos de mariscos, o T. gondii não foi detectado pela n-PCR e, nos grupos de ostras, houve detecção do T. gondii em dois grupos (3,3%). Não foi possível a genotipagem das amostras de T. gondii detectadas. O presente estudo permitiu concluir que ostras da espécie Crassostrea rhizophorae podem filtrar e reter oocistos de T. gondii e que o ambiente marinho do litoral do estado de São Paulo encontra-se contaminado com oocistos desse parasita. Assim, o consumo de ostras cruas pode representar uma potencial via de transmissão de T. gondii para o Homem e para os animais marinhos. / Toxoplasmosis is a worldwide zoonosis. Toxoplasma gondii is widely prevalent in humans and other mammals. This protozoan parasite can be transmitted by ingestion of sporulated oocysts. T. gondiioocysts can sporulate in seawater and retain their infectivity for at least six months. Experimentally, bivalve mollusks can filter and retain T. gondii oocysts from the seawater. The aim of this study was to investigate the presence of T. gondii in oysters (Crassostrea rhizophorae) and mussels (Mytella guayanensis) in natural conditions. A total of 300 oysters and 300 mussels were acquired from the Fish Market in Santos city, São Paulo state, from March 2008 to August 2008, and divided in 60 groups of five oysters and 20 groups of 15 mussels. To isolate the parasite, five mice were orally inoculated with tissue homogenates from each group of oysters or mussels. For molecular detection of T. gondii, DNA from mussels was extracted using a standard phenol-chloroform method and DNA from oysters was extracted using the guanidine isothiocianate method. A nested-PCR (Polymerase Chain Reaction) based on the amplification of a 155bp fragment from B1 gene of T. gondii was then performed. Eleven PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markers including SAG1, SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, CS3 e Apico were used to genotype positive samples. There was no isolation of the parasite by bioassay in mice. T. gondii was not detected in the groups of mussels by n-PCR. There was detection of T. gondii by n-PCR in two groups of oysters (3.3%). Genotyping of these two positive samples was not successful. The results indicate that oysters of the species Crassostrea rhizophorae, the commonest species from the coast of São Paulo, can filter and retain T. gondii oocysts and that the marine environment of the coast of São Paulo state is contaminated with oocysts of this parasite. The ingestion of raw oysters can represent a potential transmission source of T. gondii to humans and marine mammals.

Toxoplasma gondii est un parasite intracellulaire obligatoire. L'infection par T. gondii est largement répandue dans le monde entier. Néanmoins, elle est peu étudiée dans les pays d'Asie du Sud-est dont la Thaïlande.Nous avons réalisé 3 travaux sur le terrain en Thaïlande pour essayer de comprendre la circulation de ce parasite à travers une étude de séroprévalence chez des poulets en zone rurale et des essais d’isolement de souches chez les animaux en vue d’un génotypage. Lors des deux premières missions de terrain dans deux villages de la province de Kanchanaburi, nous avons cherché à déterminer la séroprévalence de l’infection chez des poulets (Gallus domesticus) en utilisant 2 tests sérologiques, Modified-Agglutination Test (MAT et immunofluorescence indirecte (IFAT) puis à isoler des souches de T.gondii à partir des animaux séropositifs. Lors de la troisième mission réalisée dans 3 autres provinces thaïlandaises(Nakhonratchasima, Lopburi et Saraburi), nous avons essayé d’isoler directement le parasite à partir de carcasses de poulets vendues sur les marchés ou d’autres animaux trouvés morts.La séroprévalence globale pour les 2 premières misions sur 600 poulets du Kanchanaburi était de 17,7% (IC 95% :14,6-20,7) et 33,0% (IC 95% : 29,2-36,8), par MAT et IFAT respectivement. Le calcul du coefficient κ montre une absence de concordance entre les deux tests.Au total, 162 essais d'isolement ont été effectués par inoculation à des souris, mais aucune souche viable de T. gondii n'a été isolée pendant ces 3 travaux sur le terrain. Cependant, nous avons détecté la présence d’ADN toxoplasmique en qPCR ciblant le gène 529 bp dans 13 culots de digestion d’organes de poulets, pigeon, caille et dans des cerveaux ou coeurs de souris inoculés par 16 autres poulets. Les Ct observés en qPCR étaient ≥33 indiquant une faible quantité d’ADN parasitaire dans nos échantillons qui n’a pas permis une caractérisation génétique par marqueurs microsatellites.Ce travail a démontré l'importance et les difficultés du travail de terrain pour l'étude de séroprévalence ainsi que l'étude d'isolement. L'isolement des souches de T. gondii a demandé un travail d'échantillonnage intensif, complexe dans l’environnement tropical et humide de la Thaïlande. Les différents paramètres ayant pu avoir un impact négatif sur nos résultats sont discutés. Ils expliquent l’absence d’isolement de souches chez des animaux séropositifs. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite. Toxoplasma gondii infection is widespread throughout the world. Nevertheless, it is poorly studied in Southeast Asian countries including Thailand. We carried out 3 field works in Thailand to try to understand the circulation of T. gondii through a seroprevalence study in chickens in rural areas and strain isolation attempts in animals. During the two first field works, performed in Kanchanaburi province, we determined the seroprevalence in chickens (Gallus domesticus) using 2 serological tests, a Modified-Agglutination-Test (MAT) and an immunofluorescence assay (IFAT) and subsequently tried to isolate the strains of T. gondii from seropositive animals. During the third field work carried out in 3 other Thai provinces (Nakhonratchasima,Lopburi and Saraburi), we attempted to isolate strains directly from chicken carcasses sold in different markets or other dead animals.The overall seroprevalence for 600 chickens sampled over the two field works in Kanchanaburi was 17.7% (95%CI: 14.6% -20.7) and 33.0% (95% CI: 29.2-36.8), by MAT, and IFAT, respectively. The κ coefficient indicated an absence of concordance between the 2 serological tests.A total of 162 isolation attempts were performed by mouse bioassays, but no viable strain of T. gondii was isolated during these 3 field works. However, a qPCR targeting 529 bp T. gondii gene was positive for 13 digestion pellets of organs of chickens, pigeon, quail and in brains or hearts of mice inoculated with 16 other chickens. These qPCR were weaklly positive (Ct ≥33) indicating a low amount of parasite DNA in our samples that did not allow genotyping T. gondii with microsatellite markers.This work demonstrated the importance and difficulties of field work for the seroprevalence study as well as strain isolation. The isolation of T. gondii strains required intensive and complex sampling in the tropical and humid environment of Thailand. The diverse factors that could have a negative impact on our results are discussed. They might explain the absence of strain isolation from seropositive animals.