Made available in DSpace on 2016-04-04T12:37:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 vanessa_silva_ioc_mest_2015.pdf: 7589740 bytes, checksum: f30786929de0ecb93ed285b9615ab299 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Humana (AIDS) é causada pelo vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Existem dois tipos de vírus: HIV-1 e HIV-2, sendo o primeiro prevalente na maior parte do mundo. No ciclo biológico, o vírus utiliza três enzimas para a sua replicação: a Transcriptase Reversa (TR), a Integrase e a Protease. A TR é crucial no início do ciclo, dado que converte o RNA viral em DNA viral, se transformando em um alvo importante para o planejamento de novos inibidores. Os Inibidores da TR disponíveis no mercado são limitados, tóxicos e apresentam diversos efeitos colaterais indesejáveis, o que favorece a interrupção do tratamento causando resistência aos medicamentos. Este fato ressalta a urgência de novos fármacos mais eficientes e menos agressivos. O objetivo deste estudo é avaliar o modo de ligação de oito compostos derivados de dois inibidores nucleosídeos conhecidos da TR, o Abacavir (ABC) e a Lamivudina (3TC). Para atingir este objetivo, utilizamos metodologias computacionais como, Docking Molecular, ADME-Tox e Dinâmica Molecular. As técnicas computacionais propostas oferecem informação estrutural sobre o reconhecimento molecular de complexos receptor-ligante permitindo a realização de experimentos de desenho racional de fármacos para a obtenção de novos compostos A estrutura tridimensional da TR escolhida está disponível no banco de dados PDB em complexo com o Tenofovir, inibidor nucleotídeo da transcriptase reversa. Os resultados obtidos nos ajudam a propor os compostos 2 - (5 \2013 chloro \2013 2 - acetamidophenyl) \2013 N - [6 - (cyclopropylamino) \2013 9 - [3 - (hydroxymethyl) cyclopent \2013 1 \2013 en -1 - yl] -1,6 \2013 dihydropurin \2013 2 - yl] - 2,2 - difluoroacetamide e 2 - (2 - acetamidophenyl) - 2,2 \2013 difluoro \2013 N - {1 - [2 - (hydroxymethyl) - 1,3 \2013 oxathiolan \2013 5 - yl] \2013 2 \2013 oxopyrimidin - 4yl} acetamide análogos do Abacavir e da Lamivudina respectivamente, como os mais promissores. Paralelamente, foi identificado o modo de ligação da Lamivudina na TR por meio da Dinâmica Molecular, avaliando a evolução temporal de sua estrutura. A partir disso, torna-se possível analisar o modo de ligação de compostos que apresentem esse mesmo arcabouço / The Acquired Immuno Deficiency Syndrome (AIDS) is caused by the human immunodeficiency virus (HIV). There are two types of virus: HIV - 1, the most predominant in the world, and HIV - 2. The HIV - 1 cycle involves the use of three enzymes for its replication: reverse transcriptase, integrase and protease. The reverse transcriptase enzyme converts viral RNA into viral DNA, a crucial step in the beginning of the cycle, making it an important target for the design of new inhibitors. The reverse transcriptase inhibitors available on the market are limited, toxic and have many undesirable side effects, which favors interruption of treatment cause resistance in drugs . These facts highlight the urg ent need for new, more efficient and less harmful drug s. The aim of this study is to evaluate the binding mode of eight analogues compounds derived from two know nucleoside reverse transcriptase inhibitors, Abacavir and Lamivudin e. To achieve this, we use the computational methods of molecular docking , ADME - Tox and molecular dynamics. The proposed computational techniques provide structural information about the receptor - ligand complex mo lecular recognition, allows the achievement the rational drug design e xperiments to obtain novel compounds. The three - dimensional structur e of the TR chosen available in PDB database in complex with Tenofovir, a known n ucleotide reverse transcriptase. The results obtained help us to propose the compounds 2 - (5 – chloro – 2 - acetamidophenyl) – n - [6 - (cyclopropyl amino) – 9 - [3 - hydroxymethyl) cyclopent – 1 – en – 1 - yl] - 1,6 – dihydropurin – 2 - yl] - 2,2 - difluoroacetamide and 2 - (2 - acetamidophenyl) - 2,2 – difluoro – n - {1 - [2 - (hydroxymethyl) - 1,3 – oxathiolan – 5 - yl] – 2 - oxopyrimidin4yl} acetamide Abacavir and Lamivudine analogues, respectively, as the most pro mising. At the same time, was analyzed the binding mode of Lamivudine through molecular dynamics to assess the evolu tion of her structure. From this, it becomes possible to analyzed the binding mode of compounds that have the same scaffold

MEDEIROS, Melissa Soares. Genotipagem e perfil de resistência aos antiretrovirais do vírus da imunodeficiência tipo 1 em população com falha terapêutica no Ceará, Brasil : 2002 a 2004. 2006. 192 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-07T13:29:20Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_msmedeiros.pdf: 2320693 bytes, checksum: e0ca832db9ac0a74bb96e8b202aefb31 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-08T16:54:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_msmedeiros.pdf: 2320693 bytes, checksum: e0ca832db9ac0a74bb96e8b202aefb31 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-08T16:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_dis_msmedeiros.pdf: 2320693 bytes, checksum: e0ca832db9ac0a74bb96e8b202aefb31 (MD5) Previous issue date: 2006 / Genotypic testing for HIV-1 drug resistance is useful for selecting antiretroviral drugs for patients developing treatment failure. O melhor entendimento da sua interpretação facilitará sua utilização como ferramenta médica na terapêutica do HIV. The optimal understanding of its interpretation will give an important tool for HIV treatment. Objective: To identify common combinations of resistance mutations and antiretroviral resistance profile. Methods: Between April 2002 and March 2004, 101 protease and reverse transcriptase (RT) sequences were determined for HIV-1 isolates from patients who were failing antiretroviral therapy. Resistance profile was obtained by Stanford program. Results: male were 76.2%, median age 38 years, CD4 media was 279.21 cells/mm3 and Viral load 4.49 log. Total of 31 mutational patterns were detected to protease inhibitor (IP), 49 to nucleoside RT inhibitor (NRTI), and 17 to nonnucleoside RT inhibitor (NNRTI). K65R was detected in 5.9% isolates. The most frequent mutations were L90M, M184V and K103N to IP, NRTI and NNRTI respectively. The main mutational patterns accounted for 49% of mutant sequences to IP, 38.5% to ITRN accounted and 40,9% to NNRTI. Patients with three or more therapeutic failure had worst resistance profile to all IP except for Lopinavir, and NRTI except for Tenofovir. High resistance to Lamivudine and NNRTI were independent of failure quantity. Conclusion: The best susceptibility was found to Lopinavir at IP’s class and to Tenofovir at ITRN’s. The main mutational patterns to IP, ITRN and NNRTI represented almost half of all patterns found. / A Genotipagem está sendo usada como método para guiar a seleção de antiretrovirais em pacientes com falha terapêutica. O melhor entendimento da sua interpretação facilitará sua utilização como ferramenta médica na terapêutica do HIV. Objetivo: Avaliar o perfil de resistência aos antiretrovirais e identificar padrões mutacionais das seqüências de protease e TR do HIV-1. Métodos: Foram estudadas as sequências de genes da protease e TR isoladas de 101 amostras de pacientes com HIV-1 em falha terapêutica, entre abril/2002 a março/2004, através de Genotipagem realizadas no Ceará. O Banco de dados de Stanford foi utilizado para avaliação de resistência e SPSS versão 11 e Epi Info versão 6 para análise estatística. Resultados: Sexo masculino 76,2%, mediana de idade 38 anos, CD4 médio de 279,21 cells/mm3 e Carga Viral 4.49 log. Na classe de Inibidores de Protease (IP) 31 padrões mutacionais foram encontrados, nos inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN) 49 e para inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos (ITRNN) 17. As mutações mais frequentes foram L90M, M184V e K103N para IP, ITRN e ITRNN espectivamente. A K65R foi detectada em 5,9% dos isolados. Três ou mais falhas terapêuticas apresentaram maior perfil de resistência para todos os IPs exceto para Lopinavir, e para todos os ITRNs exceto para Tenofovir. Os seis principais padrões mutacionais para IPs equivaleram a 49% das sequências, para ITRNs a 38,5%, e para ITRNNs os dois principais padrões corresponderam a 40,9%. Foram encontrados altos índices de resistência para ITRNNs independente da quantidade de falhas terapêuticas. Conclusão: Nos IPs a menor resistência encontrada foi ao Lopinavir e nos ITRNs ao Tenofovir. Os principais padrões mutacionais para IPs, ITRNs e ITRNNs representaram quase metade de todos os padrões de resistência encontrados.

Os inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa (NNRTI) são substâncias que são usadas no combate ao vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana). Quando essas moléculas se ligam a RT elas promovem uma mudança conformacional nessa enzima tornando o sítio ativo catalítico inativo. Embora os NNRTI representem um importante componente da quimioterapia anti-HIV, sua utilidade clínica está ameaçada pela emergência de vírus que apresentam mutações que os tornam resistentes aos NNRTI. Por exemplo, com a mutação Y181C a RT se torna resistente ao inibidor 9 Cl-TIBO, pertencente a classe dos NNRTI. A perda de interações do tipo ??? stacking é apontada como uma das razões para o surgimento de resistência da enzima RT frente aos NNRTI. Embora estas interações exerçam um papel relevante na ação de um inibidor, não existem estudos que buscam analisá-las baseada na mecânica quântica. Em virtude desse fato, o objetivo desse trabalho é empregar as potencialidades do uso das técnicas que analisam a função de onda, como orbitais naturais de ligação (NBO), análise populacional natural (NPA) e a densidade eletrônica, através do método AIM (átomos em moléculas), para obter uma compreensão aprofundada das interações estabilizadoras ou desestabilizadoras entre um NNRTI e os aminoácidos do sítio alostérico em contato com o inibidor. Foi escolhida para esse estudo inibidores da classe TIBO, pois essa classe de moléculas têm sido objeto de estudo em nosso laboratório, onde já foi feita a sua análise conformacional e um estudo QSAR-3D. Além disso, essas substâncias encontram-se complexadas com a enzima HIV-1 RT selvagem e também com essa enzima mutante (Y181C). Uma terceira estrutura cristalina usada no estudo foi a do inibidor 9 Cl-TIBO. Com isso as propostas desse trabalho foram: i) elucidar quais os tipos de interações não covalentes que ocorrem entre o inibidor TIBO e os aminoácidos do seu sítio ativo; ii) quais as possíveis causas da perda de atividade com a mutação Y181C; iii) tentar apontar qual a razão da maior atividade do inibidor 8 Cl-TIBO frente ao 9 Cl-TIBO. Para cumprir esses objetivos foi realizada a análise geométrica, da função de onda, utilizando os métodos NBO, NPA e da densidade eletrônica empregando o método AIM, assim como, a análise da energia de interação de inibidores da família TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235. A análise geométrica dos monômeros TIBO revelou que os dois inibidores (8 e 9 Cl-TIBO) apresentam conformações diferentes. Pelos métodos NBO e AIM foi verificada a existência de interações do tipo C-H???S e C-H???Cl na 8 Cl-TIBO. Apenas a primeira interação foi observada no inibidor 9 Cl-TIBO, o que dá a esta molécula uma maior liberdade conformacional. Além disso, a sobreposição da estrutura dos dímeros TIBO/Y188 revelou que a distância entre o inibidor 8 Cl-TIBO e o aminoácido Y188 (M) é a mais curta. A análise NBO e AIM das interações intermoleculares dos dímeros TIBO/Y181 (C181) e TIBO/Y188 demonstraram que as interações dos inibidores com os aminoácidos são estabilizadas por interações hidrofóbicas do tipo van der Waals, além de ligações de hidrogênio fracas do tipo C-H???N e C-H???O. Os dímeros 8 Cl-TIBO/H235 apresentam apenas uma ligação de hidrogênio fraca do tipo C-H???O. A interação dos dímeros TIBO/K101 é estabilizada, de acordo com as análises NBO e AIM, por duas ligações de hidrogênio do tipo N-H???O e N-H???S. A primeira interação tem sido descrita em vários trabalhos, mas é a primeira vez que segunda é reportada. A análise NPA e a soma das energias eletrônicas de estabilização, ??E(2), ambas obtidas pelo método NBO, juntamente com o valor da densidade no BCP (ponto crítico de ligação), oriunda do método AIM, indicam que a mutação Y181C afeta a interação do inibidor não somente com o aminoácido na posição em que ela ocorre, mas também com os aminoácidos K101, Y188 e H235. O valor de ??E(2) para a interação do inibidor TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235 indicam que o inibidor 8 Cl-TIBO apresenta uma interação mais efetiva com esses aminoácidos do que a 9 Cl-TIBO. Esse resultado é bastante interessante é mostra que ??E(2) pode ser utilizado como um parâmetro qualitativo para analisar as diferenças de atividade biológica observadas para diferentes ligantes que atuam sobre um mesmo sítio ativo. / Os inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa (NNRTI) são substâncias que são usadas no combate ao vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana). Quando essas moléculas se ligam a RT elas promovem uma mudança conformacional nessa enzima tornando o sítio ativo catalítico inativo. Embora os NNRTI representem um importante componente da quimioterapia anti-HIV, sua utilidade clínica está ameaçada pela emergência de vírus que apresentam mutações que os tornam resistentes aos NNRTI. Por exemplo, com a mutação Y181C a RT se torna resistente ao inibidor 9 Cl-TIBO, pertencente a classe dos NNRTI. A perda de interações do tipo pi-stacking é apontada como uma das razões para o surgimento de resistência da enzima RT frente aos NNRTI. Embora estas interações exerçam um papel relevante na ação de um inibidor, não existem estudos que buscam analisá-las baseada na mecânica quântica. Em virtude desse fato, o objetivo desse trabalho é empregar as potencialidades do uso das técnicas que analisam a função de onda, como orbitais naturais de ligação (NBO), análise populacional natural (NPA) e a densidade eletrônica, através do método AIM (átomos em moléculas), para obter uma compreensão aprofundada das interações estabilizadoras ou desestabilizadoras entre um NNRTI e os aminoácidos do sítio alostérico em contato com o inibidor. Foi escolhida para esse estudo inibidores da classe TIBO, pois essa classe de moléculas têm sido objeto de estudo em nosso laboratório, onde já foi feita a sua análise conformacional e um estudo QSAR-3D. Além disso, essas substâncias encontram-se complexadas com a enzima HIV-1 RT selvagem e também com essa enzima mutante (Y181C). Uma terceira estrutura cristalina usada no estudo foi a do inibidor 9 Cl-TIBO. Com isso as propostas desse trabalho foram: i) elucidar quais os tipos de interações não covalentes que ocorrem entre o inibidor TIBO e os aminoácidos do seu sítio ativo; ii) quais as possíveis causas da perda de atividade com a mutação Y181C; iii) tentar apontar qual a razão da maior atividade do inibidor 8 Cl-TIBO frente ao 9 Cl-TIBO. Para cumprir esses objetivos foi realizada a análise geométrica, da função de onda, utilizando os métodos NBO, NPA e da densidade eletrônica empregando o método AIM, assim como, a análise da energia de interação de inibidores da família TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235. A análise geométrica dos monômeros TIBO revelou que os dois inibidores (8 e 9 Cl-TIBO) apresentam conformações diferentes. Pelos métodos NBO e AIM foi verificada a existência de interações do tipo C-H???S e C-H???Cl na 8 Cl-TIBO. Apenas a primeira interação foi observada no inibidor 9 Cl-TIBO, o que dá a esta molécula uma maior liberdade conformacional. Além disso, a sobreposição da estrutura dos dímeros TIBO/Y188 revelou que a distância entre o inibidor 8 Cl-TIBO e o aminoácido Y188 (M) é a mais curta. A análise NBO e AIM das interações intermoleculares dos dímeros TIBO/Y181 (C181) e TIBO/Y188 demonstraram que as interações dos inibidores com os aminoácidos são estabilizadas por interações hidrofóbicas do tipo van der Waals, além de ligações de hidrogênio fracas do tipo C-H???N e C-H???O. Os dímeros 8 Cl-TIBO/H235 apresentam apenas uma ligação de hidrogênio fraca do tipo C-H???O. A interação dos dímeros TIBO/K101 é estabilizada, de acordo com as análises NBO e AIM, por duas ligações de hidrogênio do tipo N-H???O e N-H???S. A primeira interação tem sido descrita em vários trabalhos, mas é a primeira vez que segunda é reportada. A análise NPA e a soma das energias eletrônicas de estabilização, ambas obtidas pelo método NBO, juntamente com o valor da densidade no BCP (ponto crítico de ligação), oriunda do método AIM, indicam que a mutação Y181C afeta a interação do inibidor não somente com o aminoácido na posição em que ela ocorre, mas também com os aminoácidos K101, Y188 e H235. O valor das energias eletrônicas de estabilização para a interação do inibidor TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235 indicam que o inibidor 8 Cl-TIBO apresenta uma interação mais efetiva com esses aminoácidos do que a 9 Cl-TIBO. Esse resultado é bastante interessante é mostra que energias eletrônicas de estabilização pode ser utilizado como um parâmetro qualitativo para analisar as diferenças de atividade biológica observadas para diferentes ligantes que atuam sobre um mesmo sítio ativo

Os inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa (NNRTI) são substâncias que são usadas no combate ao vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana). Quando essas moléculas se ligam a RT elas promovem uma mudança conformacional nessa enzima tornando o sítio ativo catalítico inativo. Embora os NNRTI representem um importante componente da quimioterapia anti-HIV, sua utilidade clínica está ameaçada pela emergência de vírus que apresentam mutações que os tornam resistentes aos NNRTI. Por exemplo, com a mutação Y181C a RT se torna resistente ao inibidor 9 Cl-TIBO, pertencente a classe dos NNRTI. A perda de interações do tipo ??? stacking é apontada como uma das razões para o surgimento de resistência da enzima RT frente aos NNRTI. Embora estas interações exerçam um papel relevante na ação de um inibidor, não existem estudos que buscam analisá-las baseada na mecânica quântica. Em virtude desse fato, o objetivo desse trabalho é empregar as potencialidades do uso das técnicas que analisam a função de onda, como orbitais naturais de ligação (NBO), análise populacional natural (NPA) e a densidade eletrônica, através do método AIM (átomos em moléculas), para obter uma compreensão aprofundada das interações estabilizadoras ou desestabilizadoras entre um NNRTI e os aminoácidos do sítio alostérico em contato com o inibidor. Foi escolhida para esse estudo inibidores da classe TIBO, pois essa classe de moléculas têm sido objeto de estudo em nosso laboratório, onde já foi feita a sua análise conformacional e um estudo QSAR-3D. Além disso, essas substâncias encontram-se complexadas com a enzima HIV-1 RT selvagem e também com essa enzima mutante (Y181C). Uma terceira estrutura cristalina usada no estudo foi a do inibidor 9 Cl-TIBO. Com isso as propostas desse trabalho foram: i) elucidar quais os tipos de interações não covalentes que ocorrem entre o inibidor TIBO e os aminoácidos do seu sítio ativo; ii) quais as possíveis causas da perda de atividade com a mutação Y181C; iii) tentar apontar qual a razão da maior atividade do inibidor 8 Cl-TIBO frente ao 9 Cl-TIBO. Para cumprir esses objetivos foi realizada a análise geométrica, da função de onda, utilizando os métodos NBO, NPA e da densidade eletrônica empregando o método AIM, assim como, a análise da energia de interação de inibidores da família TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235. A análise geométrica dos monômeros TIBO revelou que os dois inibidores (8 e 9 Cl-TIBO) apresentam conformações diferentes. Pelos métodos NBO e AIM foi verificada a existência de interações do tipo C-H???S e C-H???Cl na 8 Cl-TIBO. Apenas a primeira interação foi observada no inibidor 9 Cl-TIBO, o que dá a esta molécula uma maior liberdade conformacional. Além disso, a sobreposição da estrutura dos dímeros TIBO/Y188 revelou que a distância entre o inibidor 8 Cl-TIBO e o aminoácido Y188 (M) é a mais curta. A análise NBO e AIM das interações intermoleculares dos dímeros TIBO/Y181 (C181) e TIBO/Y188 demonstraram que as interações dos inibidores com os aminoácidos são estabilizadas por interações hidrofóbicas do tipo van der Waals, além de ligações de hidrogênio fracas do tipo C-H???N e C-H???O. Os dímeros 8 Cl-TIBO/H235 apresentam apenas uma ligação de hidrogênio fraca do tipo C-H???O. A interação dos dímeros TIBO/K101 é estabilizada, de acordo com as análises NBO e AIM, por duas ligações de hidrogênio do tipo N-H???O e N-H???S. A primeira interação tem sido descrita em vários trabalhos, mas é a primeira vez que segunda é reportada. A análise NPA e a soma das energias eletrônicas de estabilização, ??E(2), ambas obtidas pelo método NBO, juntamente com o valor da densidade no BCP (ponto crítico de ligação), oriunda do método AIM, indicam que a mutação Y181C afeta a interação do inibidor não somente com o aminoácido na posição em que ela ocorre, mas também com os aminoácidos K101, Y188 e H235. O valor de ??E(2) para a interação do inibidor TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235 indicam que o inibidor 8 Cl-TIBO apresenta uma interação mais efetiva com esses aminoácidos do que a 9 Cl-TIBO. Esse resultado é bastante interessante é mostra que ??E(2) pode ser utilizado como um parâmetro qualitativo para analisar as diferenças de atividade biológica observadas para diferentes ligantes que atuam sobre um mesmo sítio ativo. / Os inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa (NNRTI) são substâncias que são usadas no combate ao vírus HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana). Quando essas moléculas se ligam a RT elas promovem uma mudança conformacional nessa enzima tornando o sítio ativo catalítico inativo. Embora os NNRTI representem um importante componente da quimioterapia anti-HIV, sua utilidade clínica está ameaçada pela emergência de vírus que apresentam mutações que os tornam resistentes aos NNRTI. Por exemplo, com a mutação Y181C a RT se torna resistente ao inibidor 9 Cl-TIBO, pertencente a classe dos NNRTI. A perda de interações do tipo pi-stacking é apontada como uma das razões para o surgimento de resistência da enzima RT frente aos NNRTI. Embora estas interações exerçam um papel relevante na ação de um inibidor, não existem estudos que buscam analisá-las baseada na mecânica quântica. Em virtude desse fato, o objetivo desse trabalho é empregar as potencialidades do uso das técnicas que analisam a função de onda, como orbitais naturais de ligação (NBO), análise populacional natural (NPA) e a densidade eletrônica, através do método AIM (átomos em moléculas), para obter uma compreensão aprofundada das interações estabilizadoras ou desestabilizadoras entre um NNRTI e os aminoácidos do sítio alostérico em contato com o inibidor. Foi escolhida para esse estudo inibidores da classe TIBO, pois essa classe de moléculas têm sido objeto de estudo em nosso laboratório, onde já foi feita a sua análise conformacional e um estudo QSAR-3D. Além disso, essas substâncias encontram-se complexadas com a enzima HIV-1 RT selvagem e também com essa enzima mutante (Y181C). Uma terceira estrutura cristalina usada no estudo foi a do inibidor 9 Cl-TIBO. Com isso as propostas desse trabalho foram: i) elucidar quais os tipos de interações não covalentes que ocorrem entre o inibidor TIBO e os aminoácidos do seu sítio ativo; ii) quais as possíveis causas da perda de atividade com a mutação Y181C; iii) tentar apontar qual a razão da maior atividade do inibidor 8 Cl-TIBO frente ao 9 Cl-TIBO. Para cumprir esses objetivos foi realizada a análise geométrica, da função de onda, utilizando os métodos NBO, NPA e da densidade eletrônica empregando o método AIM, assim como, a análise da energia de interação de inibidores da família TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235. A análise geométrica dos monômeros TIBO revelou que os dois inibidores (8 e 9 Cl-TIBO) apresentam conformações diferentes. Pelos métodos NBO e AIM foi verificada a existência de interações do tipo C-H???S e C-H???Cl na 8 Cl-TIBO. Apenas a primeira interação foi observada no inibidor 9 Cl-TIBO, o que dá a esta molécula uma maior liberdade conformacional. Além disso, a sobreposição da estrutura dos dímeros TIBO/Y188 revelou que a distância entre o inibidor 8 Cl-TIBO e o aminoácido Y188 (M) é a mais curta. A análise NBO e AIM das interações intermoleculares dos dímeros TIBO/Y181 (C181) e TIBO/Y188 demonstraram que as interações dos inibidores com os aminoácidos são estabilizadas por interações hidrofóbicas do tipo van der Waals, além de ligações de hidrogênio fracas do tipo C-H???N e C-H???O. Os dímeros 8 Cl-TIBO/H235 apresentam apenas uma ligação de hidrogênio fraca do tipo C-H???O. A interação dos dímeros TIBO/K101 é estabilizada, de acordo com as análises NBO e AIM, por duas ligações de hidrogênio do tipo N-H???O e N-H???S. A primeira interação tem sido descrita em vários trabalhos, mas é a primeira vez que segunda é reportada. A análise NPA e a soma das energias eletrônicas de estabilização, ambas obtidas pelo método NBO, juntamente com o valor da densidade no BCP (ponto crítico de ligação), oriunda do método AIM, indicam que a mutação Y181C afeta a interação do inibidor não somente com o aminoácido na posição em que ela ocorre, mas também com os aminoácidos K101, Y188 e H235. O valor das energias eletrônicas de estabilização para a interação do inibidor TIBO com os aminoácidos Y181 (C181), K101, Y188 e H235 indicam que o inibidor 8 Cl-TIBO apresenta uma interação mais efetiva com esses aminoácidos do que a 9 Cl-TIBO. Esse resultado é bastante interessante é mostra que energias eletrônicas de estabilização pode ser utilizado como um parâmetro qualitativo para analisar as diferenças de atividade biológica observadas para diferentes ligantes que atuam sobre um mesmo sítio ativo

Faculdade Christus / Introduction: Genotypic testing for HIV-1 drug resistance is useful for selecting antiretroviral drugs for patients developing treatment failure. O melhor entendimento da sua interpretaÃÃo facilitarà sua utilizaÃÃo como ferramenta mÃdica na terapÃutica do HIV. The optimal understanding of its interpretation will give an important tool for HIV treatment. Objective: To identify common combinations of resistance mutations and antiretroviral resistance profile. Methods: Between April 2002 and March 2004, 101 protease and reverse transcriptase (RT) sequences were determined for HIV-1 isolates from patients who were failing antiretroviral therapy. Resistance profile was obtained by Stanford program. Results: male were 76.2%, median age 38 years, CD4 media was 279.21 cells/mm3 and Viral load 4.49 log. Total of 31 mutational patterns were detected to protease inhibitor (IP), 49 to nucleoside RT inhibitor (NRTI), and 17 to nonnucleoside RT inhibitor (NNRTI). K65R was detected in 5.9% isolates. The most frequent mutations were L90M, M184V and K103N to IP, NRTI and NNRTI respectively. The main mutational patterns accounted for 49% of mutant sequences to IP, 38.5% to ITRN accounted and 40,9% to NNRTI. Patients with three or more therapeutic failure had worst resistance profile to all IP except for Lopinavir, and NRTI except for Tenofovir. High resistance to Lamivudine and NNRTI were independent of failure quantity. Conclusion: The best susceptibility was found to Lopinavir at IPâs class and to Tenofovir at ITRNâs. The main mutational patterns to IP, ITRN and NNRTI represented almost half of all patterns found. / A Genotipagem està sendo usada como mÃtodo para guiar a seleÃÃo de antiretrovirais em pacientes com falha terapÃutica. O melhor entendimento da sua interpretaÃÃo facilitarà sua utilizaÃÃo como ferramenta mÃdica na terapÃutica do HIV. Objetivo: Avaliar o perfil de resistÃncia aos antiretrovirais e identificar padrÃes mutacionais das seqÃÃncias de protease e TR do HIV-1. MÃtodos: Foram estudadas as sequÃncias de genes da protease e TR isoladas de 101 amostras de pacientes com HIV-1 em falha terapÃutica, entre abril/2002 a marÃo/2004, atravÃs de Genotipagem realizadas no CearÃ. O Banco de dados de Stanford foi utilizado para avaliaÃÃo de resistÃncia e SPSS versÃo 11 e Epi Info versÃo 6 para anÃlise estatÃstica. Resultados: Sexo masculino 76,2%, mediana de idade 38 anos, CD4 mÃdio de 279,21 cells/mm3 e Carga Viral 4.49 log. Na classe de Inibidores de Protease (IP) 31 padrÃes mutacionais foram encontrados, nos inibidores da transcriptase reversa anÃlogos de nucleosÃdeos (ITRN) 49 e para inibidores da transcriptase reversa nÃo anÃlogos de nucleosÃdeos (ITRNN) 17. As mutaÃÃes mais frequentes foram L90M, M184V e K103N para IP, ITRN e ITRNN espectivamente. A K65R foi detectada em 5,9% dos isolados. TrÃs ou mais falhas terapÃuticas apresentaram maior perfil de resistÃncia para todos os IPs exceto para Lopinavir, e para todos os ITRNs exceto para Tenofovir. Os seis principais padrÃes mutacionais para IPs equivaleram a 49% das sequÃncias, para ITRNs a 38,5%, e para ITRNNs os dois principais padrÃes corresponderam a 40,9%. Foram encontrados altos Ãndices de resistÃncia para ITRNNs independente da quantidade de falhas terapÃuticas. ConclusÃo: Nos IPs a menor resistÃncia encontrada foi ao Lopinavir e nos ITRNs ao Tenofovir. Os principais padrÃes mutacionais para IPs, ITRNs e ITRNNs representaram quase metade de todos os padrÃes de resistÃncia encontrados.

Resumo: O metapneumovirus humano (hMPV) é um membro da família Paramyxoviridae que foi descrito em 2001. O vírus tem sido associado com infecções respiratórias agudas (IRA) que variam desde o comprometimento do trato respiratório superior até formas graves de bronquiolite e pneumonia. O presente estudo teve como objetivos: padronizar um teste de RT-PCR para diagnóstico de rotina do hMPV; validar um controle positivo para esta metodologia; determinar a presença deste vírus em casos de IRA em pacientes hospitalizados e ambulatoriais na cidade de Curitiba - Sul do Brasil e descrever os dados clínicos desta infecção pelos diferentes subtipos de hMPV detectados. O estudo foi realizado retrospectivamente em 1.572 amostras de aspirado de nasofaringe, durante um período de três anos. O RNA foi extraído pelo método do tiocianato de guanidina e a RT-PCR realizada para amplificar um fragmento de 928pb do gene N do hMPV. O produto de PCR foi clonado, caracterizado e usado para padronizar a reação de RT-PCR. A subtipagem dos vírus detectados foi realizada por seqüenciamento genético. Os dados clínicos dos pacientes infectados foram obtidos dos prontuários médicos. Padronizou-se um teste de RT-PCR com um limite de detecção de 180 cópias/reação. O hMPV esteve presente em 61 (3,9%) amostras e os subtipos A1, A2a, B1 e B2 foram detectados entre os anos de 2006 a 2008. O vírus circulou durante todo o ano, sendo observada uma maior incidência em dois momentos: um no outono e outro no inverno e início da primavera. Co-infecções com outros vírus respiratórios foram observados em 16 (27,0%) casos. A prevalência do hMPV foi maior nos pacientes ambulatoriais (5,9%), cuja mediana de idade foi de 8,3 anos (variando de 6 meses a 75 anos), do que nos pacientes hospitalizados (4,1%), cuja mediana de idade foi de 4,8 meses (variando de 1 mês a 26 anos). Os pacientes atendidos em ambulatório desenvolveram infecção no trato respiratório superior, com sintomas gripais e todas as crianças hospitalizadas tiveram comprometimento no trato respiratório inferior. Um paciente pediátrico foi a óbito devido a complicações associadas à infecção pelo subtipo A2a do hMPV. Com esta pesquisa, observou-se que o hMPV foi etectado em pacientes com infecção respiratória de todas as faixas etárias. Diferentes subtipos do vírus podem circular no mesmo ano e nenhuma associação foi observada entre o subtipo viral e gravidade da infecção na população analisada.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-24T19:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 262881.pdf: 2759896 bytes, checksum: 6c601255ca8f91139751586839b36641 (MD5) / Neste estudo foi padronizada a reação de RT-PCR para detectar a expressão de mRNA de IL-2, para seleção in vitro de substâncias naturais ou sintéticas com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, visto que estes constituem uma das maiores classes de linfócitos e são importantes na regulação da resposta imune inata e adaptativa. Para isso foi utilizada a linhagem de células Jurkat, que são derivadas do tecido hematopoiético humano e produzem IL-2 após estimulação celular com lectinas. Para a realização da reação de RT-PCR, o RNA foi extraído das células Jurkat utilizando-se o reagente Trizol e posteriormente tratado com DNase para obter maior pureza do RNA . Para a padronização da reação de amplificação, foram testados diferentes tampões de reação e temperatura de ligação do iniciador. Os produtos de IL-2 foram confirmados por sequenciamento. Também foi padronizado o tempo e a concentração de Fitohemaglutinina (PHA) utilizada para estimular as células, que foi de 24 horas e 1 µg/ml, respectivamente. Além disso, a Ciclosporina A (CsA) foi selecionada como controle de inibição celular. Após padronização da RT-PCR, foram testados os galatos e os polissacarídeos de Agaricus blazei. Muitos estudos demonstraram que estes compostos possuem atividades farmacológicas, incluindo ações anticancerígenas, antibacteriana, antivirais, entre outras. A citotoxicidade (CC50) dos compostos utilizados foi determinada pelos ensaios colorimétricos MTT e/ou Vermelho Neutro. Dos 15 galatos testados, somente os galatos de propila, butila, octila, nonila, decila, undecila, dodecila e tetradecila, apresentaram atividade de estimulação celular e dos 15 polissacarídeos de Agaricus blazei, somente 3 mostraram-se positivos: polissacarídeo 3, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 1, polissacarídeo 4, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 2 e o polissacarídeo 7, extraído do micélio em grãos de trigo e separado por membrana de microfiltração. Paralelamente, foi realizada a imunofenotipagem das células Jurkat e feita à avaliação da estimulação celular por citometria de fluxo. Dentre os marcadores celulares testados (CD25/CD3) a frequência de células positivas para CD25 foi a que melhor refletia a ativação das células Jurkat, porém com menor sensibilidade do que a RT-PCR. Neste estudo, portanto, ficou evidenciada a utilidade de uma técnica in vitro para triagem de substâncias com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, o que permite vislumbrar a análise de grande número destas substâncias, sem utilização de animais de laboratório.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T09:16:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 286647.pdf: 2822556 bytes, checksum: efcdfec4981831ef957fb764c96e7d5d (MD5) / Neste estudo foi padronizada a reação de RT-PCR para a detecção da expressão do mRNA dos marcadores TNF-?, IL-10 e iNOS, importantes no contexto de ativação de macrófagos, para seleção in vitro de substâncias naturais ou sintéticas com potencial atividade imunomodulatória sobre macrófagos, visto que estes constituem uma das principais populações de células do sistema imune. Para isso foi selecionada a linhagem murina RAW 264.7, cultivada in vitro e que responde a estímulos como o LPS. Para a realização da RT-PCR, o RNA foi extraído das células utilizando o reagente Trizol e posteriormente feito reação de transcrição reversa com 1 µg de RNA total, em condições padronizadas. Na etapa de amplificação do cDNA, foram testadas a melhor temperatura de anelamento para cada marcador, concentração dos iniciadores específicos e diluição do cDNA. Determinou-se que o melhor tempo necessário para visualizar os produtos de amplificação era de 6 horas para os ensaios de ativação e foram estabelecidas as concentrações de LPS capazes de estimular as células em cultura, quando avaliadas pela RT-PCR e dosagem de óxido nítrico. Verificou-se que a adição prévia de polimixina B (50 µg/ml) nas amostras é eficiente na inativação de endotoxinas contaminantes. Estabeleceu-se um protocolo para testar a potencial atividade antiinflamatória de compostos químicos, pela adição da substância a ser testada 6 horas após a ativação prévia com LPS, incubação por 18 horas e observação da inibição da expressão dos marcadores. Determinou-se em seguida, a atividade de 15 formulações de polissacarídeos de Agaricus blazei, sendo que todos os extratos mostraram atividade, pela RT-PCR, para a concentração de 10 µg/ml para a citocina TNF-? e nas frações 2, 3, 11 e 12 para a enzima iNOS; enquanto que a dosagem de óxido nítrico realizada em paralelo mostrou-se menos sensível. Também avaliou-se a atividade de 9 galatos sintéticos, e concluiu-se que nenhuma das amostras testadas demonstrava atividade ativadora de macrófagos. Ficou evidenciado neste estudo, portanto, a utilidade de uma técnica in vitro para a triagem de substâncias com potencial atividade imunomodulatória sobre macrófagos, que permite vislumbrar a análise de grande número destas substâncias, sem a utilização de animais de laboratório. / In this study an RT-PCR to detect mRNA expression of the markers TNF-?, IL-10 and iNOS, relevant in the macrophage activation context, was standardized in order to in vitro screening of natural or synthetic compounds with potential immunomodulatory activity in macrophages, whereas they constitute a major population of immune systems cells. For this, was selected the murine strain RAW 264.7 cultured in vitro, and that responds to stimuli such as LPS. To perform RT-PCR, RNA was extracted from cells using Trizol reagent and subsequently made a reverse transcription reaction with 1 µg of total RNA under standard conditions. In amplification of cDNA step, were tested the best annealing temperature for each marker, the concentration of specific primers and dilution of cDNA. It was determined that the best time to view the amplification products was 6 hours for the testing of activation, and states the concentrations of LPS the cells were responsive to our model of RT-PCR and measurement of nitric oxide. It was found that the previous addition of polymyxin B (50 µg / ml) in samples is efficient in the inactivation of endotoxin contaminants. Was established a protocol to test the potential anti-inflammatory activity of chemical compounds, by adding the substance to be tested after 6 hours prior to activation with LPS, incubated for 18 hours and observing the inhibition of expression of markers. Was determined activity of 15 polysaccharides of Agaricus blazei where all the extracts showed activity in the RT-PCR for the concentration of 10 µg / ml for TNF-? cytokine and for the fractions 2, 3, 11 and 12 for the iNOS enzyme; but not in the dosage of nitric oxide. We also determined the activity of 9 gallates synthetic, and concluded that none of gallates tested showed activity in activating macrophages. Was evidenced in this study, therefore, the usefulness of an in vitro technique for screening of substances with potential immunomodulatory activity on macrophages, which paves the analysis of many of these substances without the use of laboratory animals.

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T17:48:40Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16108 bytes, checksum: 2cd537f65b91f31ace656e4a54ad1fae (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T17:48:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16108 bytes, checksum: 2cd537f65b91f31ace656e4a54ad1fae (MD5) Previous issue date: 2005-05-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Foram avaliados 14 isolados degradadores de petróleo, quanto à diversidade genética e à atividade catabólica dos mesmos e de cinco destes, em consórcio, no meio de cultivo adicionado de petróleo por meio da técnica de RT-PCR. A diversidade genética dos 14 isolados bacterianos foi avaliada por RAPD utilizando 12 oligonucleotídeos. O padrão de bandas amplificado do DNA total dos isolados evidenciou uma alta diversidade genética entre os isolados LBBMA 1, LBBMA 18a, LBBMA 53, LBBMA 88b, LBBMA 161, LBBMA 191, LBBMA 201 e LBBMA ES11, quando comparado ao padrão de bandas obtidos com os isolados LBBMA 58, LBBMA 75, LBBMA 101b, LBBMA 105a, LBBMA 195 e LBBMA 199. A detecção de seqüências genômicas e dos respectivos transcritos dos genes que codificam alcano hidroxilase, naftaleno dioxigenase e tolueno dioxigenase em meio de cultivo adicionado de petróleo evidenciou que os isolados LBBMA 58, LBBMA 75, LBBMA 101b e LBBMA 199 foram promissores para serem utilizados no processo de biorremediação. O consórcio C7 (LBBMA 105a, LBBMA 191, LBBMA 195, LBBMA 199, LBBMA 201) foi selecionado para ser avaliado quanto à atividade catabólica em meio de cultivo adicionado de petróleo, nos tempos: 0,5 hora, 4 horas, 7 horas e viii24 horas. Detectou-se neste consórcio, os transcritos correspondentes aos genes que codificam alcano hidroxilase e naftaleno dioxigenase em todos os tempos avaliados. Estes resultados mostraram que a avaliação da atividade catabólica por meio da detecção dos transcritos indicou o potencial de aplicação deste consórcio no processo de biorremediação. / The present study objectified to evaluate the genetic diversity among 14 Petroleum-degrading bacterial isolates and to verify the catabolic activity of each one separately and in consortium in culture medium with addition of petroleum by RT-PCR technique. Their genetic diversity was evaluated by RAPD using twelve primers. The isolates presented high polymorphism indicating a great genetic diversity among them. The evaluation of the potential and the catabolic activity of the isolates was accomplished using as markers three catabolic genes that encode alkane hydroxylase, naphthalene dioxygenase and toluene dioxygenase. In these isolates different results were observed for the presence of the genomic sequences and their respective transcripts. These results indicated that the isolates LBBMA 58, LBBMA 75, LBBMA 101b and LBBMA 199 are promising for the bioremediation process. The consortium C7 (LBBMA 105a, LBBMA 191, LBBMA 195, LBBMA 199, LBBMA 201) was chosen to have its catabolic activity appraised due to its greater efficiency. In this consortium transcripts corresponding to the genes that encode alkane hydroxylase and naphthalene dioxygenase were detected with 0,5 hour, 4 xhours, 7 hours and 24 hours. These results indicated the potential of this consortium for bioremediation.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As infeccoes respiratorias virais sao causas comuns de morbi-mortalidade em adultos e idosos. Recentemente descrito, o metapneumovirus foi associado a infeccoes respiratorias em criancas, ocorrendo com maior frequencia ate seus cinco anos de idade. Investigacoes recentes o identificaram tambem em adultos e imunocomprometidos. Nesta conjuntura conduziu-se em São Paulo um estudo com coleta sistematizada e consecutiva por tres anos (06/2001 a 09/2003) em tres populacoes distintas (adultos do Pronto Atendimento, transplantados renais e profissionais de Saúde) apresentando sintomas respiratorios. Cento e oitenta e cinco pacientes com resultados negativos para outros virus por outros metodos (influenza A e S, Parainfluenza 1,2 e 3, RSV, adenovirus, coronavirus e enterovirus) foram investigados quanto a presenca de metapneumovirus por uma RT-PCR otimizada em laboratorio. Vinte e quatro pacientes (12,97 por cento) apresentaram amplificacao especifica para o virus, caracterizada pelo fragmento de 347pb amplificado pelos iniciadores correspondentes ao gene F. O virus foi detectado nos meses de junho a setembro dos tres anos investigados. Houve maior frequencia na deteccao em 2003. As frequencias observadas ao final do estudo nos profissionais de Saúde, adultos do Pronto Atendimento e pacientes transplantados renais foram 10,75 por cento (10/92), 18,96 por cento (11/59), e 8,82 por cento (3/34) respectivamente. Verificou-se uma tendencia associativa entre contato com paciente e infeccao por hMPV nos profissionais de Saúde. Foi encontrada associacao entre infeccao e adultos acima de 51 anos (p=0,006). Os pacientes transplantados apresentaram sintomatologia menos expressiva. Nao foi possivel atribuir uma sintomatologia especifica a infeccao por hMPV / Viral respiratory infections are common morbi-mortality causes in adults and in the elderly. Recent advances in viral diagnostics, such as RT-PCR, allowed for the detection of a plethora of new viruses, until then uncharacterized. The recently described human metapneumovirus was associated with respiratory infections by van den Hoogen and coworkers while investigating samples from children without etiologic causes attributable. Researchers worldwide detected the virus in samples from children and recently in adult’s samples as well. Following this approach our study was aimed at adults over eighteen presenting with acute respiratory infections from June/2001 to September/2003. Three groups were enrolled: patients from an out-patient attendance, health care workers and renal transplant recipients. All samples were submitted to routine diagnostics screening through direct fluorescence assay provided by Light Diagnostics for seven different viruses and negative results were set up for RT-PCR with primers selected to hMPV´s F gene. Twenty four out of 185 patients (12.97%) were considered positive after amplification of a 347bp fragment. The virus was detected from June to September in the 2001-02 period, peaks were higher in 2003 and began earlier, as discussed below. Furthermore an association was found between infection and age (p=0,006) for the whole cohort. Out-patient attendance cases exhibited a higher detection frequency (18.92%/11:59), particularly in 2003. Health care workers and ambulatory patients had 10.75% (10:92) and 8.82% of infections attributed to hMPV. A weak tendency was found regarding infection and patient contact in the health care workers population. Transplant infections were less symptomatic than the other groups evaluated. No characteristic symptomatology could be associated with hMPV infection by this study. / BV UNIFESP: Teses e dissertações