Lors d'un stress, les cellules eucaryotes activent des mécanismes de défense afin de s'adapter aux conditions extrêmes et de survivre. Ces mêmes mécanismes peuvent être exploités par les cellules cancéreuses pour survivre au stress thérapeutique. La réponse intégrée au stress (ISR) est une réaction cellulaire qui joue un rôle crucial dans l'adaptation des cellules face à différents stress notamment en régulant la transcription et la traduction de nombreux gènes cibles spécifiques. Durant cette réponse, les cellules stressées réduisent aussi leur métabolisme général, entre autres en inhibant la traduction des ARNm, et économisent ainsi l'énergie nécessaire pour réparer les dommages causés par le stress. En conditions de stress, la traduction générale des ARNm est inhibée principalement au niveau de son étape d'initiation. Un des mécanismes clés induisant l'inhibition de l'initiation de la traduction est la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2a (eukaryotic translation initiation factor 2a). Bien que cette phosphorylation d'eIF2a, induite par le stress, entraine une inhibition globale de la synthèse protéique, elle induit d'une part la formation d'entités cytoplasmiques à ARN appelées granules de stress mais elle favorise également la traduction spécifique des ARNm spécifiques codant pour des facteurs de réponse au stress, dont le facteur de transcription ATF4. Ce facteurjoue un rôle clé lors de la réponse au stress soit en activant les voies de survie ou au contraire en favorisant celles de mort cellulaire. Ces fonctions opposées d'ATF4 dans la réponse cellulaire au stress dépendent largement de son niveau d'expression. Ainsi, nous avons cherché à caractériser le(s) mécanismes(s) de régulation de l'expression d'ATF4 lors de stress thérapeutiques au sein de cellules cancéreuses. Nous avons montré l'implication des granules de stress (GS) dans la régulation de l'expression de l'ARNm d'ATF4 lors d'un stress thérapeutique engendré par le traitement avec l'agent chimiothérapeutique sorafenib au sein de cellules d'hépatocarcinomes. Cette régulation implique la séquestration d'une fraction de l'ARNm d'ATF4 dans les GS induites par le traitement avec la sorafenib, prévenant sa surexpression létale ; ceci permet de maintenir un niveau d'expression d'ATF4 basal mais nécessaire à la survie des cellules cancéreuses. Afin de caractériser le(s) mécanisme(s) responsable(s) de l'expression basale d'ATF4, permettant la résistance des cellules cancéreuses aux traitements thérapeutiques, un RNA pull-down utilisant des fragments d'ARN biotinylés d'ATF4 a l'aide d'extraits de cellules cancéreuses soumises à un stress thérapeutique a été réalisé. L'analyse par ii spectrométrie de masse des complexes protéiques associés aux fragments d'ARN d'ATF4 biotinylés a permis l'identification d'une dizaine de protéines qui pourraient interagir avec l'ARNm d'ATF4, dont l'ARN hélicase DDX3. Nous avons observé que DDX3 promeut au niveau traductionnel l'expression d'AFT4. Des tests d'interaction protéine-protéine montrent que DDX3 est un composant du complexe d'initiation de la traduction eIF4F. L'interaction entre DDX3 et le complexe eIF4F est potentiellement médiée par le facteur eIF4G, qui est également nécessaire à la traduction d'ATF4 induite en condition de stress. Enfin, la diminution de l'expression d'ATF4 au sein de cellules issues d'hépatocarcinomes résistants via la déplétion de DDX3 sensibilise les cellules cancéreuses à la mort induite par le traitement avec la sorafenib. Cette étude caractérise de nouveaux mécanismes de régulation de l'expression du facteur ATF4 qui se produit lors de stress et qui pourraient être ciblés afin de prévenir la chimiorésistance. / During physiological or environmental stress, cells activate defense mechanisms to survive. These same mechanisms may be exploited by cancer cells to survive therapeutic stresses. The integrated stressresponse (ISR) is one of the cell responses that play a crucial role in the adaptation of cells to various stresses such as the transcriptional and translational régulation of many specific target genes. During this cell response, stressed cells reduce their general metabolism in part by inhibiting mRNA translation, thereby saving energy needed to repair stress-induced damages. Under stress conditions, the regulation oftranslation occurs mainly at its initiation step through the phosphorylation of the translation initiation factor eIF2a. While this phosphorylation, induced by stress, causes a global inhibition ofprotein synthesis, it induces on the one hand the formation of cytoplasmic RNA entities called stress granules (GS) but it also promotes the preferential translation of specific mRNAs coding for stress response factors. Among those, ATF4 is a master transcription factor that orchestrates gene expression during various stresses including those involved in cancer, by either activating survival pathways or on the contrary promoting those of cell death. These opposite ATF4 functions in the cellular stress response depend largely on its expression level linked to its translational regulation by the phosphorylation of eIF2a. Thereby, we sought to characterize the mechanisms(s) that regulate the expression ofATF4 during therapeutic stresses in cancer cells. We described the implication of stress granules in the regulation of ATF4 expression during stress induced by the treatment with sorafenib, a chemotherapeutic agent used to treat hepatocellular carcinoma (HCC). This novel mechanism involves the formation of stress granules that sequester a fraction of ATF4 mRNA in its repressed form, thus preventing its lethal overexpression. This resulted in a basal level of ATF4 expression which is necessary for the survival of cancer cells. Then, in order to characterize the mechanism(s) (e.g. RNAbinding proteins and translation initiation factors such as eIF4G) responsible for the basal translation of ATF4 mRNA allowing the resistance of cancer cells to therapeutic treatments, we performed a biotinylated RNA-pulldown assay with cancer cells extracts subjected to sorafenib. Mass spectrometry analyses of the protein complexes associated with ATF4 biotinylated-RNA fragments led to the identification ofthe DEAD-boxRNA helicase DDX3, as potential interactor with ATF4 mRNA. By combining depletion experiments with various biochemical assays (e.g. luciferase assays), we showed that DDX3 drives sorafenib-induced iv ATF4 mRNA expression at the translational level. Protein-interaction assays identified DDX3 as a component of the translation initiation complex eIF4F. The interaction between DDX3 and the eIF4F complex is potentially mediated by eIF4GI, which we found to be required forsorafenib-induced ATF4 expression. Furthermore, reducing ATF4 expression in resistant HCC cellsthrough DDX3 depletion sensitizes cancer cellsto Sorafenib-induced cell death. Thus, this study identified new regulatory pathways of ATF4 factor that could be targeted to prevent drug resistance in cancer cells and improve the conventional therapies.

Les progrès fulgurants des technologies de séquençage permettent de développer des projets de recherche très complexes. De plus, les consortiums internationaux tels qu’ENCODE, Roadmap Epigenomics et Fantom offrent publiquement de vastes jeux de donnés à la communauté scientifique. Ainsi, mon projet de recherche au doctorat a pour but de développer de nouvelles approches bioinformatiques afin d’analyser efficacement les données génomiques de type ChIP-Seq pour cibler les changements dans les patrons d’interactions entre les protéines et l’ADN. De nouveaux outils R tels ENCODExplorer et FantomTSS ont donc été développés afin de faciliter l’intégration des données publiques. De plus, l’outil metagene, développé dans le cadre de mon doctorat, permet de comparer les patrons d’enrichissement des protéines interagissant avec l’ADN. Il extrait efficacement la couverture des régions génomiques, normalise le signal et d’utilise les contrôles pour retirer le bruit de fond. Il produit des graphiques pour comparer visuellement les facteurs et conditions et offre des outils statistiques pour cibler les profils significativement différents. Afin de valider mon approche expérimentale, j’ai analysé une centaine de jeux de données de ChIP-Seq de la lignée GM12878 pour étudier les profils d’enrichissement au niveau des amplificateurs et des promoteurs en fonction de leur activité transcriptionnelle. Cette étude a ciblé deux modes de recrutement distincts, soit l’effet gradient et l’effet seuil. Face à la complexité et la quantité de données disponibles, il est essentiel de développer de nouvelles approches méthodologiques et statistiques afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes biologiques. ENCODExplorer et metagene sont disponibles sur Bioconductor. / Recent progress in sequencing technologies opened the possibility of performing very complex research experiments. Combined with the vast public datasets produced by intenational consortiums such as ENCODE, Roadmap Epigenomics and Fantoms, the amount of data to process can be daunting. The goal of my doctoral project is to develop new bioinformatic approaches to facilitate the integration of ChIP-Seq data for the study of the dynamic of the interactions between proteins and DNA. New tools such as ENCODExplorer and FantomTSS were developped in R to make the publicly available datasets easier to integrate. Futhermore, the metagene package allows the comparison of enrichment patterns of DNA-interacting proteins. This package efficiently extracts read coverage from genomic regions of interest, normalize the signal and uses controls to remove background noise. The main functionnality of the metagene package is to visually compare enrichment profiles from multiple groups of genomic regions and to offer statistical tools to caracterize and compare those profiles. To validate my experimental approach, I used over a hundred datasets from the GM12878 cell line produced by the ENCODE consortium to study the enrichment profiles of transcription factors and histones in enhnacer and promoter regions. I was able to define two distinct recruitment patterns: the gradient effect and the threshold effect. With the ever growing complexity of genomic datasets, it is essential to develop new methodotical approaches to allow a better understanding of the underlying biological processes. ENCODExplorer and metagene are both available on Bioconductor.

Nous avons identifié le gène GPR84 comme étant exprimé par la microglie, c'est-à-dire les macrophages du système nerveux central. Il code pour un récepteur couplé aux protéines G dont le ligand endogène, la fonction et la régulation demeurent inconnus. Dans cette étude, nous avons testé l'hypothèse que l'augmentation de la transcription du gène GPR84, dans la microglie, soit associée à des processus inflammatoires. Pour ce faire, nous avons induit une réaction inflammatoire systémique à la lipopolysaccharide (LPS) chez des souris normales ou déficientes en l'une ou l'autre des cytokines IL-1 et TNF. Par la combinaison des techniques d'hybridation in situ et d'immunohistochimie, il a été montré que, suite à une injection systémique de LPS ou intraparenchymale de TNF, les cellules microgliales et les macrophages du cerveau expriment fortement l'ARNm du gène GPR84. Cette activation est quasi-absente chez les souris normales. Finalement, nous avons démontré que la production du GPR84 par la microglie se présentait non seulement durant la phase aigûe de l'endotoxémie, mais également durant l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle de la sclérose en plaques. Nos résultats illustrent donc que le GPR84, nouveau marqueur, sensible, de l'activation microgliale, pourrait jouer un rôle important dans la régulation des processus neuroinflammatoires.

La transcription des gènes de l'ARN ribosomique (ARNr) est essentielle à la synthèse des ribosomes qui sont eux-mêmes requis pour la production des protéines et donc de l'ensemble des fonctions cellulaires. Malgré ce rôle fondamental, les mécanismes de la synthèse des ARN ribosomiques sont peu élucidés. Mes travaux ont d'abord porté sur la caractérisation du facteur de liaison en amont UBF (Upstream Binding Factor) dans la régulation de l'activité de l'ARN polymerase I (RPI). UBF lie l'ADN des gènes ribosomiques (ADNr) et forme une structure appelée l'Enhancesome. La phosphorylation par ERK des boîtes HMG1 d'UBF provoque un changement de conformation de l'Enhancesome. La signalisation ERK augmente rapidement la transcription ribosomique, mais ne change pas le nombre de polymerases engagées sur les gènes. La phosphorylation d'UBF par ERK le rend plus permissif au passage de RPI, ce qui en fait un modulateur de l'élongation transcriptionnel dépendant de la signalisation par des facteurs de la croissance. Dans un autre ordre d'idées, la méthylation de l'ADN est associée au silencing épigénétique. Nous avons montré que la perte totale de méthylation CpG suscite une réactivation partielle des gènes ribosomiques silencieux et provoque des défauts prononcés de transcription et de maturation des ARNr. J'ai ensuite démontré que la chromatine est plus accessible qu'à la normale, ce qui permet à l'ARN polymerase II (RPIJ) de se lier et transcrire de façon aberrante sur le locus ribosomique. Je me suis de plus intéressé à TTF-I (Transcription Termination Factor-I), un facteur de transcription régulé par le suppresseur de tumeur ARF et que nous avons observé faire la navette entre le noyau et les gènes ribosomiques. En plus de son interaction avec les gènes ribosomiques, TTF-I est retrouvé aux promoteurs de gènes codants des protéines, bien que sa fonction sur ces gènes reste à déterminer. En outre, j'ai développé un essai d'immunoprecipitation séquentielle de la chromatine des gènes ribosomique afin de disposer d'un outil puissant pour comprendre les différences qui distinguent les gènes actifs et inactifs. Les résultats préliminaires indiquent une absence d'histone et une association d'UBF marquée sur les régions activement transcrites de l'ADNr.

En réponse à des signaux environnementaux, la cellule module son programme transcriptionnel afin de mener à une expression spatio-­temporelle adéquate des gènes. L’orchestration d’une telle adaptation repose entre autres sur la séquence primaire du génome, son organisation au sein de la chromatine, ainsi que sa structure tridimensionnelle au sein du noyau. De plus, de nombreux régulateurs permettent d’intégrer ces différents niveaux de régulation afin de contrôler l’activité de l’ARN polymérase II. Dans ce contexte, le complexe cohésine et son facteur de charge sur l’ADN, NIPBL, jouent un rôle clé dans l’interconnexion fonctionnelle entre l’organisation 3D du génome et la transcription. En effet, ces facteurs modulent l’activation de la transcription en rapprochant des régions enhancers de promoteurs et participent à la formation de domaines d’interactions chromosomiques. Par ailleurs, des mutations de NIPBL et du complexe cohésine sont associées au Syndrome de Cornelia de Lange (CdLS), une pathologie caractérisée par une altération de l’expression des gènes. Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la transcription par NIPBL et cohésine sont encore méconnus. L’objectif général de mon projet de doctorat est de définir le rôle de NIPBL et du complexe cohésine dans la régulation du lien entre la topologie du génome et le contrôle de l’expression des gènes. Dans un premier temps, nous montrons que les gènes dérégulés dans le CdLS sont préférentiellement organisés au sein de communautés de gènes, des structures formées par des interactions d’éléments régulateurs non codants ainsi que de gènes dans l’espace chromosomique tridimensionnel. Au sein de cette organisation, les gènes affectés par des mutations de NIPBL ou de la sous-­unité SMC1A du complexe cohésine sont retrouvés positionnés à portée de régions occupées par cohésine et NIPBL et interagissent par l’intermédiaire de contacts promoteur-­promoteur. Dans un second temps, nous présentons des données suggérant un rôle de cohésine dans la régulation de l’initiation de la transcription et un rôle de NIPBL dans le contrôle de la relâche de la pause. Enfin, nous apportons des évidences d’une fonction de NIPBL et cohésine dans la régulation du niveau basal et de l’activation des gènes dont l’expression est stimulée par des hormones. Dans leur ensemble, ces travaux contribuent à l’amélioration des connaissances sur la contribution de l’architecture des chromosomes aux mécanismes généraux de la régulation de la transcription. / In response to environmental signals, the cell modulates its transcriptional program in order to carry out appropriate spatiotemporal gene expression. The orchestration of this adaptation relies on the primary sequence of the genome, its organization into chromatin, and its tridimensional structure inside the nucleus. Moreover, multiple regulators integrate these different regulation levels in order to control the activity of RNA polymerase II. In this context, the cohesin complex and its DNA loader, NIPBL, play a pivotal role in the functional interconnection between the 3D organization of the genome and transcription. Indeed, these factors modulate the activation of transcription by bringing enhancers and promoters into close proximity and participate in the formation of chromosome interaction domains. Moreover, mutations in NIPBL and the cohesin complex are associated with the Cornelia de Lange Syndrome (CdLS), a pathology characterized by gene expression changes. However, the exact molecular mechanisms involved in the regulation of transcription by NIPBL and cohesin are still not understood. The general aim of my doctoral research is to define the role of the cohesin complex and NIPBL in the regulation of the connection between genome topology and gene expression control. First, we show that genes deregulated in CdLS are preferentially organized into connected gene communities, structures emerging from the interactions of noncoding regulatory elements and genes in the three-­dimensional chromosomal space. Within this organization, genes affected by mutations in NIPBL and the SMC1A subunit of the cohesin complex are positioned within reach of NIPBL-­ and cohesin-­occupied regions through promoter-­ promoter interactions. In addition, we present data suggesting a role of the cohesin complex in the initiation of transcription and a role of NIPBL in the control of pause release. Finally, we show evidence of a function of NIPBL and cohesin in the regulation of the basal level and the activation of genes stimulated by hormones. Ultimately, this work aims to gain insight into the contribution of the architecture of chromosomes to the general mechanisms of transcriptional regulation.

Le trouble majeur de la dépression est un des troubles de santé mentale les plus fréquents dans la société d’aujourd’hui avec plus de 350 millions de personnes atteintes dans le monde. Malgré la présence de différents types de traitement, comme les antidépresseurs ou les thérapies comportementales, les causes de ce trouble ne sont pas encore complètement élucidées. Les lacunes concernant la compréhension de cette pathologie se trouve plus particulièrement au niveau de ses fondements génétiques. A partir d’un grand échantillon de 267 sujets atteints de la dépression, de 286 sujets témoins ainsi que de trois modèles animaux, la présente étude a pour objectif de mettre en évidence différents gènes et fonctions associés de façon significative à cette maladie et de caractériser les différences transcriptionnelles spécifiques au sexe. Pour ce faire, deux grandes étapes composent ce projet. Une analyse de gènes différentiellement exprimés ainsi qu’une de modules de gènes Eigengenes, toutes deux effectuées sur l’humain et sur les modèles animaux. Les résultats ont mis en exergue plusieurs gènes associés à la dépression et partagés entre l’humain et les modèles animaux. Il semblerait que le modèle animal qui reproduit le plus les observations chez l’humain soit celui de l’isolation sociale. De plus, plusieurs fonctions biologiques pertinentes avec la caractérisation du trouble étudié ont été identifiées. Par surcroît, les modules de gènes associés à la dépression chez les femelles étaient en plus grand nombre que chez les mâles et cette observation est bien reproduite dans le modèle du stress variable chronique de l’animal. Cette étude a donc permis une amélioration des connaissances concernant la génétique de la dépression. Il en ressort que les modèles animaux utilisés dans cette étude permettent de bien de reproduire un état dépressif chez l’animal. / Major depressive disorder is one of the most common mental health disorder in modern society affecting more than 350 million people worldwide. While different types of treatment are available, such as antidepressants or behavioural therapies, causes of this disorder are not yet fully understood. A better comprehension of its genetic basis could fulfil the gaps. From a large sample of 267 subjects with depression, 286 control subjects and three animal models, this study aims to identify different genes and functions significantly associated with this disorder and to characterize sex-specific transcriptional differences. This project splits in two major steps: a differentially expressed genes analysis and a gene modules analysis using Eigengenes, both performed on humans and animal models. Results highlight several genes shared between humans and animal models. The animal model that seems to better reproduce the effects observed in humans is that of social isolation. In addition, several biological functions appear to be relevant to major depressive disorder characterization. Furthermore, gene modules associated with depression are more numerous in females than in males and this observation is reproduced in the animal’s chronic variable stress model. This study therefore enhanced knowledge about depression’s genetics and shows that animal models can be effectively used to reproduce a depressive state in animals.

Face à un environnement changeant, la cellule a dû développer des systèmes de régulation lui permettant de s’adapter et d’assurer son développement et sa survie. Ces systèmes de régulation s’organisent autour de réseaux de régulation transcriptionnelle permettant l’expression des gènes codant pour les protéines dont la cellule a besoin. Dans la plupart des réseaux trancriptionnels, la régulation de la transcription des gènes est « raffinée » par la présence de circuits de rétroaction positifs et négatifs à l’origine de deux types de comportements différents: la multistabilité d’une part, et les comportements homéostatiques ou oscillants d’autre part. Deux réseaux de régulation transcriptionnelle de complexité différente ont été étudiés au cours de cette thèse :le réseau p53-Mdm2 impliqué dans l'arrêt de la croissance cellulaire, la réparation de l’ADN et l’apoptose chez les mammifères, et le réseau de facteurs transcriptionnels GATA impliqué dans la régulation du catabolisme de l’azote chez la levure Saccharomyces cerevisiae. L’analyse théorique du réseau p53-Mdm2 a eu pour principal objectif de reproduire et d’interpréter les données expérimentales disponibles dans la littérature concernant la réponse oscillante de la p53 lorsque l’ADN de la cellule est endommagé. L’analyse théorique des comportements du réseau GATA, quant à elle, a été couplée à une étude expérimentale dans les milieux de qualité intermédiaire en azote peu investigués jusqu’à présent. Pour analyser les propriétés dynamiques de ces deux réseaux, plusieurs approches complémentaires, se situant à différents niveaux de description, ont été utilisées: l’approche logique, différentielle et stochastique.<p>La première partie de cette thèse a été consacrée à l’étude du réseau p53-Mdm2 pour lequel nous avons développé un modèle simple composé d’un circuit de rétroaction positif imbriqué dans un circuit de rétroaction négatif. Les résultats de notre analyse logique montrent que les principales propriétés dynamiques du réseau peuvent être résumées par un petit nombre de diagrammes de bifurcation logique. Ces scénarios de bifurcations diffèrent par la séquence d’activation du circuit positif et négatif composant le réseau et dépendent d’une part de l’affinité de la p53 pour ses gènes cibles et d’autre part de son activité transcriptionnelle. Nous proposons que différents stress et types cellulaires pourraient correspondre à différents scénarios de bifurcation et donc conduire à des réponses différentes après irradiation. Cette première analyse qualitative nous a permis de rendre compte de différents aspects de la dynamique du réseau observés expérimentalement, tels que le changement de fréquence des oscillations en cours de réponse, les oscillations de longue durée de la p53 ou l’amortissement rapide des oscillations à l’échelle d’une population de cellules. Pour nous affranchir des fortes non-linéarités inhérentes au traitement logique, nous avons ensuite traduit le modèle logique en un modèle différentiel et montré que les principaux comportements présentés par le modèle logique sont conservés, suggérant que la structure du réseau détermine dans une large mesure les principales potentialités dynamiques du système. L’analyse des propriétés de bifurcation du modèle différentiel en fonction du niveau de dommage à l’ADN nous a également permis de mettre en évidence la présence de deux régimes oscillants d’amplitude, de valeur moyenne et de fréquence nettement différentes, séparés par une zone de bicyclicité où ces deux régimes coexistent. Cette propriété permet d’expliquer l’existence des deux fréquences d’oscillation différentes qui ont été observées expérimentalement en fonction de la dose d’irradiation. Enfin l’analyse stochastique de notre modèle nous a, en particulier, permis de rendre compte de l’augmentation du nombre de cellules oscillant à des fréquences élevées lorsque la dose d’irradiation augmente, observée expérimentalement.<p>La deuxième partie de notre thèse a été consacrée à l’étude du réseau de facteurs GATA chez la levure S.cerevisiae. Ce réseau, constitué des activateurs Gln3 et Nil1 et des répresseurs Dal80 et Gzf3, comporte plusieurs circuits de rétroaction positifs et négatifs interconnectés. Dans le but d’aider à comprendre le rôle et le fonctionnement du réseau GATA, nous avons effectué une analyse théorique et expérimentale de son comportement dynamique en fonction de la qualité de la source azotée. L’analyse différentielle montre la possibilité d’un comportement bistable dans les milieux de qualité intermédiaire en azote et d’oscillations amorties suite à un transfert nutritionnel d’une condition azotée à une autre, lorsque l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 est synergique ou lorsque le gène Gln3 est supprimé. Gzf3 serait le répresseur clef impliqué dans la bistabilité tandis que Dal80 serait le répresseur clef impliqué dans les comportements oscillants. L’analyse stochastique nous a permis d’étudier l’effet des fluctuations moléculaires sur ces comportements et les distributions de variables importantes du système dans une population de cellules. Pour le modèle synergique de la souche sauvage et celui du mutant gln3°, elle a montré l’existence, dans des milieux de qualité intermédiaire en azote, de deux populations de cellules qui coexistent :une population où l’expression de Dal80 est réprimée, une autre où son expression est activée. Enfin, l’étude de la dynamique du couplage entre la protéine fluorescente Gfp, sous le contrôle du promoteur de DAL80, et le réseau GATA montre que, pour des ordres de grandeur physiologique de la vitesse de disparition de la Gfp, la bimodalité présente au niveau du réseau GATA devrait se refléter au niveau de la Gfp.<p>Les comportements bistables et oscillants mis en évidence dans notre étude théorique du réseau GATA ont ensuite été testés expérimentalement en suivant la Gfp sous le contrôle du promoteur de DAL80 en fonction de la concentration de la source azotée glutamine. Cette étude expérimentale nous a permis de mettre en évidence l’existence d’oscillations amorties de la fluorescence de la protéine de fusion Dal80-Gfp. De telles oscillations cependant n’ont pas été observées dans les expériences réalisées sur les autres souches testées pour lesquelles le gène de la Gfp est fusionné au promoteur de DAL80. Notre étude expérimentale montre également l’existence, chez la souche sauvage, d’une population unique de cellules fluorescentes quelle que soit la concentration du milieu extérieur en glutamine testé (0.2mM à 10mM). Un modèle additif où l’activation des gènes du réseau par Gln3 et Nil1 n’est pas synergique serait donc en meilleur accord avec nos observations. Chez les souches où le facteur Gln3 est inactivé, par contre, deux populations cellulaires, l’une de forte fluorescence et constituée de cellules de grande taille, l’autre de plus faible fluorescence et constituée de cellules de taille plus petite, coexistent pour des concentrations intermédiaires du milieu extérieur en glutamine. La forte corrélation observée entre la taille et la fluorescence des cellules suggère que le comportement bimodal observé au niveau de la fluorescence est lié au comportement bimodal observé au niveau de la taille. Enfin, un modèle phénoménologique de la croissance cellulaire nous a permis de reproduire l’existence de deux populations cellulaires de taille distincte.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Chez une multitude de métazoaires étudiés, une période de quiescence transcriptionnelle est observée chez le jeune embryon suite à la fécondation de l'ovocyte. La durée de cette période est spécifique à chaque espèce et chez le bovin, l'embryon n'active son propre génome qu'aux stades 8- à 16-cellules. Précédemment à cette activation de la transcription, l'embryon subsiste grâce à l'utilisation des ARNm et des protéines fournies par l'ovocyte. C'est également à partir de ces réserves que l'embryon doit puiser les différents facteurs impliqués dans l'activation de son génome au moment requis. Les expériences présentées dans cette thèse étaient destinées à améliorer nos connaissances de l'activation du génome embryonnaire chez le bovin. Dans un premier temps, la caractérisation de l'expression de plusieurs facteurs de transcription chez l'embryon a été effectuée et le rôle envisageable de ces facteurs dans l'activation du génome a aussi été démontré. Par la suite, nous avons établi une liste exhaustive de plus de 300 transcrits embryonnaires exprimés très tôt dès l'activation du génome. Cette étude du transcriptome a permis l'identification d'une multitude de gènes associés à la transcription et au maintient de la pluripotence que l'on retrouve chez les cellules embryonnaires. Afin de définir la fonction ou le rôle des différents joueurs identifiés lors de nos études, nous avons mis au point un procédé qui cible spécifiquement un transcrit donné et induit sa dégradation dans les ovocytes bovins sans toutefois induire des effets collatéraux dommageables sur la compétence au développement de ces ovocytes. Cette méthode utilise l'interférence ARN qui réduit à des niveaux très faibles la présence d'un transcrit ciblé, ce qui permet d'étudier les effets de sa perte de fonction. Cette méthode a permis d'établir le rôle crucial dans l'embryon d'un gène issu de nos premières études : MATRIN 3. La dégradation de l'ARN de MATRIN 3, une composante architecturale de la matrice nucléaire qui agit aussi au niveau de la transcription, s'est avérée avoir des effet néfastes sur la survie embryonnaire. Les informations fournies par la combinaison des études présentées dans cette thèse contribuent à dresser un portrait mieux défini de l'activation du génome chez le bovin.

Pendant l'ovogenèse, l'ovocyte synthétise et emmagasine de nombreux ARNm maternels dans un état de traduction inactive. Ils sont traduits pendant la maturation et le développement embryonnaire grâce à la polyadénylation cytoplasmique, qui est régulée par des éléments spécifiques localisés dans leur 3' UTR. Les expériences présentées dans cette thèse ont été menées chez l'ovocyte bovin afin de mieux comprendre la régulation de la traduction par la polyadénylation cytoplasmique d'ARNm maternels. En étudiant l'ARNm de la cycline Bl, nous avons démontré que la polyadénylation cytoplasmique et l'initiation de la traduction peut survenir avant la maturation in vitro de l'ovocyte. Nous avons ensuite identifié et caractérisé un nouveau gène de l'ovocyte bovin nommé OOSPI (oocyte-secreted protein 1), qui est exprimé sous deux variants d'épissage : OOSPI vl (variant 1); et OOSPI_v2 (variant 2). Les transcrits de ce gène sont présents en grande quantité dans les ovocytes immatures (GV) et sont dégradés graduellement pendant la maturation et le développement, sans être exprimés à nouveau suite à l'activation du génome embryonnaire. Nous avons démontré que le gène OOSPI est un marqueur ovocyte-spécifique et que l'ARNm OOSPI vl est un marqueur de compétence au développement. L'étude de l'état de polyadénylation de l'ARNm OOSPI vl a permis de découvrir que sa queue poly(A) est longue dans les ovocytes en GV, allongée dans le zygote et raccourcie dans l'embryon au stade 8 cellules. Ce profil de polyadénylation est similaire à celui d'autres ARNm maternels ovocytaires possédant un CPE de type embryonnaire (eCPE) dans leur 3' UTR, comme celui de l'ARNm OOSP1 vl. Nous n'avons pu étudier l'initiation de la traduction de l'ARNm OOSPI vl puisque la protéine OOSPI vl est déjà présente dans les ovocytes immatures et matures (Mil), sous trois masses moléculaires différentes. La forme protéique de faible masse moléculaire disparaît complètement en fonction du temps après 18 h de fécondation in vitro. Seule la forme protéique de masse moyenne est encore présente dans les blastocystes. Nous avons montré que l'ARNm OOSPI vl et la protéine qu'il code sont finement régulés lors de la fécondation et du développement embryonnaire. / During oogenesis, the oocyte synthesizes and stores numerous maternal mRNA in a translational inactive state. Their translation is linked to cytoplasmic polyadenylation during maturation and embryo development and is driven by specific elements in their 3' UTR. The experiments presented in this thesis were conducted in the bovine oocyte to better understand translation regulation of maternal mRNA by cytoplasmic polyadenylation. With the study of cyclin Bl mRNA, we demonstrated that cytoplasmic polyadenylation and translation initiation can occur before in vitro maturation of the oocyte. We then identified and characterized a novel bovine oocyte gene named OOSP1 (oocyte-secreted protein 1), that is expressed under two splicing variants : OOSP1 vl (variant 1); and OOSPlv2 (variant 2). These transcripts are highly present in immature (GV) oocytes and are gradually depleted during maturation and development, without being reexpressed following embryonic genome activation. We showed that the OOSP1 gene is an oocyte-specific marker and that OOSPlvJ mRNA is a marker for developmental competence. The study of OOSPlvl mRNA polyadenylation status showed that its poly(A) tail is long in GV stage oocytes, elongated in zygotes and shortened in 8-cell embryos. This polyadenylation pattern is similar to the ones of other oocyte maternal mRNA bearing an embryonic type CPE (eCPE) in their 3' UTR, as the one present in OOSPlvl mRNA. We were not able to study OOSPlvl mRNA translation initiation since OOSPljvl protein was already present, in three different molecular masses, in immature and mature (Mil) oocytes. The low molecular mass protein form disappears in a time-dependant manner after 18 h of in vitro fertilization and only the medium molecular mass protein form is still present in blastocysts. We demonstrated that OOSP1 vl mRNA and its encoded protein are finely regulated during fertilization and embryo development.

La transition maternelle-embryonnaire constitue une étape très importante dans le développement précoce des animaux. Elle marque la transition entre l'utilisation et la dégradation du matériel génétique maternel vers l'activation du nouveau matériel génétique embryonnaire. Ces ARNm maternels que contient l'ovocyte sont particulièrement importants durant les quelques jours où la transcription est absente, laissant le zygote utiliser ses réserve de transcrits accumulés. La transition maternelle-embryonnaire doit donc comprendre des mécanismes de contrôles suffisamment précis pour permettre la dégradation des transcrits maternels non-traduits. Ces contrôles, qui ne sont pas encore bien connus dans la littérature, font l'objet de beaucoup de recherches. Les microARNs sont de petits fragments d'ARN d'une longueur de 19 à 24 nucleotides de plus en plus étudiés pour leurs rôles dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes et représentent un mécanisme de régulation potentiel des transcrits maternels. L'analyse des microARNs a donc été effectuée tout au long de la maturation ovocytaire jusqu'aux stades embryonnaires préimplantatoires. Une analyse préliminaire comparant un groupe de GV à un groupe de Mil par biopuce a permis de sélectionner deux candidats, soit miR-21 et miR-130a, qui possèdent tous les deux une expression différentielle (P < 0,01). Leurs formes mature et précurseur ont été quantifiées sur des pools de 20 ovocytes en stades GV, GVBD et Mil, ainsi que chez les embryons de 2, 4, 8 cellules et blastocystes, en trois réplicats biologiques (n = 3). Les quantifications ont démontré des résultats surprenants. Pour miR-130a mature, une corrélation positive (P = 0,05) du stade GV jusqu'à l'embryon de 8 cellules a été validée par un profil semblable chez le précurseur (P = 0,002). Une corrélation positive a aussi été obtenue pour miR-21 (P = 0,003) et son précurseur a démontré une augmentation significative (P = 0,05) entre le niveau d'expression observé en Mil et le niveau d'expression chez l'embryon de 2 cellules. Suite à une exposition d'une durée de 30 à 34 heures dans un milieu de culture contenant 25 pg/ml d'a-amanitine, les mêmes microARNs ont été quantifiés sur des pools d'embryons de 2 cellules. Dans tous les cas, excepté pour le précurseur de miR-130a, les résultats ont démontré une diminution significative du niveau d'expression chez les embryons traités (P < 0,05). De plus, le gène contrôle SFRS3 a aussi démontré une diminution significative. Pour toutes les quantifications, le gène H2A.1 a