A seca é um dos principais problemas que afetam a produção do feijoeiro. A despeito da importância de caracteres fenotípicos radiculares, muitos dos esforços de melhoramento genético da cultura tem focado na seleção de cultivares com maior produção de grãos. A simbiose estabelecida entre plantas e FMA aumentam o potencial de captação de água no solo através das extensas redes formadas pelas hifas e alteram vias metabólicas vitais para a manutenção das relações hídricas da planta. O modelo de interação feijoeiro (BAT 477) colonizado por uma mistura de FMA (Glomus clarum, Acaulospora scrobiculata e Gigaspora rosea) foi submetido a um déficit hídrico de 96 h durante o pré-florescimento. O transcritoma global de raízes inoculadas e não-inoculadas, sujeitas ou não à seca, foi comparado por RNA-Seq. Um conjunto de 71 transcritos foram induzidos por FMA durante a seca. Comparando-se os tratamentos estresse e controle, 12.086 unigenes foram regulados em plantas inoculadas e 11.938 em não-inoculadas, refletindo o alto potencial de tolerância da linhagem BAT 477 e indicando que a presença de FMA produz uma regulação fina no perfil de expressão de genes regularmente envolvidos na resposta da planta ao estresse. Foram selecionados 15 fatores de transcrição e seus perfis de expressão foram caracterizados por RT-qPCR tomando-se três períodos, 48, 72 e 96 h de déficit hídrico. Plantas inoculadas ativaram a expressão destes genes mais tardiamente (após 72 h), refletindo melhorias nas condições hídricas da planta que adiam a percepção do estresse. Adicionalmente, a expressão de 23 transcritos foi avaliada em três amostras teciduais diferentes obtidas por microscopia de microdissecção a laser. Glucan 1,3 ?-Glucosidase e PIP2,3, foram detectados somente em células do córtex radicular contendo arbúsculos indicando uma possível indução tecido específica dependente da presença dos fungos. Análises complementares apontaram a regulação de 171 unigenes envolvidos na resposta das FMA ao estresse. Estes resultados validam a hipótese inicial de que a inoculação com FMA altera os perfis de expressão de genes vitais para a resposta da planta ao déficit hídrico / Drought is one of the main problems that affect common bean\'s production. Despite the importance of root fenological characters, breeding efforts for the culture have focused on the selection of cultivars for grain yield. The symbiosis stablished between AMF and plants enhances the potential of water absorption from the soil through an extensive net formed by hyphae and alters vital metabolic pathways involved in the maintenance of the water relations in plants. The interaction model common bean (BAT 477) colonized by a mixture of AMF (Glomus clarum, Acaulospora scrobiculata and Gigaspora rosea) was exposed to a water deficit regime of 96 h during pre-flowering. Global transcriptome from inoculated and non-inoculated roots, exposed or not to drought, were compared through RNA-Seq. A set of 71 transcripts was induced by AMF during drought. Comparing both stress and control treatments, 12,086 unigenes were regulated in inoculated plants, and 11,938 in non-inoculated, reflecting the great tolerance potencial of the lineage BAT 477 and indicating that the presence of AMF produces a fine tune regulation on the expression of genes regularly involved on the drought response of the plant. It was selected 15 transcription factors and their expression profiles were characterized through RT-qPCR taking 3 periods, 48, 72 and 96 h of water deficit. AM plants activated earlier (after 72 h) the expression of these genes, reflecting improvements on the water conditions of the plant that delay the stress perception. Additionally, the expression of 23 transcripts was evaluated on three different tissue samples obtained through laser microdissection microscopy. Glucan 1,3 ?-Glucosidase and PIP2,3, were detected only in cortical cells containing arbuscules, pointing to a possible tissue specific induction dependent of the presence of the fungus. Additional analysis point to the regulation of 171 unigenes involved on the response of the AMF to drought. These results corroborate the initial hypothesis that the inoculation with AMF alters the gene expression profiles of genes that are vital for water deficit response in plants

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-29Bitstream added on 2014-06-13T21:03:51Z : No. of bitstreams: 1 silva_dcg_dr_jabo.pdf: 913437 bytes, checksum: aa269781e66dfd6e36870d5868db52c3 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A ferrugem asiática da soja é causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi. Quatro genes de resistência à ferrugem da soja distintos, Rpp1 a 4, foram descritos. O objetivo deste trabalho foi mapear geneticamente os genes de resistência Rpp2 e Rpp4 e identificar genes induzidos pela resposta de defesa mediada pelo gene Rpp2. Duas populações F2:3 derivadas dos cruzamentos entre as linhagens resistentes PI 230970 (Rpp2) e PI 459025 (Rpp4) com a cultivar suscetível BRS 184, e marcadores SSR, foram utilizados neste estudo. Os locos Rpp2 e Rpp4 foram mapeados nos grupos de ligação J e G da soja, respectivamente, e os marcadores associados terão grande valor no processo de seleção assistida por marcadores para este caráter. Quatro bibliotecas de cDNA, derivadas de folhas do genótipo resistente PI 230970 (Rpp2) e do genótipo suscetível Embrapa 48, obtidas às 24 e 192 horas após a inoculação com esporos de P. pachyrhizi, foram geradas utilizando a metodologia SSH e tiveram seu padrão de expressão avaliado por análise de microarranjos de cDNA. Foram produzidas 3.807 sequências viáveis, das quais 670 foram sequências únicas, sendo 149 destas (22,2%) novas sequências da soja. A categoria funcional mais representativa para as quatro bibliotecas foi proteção celular, defesa e virulência. Apenas 65 trnascritos foram diferencialmente expressos, estando eles envolvidos na geração de espécies reativas de oxigênio, fitoalexinas e proteínas antimicrobianas, morte celular e senescência, modificação, estabilização e degradação protéica, controle da expressão gênica e reforço de parede celular. Este trabalho permitiu a identificação de novas seqüências da soja e contribuiu para a elucidação da estratégia de defesa mediada pelo gene Rpp2. / Asian soybean rust is caused by the fungus Phakopsora pachyrhizi. Four resistance genes to this disease, Rpp1 to 4, were previously identified. The aim of this work was to identify SSR markers linked to Rpp2 and Rpp4, and to characterize genes up-regulated under soybean-Asian rust interaction. Two F2:3 populations derived from the crosses PI 230970 (Rpp2) x BRS 184 and PI 459025 (Rpp4) x BRS 184, and SSR markers were used for mapping. Rpp2 and Rpp4 loci were mapped on the soybean linkage groups J and G, respectively, and the associated markers will be highly valuable to assist the introduction of these genes into soybean cultivars. Four cDNA libraries derived from leaf samples of the resistant genotype PI 230970 and the susceptible genotype Embrapa 48, obtained at 24 and 192 hours after inoculation, were generated using SSH and evaluated by cDNA microarray analysis. A total of 3,807 reliable ESTs were obtained, 670 from them were unique. The most representative functional category in all libraries was “cell rescue, defense and virulence”. Only 65 transcripts were differentially expressed among treatments, and were involved in the generation of reactive oxygen species, phytoalexins and antimicrobial proteins; cell death and senescence; protein fate; gene expression control; and reinforcement of cell wall. This work produced novel soybean sequences and contributed to the comprehension of the soybean mechanism of resistance to Asian rust mediated by Rpp2.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-27T13:50:34Z No. of bitstreams: 2 Tese - Arthur Tavares de Oliveira Melo - 2015.pdf: 5375267 bytes, checksum: 306e8d72c2977068f8f669824b83ca4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-27T14:08:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Arthur Tavares de Oliveira Melo - 2015.pdf: 5375267 bytes, checksum: 306e8d72c2977068f8f669824b83ca4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-27T14:08:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Arthur Tavares de Oliveira Melo - 2015.pdf: 5375267 bytes, checksum: 306e8d72c2977068f8f669824b83ca4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-01-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The sugarcane is one of the most important crop species to provide sugar and renewable energy in the world. Due to the high amount of repetitive elements and the various polyploidization events suffer during its evolution, the Saccharum spp. genome has not yet been assembled and annotated, unlike other agronomic important species. So, the knowledge about sugarcane transcriptome become even more useful for supporting genomic analyzes studies. A draft assembly of sugarcane transcriptome was obtained from Illumina sequencing paired-ends libraries of five different plant organs, sampled from thirty elite clones. Analyzes of quality control and normalization was done in the RNA-seq data. Trinity package was used for de novo assembly. The scaffolds obtained and identified as complete ORFs were annotated according to Gene Ontology terms. The draft assembly was characterized by the identification of microsatellites and SNPs molecular markers and for assessing the contribution of different plant organs for transcriptome final assembly. The draft sugarcane transcriptome comprised 178 Mb, over 131,831 scaffolds, representing 61,225 genes. The transcripts average size was 1,350 bp and N50 value was 1,667 bp. A total of 1,250 transcripts identified as complete ORFs showed no similarity to sequences of the nr NCBI database, are considered new Transcript Active Regions (nTARs). The annotation performed using the KEGG database identified 234 transcripts coding for enzymes members of sucrose and starch metabolism, an important metabolic pathway for understanding the relationship between photosynthetic rate and sucrose accumulation in the stalk. The five plant organs used contributed equally for the draft sugarcane transcriptome. A total of 12,931 genomic regions were identified containing perfect microsatellites, with a predominance of di and tri nucleotide. On average, one SNP every 18 bp was identified, with more than four million SNPs identified with satisfactory values of haplotype and quality scores. The nucleotide diversity of thirty elite clones used in this study was high. The identification of these molecular markers, particularly SNPs markers, provides the possibility of using these polymorphisms in genomic and genetic studies of sugarcane, including the possibility of application of genome wide selection like breeding strategy. The sugarcane transcriptome draft assembly proposed in this study has data and analysis quality sufficient to be used in attempt to encompass a reference transcriptome for the species of Saccharum spp. / A cana-de-açúcar é uma das principais espécies cultivadas para o fornecimento mundial de açúcar e energia renovável. Devido à elevada quantidade de elementos repetitivos e os vários eventos de poliploidização, o genoma da espécie ainda não foi montado e anotado, diferentemente de outras espécies de interesse agronômico. Assim, as informações do transcritoma da espécie se tornam ainda mais úteis por dar suporte ás iniciativas de análises genômicas. Um draft assembly do transcritoma de cana-de-açúcar foi montado a partir do sequenciamento Illumina de bibliotecas paired-ends de cinco órgãos distintos da planta, obtidos de uma amostra de trinta clones elite. Os dados de RNA-seq passaram por análises de controle de qualidade e normalização. O software Trinity foi utilizado para montagem de novo do transcritoma. Os scaffolds obtidos identificados como ORFs completas foram anotados conforme os termos do Gene Ontology. O draft assembly obtido para o transcritoma de cana-de-açúcar foi caracterizado pela identificação de marcadores moleculares do tipo microssatélites e SNPs e pela avaliação da contribuição dos diferentes órgãos vegetais para constituição final do transcritoma. O transcritoma obtido compreendeu 178 Mb, distribuídos em 131.831 scaffolds, representando 61.225 genes. O tamanho médio dos transcritos foi de 1.350 pb, com valor de N50 igual a 1.667 pb. Um total de 1.250 transcritos, identificados como ORFs completas, não apresentaram similaridade com sequências do banco de dados nr do NCBI, sendo considerados novas regiões transcricionalmente ativas (nTARs). A anotação realizada através do banco de dados do KEGG identificou 234 transcritos codificantes para enzimas integrantes do metabolismo de sacarose e amido, uma importante rota metabólica para compreensão da relação entre taxa fotossintética e o acúmulo de sacarose no colmo. Os cinco órgãos vegetais utilizados contribuíram igualmente para a constituição do draft do transcritoma de cana-de-açúcar. Foram identificadas 12.931 regiões genômicas contendo microssatélites perfeitos, com predomínio de di e tri nucleotídeos. Em média, identificou-se um SNP a cada 18 pares de bases, com mais de quatro milhões de SNPs identificados. A diversidade nucleotídica dos trinta clones elites utilizados é elevada. A identificação destes marcadores moleculares, principalmente os marcadores SNPs, fornece a possibilidade de utilização destes polimorfismos em estudos genéticos e genômicos de cana-de-açúcar, incluindo o emprego em abordagens como seleção genômica ampla no melhoramento da espécie. O draft assembly do transcritoma de cana-de-açúcar proposto neste estudo possui qualidade de dados e de análise suficiente para ser utilizado na tentativa de abranger um transcritoma de referência para as espécies de Saccharum spp.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-07-13T21:03:27Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Priscila Elias Campos Naves - 2012.pdf: 1687485 bytes, checksum: 4d21dacd2ba42ae2bd0c8df7e82075b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-07-14T13:01:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Priscila Elias Campos Naves - 2012.pdf: 1687485 bytes, checksum: 4d21dacd2ba42ae2bd0c8df7e82075b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T13:01:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Priscila Elias Campos Naves - 2012.pdf: 1687485 bytes, checksum: 4d21dacd2ba42ae2bd0c8df7e82075b0 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2012-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides is a thermal dimorphic fungus that causes Paracoccidioidomycosis (PCM), an endemic disease in Latin America. Immune cells have a variety of defense mechanisms against pathogens, such as the production and release of nitric oxide (NO), one of the reactive nitrogen species (RNS). RNS react with cellular components, resulting in damage to DNA and membranes, inhibition of repiration and inactivation of cellular enzymes. To understand how Paracoccidioides responds to nitrosative stress, this study aims to identify genes that might contribute to this response. The Paracoccidioides yeast cells grouth was evaluated in the presence of various concentrations of sodium nitrite (NaNO2). The nitrosative stress was confirmed by quantification of nitrite in the cultures supernatant and by the inhibition of the cytochrome c oxidase (complex IV) activity. The transcriptional analyzes were performed by sequencing a cDNA library constructed with Paracoccidioides mRNA obtained after incubation of fungal cells with 500 µM NaNO2 during 1 h. The results show the induction of transcripts related to several cellular pathways, including genes of mitochondrial electron transport chain. The expression of selected transcripts was confirmed by quantitative real time RT-PCR. Moreover, mitochondrial activity measured by XTT method was reduced in the presence of NaNO2 during the first 2 hours of treatment. Additionally, the NADP+/NADPH ratio is lower during nitrosative stress, as demonstrated. The results suggest that the induction of transcripts associated with energy production during nitrosative stress may reflect a compensatory effect on the inhibition of enzymes that carry out this metabolic function, probably to ensure the production of energy and/or contribute to the redox balance by generation of NADPH. / Paracoccidioides é um fungo termodimórfico causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma doença endêmica na América Latina. Células do sistema imune humano possuem uma variedade de mecanismos de defesa contra patógenos, como a produção e liberação de óxido nítrico (NO), uma das espécies reativas de nitrogênio (RNS). RNS reagem com os componentes celulares, o que resulta em danos ao DNA e membranas, inibição da respiração e inativação de enzimas celulares. Para entender como Paracoccidioides responde ao estresse nitrosativo, esse trabalho tem como objetivo identificar genes que possam contribuir para esta resposta. O crescimento de células de levedura de Paracoccidioides foi avaliado na presença de várias concentrações de nitrito de sódio (NaNO2). O estresse nitrosativo foi confirmado através da quantificação de nitrito no sobrenadante das culturas e da inibição da atividade da enzima citocromo c oxidase (Complexo IV). As análises transcricionais foram feitas a partir do sequenciamento da biblioteca de cDNA construída utilizando-se mRNA obtido após incubação de células leveduriformes de Paracoccidioides na presença de 500µM de NaNO2 durante 1 hora. Os resultados mostram a indução de transcritos relacionados a várias vias celulares, incluindo genes da cadeia mitocondrial transportadora de elétrons. A expressão de alguns desses transcritos foi confirmada por PCR quantitativo em tempo real. Adicionalmente, a atividade mitocondrial, avaliada através do método do XTT, apresentou-se reduzida na presença de NaNO2 durante as primeiras 2 horas de tratamento. A razão NADP+/NADPH foi avaliada, apresentando-se menor durante o estresse nitrosativo. Os resultados sugerem que a indução de transcritos relacionados à produção de energia durante o estresse nitrosativo possa refletir um efeito compensatório sobre a inibição de enzimas que desempenham esta função metabólica, provavelmente para assegurar a produção de energia e/ou contribuir para o balanço redox através da geração de NADPH.

A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma importante cultura na produção de alimentos e energia. Várias espécies de insetos podem causar sérios prejuízos econômicos à cultura da cana-de-açúcar. A broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis) é a praga de maior relevância por estar amplamente distribuída nas regiões canavieiras. O silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) se tornou uma técnica amplamente estudada e utilizada nos mais diversos aspectos da biologia. Uma de suas aplicações é no controle de insetos-praga como uma alternativa de alta eficiência, especificidade e reduzido impacto ambiental. A ingestão de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA) com identidade a regiões de genes essenciais de insetos-praga pode resultar no silenciamento destes genes, levando a fenótipos deficientes. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo buscar genes alvos para o silenciamento com potencial para impedir o desenvolvimento normal da D. saccharalis e estabelecer uma forma de entrega do dsRNA eficiente para o teste de genes, visando assim validar o uso da técnica para a espécie. Por meio da clonagem de regiões de genes ortólogos já utilizados como alvo de silencimento em outras espécies de insetos (V-ATPase A, Receptor de Ecdisona e Arginina Kinase), e de genes com função específica identificadas após a caracterização do transcritoma de D. saccharalis (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland e Quitina Sintase) foram conduzidos ensaios de RNAi. Foram realizados ensaios de dose resposta para o gene V-ATPaseem lagartas neonatas, onde a concentração selecionada por causar melhor redução na expressão do gene alvo foi de 2,5 µg µL-1. Esta concentração foi então utilizada em ensaios de alimentação para os outros genes. Os genes V-ATPase A, receptor de Ecdisona, Arginina Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase e Quitina Sintase apresentaram redução significativa no número de transcritos em larvas, demonstrando a viabilidade do uso de RNAi em D. saccharalisneonatas. O gene Neverland não demonstrou redução no acúmulo de transcritos nas condições trabalhadas. O gene GFP inicialmente utilizado como controle negativo apresentou variação na expressão de genes alvo, sendo desconsiderado como bom controle para D. saccharalis. O silenciamento dos genes alvo requer quantidades elevadas de dsRNA, superiores aos obtidos por transcrição in vitro, o que limita a viabilidade de ensaios com maiores replicatas e para determinar efeitos biológico. Alternativas de produção de dsRNA devem ser avaliadas para viabilizar a seleção de genes alvo efetivos / Sugarcane (Saccharum spp.) is an important crop for the production of food and bioenergy. Many insect species can cause economic losses in sugarcane. The sugarcane borer (Diatraea saccharalis) is the most important sugarcane pest, because it occurs in all production regions. Gene silencing by RNA interference (RNAi) rapidly became a widely investigated approach, adopted in various aspects of biology. One of the potential applications of RNAi is agricultural pest control, as an alternative with high efficiency, specificity and reduced environmental impact. The ingestion of double-stranded RNA (dsRNA) molecules with identity to regions of essential genes of the insect-pest can result in the target gene knock-down and, consequently, to deficient phenotypes. In the present work, target genes with the potential to affect the normal development of D. saccharaliswere searched, together with an efficient dsRNA delivery approach to test the target-genes to validate the use of the RNAi in D. saccharalis. Based on degenerated primers, expressed orthologous genes previously tested in other insect species (V-ATPase A, Ecdisone Receptor, and Arginine Kinase) were cloned,whilegenes with specific function (Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase, Neverland, and Chitin Synthase) were identified from an in-house assembled transcriptome of D. saccharalis and cloned. A dose-response assay was conducted using the V-ATPase gene region delivered by droplets to neonate larvae, and the 2.5 µg µL-1dsRNA concentration was selected for further tests. This concentration was then used to deliver the other genes. The dsRNA version from the genes V-ATPase A, Ecdisone Receptor, Arginine Kinase, Juvenile Hormone Epoxide Hydrolase and Chitin Synthaseexhibited a significant reduction in the accumulation of transcripts, indicating the viability of RNAi to D. saccharalis in 1st instar larvae. The Neverland gene was not silenced by RNAi in the used conditions. The dsRNA of the Green Fluorescent Protein gene, used as negative control appeared to affectother gene targets. Target gene silencing require large amounts of dsRNA, more than what is achievable by in vitro transcription, which limits the viability to conduct large assays with more replicates and to determine biological effects. Alternatives to produce dsRNA need to be evaluated to enable the selection of effective target genes

Plasmodium vivax é o parasita causador de malária humana com maior distribuição global, responsável pela redução da qualidade de vida de milhões de pessoas ao redor do mundo. O objetivo geral do trabalho foi contribuir, através de metodologias estatísticas e de bioinformática, para o entendimento do mecanismo de escape da eliminação pelo baço do hospedeiro utilizado por P. vivax. Para isso, primeiramente realizou-se a análise estatística de um experimento de transcritômica, através de microarrays. Esse experimento foi conduzido previamente pelo grupo de colaboradores do presente estudo, utilizando um modelo animal, Aotus lemurinus griseimembra, com o objetivo de identificar genes de P. vivax expressos somente em parasitas retirados de macacos que possuíam o baço intacto. Em uma segunda fase, foi projetado um tiling array contendo todos os éxons e as regiões 5UTR e 3UTR disponíveis do genoma de P. vivax, que será utilizado para a realização de mais investigações a respeito da influência da presença do baço na expressão gênica de P. vivax. Na última etapa, foi conduzida uma melhoria na anotação funcional do genoma de P. vivax, através de uma metodologia automática, com o objetivo de adicionar informações para auxiliar na interpretação biológica dos resultados obtidos anteriormente e em estudos futuros. / Plasmodium vivax is the parasite that causes the human malaria type with the largest global distribution and it is responsible for quality of life impairment of millions of people around the world. The general purpose of this study was contribute to understand the mechanism used by P. vivax to scape from the host spleen elimination, through statistical methodologies and bioinformatics. First of all, we carried out statistical analysis of a microarray experiment conducted earlier by the collaborators of this study, using Aotus lemurinus griseimembra as model organism, in order to identify genes of P. vivax expressed only in parasites extracted from monkeys with intact spleen. In the second step, we designed a tiling array containing 5\'UTR, 3\'UTR and all the exons of the P. vivax genome, which will be used to perform more experiments to investigate the role of the spleen on the parasite gene expression. In the last step, we add information to the functional annotation of P. vivax genome, through an automated methodology, to improve the biological interpretation of the results previously obtained and in future studies.

O Brasil é o maior produtor mundial de feijão com produção média anual de 3,5 milhões de toneladas, entretanto, um dos maiores problemas enfrentados por essa cultura é o déficit hídrico, que leva a uma redução considerável em seu rendimento. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água durante o seu desenvolvimento é de grande utilidade. E, como a tolerância à seca é um caráter multigênico, genótipos com diferentes graus de tolerância apresentam expressão gênica diferencial, com ativação e/ou repressão de determinados genes. Diante disso, esse trabalho teve como objetivos: (i) identificar genes diferencialmente expressos em dois genótipos de feijoeiro comum, sendo um tolerante (BAT 477) e o outro suscetível (IACCarioca 80SH) à seca; (ii) verificar a expressão gênica espacial (em raízes, caules e folhas) e temporal (cinco níveis crescentes de déficit hídrico - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 120 h de exposição ao estresse) por meio de RT-qPCR; (iii) predizer a função dos genes identificados, com base nos genes ortólogos de Arabidopsis thaliana, usando dados públicos de microarranjo disponíveis na plataforma Genevestigator. Para atingir esses objetivos, foi conduzido um experimento em casa-de-vegetação, sendo induzido o déficit hídrico, por meio da suspensão da irrigação, quando as plantas atingiram o estádio fenológico R5, mantendo sob suprimento hídrico adequado as plantas-controle. Foi então utilizada a técnica de cDNA-AFLP para isolar os transcritos diferencialmente expressos entre os dois genótipos, sob seca, a qual aliada ao sequenciamento possibilitou a identificação e anotação de 45 transcritos, sendo 21 exclusivamente expressos no genótipo tolerante e 24 no genótipo suscetível. Dentre os transcritos identificados no genótipo tolerante, podem ser listados pelo menos 11, com potencial de serem usados para transformação genética (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related e TCP transcription factor), e no genótipo suscetível, podem ser listados nove (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin e SWI/SNF-related chromatin binding). Na análise de expressão gênica espacial e temporal, os transcritos mais promissores para uso em trabalhos futuros de transformação genética foram: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase e HSP 70 protein, uma vez que tiveram uma expressão bastante pronunciada no genótipo tolerante. Através das análises in silico, baseadas nos genes ortólogos de A. thaliana, foram descobertos processos e vias metabólicas que podem estar envolvidos na resposta do feijoeiro comum ao déficit hídrico. Além disso, foram identificados genes associados com a tolerância à seca, corroborando os dados experimentais. Sendo assim, os resultados obtidos nesse trabalho fornecem o entendimento necessário ao desenvolvimento de ferramentas moleculares (marcadores para genes diferencialmente regulados) para serem utilizados em programas de melhoramento, bem como para informação genética básica na anotação funcional do genoma do feijoeiro e também para utilização desses genes candidatos em trabalhos de transformação genética para obtenção de plantas mais tolerantes à seca. / Brazil is the largest producer of common beans, with average annual production of 3.5 million tonnes; however, one of the biggest problems faced by this crop is drought, which leads to a considerable reduction in their yield. Thus, the identification of genes that control the defense mechanisms and adaptation of common bean to drought during its development is very useful. Drought tolerance is a multigenic character, so genotypes with different degrees of water deficit tolerance exhibit differential gene expression, with activation and/or repression of certain genes. Therefore, this study aimed to: (i) identify differentially expressed genes in two common bean genotypes, one tolerant (BAT 477) and other susceptible (IAC-Carioca 80SH) to drought, (ii) verify the spatial (root, stem and leaves) and temporal (five increasing levels of water deficit - 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h of stress exposition) gene expression by RTqPCR (iii) predict the genes function, based on Arabidopsis thaliana orthologous genes, using available data in the public microarray platform Genevestigator. To achieve these objectives, an experiment was conducted in a green house, being induced water deficit, by withholding water when the plants reached growth stage R5, maintaining adequate water supply under the control plants. To isolate transcripts differentially expressed between the two genotypes under drought was used the cDNA-AFLP technique, which coupled with sequencing enabled the identification and annotation of 45 transcripts, 21 exclusively expressed in the tolerant genotype and 24 in the susceptible one. Among the transcripts identified in the tolerant genotype, may be listed at least 11, with potential to be used in genetic transformation (chlorophyll A-B binding protein, HSP40, HSP70, glycosyl hydrolase, serine/threonine protein kinase, trehalose-6-phosphate synthase, E3 ubiquitin ligase, fructose biphosphate aldolase, mediator complex subunit 13, aquaporin nodulin MTN-3-related and TCP transcription factor), and in the susceptible genotype, can be listed nine (coatomer protein complex, monoamine-oxidase A repressor R1, synaptobrevin, haloacid dehalogenase-like hydrolase, ADP-ribosylation factor, mTERF, serine protease S1C HtrA-related, legume lectin and SWI/SNF-related chromatin binding). In the spatial and temporal gene expression analysis, the transcripts that stood out for use in genetic transformation future studies were: aquaporin nodulin MTN3, E3 ubiquitin ligase, serine/threonine protein kinase, glycosyl hydrolase and HSP 70 protein, since it had an expression quite pronounced in the tolerant genotype. Through the in silico analysis, based on orthologous genes of A. thaliana, was discovered processes and metabolic pathways that may be involved in the common bean response to drought. In addition, we identified genes associated with drought tolerance, corroborating the experimental data. Thus, the present results provide the necessary understanding to develop molecular tools (markers for differentially regulated genes) to be used in breeding programs, as well as basic genetic information in the common bean functional genome annotation and also to use these candidate genes for genetic transformation to obtain drought-tolerant plants.

In this study we used Next-generation sequencing \"NGS\" for DNA and RNA sequencing to search for molecular markers associated with resistance of Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) to insecticides and Bacillus thuringiensis Berliner (Bt) proteins. For this purpose, we selected S. frugiperda resistant strains to insecticides (chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, lufenuron, teflubenzuron and spinosad) belonging to different chemical groups and to the YieldGard VT-PRO&reg; maize expressing Cry1A.105 and Cry2Ab2 proteins. The results of gene expression between resistant and susceptible strains of the neurotoxic insecticides chlorpyrifos and lambda-cyhalothrin demonstrated 935 differentially expressed genes associated with chlorpyrifos resistance and 241 differentially expressed genes associated with lambda-cyhalothrin. Most of these genes was related to high levels of expression in detoxification enzymes, especially the CYP3 and CPY6 families. Regarding to the insecticide teflubenzuron, the inheritance of resistance was characterized as autosomal, incompletely recessive and polygenic. The results of gene expression between resistant and susceptible strains of teflubenzuron indicated 3,519 differentially expressed transcripts, mainly detoxification enzymes from the GSTs, UGTs, P450s, CEs, as well as transport and regulation genes. This gene expression profile was also identified to YieldGard VT-PRO&reg; resistant strain, which also demonstrated changes in the expression levels of other gene groups such as cadherin, aminopeptidases and alkaline phosphatase. Finally, to identify SNP markers associated with resistance of S. frugiperda to insecticides and Bt proteins, we used a genotyping by sequencing (GBS) protocol to all resistant strains and the susceptible strain. A total of 4,276 SNPs was recovered after filtering processes, where 53 polymorphic loci under selection were statistically significant (FDR<=0.047) and none of them was associated with coding regions. However, several of these SNPs were associated with regulatory regions of the genome. Analyses using DAPC resulted in the formation of seven clusters, with the susceptible line being separated from all resistant strains. The resistant strain to chlorpyrifos presented an exclusive cluster separated from the other resistant strains, which were grouped together. The association analyses between susceptible and resistant strains indicated 17 loci associated with all resistant strains, 114 loci associated with resistance to chlorpyrifos, 105 to lambda-cyhalothrin, 84 to lufenuron, 87 to teflubenzuron, 108 to spinosad and 62 to YieldGard VT-PRO&reg; maize. Therefore, we can conclude that the resistance processes associated to insecticides and Bt toxins are due to a large number of molecular modifications at specific sites associated with detoxification and regulation processes. The use of technologies that allow for a systematic and comprehensive analyses of these phenomena, such as new-generation sequencing, large-scale molecular marker search, and functional studies with several insecticide groups should be the new research base to advance the knowledge on adaptive processes driven by the evolution of insect resistance to insecticides and Bt proteins. / Técnicas de sequenciamento de DNA e RNA de próxima geração foram utilizadas para identificar marcadores moleculares associados à resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a inseticidas e proteínas de Bacillus thuringiensis Berliner (Bt). Para tanto, foram selecionadas linhagens de S. frugiperda resistentes a moléculas inseticidas (chlorpyrifos, lambda-cyhalothrin, lufenuron, teflubenzuron e spinosad) pertencentes a diferentes grupos químicos e ao milho YieldGard VT-PRO&reg; que expressa proteínas Cry1A.105 e Cry2Ab2. Os resultados de expressão gênica entre as linhagens resistentes e suscetíveis aos inseticidas neurotóxicos chlorpyrifos e lambda-cyhalothrin, indicaram 935 genes associados à resistência a chlorpyrifos e 241 genes a lambda-cyhalothrin que foram diferencialmente expressos. A maior parte desses genes está relacionada a elevados nível de expressão de enzimas de detoxificação, principalmente das famílias CYP3 e CPY6. Com relação ao inseticida teflubenzuron, o padrão de herança da resistência foi caracterizado como resistência autossômica, incompletamente recessiva e poligênica. Os resultados de expressão gênica entre as linhagens resistente e suscetível a teflubenzuron indicou 3.519 transcritos diferencialmente expressos, principalmente de enzimas de detoxificação dos grupos GSTs, UGTs, P450s, CEs, além de genes de transporte e regulação. Esse perfil de expressão gênica também foi identificando na linhagem resistente ao milho YieldGard VT-PRO&reg;, o qual também demonstrou modificações nos níveis de expressão de outros grupos gênicos como caderina, aminopeptidases e alcalino-fosfatase. Por último, com a finalidade de identificarmos marcadores tipo SNP associados à resistência de S. frugiperda a inseticidas e proteínas Bt, o protocolo de genotyping by sequencing (GBS) foi utilizado para todas as linhagens resistentes mencionadas e a linhagem suscetível de referência. Foram recuperados 4.276 SNPs após os processos de filtragem, sendo identificados 53 locos polimórficos sob seleção estatisticamente significantes (FDR<=0,047), sendo que nenhum deles associado a regiões codificantes. No entanto, vários desses SNPs foram associados a regiões reguladoras do genoma. As análises utilizando DAPC resultou na formação de sete grupos, com a separação da linhagem suscetível de todas as linhagens resistentes. A linhagem resistente a chlorpyrifos apresentou um grupo exclusivo separado das demais linhagens resistentes, as quais permaneceram agrupadas. As análises de associação entre as linhagens suscetível e resistentes indicaram 17 locos associados a todas as linhagens resistentes, 114 locos associados à linhagem resistente a chlorpyrifos, 105 a lambda-cyhalothrin, 84 a lufenuron, 87 a teflubenzuron, 108 a spinosad e 62 ao milho YieldGard VT-PRO&reg;. Dessa forma podemos concluir que os processos de resistência associados a inseticidas e toxinas Bt são decorrentes de um grande número de modificações moleculares em sítios específicos associados a detoxificação e processos de regulação. Portanto, a utilização de tecnologias que possibilitem a análise sistêmica e ampla desses fenômenos, como sequenciamento de nova geração, busca de marcadores moleculares em larga escala e estudos funcionais com diversos grupos de inseticidas devem ser a nova base de pesquisa para avançar o conhecimento dos processos adaptativos impulsionados pela evolução da resistência de insetos a inseticidas e proteínas Bt.

As bases genéticas e moleculares da resistência de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) a lufenuron foram exploradas no presente estudo. Inicialmente, uma linhagem de S. frugiperda resistente a lufenuron foi selecionada a partir de uma população coletada na cultura do milho na região de Montevidiu-GO com intenso uso desse inseticida. As curvas de concentração-resposta a lufenuron para as linhagens de S. frugiperda suscetível (SUS) e resistente (LUF-R) a lufenuron foram caracterizadas pelo método de bioensaio com tratamento superficial da dieta artificial. As CL50 (I.C. 95%) estimadas para as linhagens SUS e LUF-R foram de 0,23 (0,18 - 0,28) e 210,6 (175,90 - 258,10) ?g de lufenuron.mL-1 respectivamente, com razão de resistência de ? 915 vezes. A partir dos resultados de cruzamentos recíprocos entre as linhagens SUS e LUF-R, concluiu-se que a herança da resistência de S. frugiperda a lufenuron é autossômica e incompletamente recessiva. Os testes de retrocruzamentos da progênie F1 de cruzamentos recíprocos com o parental LUF-R demonstraram um efeito poligênico para a resistência, com a estimativa do número mínimo de segregações independentes entre 1,54 e 1,71, indicando que o número de loci associado à resistência é baixo. Para conhecer o perfil de transcritos de lagartas de S. frugiperda e avaliar o padrão de expressão gênica diferencial entre lagartas da linhagem LUF-R em comparação ao de lagartas da linhagem SUS, buscando identificar o(s) mecanismo(s) de resistência a lufenuron, foram utilizadas novas tecnologias de sequenciamento em larga escala. Para isso, foram utilizados sequenciamentos de quatro bibliotecas de cDNA (plataforma HiScan 1000, Illumina©) obtidas de lagartas de 4º ínstar de S. frugiperda das linhagens LUF-R e SUS, induzidas ou não com lufenuron. O transcritoma foi construído utilizando aproximadamente 19,6 milhões de leituras single-end, o que gerou 18.506 transcritos, com N50 de 996 pb. A pesquisa contra o banco de dados nr (NCBI) proporcionou anotação funcional de 51,1% (9.457) dos transcritos obtidos, grande parte dos alinhamentos apresentaram homologia a insetos, com o maior número deles (45%) se assemelhando aos de Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), enquanto 10% se assemelharam a sequências de diversas espécies do gênero Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), sendo 3% dos alinhamentos obtidos contra sequências de Spodoptera frugiperda. A análise comparativa da expressão gênica entre lagartas de S. frugiperda resistente e suscetível a lufenuron identificou 1.224 transcritos expressos diferencialmente (p <= 0,05, teste t; expressão relativa > 2). Sete destes transcritos foram associados ao metabolismo da cutícula, sendo cinco deles superexpressos na linhagem LUFR. O metabolismo de detoxificação apresentou 48 transcritos expressos diferencialmente, dos quais foram identificados 40 transcritos associados às monooxigenases P450, cinco a glutationa-S-transferase, dois às carboxilesterases e um a esterase. Foi observado que 39 dos 48 transcritos associados ao metabolismo de detoxificação foram superexpressos na linhagem resistente. Este padrão foi confirmado a partir da expressão relativa utilizando \"PCR quantitativa em Tempo Real - qPCR\". Estes resultados representam um importante passo para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência de S. frugiperda a lufenuron, proporcionando, ainda, uma visão mais ampla do perfil de expressão gênica de insetos a inseticidas. / The genetic and molecular basis of resistance to lufenuron in Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) were exploited in this study. The resistant population of S. frugiperda was selected from a population collected in Montevidiu, Goiás. Initially, a luferunon-resistant strain of S. frugiperda was selected from a population collected in cornfields located in Montevidiu, Goiás State, Brazil, with intense use of this insecticide. The diet surface treatment bioassay was used to characterize the concentration-response to lufenuron in the susceptible (SUS) and resistant (LUF-R) strains of S. frugiperda. The estimated LC50s (95% C.I.) for the SUS and LUF-R strains were 0.23 (0.18 - 0.28) and 210.6 (175.90 - 258.10) ?g of lufenuron.mL-1 respectively, with resistance ratio of ? 915-fold. Based on reciprocal crosses between SUS and LUF-R strains, the inheritance of S. frugiperda resistance to lufenuron was incomplete autosomal recessive. Backcrosses between F1 of the reciprocal crosses and the parental LUF-R revealed a polygenic resistance, with an estimation of the minimum number of resistance genes from 1.54 to 1.71, indicating that the number of loci associated to resistance is low. Then, a new high-throughput cDNA sequencing technologies was explored to characterize the transcriptional profile of larvae of Spodoptera frugiperda, and to compare the differential gene expression between resistant and susceptible strains of S. frugiperda to lufenuron in order to identify the resistance mechanism(s) involved. Four cDNA libraries obtained from fourth instars of the resistant (LUF-R) and the susceptible (SUS) S. frugiperda strains, exposed or not to lufenuron, were sequenced in a HiScan1000® platform (Illumina©). The transcriptome was de novo assembled using nearly 19.6 million single-end reads, leading to 18,506 transcripts with a N50 of 996 bp in length. A Blast search against the non-redundant database available in NCBI allowed the functional annotation of 51.1% (9,457) of the obtained transcripts. Most of these transcripts aligned with insect sequences, and a majority of them (45%) with Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Nearly 10% of the transcripts aligned with species belonging to Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae), with 3% of the alignments matching sequences from Spodoptera frugiperda. Differential gene expression analysis between the resistant and the susceptible strains identified 1,224 differentially expressed transcripts (p <= 0.05, t-test; fold change > 2). Seven of them were associated with the cuticle metabolism, and five out seven were up-regulated in the resistant strain (LUF-R). A large set of transcripts (48) associated with the detoxification metabolism was differentially expressed; 40 P450 monooxygenases, five glutathione-Stransferases, two carboxylesterase and one esterase were identified. Thirty-nine out of these 48 transcripts were up-regulated in the resistant strain. Gene expression data obtained by RNA-Seq analysis was validated by quantitative real time PCR (qPCR) of several selected target transcripts. These results represent an important step toward the understanding of the molecular mechanisms of resistance of S. frugiperda to lufenuron, and provide a broader view on the gene expression profile of insects to insecticides.

A Febre de Chikungunya é uma doença sistêmica causada por arbovírus e estima-se que afete cerca de 1 milhão de pessoas anualmente. Os principais sintomas associados com esta doença são febre e poliartralgia, podendo esta última assumir um caráter crônico em cerca de metade dos casos. Devido aos inúmeros surtos que ocorreram nos últimos 50 anos, diversos estudos tiveram como objetivo determinar os mecanismos de replicação do vírus e da resposta imune. Mesmo assim, pouco se sabe sobre quais moléculas possibilitam o processo de infecção. Já foi demonstrada a importância de interferons, principalmente de tipo I, citocinas e quimiocinas na diminuição da replicação viral. Além disso, há uma preferência do vírus por tipos celulares específicos como células endoteliais e epiteliais. Porém, estudos mostram informações contraditórias referentes ao papel de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), principalmente com relação a monócitos e células B e T. Diante deste contexto, o tratamento utilizado atualmente é direcionado apenas ao alívio de sintomas uma vez que não existem drogas ou vacinas licenciadas específicas para esta doença. Logo, o objetivo deste trabalho é estudar as modificações transcricionais que ocorrem em amostras humanas durante o processo de infecção pelo vírus de Chikungunya de modo a esclarecer os mecanismos utilizados pelo sistema imune em resposta a infecção. Além disso, este estudo tem como finalidade apontar possíveis diferenças transcricionais entre amostras crônicas e não-crônicas. / The Chikungunya Fever is a systemic disease transmitted by arboviruses and is estimated to affect 1 million people annually. The main symptoms associated with this disease are fever and polyarthralgia, which can develop to chronic features in about half of the cases. Due to outbreaks that occurred in the last 50 years, many studies had the goal of determining the mechanisms of virus replication and immune response. Nevertheless, it is still poorly understood which molecules enable the ocurrence of the infection process. It has already been shown the importance of interferons, mainly type I, cytokines and chemokines in restricting the viral replication. In addition, the Chikungunya virus shows a preference for specific cell types such as endothelial and epithelial cells. However, studies display contradictory information regarding the role of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), mainly in relation to monocytes and B and T cells. Given this context, the treatment currently used is directed only to alleviate the symptoms since there are no specific licensed drugs or vaccines for this disease. Therefore, the objective of this work was to study the transcriptional modifications that occur in humans during the process of Chikungunya virus infection in order to clarify the mechanisms used by the immune system. In addition, it aims to point out possible transcriptional differences between sample from the Chronic and Non-Chronic acute phase of the infection.