A utilização do vírus adeno-associado recombinante (AAVr) como vetor de transferência gênica em células tumorais está crescendo. Neste trabalho, o promotor gênico de E2F-1, um promotor ativo durante a divisão celular, foi inserido no AAVr e utilizado para dirigir a expressão do HSV-tk ou luciferase e, simultaneamente, eGFP afim de direcionar a expressão viral para células em proliferação. Em paralelo, foram construídos vetores portadores do promotor constitutivo CMV para servir como controles. O promotor gênico de E2F-1 não foi eficiente em dirigir a expressão dos transgenes na linhagem celular HT1080, enquanto o promotor CMV apresentou uma alta expressão dos repórteres e do gene terapêutico. A baixa eficiência do promotor E2F-1 ainda não foi explorada, mas poderia ser relacionada com o desempenho intrínseco deste promotor, a biologia do vetor AAVr e especificidade celular. Contudo, o bom desempenho do vetor AAVr contendo o promotor CMV abre a possibilidade de realizar novos ensaios de transferência gênica para tratamento e visualização de células tumorais / The utilization of recombinant adeno-associated virus (AAVr) as a gene transfer vector in tumor cells is increasing. In this work, the promoter of the E2F-1 gene, active during cell division, was inserted in an AAVr vector and used to drive the expression of HSV-tk or luciferase and, simultaneously, eGFP with the intent of limiting viral expression to proliferating cells. Also, vectors with the constitutive CMV promoter were constructed to be used as controls. The E2F-1 promoter was not efficient in driving the expression of the transgenes in the HT1080 cell line, while the CMV promoter shows high level expression of the reporter and the therapeutic genes. The low efficiency of E2F promoter has not yet been explored, though this problem could be related to the intrinsic performance of this promoter, the biology of the vector AAV and cell-specific factors. However, the performance of the AAVr containing the CMV promoter creates the possibility of performing new gene transfer protocols for the treatment and visualization of tumor cells.

A obtenção de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica de grande valor, contribuindo nos programas de melhoramento. Plantas transgênicas contendo genes de peptídeos antibacterianos são uma boa alternativa nos programas visando resistência às bactérias. A cecropina é um peptídeo isolado de inseto que apresenta ação antibacteriana contra diversas bactérias, entre elas, a Xylella fastidiosa causadora da clorose variegada dos citros (CVC). Com isso, este trabalho teve dois objetivos: 1) obter plantas transgênicas dos cultivares copa de laranja 'Hamlin' e laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 dirigido pelos promotores do gene da fenilalanina amônia-liase (PAL) clonado de citros (CsPP) e de Arabidopsis thaliana (AtPP), que conferem expressão gênica nos vasos do xilema. Obter plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' com o gene GUS dirigido pelo promotor AtPP. 2) avaliar plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39 inoculadas com Xylella fastidiosa. As transformações genéticas foram realizadas através do co-cultivo de explantes, coletados de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais), com Agrobacterium tumefaciens. Para isso, utilizou-se a estirpe EHA-105 de A. tumefaciens contendo os vetores binários CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 ou AtPP-GUS/2201. A seleção das gemas transformadas foi feita em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina, e para confirmação da transformação foram realizados teste histoquímico GUS e análises moleculares de PCR e 'Southern blot'. As gemas regeneradas foram microenxertadas em citrange 'Carrizo' ou laranja 'Hamlin' não transgênicos. Foi possível a obtenção de gemas transformadas para todos os cultivares, porém a regeneração de plantas ocorreu para laranja 'Hamlin' transformada com os vetores CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 e AtPP-GUS/2201. Para a avaliação da resistência de plantas transgênicas a Xylella fastidiosa foram selecionadas nove plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39, sendo que em quatros plantas o gene está sendo dirigido pelo promotor CsPP e nas outras cinco plantas pelo promotor CaMV 35S. Essas plantas foram multiplicadas por borbulhia e inoculadas mecanicamente com Xylella fastidiosa. Foram realizados isolamentos primários e quantificações bacterianas aos quatro e dez meses após a inoculação da bactéria para verificar a eficiência da inoculação e movimentação sistêmica da bactéria. Avaliações sintomáticas foliares também foram feitas aos oito meses após a inoculação. Os resultados dos isolamentos aos quatro meses mostraram que a inoculação da bactéria foi eficiente, já que houve crescimento bacteriano na maioria das placas com meio de cultura. A movimentação sistêmica da bactéria pôde ser detectada no isolamento aos dez meses. Das nove plantas avaliadas, uma planta transgênica apresentou crescimento populacional menor do que a da planta controle, indicando uma resistência ao patógeno. Nas avaliações sintomáticas foliares, as plantas transgênicas não diferiram do controle. / The production of genetically modified plants has become an important biotechnological tool, contributing with breeding programs. Transgenic plants expressing antibacterial peptides genes are a good alternative for breeding programs aiming to obtain bacterial resistance. Cecropin is a peptide isolated from an insect, which presents antibacterial effect against several bacteria including the citrus variegated chlorosis in which the causal agent is Xylella fastidiosa. This work had two objectives: 1) genetically transform 'Hamlin' and 'Pêra' sweet oranges scions with the cecropin MB39 gene under the control of the phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, cloned from citrus (CsPP) and from Arabidopsis thaliana (AtPP). This promoter confers gene expression within the xylem vessels. Obtain transgenic plants of 'Hamlin' and 'Valência' sweet oranges with the GUS gene under the control of the AtPP promoter. 2) Evaluate the resistance to Xylella fastidiosa of 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene. Co-culture of explants with Agrobacterium tumefaciens was used to genetically transform in vitro plants (epicotyl segments) and greenhouse plants (internodal segments). A. tumefaciens strain EHA-105 containing the CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 or AtPP-GUS/2201 binary vectors were used for transformation. Culture medium containing the antibiotic kanamycin was used for selection of transformed buds. Confirmation of transgenesis was carried out by GUS assays, PCR and Southern blot analysis. Regenerated buds were in vitro grafted on non-transgenic 'Carrizo' citrange or 'Hamlin' sweet orange rootstocks. Transformed buds were obtained for all cultivars, however plant regeneration was only obtained for 'Hamlin' sweet orange transformed with vectors CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 and AtPP-GUS/2201. Nine 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene were selected for the Xylella fastidiosa resistance experiment. Four transgenic lines were controlled by the CsPP promoter and the other five lines were controlled by the CaMV 35S promoter. These transgenic lines were graft propagated and mechanically inoculated with Xylella fastidiosa. Primary isolations and bacterial quantifications were conducted on the fourth and tenth month after inoculation in order to detect inoculation efficiency and bacterial systemic movement. Leaf symptom evaluations were executed eight months after inoculations. The bacterial isolation results from the fourth month indicated that inoculations were successful, since bacterial growth could be detected in the majority of culture mediums. Systemic movement of bacteria within the plants was detected after ten months. From the nine transgenic lines tested, one presented reduced pathogen growth when compared to controls indicating resistance. Transgenic lines did not differ from controls regarding leaf symptoms.

A transformação genética está se tornando uma importante ferramenta, dentro dos programas de melhoramento genético de citros, e uma alternativa para contornar barreiras naturais da espécie, que dificultam o desenvolvimento de novas variedades pelo melhoramento convencional. Entretanto, os protocolos utilizados para transformação genética de citros têm resultado num baixo número de plantas transgênicas. Com o objetivo de estudar fatores que possam influenciar o processo de transformação genética de citros via Agrobacterium tumefaciens analisou-se o efeito do uso de acetoseringona em diferentes etapas do processo, as condições de incubação dos explantes durante e após o período de co-cultivo e o tipo de corte do explante. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro da variedade de laranja doce ‘Hamlin’ (Citrus sinensis L. Osbeck.) e da variedade citrange ‘Carrizo’ (C. sinensis x Poncirus trifoliata Raf.), inoculados com a estirpe EHA 105 de A. tumefaciens, contendo o plasmídeo p35SGUSINT, com o gene de seleção que codifica a enzima neomicina fosfotransferase II (nptII) e o gene repórter uidA que codifica a enzima b-glucuronidase (gus). O protocolo básico para transformação genética foi com a inoculação dos explantes por 20 minutos, com o período de co-cultivo de 3 dias em me io de cultura suplementado com acetoseringona (100 mM) e transferidos para meio de cultura de seleção, constituído de meio de cultura EME, suplementado com BAP (1mg L -1 ), canamicina (100 mg L -1 ) e cefotaxime (500 mg L -1 ). As avaliações foram realizadas após 5-6 semanas de incubação, determinando-se o número de explantes com gemas adventícias, o número de gemas adventícias gus + e calculando-se a eficiência de transformação genética, definida pela relação entre o número de gemas gus + regeneradas e o número de explantes inoculados. Pelos resultados obtidos pôde-se observar uma maior eficiência de transformação genética para a variedade citrange ‘Carrizo’; e que a eficiência da transformação genética aumentou, principalmente para a variedade de laranja doce 'Hamlin', quando a incubação do material durante o período de co-cultivo foi feita sob temperaturas inferiores a 27 °C. A suplementação do meio de cultura de co-cultivo com acetoseringona depende do pH deste meio de cultura. A utilização de explantes seccionados longitudinalmente não se mostrou favorável devido ao crescimento excessivo da bactéria na superfície do explante. / Genetic transformation is an important biotechnological tool in citrus genetic breeding programs, and an alternative to overcome natural barriers to the development of new varieties, by conventional breeding. However, the protocols used for citrus genetic transformation have resulted in a low number of transgenic plants. Therefore, this research evaluated some factors that might influence citrus genetic transformation process via Agrobacterium tumefaciens, such as: the addition of acetosyringone in different steps of the process, the explant incubation conditions during and after the period of co-cultivation, and the explant type cut. Epicotyl segments from seedlings of 'Hamlin' sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and ‘Carrizo’ citrange (C. sinensis L. Osbeck x Poncirus trifoliata Raf.) were inoculated with EHA 105 strain of A. tumefaciens harboring the binary plasmid p35SGUSINT containing the selection gene for neomicyn phosphotransferase II (nptII) and the reporter gene uidA for b-glucuronidase (GUS). The basic protocol for genetic transformation included the explant inoculation for 20 minutes, and 3 days of co-cultivation in the culture medium supplemented with acetosyringone (100 mM). The epicotyl segments were transferred to selection culture medium, EME culture medium supplemented with BAP (1 mg L -1 ), kanamycin (100 mg L -1 ) and cefotaxime (500 mg L -1 ). The evaluations were done after 5-6 weeks of incubation, determining the number of explants with shoots, the number of gus + shoots, and calculating the genetic transformation efficiency, defined by the relation between the number of gus + shoots and the number of inoculated explants. The highest genetic transformation efficiency was observed in 'Carrizo' citrange. An increase of genetic transformation efficiency, mainly for the 'Hamlin' sweet orange occurred when the segments were incubated under temperatures below 27 o C. The supplementation of the co-cultivation culture medium with acetosyringone depends on pH value of itself. The use of explant sectioned did not favor transformation, probably due to the excessive bacterial growth on explant surface.

Em sua maioria, estratégias de transferência gênica utilizam arranjos com promotores e transgenes funcionando de maneira independente entre si, como é o caso do amplamente utilizado promotor CMV. Nosso grupo foge dessa linha de promotores/transgenes independentes. Desenvolvemos uma nova estratégia de transferência gênica que combina estrategicamente a atividade do transgene e o do promotor de expressão gênica, onde o promotor foi modificado com a inserção do elemento PG, responsívo a p53. Neste trabalho construímos um novo vetor adenoviral (AdPGp53) contendo o gene da proteína supressora de tumor p53 cuja expressão é controlada por ela própria através do elemento PG. Em comparação com um vetor adenoviral que possui o gene da p53 sob ação do promotor tradicional CMV (AdCMVp53), o vetor AdPGp53 apresentou expressão superior de p53 em células humanas de carcinoma de próstata PC3, maior morte celular in vitro e parece ter diminuído o ritmo de crescimento tumoral in vivo em um modelo xenográfico de células PC3 em camundongos atímicos. / The majority of gene therapy strategies in use today are based on promoters and transgenes that work independently, and an example of this is the widely used CMV promoter. Our group breaks way from the use of independent promoter/transgene activity. We developed a new gene transfer strategy which combines the transgene activity and the promoter of gene expression. This was achieved by the insertion of the PG element, which is a p53-responsive enhancer, in the promoter. In the present work we built a new adenoviral vector (AdPGp53) containing the p53 tumor suppressor gene, whose expression is controlled by the p53 protein itself through the PG element. In comparative experiments, in which we used our AdPGp53 vector and another adenoviral vector, with a p53 gene and a traditional CMV promoter (AdCMVp53), our vector showed superior p53 expression in PC3 human prostate cancer cells, superior cell death in vitro and a tendency in diminishing tumor growth in an in vivo xenograft model in nude mice injected with PC3 cells.

Modelos humanizados de porco são muito importantes para pesquisa biomédica e desenvolvimento de novas drogas e tratamentos. Além de ser um melhor modelo para doenças humanas do que animais de menor porte devido sua maior semelhança fisiológica, anatômica, de metabolismo e tempo de vida, o modelo suíno ainda permite suprimento ilimitado de órgãos para transplante. Apesar dessas vantagens, a expressão gênica inconsistente de animais transgênicos tornam a criação e avaliação desses animais muito dispendiosas, imprevisível e não permite a comparação de resultados de animais diferentes de maneira apropriada. Nesse estudo descrevemos uma nova técnica utilizando o promoter endógeno para a geração de um protocolo de substituição de genes com padrão clonal (transplante clonal de genes) sem clonagem de células, preservando a expressão genética e sua regulação intactas. Esse protocolo é reprodutível e pode ser aplicado para mais de um alvo genético, permitindo geração rápida de linhas transgênicas de animais (14-20 dias) com potencial de se tornar o novo padrão para geração de animais transgênicos de grande porte Suínos / Humanized pig models are very important for biomedical research, and drugs and treatment development. Not only it is a better model for diseases than smaller animals because of its closer physiology, anatomy, metabolism and life span, it also may provide unlimited organs for transplantation. In spite of all this advantages, inconsistent gene expression in transgenic animals make its generation and evaluation expensive, unpredictable and do not allow proper outcome comparison between different animals. In this report we describe a reproducible technique utilizing the endogenous promoter for generation of a clonal pattern gene replacement protocol (clonal gene transplant) without cell cloning, maintaining the normal gene expression and its regulation. This protocol is reproducible and applicable to more than one gene target, allowing fast generation of transgenic animals cell lines (as low as 14-20 days) and could become the new standard for transgenic large animal generation

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças mais ameaçadoras para citricultura mundial e, até o momento, não foi encontrada resistência na base genética do gênero Citrus. A doença é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp., endêmica de floema. Portanto, na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB é desejável avaliar construções gênicas em que o gene de interesse se expresse preferencialmente na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no floema. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens, de citrange Carrizo [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cultivares Hamlin, Valência e Pêra, contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), para verificar se esses promotores regulam a expressão do gene repórter na região do floema. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro e como agente de seleção de regeneração de plantas transgênicas foi utilizado o gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina. Dos brotos regenerados foi coletada uma amostra de material para a realização do ensaio histoquímico com X-GLUC. Os brotos que formaram coloração azulada confirmaram a integração do transgene, sendo esses enxertados em porta enxertos previamente germinados e estiolados in vitro. A partir do número de explantes introduzidos, número explantes responsivos, número de brotos regenerados e número de brotos regenerados GUS positivos calculou-se a eficiência de transformação genética dos experimentos. Para a confirmação da transformação genética de laranja Hamlin foram realizadas análises de PCR e Southern blot de três plantas GUS positivas aclimatizadas. Também foram feitos cortes histológicos manuais para melhor visualização da reação histoquímica de GUS das plantas de laranja Hamlin Southern blot positivas. Todos os experimentos de transformação regeneraram pelo menos um broto GUS positivo. As plantas de laranja Hamlin analisadas por PCR e Southern blot analisadas foram confirmadas como transformadas com uma inserção do transgene. Plantas nas quais foram realizados cortes histológicos indicaram expressão diferencial das construções gênicas no floema. / Huanglongbing (HLB) is one of the most threatening diseases to worldwide citriculture and till the present moment, no resistance has been found in citrus genetic basis. This disease has Candidatus Liberibacter spp. as the pathogenic agent, an endemic phloem bacterium. Therefore, in the search for a transgenic plant resistant to HLB, it is desirable to evaluate constructions in which the gene of interest is expressed, preferentially, in tissues where the bacteria grow, i.e., in the phloem. Therefore, this work aimed to obtain transgenic plants of Carrizo citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck], and of Hamlin, Valencia, and Pera sweet oranges [Citrus sinensis (L.) Osbeck], via Agrobacterium tumefaciens, containing uidA (GUS) gene, controlled by the promoters Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), in order to check if these promoters drive the reporter gene expression in the phloem. For the transformation, in vitro germinated seedlings epicotil segments were used. The gene nptII, which confers resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selective system. From the regenerated shoots, a tissue sample was collected to perform the X-GLUC histochemical analysis. The regenerated shoots colored in blue were considered transgenic, and these were grafted on in vitro grown rootstocks. The transformation efficiency of each experiment was calculated based on the number of introduced explants, responsive explants, number of regenerated shoots, and number of GUS positive regenerated shoots. In order to confirm the genetic transformation of Hamlin sweet orange, PCR and Southern blot analyses of three positive GUS acclimatized plants were performed. Anatomic slices for better visualization of blue color formed by GUS reaction were also made. All transformation experiments regenerated at least one GUS positive shoot. Plants of Hamlin sweet orange analyzed by PCR and Southern blot are transformed and have one transgene insertion. Anatomical analyses indicated preferential expression of the transgenes in the phloem.

Atualmente a cultura da cana de açúcar tem ganhado destaque no cenário mundial devido a seu potencial uso na produção de bioenergia o qual poderia ser beneficiado desenvolvendo-se cultivares com aumento da produtividade de biomassa por unidade de área, o que é por sua vez, determinada pela arquitetura da planta. A brotação lateral é um dos principais fatores que regulam a arquitetura dos vegetais. Recentemente, esta fase do desenvolvimento tem sido estudada intensivamente em plantas consideradas modelo, elucidando em parte as vias genéticas, ambientais e hormonais que regulam este processo. Dentro desta vias, microRNAs, uma classe de pequenos RNAs não codantes que modula pós-transcricionalmente a expressão de genes endógenos, parecem ser importantes reguladores. Em cana de açúcar, a brotação lateral é importante para a arquitetura dos ramos laterais, germinação de gemas e perfilhamento. Entretanto, devido a sua complexidade genética e ausência de mutantes defectivos na brotação lateral, estudos nesta área ao nível molecular são limitados. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos estudar em cana de açúcar a via microRNA156/fatores de transcrição do tipo SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPL), a qual é associada à regulação do perfilhamento, bem como caracterizar molecularmente o processo de emergência de gemas axilares. Ferramentas computacionais usando o banco publico de ESTs TIGR gene índex permitiram identificar e classificar no genoma de cana de açúcar, diferentes genes associados ao processo de brotação lateral e resposta hormonal. Entres estes, seis genes SPL regulados pelo miR156 foram identificados, sendo um deles (SsSPL1) homólogo a SPLs envolvidas diretamente na regulação do perfilhamento. A expressão da SsSPL1 foi monitorada em diferentes tecidos e órgãos, juntamente com o miR156. Os dados sugerem que a SsPL1, é regulada negativamente pelo miR156, sendo esta via também conservada em cana de açúcar. Foram geradas plantas transgênicas da cultivar RB85486 com o gene endógeno SsmiR156a/b o qual codifica um precursor conservado do miR156 e parece estar associado com a evolução da arquitetura em monocotiledôneas. O acúmulo do miR156 foi avaliado em plantas transformadas via RT-qPCR encontrando variabilidade na sua expressão. Bibliotecas de pequenos RNAs foram geradas em gemas dormentes e em desenvolvimento, permitindo identificar membros de 26 famílias de miRNAs. A expressão de quatro deles, de seus genes-alvo e de outros genes selecionados foi monitorada em gemas dormentes e com 2 e 5 dias após o plantio. Interessantemente, o miR159 foi o mais expresso em gemas axilares de cana e parece ser um fator chave na emergência da gema, já que, segundo os resultados obtidos, esse miRNA parece modular a expressão do seu gene alvo SsGAMyB, o qual é um fator de transcrição implicado na ativação de genes de resposta a giberelina. Durante esta fase inicial do desenvolvimento também foi observado alterações na expressão de genes associados com processos de transdução de sinal associados aos fitohormônios auxina e etileno. Os resultados obtidos indicam que a emergência de gemas laterais é um processo dinâmico em que fitohormônios, fatores de transcrição e microRNAs participam conjuntamente para promover o crescimento e 12 desenvolvimento da nova plântula de cana de açúcar. / Sugarcane is an economically important biofuel crop that recently has become a target for improvement of sustainable biomaterial production due to its high biomass productivity and built-in containment features. Therefore, studies aiming to improve the production of biomass per area are among the most important issues in sugarcane production. Plant biomass is defined, at least in part, by its shoot architecture. Although shoot architecture (branching/tillering) is to some extend influenced by environmental factors, it is determined mainly by the plants genetic program. This includes developmental programs that are regulated by a complex network of genetic pathways that integrate endogenous and environmental cues. Several transcription factors as well as microRNAs are likely part of this network. In this study, we started to investigate the roles of the genetic pathway regulated by the microRNA156 and its targets, the transcription factors SQUAMOSA promoter-binding-protein (SPLs) in sugarcane branching/tillering. We identified six members of the SPL family that were further classified into four subfamilies. In both dicots and monocots, these SPLs are key regulators of the plant shoot architecture. We monitored the expression patterns of SsmiR156 e SsSPL1 in distinct sugarcane tissues/organs. Our observations suggest that miR156 regulates posttranscriptionally SsSPL1 mainly in leaf tissues. We generated transgenic sugarcane plants overexpressing the monocot-specific sugarcane miR156 precursor SsMIR156b/c via biolistic method. This precursor is thought to be important for the evolution of grass shoot architecture. Although we observed higher accumulation of mature SsmiR156b/c in leaf tissues of some transgenic plants as compared with tissues from non-transgenic plants, we could not detect any significant changes in their vegetative architecture. Using deep sequencing approaches, we have generated two small RNA libraries from dormant and outgrown sugarcane lateral buds. Preliminary analyses indicate that a select group of small RNAs are expressed in lateral buds, including over 200 repeat-associated small interfering RNAs (rasiRNAs) and 25 conserved microRNAs (miRNAs). Amongst the miRNAs, miR159 was the most sequenced in the two libraries. We evaluated miR159 accumulation pattern in addition to other selected miRNAs via qRT-PCR in dormant and developing buds. The majority of the evaluated miRNAs accumulate differentially during bud development, though with distinct expression patterns. Interestingly, miR159 accumulates at high levels in dormant buds, but scarcely in developing buds. Conversely, the experimentally confirmed miR159 target, a sugarcane GAMyB-like gene (SsGAMyB), is lowly expressed in dormant buds while its transcripts accumulate at higher levels in developing buds. GAMyB-like genes encode R2R3 MYB domain transcription factors that have been implicated in gibberellin (GA) and abscisic acid (ABA) signaling in germinating seeds. Our data suggest miR159 regulates GAMyB-like genes during sugarcane bud outgrowth. Similarly, SsSPL1 is regulated posttranscriptionally by the miR529, though this gene has sites for both miR529 and miR156. Auxin and ethylene-associated regulatory pathways are affected during sugarcane bud development. Taken together,our data indicate that sugarcane bud outgrowth from rhizomes is a complex developmental process involving hormones, transcription factors as well as microRNAs and other regulatory RNAs.

O Huanglongbing (HLB) é uma das doenças mais ameaçadoras para citricultura mundial e, até o momento, não foi encontrada resistência na base genética do gênero Citrus. A doença é causada pela bactéria Candidatus Liberibacter spp., endêmica de floema. Portanto, na busca por uma planta transgênica resistente ao HLB é desejável avaliar construções gênicas em que o gene de interesse se expresse preferencialmente na região em que a bactéria coloniza a planta, ou seja, no floema. Assim, o objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens, de citrange Carrizo [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] e de laranja doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck] cultivares Hamlin, Valência e Pêra, contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), para verificar se esses promotores regulam a expressão do gene repórter na região do floema. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro e como agente de seleção de regeneração de plantas transgênicas foi utilizado o gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina. Dos brotos regenerados foi coletada uma amostra de material para a realização do ensaio histoquímico com X-GLUC. Os brotos que formaram coloração azulada confirmaram a integração do transgene, sendo esses enxertados em porta enxertos previamente germinados e estiolados in vitro. A partir do número de explantes introduzidos, número explantes responsivos, número de brotos regenerados e número de brotos regenerados GUS positivos calculou-se a eficiência de transformação genética dos experimentos. Para a confirmação da transformação genética de laranja Hamlin foram realizadas análises de PCR e Southern blot de três plantas GUS positivas aclimatizadas. Também foram feitos cortes histológicos manuais para melhor visualização da reação histoquímica de GUS das plantas de laranja Hamlin Southern blot positivas. Todos os experimentos de transformação regeneraram pelo menos um broto GUS positivo. As plantas de laranja Hamlin analisadas por PCR e Southern blot analisadas foram confirmadas como transformadas com uma inserção do transgene. Plantas nas quais foram realizados cortes histológicos indicaram expressão diferencial das construções gênicas no floema. / Huanglongbing (HLB) is one of the most threatening diseases to worldwide citriculture and till the present moment, no resistance has been found in citrus genetic basis. This disease has Candidatus Liberibacter spp. as the pathogenic agent, an endemic phloem bacterium. Therefore, in the search for a transgenic plant resistant to HLB, it is desirable to evaluate constructions in which the gene of interest is expressed, preferentially, in tissues where the bacteria grow, i.e., in the phloem. Therefore, this work aimed to obtain transgenic plants of Carrizo citrange [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck], and of Hamlin, Valencia, and Pera sweet oranges [Citrus sinensis (L.) Osbeck], via Agrobacterium tumefaciens, containing uidA (GUS) gene, controlled by the promoters Citrus pholem protein 2 (CsPhP2), Arabidopsis thaliana pholem protein 2 (AtPhP2) and Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2), in order to check if these promoters drive the reporter gene expression in the phloem. For the transformation, in vitro germinated seedlings epicotil segments were used. The gene nptII, which confers resistance to the antibiotic kanamycin, was used as the selective system. From the regenerated shoots, a tissue sample was collected to perform the X-GLUC histochemical analysis. The regenerated shoots colored in blue were considered transgenic, and these were grafted on in vitro grown rootstocks. The transformation efficiency of each experiment was calculated based on the number of introduced explants, responsive explants, number of regenerated shoots, and number of GUS positive regenerated shoots. In order to confirm the genetic transformation of Hamlin sweet orange, PCR and Southern blot analyses of three positive GUS acclimatized plants were performed. Anatomic slices for better visualization of blue color formed by GUS reaction were also made. All transformation experiments regenerated at least one GUS positive shoot. Plants of Hamlin sweet orange analyzed by PCR and Southern blot are transformed and have one transgene insertion. Anatomical analyses indicated preferential expression of the transgenes in the phloem.

Muitas plantas apresentam crescimento indeterminado e são capazes de produzir novos órgãos e tecidos ao longo de todo seu ciclo de vida. Essa capacidade é devida parcialmente à expressão altamente regulada de genes específicos, tais como os genes SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPLs). SPLs codificam fatores de transcrição específicos de plantas que desempenham papéis importantes em diferentes aspectos do desenvolvimento, tais como mudança de fase juvenil-adulto, definição da arquitetura da planta e amadurecimento do fruto. A maioria dos genes SPLs são pós-transcricionalmente regulados pelo microRNA (miRNA) miR156. Apesar de alguns aspectos regulados pelas SPLs serem bem estudados, suas funções moleculares durante o desenvolvimento do fruto são pouco compreendidas. Neste trabalho, nós geramos 22 eventos transgênicos de Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) superexpressando o precursor AtMIR156b. Plantas transgênicas exibiram morfologia foliar e floral anormal além de alteração na arquitetura vegetal. Interessantemente, a maioria dos eventos apresentou frutos de crescimento indeterminado, os quais não apresentam sementes sendo caracterizados pelo crescimento de frutos secundários além da presença de estruturas vegetativas e meristemas florais ectópicos. Fazendo uso da técnica de RT-qPCR, nós encontramos uma robusta correlação entre expressão do miR156 e o fenótipo dos frutos, sugerindo que esta rota regula o desenvolvimento e determinação do fruto de tomateiro. O mutante de tomateiro Mouse ears (Me) apresenta um fraco nível de indeterminação no fruto, sendo que os níveis do transcrito miR156 maduro são maiores no fruto mutante quando comparado aos controles MT, mas significativamente menores que nos frutos transgênicos. Oito SPLs de tomateiro foram silenciadas em diferentes níveis em frutos de diferentes eventos transgênicos e no mutante Me. O fator de transcrição do tipo MADS-box MACROCALYX (MC), o qual é ortólogo ao gene APETALA1 (AP1) de arabidopsis (alvo direto in vivo da proteína SPL3), afeta a determinação da inflorescência e o desenvolvimento das sépalas. A expressão de MC foi severamente reduzida nos frutos dos eventos transgênicos, mas não no mutante Me. Este dado sugere que a desregulação da expressão de MC deve ser responsável pelo forte fenótipo de indeterminação do fruto observados nos eventos transgênicos. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem uma nova função para a via genética mir156/SPL na regulação do desenvolvimento e determinação de frutos carnosos, provavelmente através da regulação da expressão de MC. / Many plants have indeterminate growth and are capable of producing new organs and tissues throughout their life. This capability is partially due to the highly regulated expression of specific genes such as SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like (SPL) genes. SPLs encode plant-specific transcription factors that play important roles in development, such as phase transition, plant architecture, and fruit ripening. Most SPL genes are post-transcriptionally regulated by the microRNA (miRNA) miR156. Although some developmental aspects regulated by SPLs have been well studied, their molecular roles during fruit development are poorly understood. In this work, we generated 22 transgenic events of Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom (MT) overexpressing AtMIR156b precursor. Transgenic plants exhibit abnormal leaf and flower morphology and altered vegetative architecture. Interestingly, most events display navel-like fruits that are seedless and characterized by the growth of secondary fruits and present leaf-like structures as well as ectopic flowering meristems. By using RT-qPCR, we found a robust correlation between miR156/SPL expression and the fruit phenotype, suggesting that this pathway regulates tomato fruit development and determinacy. The tomato mutant Mouse ears (Me) displays a weak level of fruit indeterminacy. Levels of mature miR156 transcripts are higher in fruits from the mutant as comparing to MT fruits, but significantly lower than in transgenic fruits. Eight tomato SPLs were downregulated at variable levels in fruits from distinct transgenic events and Me plants. The MADS-type of transcription factor Macrocalyx (MC) gene is an orthologue of Arabidopsis AP1 (a direct in vivo target of SPL3) and affects tomato inflorescence determinacy and sepal development. MC was severely downregulated in fruits from transgenics but not in fruits from Me mutant. This data suggests that the MC misregulation may lead to the strong fruit indeterminacy phenotype observed in the transgenic events. Taken together, our data suggest a new function for miR156/SPL pathway in regulating fruit development and determinacy likely through the regulation of MC expression.

A obtenção de plantas geneticamente modificadas tornou-se uma ferramenta biotecnológica de grande valor, contribuindo nos programas de melhoramento. Plantas transgênicas contendo genes de peptídeos antibacterianos são uma boa alternativa nos programas visando resistência às bactérias. A cecropina é um peptídeo isolado de inseto que apresenta ação antibacteriana contra diversas bactérias, entre elas, a Xylella fastidiosa causadora da clorose variegada dos citros (CVC). Com isso, este trabalho teve dois objetivos: 1) obter plantas transgênicas dos cultivares copa de laranja 'Hamlin' e laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 dirigido pelos promotores do gene da fenilalanina amônia-liase (PAL) clonado de citros (CsPP) e de Arabidopsis thaliana (AtPP), que conferem expressão gênica nos vasos do xilema. Obter plantas transgênicas de laranja 'Hamlin' e laranja 'Valência' com o gene GUS dirigido pelo promotor AtPP. 2) avaliar plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39 inoculadas com Xylella fastidiosa. As transformações genéticas foram realizadas através do co-cultivo de explantes, coletados de plantas cultivadas in vitro (segmentos de epicótilo) ou em casa de vegetação (segmentos internodais), com Agrobacterium tumefaciens. Para isso, utilizou-se a estirpe EHA-105 de A. tumefaciens contendo os vetores binários CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 ou AtPP-GUS/2201. A seleção das gemas transformadas foi feita em meio de cultura contendo o antibiótico canamicina, e para confirmação da transformação foram realizados teste histoquímico GUS e análises moleculares de PCR e 'Southern blot'. As gemas regeneradas foram microenxertadas em citrange 'Carrizo' ou laranja 'Hamlin' não transgênicos. Foi possível a obtenção de gemas transformadas para todos os cultivares, porém a regeneração de plantas ocorreu para laranja 'Hamlin' transformada com os vetores CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 e AtPP-GUS/2201. Para a avaliação da resistência de plantas transgênicas a Xylella fastidiosa foram selecionadas nove plantas de laranja 'Valência' transformadas com o gene cecropin MB39, sendo que em quatros plantas o gene está sendo dirigido pelo promotor CsPP e nas outras cinco plantas pelo promotor CaMV 35S. Essas plantas foram multiplicadas por borbulhia e inoculadas mecanicamente com Xylella fastidiosa. Foram realizados isolamentos primários e quantificações bacterianas aos quatro e dez meses após a inoculação da bactéria para verificar a eficiência da inoculação e movimentação sistêmica da bactéria. Avaliações sintomáticas foliares também foram feitas aos oito meses após a inoculação. Os resultados dos isolamentos aos quatro meses mostraram que a inoculação da bactéria foi eficiente, já que houve crescimento bacteriano na maioria das placas com meio de cultura. A movimentação sistêmica da bactéria pôde ser detectada no isolamento aos dez meses. Das nove plantas avaliadas, uma planta transgênica apresentou crescimento populacional menor do que a da planta controle, indicando uma resistência ao patógeno. Nas avaliações sintomáticas foliares, as plantas transgênicas não diferiram do controle. / The production of genetically modified plants has become an important biotechnological tool, contributing with breeding programs. Transgenic plants expressing antibacterial peptides genes are a good alternative for breeding programs aiming to obtain bacterial resistance. Cecropin is a peptide isolated from an insect, which presents antibacterial effect against several bacteria including the citrus variegated chlorosis in which the causal agent is Xylella fastidiosa. This work had two objectives: 1) genetically transform 'Hamlin' and 'Pêra' sweet oranges scions with the cecropin MB39 gene under the control of the phenylalanine ammonia-lyase (PAL) gene promoter, cloned from citrus (CsPP) and from Arabidopsis thaliana (AtPP). This promoter confers gene expression within the xylem vessels. Obtain transgenic plants of 'Hamlin' and 'Valência' sweet oranges with the GUS gene under the control of the AtPP promoter. 2) Evaluate the resistance to Xylella fastidiosa of 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene. Co-culture of explants with Agrobacterium tumefaciens was used to genetically transform in vitro plants (epicotyl segments) and greenhouse plants (internodal segments). A. tumefaciens strain EHA-105 containing the CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 or AtPP-GUS/2201 binary vectors were used for transformation. Culture medium containing the antibiotic kanamycin was used for selection of transformed buds. Confirmation of transgenesis was carried out by GUS assays, PCR and Southern blot analysis. Regenerated buds were in vitro grafted on non-transgenic 'Carrizo' citrange or 'Hamlin' sweet orange rootstocks. Transformed buds were obtained for all cultivars, however plant regeneration was only obtained for 'Hamlin' sweet orange transformed with vectors CsPPCEC/2201, AtPPCEC/2201 and AtPP-GUS/2201. Nine 'Valência' sweet orange plants transformed with the cecropin MB39 gene were selected for the Xylella fastidiosa resistance experiment. Four transgenic lines were controlled by the CsPP promoter and the other five lines were controlled by the CaMV 35S promoter. These transgenic lines were graft propagated and mechanically inoculated with Xylella fastidiosa. Primary isolations and bacterial quantifications were conducted on the fourth and tenth month after inoculation in order to detect inoculation efficiency and bacterial systemic movement. Leaf symptom evaluations were executed eight months after inoculations. The bacterial isolation results from the fourth month indicated that inoculations were successful, since bacterial growth could be detected in the majority of culture mediums. Systemic movement of bacteria within the plants was detected after ten months. From the nine transgenic lines tested, one presented reduced pathogen growth when compared to controls indicating resistance. Transgenic lines did not differ from controls regarding leaf symptoms.