Les ATPases F1F0 sont présentes chez la majorité des bactéries, notamment les mycoplasmes qui sont caractérisés par un génome réduit et un mode de vie parasitaire. En plus de l’opéron codant l’ATPase F1F0, des clusters apparentés de sept gènes ont été identifiés dans le génome de nombreux mycoplasmes. Au cours de cette thèse, nous avons cherché à caractériser l’évolution et la fonction de ces clusters supplémentaires. Quatre des protéines codées par ces clusters présentent des similarités structurales avec les sous-unités α, β,  et ε de l’ATPase F1F0, résultant en une potentielle structure F1-like. Les trois autres protéines ne présentent aucune similarité avec des protéines connues. Une localisation transmembranaire est prédite pour deux d’entre elles. Deux types d’ATPase F1-like, Type 2 et Type 3, ont été identifiés. Les clusters de Type 2 et de Type 3 pourraient être originaires du groupe phylogénétique Hominis, les clusters de Type 3 ayant vraisemblablement été disséminés par des transferts horizontaux de gènes entre mycoplasmes colonisant le même hôte. Les gènes du cluster de Type 3 de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides sont organisés en opéron et exprimés en milieu axénique. Des études de mutagénèse et de complémentation démontrent que le cluster de Type 3 est associé à une activité ATPase majeure des fractions membranaires. Des analyses biochimiques suggèrent que l’activité ATPase du cluster est sensible au ∆pH mais pas au ∆Ψ. Ces analyses suggèrent que le sodium et le potassium ne sont pas impliqués dans le fonctionnement de l’ATPase F1-likeX0. Les sous-unités des ATPases F1-likeX0 et F1F0 présentent un comportement différent en présence de détergents. L’ensemble de ces expériences suggèrent que l’ATPase F1-likeX0 est un complexe plus fragile que l’ATPase F1F0. Nos résultats montrent qu’en dépit d’une tendance à la réduction de génome, les mycoplasmes ont développé et échangé des ATPases sans équivalent chez d’autres bactéries. Nous proposons un modèle dans lequel une structure F1-like est associée avec un domaine hypothétique X0, enchâssé dans la membrane des mycoplasmes. / F1F0 ATPases have been found in most bacteria, including mycoplasmas that are characterized by drastically reduced genomes and a parasitic lifestyle. In addition to the typical operon of eight genes encoding genuine F1F0 ATPase, related clusters of seven genes were identified in many mycoplasmas. In this work, we investigated the evolution and the function of these supplementary clusters. Four proteins encoded by these clusters present structural similarities with subunits α, β,  and ε of F1F0 ATPases, resulting in potential F1-like structures. The three other encoded proteins did not show any similarity to known proteins. Transmembrane helices were predicted for two of them, suggesting a membrane localisation. Two types of F1-like ATPases, Type 2 and Type 3, were identified. Clusters encoding Type 2 and Type 3 ATPases were assumed to originate from the Hominis group of mycoplasmas. Further spreading of Type 3 ATPases towards other phylogenetic groups by horizontal gene transfers in between mycoplasmas sharing a same host was proposed on the basis of phylogenetic trees and genomic context. Functional analyses indicated that genes of Type 3 cluster in the ruminant pathogen Mycoplasma mycoides subsp. mycoides were organized as an operon. Proteomic analyses indicated that the seven encoded proteins were produced during growth in axenic media. Mutagenesis and complementation assays demonstrated that Type 3 cluster was associated with a major ATPase activity of membrane fractions. Biochemical analyses indicated that this ATPase activity was sensitive to ΔpH but not to ΔΨ. These analyses suggested that Na+ and K+ were not involved in the F1-likeX0 functioning. Our results indicated a behaviour of F1-likeX0 ATPase subunits that is different to that of F1F0 ATPase subunits in presence of detergents. Altogether, these analyses suggest that the F1-likeX0 complex could be more fragile than the F1F0 complex. Our results showed that despite their tendency to genome reduction, mycoplasmas have evolved and exchanged specific F1-like ATPases with no known equivalent in other bacteria. We propose a model in which the F1-like structure is associated with a hypothetical X0 sector embedded in the membrane of mycoplasmal cells.

Le modèle Aevol est un modèle d'évolution expérimentale in silico développé par Carole Knibbe et Guillaume Beslon pour étudier l'évolution de la structure des génomes. Aevol a permis d'identifier une très forte pression de sélection indirecte vers un certain niveau de variabilité mutationnelle du phénotype : la survie à long terme d'une lignée étant conditionnée à sa capacité à produire des mutations avantageuses sans pour autant produire trop de mutations délétères, un certain compromis entre robustesse et évolvabilité est indirectement sélectionné. Une conséquence de cette pression de sélection indirecte est le rôle central joué par le taux spontané de réarrangements chromosomiques dans la détermination de la structure du génome. Dans ce travail, nous avons modifié le modèle Aevol pour introduire d'une part un processus explicite de régulation de l'expression des gènes et d'autre part, une sensibilité aux similarités entre séquences dans les événements de recombinaison de l'ADN. Nous avons ainsi pu étudier l'effet de ces variations sur la sélection de second-ordre. Nous avons en particulier observé que celle-ci est extrêmement robuste aux choix de modélisation : les effets liés aux réarrangements sont en effet observés de la même façon lorsque les organismes possèdent un réseau de régulation (qui plus est, ces effets sont visibles sur le réseau lui-même), lorsque les réarrangements se produisent préférentiellement entre séquences similaires et lorsque les transferts horizontaux sont possibles. De plus, les effets de cette pression de sélection de second-ordre ne sont pas limités au niveau génomique : de forts taux de réarrangements tendent à donner lieu à des génomes présentant beaucoup d'opérons, très peu d'ARNs non-codants et des réseaux de régulation très simples. Au contraire, chez les organismes ayant évolué avec de faibles taux de réarrangement, la plupart des gènes sont transcrits sur des ARNs monocistroniques. Ces organismes possèdent un grand nombre d'ARNs non-codants et présentent des réseaux de régulation très complexes. Ces effets observés dans le modèle à différents niveaux d'organisation peuvent s'apparenter à de nombreuses caractéristiques observées chez les organismes réels. Ainsi les pressions sélectives indirectes observées grâce au model Aevol permettent de reproduire un large spectre de propriétés biologiques connues en ne modifiant que le seul taux de réarrangements dans le modèle. Ces mécanismes de sélection indirecte apparaissent donc comme de bons candidats pour expliquer ces mêmes observations sur les organismes réels. / The Aevol model is an in silico experimental evolution model that was specifically developped by Carole Knibbe to study the evolution of the structure of the genome. Using Aevol, a very strong second-order selective pressure towards a specific level of mutational variability of the phenotype was revealed: it was shown that since the survival of a lineage on the long term is conditionned to its ability to produce beneficial mutations while not loosing those previously found, a specific trade-off between robustness and evolvability is indirectly selected. A consequence of this indirect selective pressure is the central role played by the spontaneous rate of chromosomal rearrangements in determining the structure of the genome. More specifically, it was shown that because some rearrangements (large duplications and large deletions) have an impact not only arround their breakpoints but on the whole sequence between them, non-coding sequences are actually mutagenic for the coding sequences they surround. The consequence is a clear trend for organisms having evolved under high rearrangement rates to have very short genomes with hardly any non-coding sequences while organisms evolving in the context of low rearrangement rates have huge, mostly non-coding genomes. Here, we modified the Aevol model to introduce an explicit regulation of gene expression as well as a sensitivity to sequence similarity in DNA recombination events. We observed that the effects of the second-order pressure mentioned above are very robust to modelling choices: they are similarly observed when gene regulation is made available, when rearrangements occur preferentially between similar sequences and even when a biologically plausible process of horizontal transfer is allowed. Moreover, the effects of this second-order selective pressure are not limited to the genomic level: high rearrangement rates usually lead to genomes that have many polycistronic RNAs, almost no non-coding RNAs and very simple regulation networks. On the contrary, at low rearrangement rates organisms have most of their genes transcribed on monocistronic RNAs, they own a huge number of coding RNAs and present very complex and intricate regulation networks. These astounding effects at different levels of organization can account for many features found on real organisms. Thus, the indirect selective pressure that was identified thanks to the Aevol model allows to reproduce a large panel of known biological properties by changing the sole spontaneous rearrangement rate, making this pressure a good candidate for explaining these observations on real organisms.

Le cuivre, souvent utilisé pour gérer les bactérioses en agriculture, est largement utilisé dans la lutte contre Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), agent responsable du chancre asiatique des agrumes. La récente détection d’un phénotype résistant au cuivre (CuR) chez Xcc dans deux territoires ultramarins français a motivé une étude génomique qui a révélé, dans les génomes de souches CuR, la présence d’un plasmide conjugatif portant un transposon adaptatif de type Tn3. Sa conservation chez plusieurs espèces de Xanthomonas phytopathogènes suggère le rôle des transferts horizontaux (HGT) dans l’adaptation de Xcc. Nous avons donc analysé, dans l’océan Indien, les relations phylogénétiques de souches sensibles et CuR en prenant en compte à la fois les SNP et les variations de contenu en gènes. La datation de la phylogénie a permis de formuler des scenarii d’introduction de la bactérie dans la région. La phylogénie a montré une structure géographique forte à l’échelle de l’océan Indien, qui s’estompe à l’échelle de la Réunion et disparaît à l’échelle du verger. Au sein des vergers, l’admixture est un élément favorable aux HGT entre souches génétiquement différentes. Ils sont pourtant peu caractérisés chez les bactéries du genre Xanthomonas. Nous avons ainsi analysé la dispersion de l’ensemble des gènes plasmidiques connus de la famille des Xanthomonadaceae dans l’ensemble des génomes bactériens de NCBI, mettant en évidence à la fois la forte prévalence des gènes plasmidiques au sein des Xanthomonadaceae mais aussi la limite taxonomique forte à leur échange par conjugaison. L’importance du mosaïsme plasmidique, en partie lié aux éléments mobiles a aussi été illustrée. L’ensemble de nos résultats souligne l’importance des HGT dans l’évolution des bactéries du genre Xanthomonas, et la nécessité de caractériser finement le contenu et le fonctionnement du génome environnemental des Xanthomonadaceae pour appréhender au mieux l’adaptation de ces bactéries phytopathogènes. / Copper, frequently used in agriculture to control bacterial diseases, is commonly used against Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), the bacterial agent of Asiatic citrus canker. The recent detection of a copper-resistant phenotype in two French overseas regions motivated a genomic study which revealed, in copper-resistant (CuR) strains, a conjugative plasmid encoding an adaptive transposon of the Tn3 family. Its conservation in several Xanthomonas species suggested the role of horizontal gene transfer (HGT) in Xcc adaptation. We therefore analyzed the evolutionary history of susceptible and CuR Xcc strains in the Indian Ocean using both SNP and gene content variations. The dating of the obtained phylogeny allowed us to hypothesize the history of Xcc introduction into the region. The phylogeny showed a strong geographic structure among islands of the Indian Ocean region, which faded at the Réunion scale and disappeared at the grove scale. Among the groves, admixture is a factor favoring HGT between genetically distinct strains. This form of evolution is however largely uncharacterized in the Xanthomonas genus. To fill this gap, we searched genetic homology between the whole known plasmid gene content of the Xanthomonadaceae family and the complete set of genomes hosted in NCBI databases. We highlighted both the ubiquity of plasmid genes in the Xanthomonadaceae family and the taxonomical barrier of their sharing by conjugation. The small fraction of genes that were exchanged through the complete sharing of plasmids also revealed the importance of plasmid mosaicism, partly due to mobile genetic elements. Taken together, our results highlight the importance of bacterial communities in the evolution of phytopathogenic bacteria of the Xanthomonas genus, and the need for a precise characterization of the content and the functioning of the Xanthomonadaceae environmental genome in order to fully apprehend the adaptation of these phytopathogenic bacteria.

En 1977, Carl Woese sépare les procaryotes en deux grands groupes en proposant une nouvelle classification basée sur des critères phylogénétiques. Les Archaea deviennent ainsi un domaine à part entière aux cotés des Bacteria et des Eucarya. Depuis, la compréhension de ce nouveau groupe et de ses relations avec les deux autres domaines, essentielles pour comprendre l’évolution ancienne du vivant, est largement passée par l’étude de leur phylogénie. Presque 40 ans de recherche sur les archées ont permis de faire évoluer leur image : de bactéries vivant dans des milieux spécialisés, souvent extrêmes, on est passé à un domaine indépendant, très diversifié aussi bien génétiquement, métaboliquement ou encore écologiquement. Ces dernières années la barre symbolique de cent génomes complets d’archées séquencés a été franchie et, parallèlement, les projets génomiques et métagénomiques sur des groupes peu caractérisés ou de nouvelles lignées de haut rang taxonomique (e.g. Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, groupe MGC, groupe II des Euryarchaeota, etc.) se sont multipliés. Tout ceci apporte un matériel sans précédent pour l’étude de l’histoire évolutive et de la diversité des Archaea. Les protéines ribosomiques ont été utilisées de façon courante pour inférer la position phylogénétique des nouvelles lignées d’Archaea. Néanmoins, les phylogénies résultantes ne sont pas complètement résolues, laissant des interrogations concernant d’importantes relations de parenté. La recherche de nouveaux marqueurs est donc cruciale et c’est dans ce contexte que mon projet de thèse s’inscrit. À partir de l’analyse des génomes de deux Thaumarchaeota et d’une Aigarchaeota, nous avons identifié 200 protéines conservées et bien représentées dans les différents phyla d’archées. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, ce qui peut apporter un signal phylogénétique complémentaire à celui des marqueurs de type informationnel utilisés par le passé. En plus de confirmer la plupart des relations phylogénétiques inférées à partir de ces derniers (i.e., protéines ribosomiques et sous unités de l’ARN polymérase), l’analyse phylogénétique de ces nouveaux marqueurs apporte un signal permettant une meilleure résolution de la phylogénie des archées et la clarification de certaines relations jusqu’ici confuses. Un certain nombre de ces nouveaux marqueurs sont aussi présents chez les bactéries. Les relations entre les grands phyla d’archées restant encore non résolues, nous avons utilisé ces protéines pour essayer de placer la racine de l’arbre des Archaea en utilisant comme groupe extérieur les bactéries. Nous avons ainsi pu identifier 38 protéines, parmi les 200 sélectionnées précédemment, ayant un signal phylogénétique suffisamment fiable pour cette étude, auxquelles nous avons ajouté 32 protéines ribosomiques universelles. L’utilisation conjointe de ces données nous a permis de placer la racine entre les Euryarchaeota, d’une part, et un groupe rassemblant les Thaumarchaeota, les Aigarchaeota, les Korarchaeota et les Crenarchaeota, d’autre part. Ce nouvel éclairage sur l’évolution ancienne des archées nous a amené à proposer une révision de leur taxonomie avec, principalement, la création du nouveau phylum "Proteoarchaeota" contenant les quatre phyla actuels que nous proposons de rétrograder en classes : Thaumarchaea, Aigarchaea, Korarchaea et Crenarchaea.Finalement, l’analyse des protéines codées dans les trois génomes qui ont servi de point de départ de ma thèse nous a permis de générer une masse considérable de données qui ont révélé des traits particuliers ou encore des histoires évolutives inattendues. Un exemple est l’histoire du complexe formé par la chaperonne DnaK et de ses co-chaperonnes GrpE, DnaJ, et DnaJ-Fer chez les Thaumarchaeota, impliquant plusieurs transferts horizontaux entre les trois domaines du vivant. / In 1977, Carl Woese proposed a new classification of organisms based on phylogenetic criteria where he divided prokaryotes into two major groups. Thus, Archaea were defined as a new domain, together with Bacteria and Eucarya. Since then, the study of this group and its relationships with the two other domains, essential to understand the early evolution of Life, has been largely done through the investigation of its phylogeny. Almost 40 years of research on the archaea have led to a significant evolution of the knowledge on this group: from considering them as bacteria living in specialized environments, most often extreme ones, to defining them as an independent domain, highly diversified in genetic, metabolic and ecological terms. During the last years, the symbolic barrier of 100 complete archaeal genome sequences has been reached and, simultaneously, many genome projects from poorly-known groups or new high-rank lineages (e.g., Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, MGC, group II Euryarchaeota, etc.) have been launched. All this provides unprecedented information to study the evolutionary history of Archaea. Ribosomal proteins have been used recurrently to infer the phylogenetic position of new archaeal lineages. Nevertheless, the resulting phylogenies are not fully resolved and several important nodes remain uncertain. The identification of new phylogenetic markers is therefore crucial. This represents the framework of my PhD thesis project. On the basis of the analysis of the genome sequences of two Thaumarchaeota and one Aigarchaeota, we have identified 200 conserved proteins well represented among the different archaeal phyla. These proteins are involved in a number of cellular functions, thus providing a phylogenetic signal complementary to the one obtained from the informational proteins (i.e., ribosomal proteins and RNA polymerase subunits). The phylogenetic analysis of these new markers has led to a better resolution of the archaeal phylogeny, including several relationships that remained unclear. Several of the new markers are also present in bacteria. Since the relationships among the different archaeal phyla are not yet resolved, we have used those markers to try to place the root of the archaeal phylogeny using the bacterial sequences as outgroup. We have identified 38 proteins among the 200 detected before containing a phylogenetic signal useful for that purpose, to which we have added 32 universal ribosomal proteins. The use of this complete dataset allowed us locating the root between the Euryarchaeota and a large group joining the Thaumarchaeota, Aigarchaeota, Korarchaeota and Crenarchaeota. This new result on the ancient evolutionary history of Archaea has led us to propose a taxonomic revision for this domain, in particular the erection of a new phylum "Proteoarchaeota", containing the current four phyla that we propose to retrograde into classes (Thaumarchaeales, Aigarchaeales, Korarchaeales and Crenarchaeales). Finally, the analysis of the proteins encoded by the three reference genomes at the origin of this work has generated a large amount of data, which reveals particular traits in certain organisms or unexpected evolutionary histories. One example concerns the evolution in Thaumarchaeota of the protein complex composed of the DnaK chaperon and its co-chaperons GrpE, DnaJ, and DnaJ-Fer, which involves several horizontal gene transfer events among the three domains of Life.

À l'heure actuelle, une large proportion des recherches vouées à l'identification et au développement de nouvelles thérapies anticancéreuses est basée sur l'apoptose. Dans les dernières décennies, divers composés phytochimiques ont été caractérisés comme des agents pharmacologiques susceptibles d'éliminer les cellules cancéreuses via l'induction de l'apoptose. Parmi ceux-ci, l'isoliquiritigénine (ILG), un flavonoïde naturellement présent dans les racines de réglisse, se distingue des autres par ses nombreuses propriétés thérapeutiques incluant une activité antitumorale. Chez les mammifères, les cellules apoptotiques (CA) peuvent être complètement dégradées via leur capture par des cellules phagocytaires spécialisées ou servir de vecteurs d'ADN dans un processus appelé transfert horizontal de gènes (THG). Ainsi, il a été mis en évidence que des CA dérivées de cancer du col de l'utérus peuvent induire le transfert de séquences d'oncogènes de papillomavirus humains (HPV) à des fibroblastes primaires humains (HPFs) qui acquièrent des propriétés de cellules transformées. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l'internalisation de CA par les fibroblastes, un modèle de phagocyte non-professionnel, n'ont pas encore été clairement identifiés et la caractérisation de ces événements qui précèdent le THG est essentielle à la compréhension de ce processus et de la transformation des cellules receveuses qui peut en découler.Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse étaient, (i) d'analyser les effets anticancéreux de l'ILG sur des cellules dérivées de cancer du col de l'utérus, (ii) de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la capture des CA par les HPFs, (iii) d'étudier les événements cellulaires qui font suite à ce processus comme la maturation des phagosomes, le THG et l'acquisition de propriétés de transformation et enfin, (iv) de démontrer la preuve de la conservation de la capacité tumorigénique des CA in vivo.Un premier travail a permis de mettre en lumière les propriétés antitumorales de l'ILG via une multiplicité d'actions sur des modèles cellulaires de cancer du col de l'utérus in vitro, incluant des activités anti-proliférative, pro-apoptotique, anti-migratoire. Concernant la lignée cellulaire Ca Ski, p53 sauvage et représentative du carcinome du col utérin le plus fréquent, associé à une infection transformante par HPV16, l'apoptose induite par l'ILG semble dépendante de p53 et de la mitochondrie, mais aussi de la voie des récepteurs de mort, comme attesté par l'augmentation des niveaux de protéines p53 et p21, la dissipation du potentiel membranaire mitochondrial, la libération du cytochrome c et le clivage des caspases-9, -8 et -3. Ces effets pourraient être la conséquence de la diminution de l'expression de l'oncoprotéine virale E6 d'HPV16 induite par l'ILG entraînant la restauration de l'expression de p53. Nos travaux révèlent un fort potentiel de l'ILG contre différents types de cellules malignes et ouvrent le champ à de nouvelles modalités de traitement des cancers associés à HPV. / Most of the research strategies aiming at improving anticancer therapies currently target apoptosis. Over the last decades, several natural products derived from herbal medicine or food have been identified as pharmacological agents for cancer cell elimination through apoptosis induction. Among them, isoliquiritigenin (ILG) is a chalcone derivative isolated from liquorice and shallots which exhibits a wide variety of biological functions including antitumor properties.In mammals, apoptotic cells (AC) can either be eliminated after their capture by specialized phagocytes or act as vectors of DNA in a process named horizontal gene transfer (HGT). For instance, AC derived from cervical cancer cells can transfer human papillomavirus (HPV) oncogene sequences to human primary fibroblasts (HPFs) which subsequently acquire transformed cell properties. The molecular mechanisms underlying AC uptake by HPFs, a model of non-professional phagocytes, have not been clearly identified. Characterizing these upstream events appears critical to broaden our understanding of HGT and the ultimate transformation of recipient cells which may subsequently occur.The aims of this work were to (i) study the antitumor effects of ILG on cervical cancer cell lines,(ii) characterize the cellular and molecular mechanisms underlying AC uptake by HPF, (iii) study the cellular events which occur in HPFs following AC engulfment such as phagosome maturation, HGT and acquisition of transformed properties, and (iv) evaluate the tumorigenic properties of AC in vivo.In a first part of this PhD project, we found that ILG exhibits multiple antitumor actions on cervical cancer cells in vitro including anti-proliferative, pro-apoptotic and anti-migration properties. Further studies on apoptosis-related events were conducted in Ca Ski cells (p53wt, HPV16 DNA positive), which are representative of the most frequent cervical carcinoma. The treatment of Ca Ski cells with ILG is associated with increased levels of p53 and p21 proteins, loss of mitochondrial membrane potential, cytochrome c release and caspase-9, -8 and -3 cleavage. These features suggest that ILG-induced apoptosis is dependent on p53 and involve both mitochondrial and death receptor- mediated pathways. The effect of ILG in Ca Ski cells may be partly explained by the decrease of HPV16 E6 oncoprotein expression and the associated raise of p53 levels observed after cell treatment. Our work highlights the potential of ILG as an antitumor agent and provides the opportunity of new treatment. ln the second part of this work, we set up a method based on flow cytometry to quantitatively analyze AC uptake. This original method and microscopy analysis allowed us to show that HPFs act as non-professional phagocytes and are able to engulf subcellular fragments rather than dying whole cells, with lower efficiency and rapidity compared to professional phagocytes as macrophages. Uptake of AC by HPFs depends on time, temperature and the presence of bivalent ions. Morphological analysis and fonctional assays using endocytosis inhibitors revealed a mechanism related to phagocytosis and/or macropinocytosis. The recognition of phosphatidylserine exposed on the surface of AC by their receptor BAIl has emerged as a required event for AC uptake by HPFs.

Les transferts horizontaux de gènes (THG) ont été démontrés pour jouer un rôle important dans l'évolution des procaryotes. Leur impact a été le sujet de débats intenses, ceux-ci allant même jusqu'à l'abandon de l'arbre des espèces. Selon certaines études, un signal historique dominant est présent chez les procaryotes, puisque les transmissions horizontales stables et fonctionnelles semblent beaucoup plus rares que les transmissions verticales (des dizaines contre des milliards). Cependant, l'effet cumulatif des THG est non-négligeable et peut potentiellement affecter l'inférence phylogénétique. Conséquemment, la plupart des chercheurs basent leurs inférences phylogénétiques sur un faible nombre de gènes rarement transférés, comme les protéines ribosomales. Ceux-ci n'accordent cependant pas autant d'importance au modèle d'évolution utilisé, même s'il a été démontré que celui-ci est important lorsqu'il est question de résoudre certaines divergences entre ancêtres d'espèces, comme pour les animaux par exemple. Dans ce mémoire, nous avons utilisé des simulations et analyser des jeux de données d'Archées afin d'étudier l'impact relatif des THG ainsi que l'impact des modèles d'évolution sur la précision phylogénétique. Nos simulations prouvent que (1) les THG ont un impact limité sur les phylogénies, considérant un taux de transferts réaliste et que (2) l'approche super-matrice est plus précise que l'approche super-arbre. Nous avons également observé que les modèles complexes expliquent non seulement mieux les données que les modèles standards, mais peuvent avoir un impact direct sur différents groupes phylogénétiques et sur la robustesse de l'arbre obtenu. Nos résultats contredisent une publication récente proposant que les Thaumarchaeota apparaissent à la base de l'arbre des Archées. / Horizontal gene transfer (HGT) had been demonstrated to play an important role in the evolution of prokaryotes. Their impact on phylogeny was the subject of a heated debate, with some proposing that the concept of a species tree should be abandoned. The phylogeny of prokaryotes does contain a major part of the historical signal, because stable and functional horizontal transmissions appear to be by far rarer than vertical transmissions (tens versus billions). However, the cumulative effect of HGT is non-negligible and can potentially affect phylogenetic inference. Therefore, most researchers base their phylogenetic inference on a low number of rarely transferred genes such as ribosomal proteins, but they assume the selection of the model of evolution as less important, this despite the fact that it has been shown of prime importance for much less deep divergences, e.g. like animals. Here, we used a combination of simulations and of real data from Archaea to study the relative impact of HGT and of the inference methods on the phylogenetic accuracy. Our simulations prove that (1) HGTs have a limited impact on phylogeny, assuming a realistic rate and (2) the supermatrix is much more accurate than the supertree approach. We also observed that more complex models of evolution not only have a better fit to the data, but can also have a direct impact on different phylogenetic groups and on the robustness of the tree. Our results are in contradiction to a recent publication proposing that the Thaumarchaeota are at the base of the Archaeal tree.

En 1977, Carl Woese sépare les procaryotes en deux grands groupes en proposant une nouvelle classification basée sur des critères phylogénétiques. Les Archaea deviennent ainsi un domaine à part entière aux cotés des Bacteria et des Eucarya. Depuis, la compréhension de ce nouveau groupe et de ses relations avec les deux autres domaines, essentielles pour comprendre l'évolution ancienne du vivant, est largement passée par l'étude de leur phylogénie. Presque 40 ans de recherche sur les archées ont permis de faire évoluer leur image : de bactéries vivant dans des milieux spécialisés, souvent extrêmes, on est passé à un domaine indépendant, très diversifié aussi bien génétiquement, métaboliquement ou encore écologiquement. Ces dernières années la barre symbolique de cent génomes complets d'archées séquencés a été franchie et, parallèlement, les projets génomiques et métagénomiques sur des groupes peu caractérisés ou de nouvelles lignées de haut rang taxonomique (e.g. Nanohaloarchaea, Thaumarchaeota, ARMAN, Aigarchaeota, groupe MGC, groupe II des Euryarchaeota, etc.) se sont multipliés. Tout ceci apporte un matériel sans précédent pour l'étude de l'histoire évolutive et de la diversité des Archaea. Les protéines ribosomiques ont été utilisées de façon courante pour inférer la position phylogénétique des nouvelles lignées d'Archaea. Néanmoins, les phylogénies résultantes ne sont pas complètement résolues, laissant des interrogations concernant d'importantes relations de parenté. La recherche de nouveaux marqueurs est donc cruciale et c'est dans ce contexte que mon projet de thèse s'inscrit. À partir de l'analyse des génomes de deux Thaumarchaeota et d'une Aigarchaeota, nous avons identifié 200 protéines conservées et bien représentées dans les différents phyla d'archées. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires, ce qui peut apporter un signal phylogénétique complémentaire à celui des marqueurs de type informationnel utilisés par le passé. En plus de confirmer la plupart des relations phylogénétiques inférées à partir de ces derniers (i.e., protéines ribosomiques et sous unités de l'ARN polymérase), l'analyse phylogénétique de ces nouveaux marqueurs apporte un signal permettant une meilleure résolution de la phylogénie des archées et la clarification de certaines relations jusqu'ici confuses. Un certain nombre de ces nouveaux marqueurs sont aussi présents chez les bactéries. Les relations entre les grands phyla d'archées restant encore non résolues, nous avons utilisé ces protéines pour essayer de placer la racine de l'arbre des Archaea en utilisant comme groupe extérieur les bactéries. Nous avons ainsi pu identifier 38 protéines, parmi les 200 sélectionnées précédemment, ayant un signal phylogénétique suffisamment fiable pour cette étude, auxquelles nous avons ajouté 32 protéines ribosomiques universelles. L'utilisation conjointe de ces données nous a permis de placer la racine entre les Euryarchaeota, d'une part, et un groupe rassemblant les Thaumarchaeota, les Aigarchaeota, les Korarchaeota et les Crenarchaeota, d'autre part. Ce nouvel éclairage sur l'évolution ancienne des archées nous a amené à proposer une révision de leur taxonomie avec, principalement, la création du nouveau phylum "Proteoarchaeota" contenant les quatre phyla actuels que nous proposons de rétrograder en classes : Thaumarchaea, Aigarchaea, Korarchaea et Crenarchaea.Finalement, l'analyse des protéines codées dans les trois génomes qui ont servi de point de départ de ma thèse nous a permis de générer une masse considérable de données qui ont révélé des traits particuliers ou encore des histoires évolutives inattendues. Un exemple est l'histoire du complexe formé par la chaperonne DnaK et de ses co-chaperonnes GrpE, DnaJ, et DnaJ-Fer chez les Thaumarchaeota, impliquant plusieurs transferts horizontaux entre les trois domaines du vivant.

La phylogénie permet de reconstituer l'histoire évolutive de séquences ainsi que des espèces qui les portent. Les récents progrès des méthodes de séquençage ont permis une inflation du nombre de séquences disponibles et donc du nombre d'arbres de gènes qu'il est possible de construire. La question qui se pose est alors d'optimiser la recherche d'informations dans ces arbres. Cette recherche doit être à la fois exhaustive et efficace. Pour ce faire, mon travail de thèse a consisté en l'écriture puis en l'utilisation d'un ensemble de programmes capables de parcourir et d'annoter les arbres phylogénétiques. Cet ensemble de programmes porte le nom de TPMS (Tree Pattern Matching Suite). Le premier de ces programmes (tpms_query) permet d'effectuer l'interrogation de collections à l'aide d'un formalisme dédie. Les possibilités qu'il offre sont : La détection de transferts horizontaux : Si un arbre de gènes présente une espèce branchée dans un arbre au milieu d'un groupe monophylétique d'espèces avec lesquelles elle n'est pas apparentée, on peut supposer qu'il s'agit d'un transfert horizontal, si ces organismes sont des procaryotes ou des eucaryotes unicellulaires. La détection d'orthologie : Si une partie d'un arbre de gènes correspond exactement à l'arbre des espèces, on peut alors supposer que ces gènes sont un ensemble de gènes d'orthologues. La validation de phylogénies connues : Quand l'arbre des espèces donne lieu à des débats, il peut est possible d'interroger une large collection d'arbres de gènes pour voir combien de familles de gènes correspondent à chaque hypothèse. Un autre programme, tpms_computations, permet d'effectuer des opérations en parallèle sur tous les arbres, et propose notamment l'enracinement automatique des arbres via différents critères, ainsi que l'extraction de sous arbres d'orthologues (séquence unique par espèce). Il propose aussi une méthode de détection automatique d'incongruences. La thèse présente le contexte, les différents algorithmes à la base de ces programmes, ainsi que plusieurs utilisations qui en ont été faites

Les éléments génétiques mobiles contribuent grandement à la diversité et à l’évolution des génomes bactériens par le biais du transfert horizontal. Parmi eux, les éléments intégratifs conjugatifs (ICE) codent leur propre excision, leur transfert par conjugaison et leur intégration. En revanche, les éléments intégratifs et mobilisables (IME) ne sont autonomes que pour leur excision et intégration et ne codent seulement que certaines des protéines/fonctions (oriT) dont ils ont besoin pour leur transfert conjugatif. Par conséquent, les IME ont besoin d’un élément conjugatif « helper » pour se transférer. Malgré leur impact sur le flux des gènes et l’évolution des génomes, la prévalence des ICE reste peu étudiée et seulement très peu d’IME avaient été identifiés au début de cette étude. De plus, bien que plusieurs méthodes de détection des ilots génomiques existent, aucune d’elles n’est dédiée aux ICE ou aux IME. Ce qui ne facilite pas l’analyse exhaustive de ces éléments. Le genre Streptococcus appartient au phylum des firmicutes. La quasi-totalité des streptocoques sont des bactéries commensales ou pathogènes de l’homme et d’autres animaux. Aussi, 2 espèces de streptocoques sont utilisées en tant que ferments lactiques lors la production de laits fermentés et divers fromages. Globalement, le genre streptocoques représente un groupe d’intérêt pour l’homme, l’étude du flux de gènes au sein de ces organismes et l’impact qu’il peut avoir sur leur mode vie est primordiale. Au cours de cette thèse, nous avons recherché les ICE et les IME dans 124 souches de streptocoques appartenant à 27 espèces en utilisant une base de données de référence comportant des protéines dites « signatures » d’IME et d’ICE (de leurs modules de conjugaison/mobilisation et d’integration/excision). Cette analyse exhaustive a permis l’identification et la délimitation de 131 ICE ou ICE légèrement dégénérés et 144 IME. Tous ces éléments ont été délimités, ce qui nous a permis de déterminer leur spécificité d’intégration dans les génomes. Au total, 17 spécificités d’intégration ont été identifiées pour les ICE dont 8 encore jamais décrites (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC) et 18 spécificités pour les IME dont seulement 5 étaient connues chez les firmicutes. Les modules d’intégration des ICE codent soit une intégrase à tyrosine pouvant avoir une faible spécificité (1 famille d’intégrase) ou une forte spécificité (13 spécificités différentes), soit des intégrases à sérine seule ou en triplet (4 spécificités différentes), soit une transposase à DDE. Les IME codent soit des intégrases à tyrosine (10 spécificités différentes) soit des intégrases à serine seule (8 spécificités différentes). Les ICE ont été groupés en 7 familles distinctes selon les protéines codées par leur module de conjugaison. Les IME présentaient une très forte diversité au sein de leur module de mobilisation, empêchant ainsi leur regroupement en famille selon les gènes portés par ce module. Les analyses phylogénétiques des protéines signature codées par tous les ICE et les IME ont montré des échanges de modules d’intégration entre les ICE et les IME et de nombreux échanges entre les modules de mobilisation des IME. L’ensemble de ces résultats révèle la forte prévalence et l’extrême diversité des ICE et des IME au sein des génomes de streptocoques. Une meilleure connaissance et compréhension de ces éléments nous a incité à construire un outil informatique semi-automatisé de détection des ICE et des IME de Streptocoques ainsi que leurs sites d’insertion / Mobile genetic elements largely contribute to the evolution and diversity of bacterial genomes through horizontal gene transfer. Among them, the integrative and conjugative elements (ICEs) encode their own excision, conjugative transfer and integration. On the other hand, integrative mobilizable elements (IMEs) are autonomous for excision and integration but encode only some of the proteins needed for their conjugative transfer. IMEs therefore need a “helper” conjugative element to transfer. Despite their impact on gene flow and genome dynamics, the prevalence of ICEs remains largely underscored and very few IMEs were identified at the beginning of this study. Furthermore, although several in silico methods exist to detect genomic islands, none are dedicated to ICEs or IMEs, thus complicating exhaustive examination of these mobile elements. The Streptococcus genus belongs to the firmicutes’ phylum. Almost all streptococci are commensal bacteria or pathogenes to men and animals. Two species of Streptococcus are also used in the dairy industry as lactic ferments in order to produce fermented milk and different types of cheese. Studying the gene flux of the Steptococci genus and the impact it can have on the lifestyle of these organisms is essential, as it has a lot of interest for human health and activities. In this work, we searched for ICEs and IMEs in 124 strains of streptococci belonging to 27 species using a reference database of ICE and IME signature proteins (from their conjugation, mobilization and integration/excision modules). This exhaustive analysis led to the identification and delimitation of 131 ICEs or slightly decayed ICEs and 144 IMEs. All these elements were delimited, which allowed us to identify their integration specificities in the genomes. In total, 17 ICE integration specificities were identified. Among them, 8 had never been described before (ftsK, guaA, lysS, mutT, rpmG, rpsI, traG and ybaB/EbfC). 18 specificities were also identified for IMEs, among which only 5 were known for the firmicutes. ICEs encode high or low-specificity tyrosine integrases (13 different specificities), single serine intégrases (1 specificity), triplet of serine integrases (3 different specificities), or DDE transposases while IMEs encode either tyrosine integrases (10 different specificities) or single serine integrases (8 different specificities). ICE were grouped in 7 distinct families according to the proteins encoded by their conjugation module whereas the mobilization modules of IMEs were highly diverse, preventing them from grouping into families according to their mobilization modules. The phylogenetic analysis of the signature proteins encoded by all ICEs and IMEs showed integration module exchanges between ICEs and IMEs and several mobilization module exchanges between IMEs. The overall results reveal a strong prevalence and extreme diversity of these elements among Streptococci genomes. Better understanding and knowledge of ICEs and IMEs prompted us to build a semi-automated command-line tool to identify streptococcal ICEs and IMEs as well as to determine their insertion site

En dépit de leur importance, la caractérisation des communautés bactériennes dans l’environnement reste encore très incomplète. Les principales raisons sont, d’une part, la difficulté d’appréhender la totalité de la communauté bactérienne quand plus de 99% des bactéries demeurent récalcitrantes à la culture in vitro et ne peuvent donc être étudiées par les approches classiques de microbiologie. D’autre part, la métagénomique, censée contourner cette méthode de culture en s’intéressant à l’ensemble des génomes extraits des milieux d’études, demeure elle aussi imparfaite du fait de limitations techniques (biais d’extraction de l'ADN, de clonage, de PCR, de séquençage et d’assemblage des génomes etc.) et conceptuelles, inhérentes à la complexité et l’hétérogénéité des environnements. Pour compenser les limites de chacune de ces techniques, des méthodes de tri cellulaire appliquées en conjonction avec les deux premières pourraient aider à un meilleur décryptage de la diversité microbienne. Basée sur la sélection spécifique (taxonomique et/ou fonctionnelle) et l’isolement direct des cellules bactériennes ciblées à partir d’un échantillon environnemental complexe, l’étude est restreinte à une population spécifique, voire à une cellule isolée. Pourront alors être appliquées les approches classiques de mise en culture ou d’extraction de l’ADN pour une étude restreinte à l’ADN ou l’ARN, leur répétition sur les différentes populations devant à terme (lointain) approcher l’exhaustivité. C’est dans ce contexte que s’est positionné ce travail de thèse visant dans un premier temps à mettre au point un nouvel outil de tri cellulaire basé sur l’intégration de micro-aimants permanents dans un canal microfluidique. A partir de ce système de tri magnétique miniaturisé, offrant de nombreux avantages (dispositif portable, peu coûteux, nécessitant de faibles volumes réactionnels et potentiellement intégrable en « laboratoire sur puce »), une technique d’isolement sélectif de cellules bactériennes marquées magnétiquement a alors été développée. Ciblées sur des critères taxonomiques après hybridation in situ avec des sondes d’acides nucléiques biotinylés complémentaires d’une région spécifique du gène 23S rRNA, des cellules bactériennes ont été marquées magnétiquement après réaction de la sonde avec des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées par des molécules de streptavidine. Les premiers résultats montrent l’établissement d’une méthode de tri suffisamment spécifique et sensible pour piéger les cellules marquées diluées (0,04%) au sein d’une suspension, à des niveaux compatibles avec l’isolement futur de populations d’intérêt à partir de communautés d’environnements complexes. Sur un principe comparable, l’approche a été adaptée à l’étude des transferts horizontaux de gènes in situ. Les applications d’un tri cellulaire grâce au marquage par des nanoparticules magnétiques et l’emploi de micro-aimants intégrés dans des microsystèmes fluidiques semblent donc très prometteuses pour le développement de la microbiologie environnementale. / Despite their importance, bacterial communities in the environment remain poorly characterized. On the one hand, it is difficult to gain knowledge of the community as a whole because over 99% of bacteria are recalcitrant to in vitro culture, rendering classic microbiological approaches imposible to carry out. On the other hand, metagenomics, which can be used to circumvent culture-based approaches by extracting all the genomes from a given environment, is also problematic given the associated technical limitations (biases related to DNA extraction, cloning, PCR, genome sequencing and assembling etc.), and conceptual difficulties related to the complexity and the homogeneity of the environments. In order to overcome some of the limitations of these approaches, bacterial cell selection methods have been developed and can be used to improve our understanding of microbial diversity. Based on taxonomic and/or functional selection and the direct isolation of bacterial cells from an environmental sample, bacterial cell selection can be used to reduce microbial community complexity by targeting specific populations, or even an isolated cell. A variety of classic approaches such as cultivation or DNA/RNA extraction can then be carried out. This cycle can theoretically be repeated until all members of the community are characterized. The aim of this doctoral thesis was to design a novel cell selection tool based on the permanent integration of micro-magnets into a microfluidic canal. In conjunction with a new miniaturized magnetic selection system that provides several advantages over larger systems (portable, low cost, requiring smaller reaction volumes and can be potentially integrated on “laboratory on a chip” systems), a method for selective bacterial cell isolation using magnetic labeling was developed. The bacterial cells were targeted based on taxonomic criteria; biotin-labeled probes were developed for a specific region of the 23S rRNA gene. Following in situ hybridization with the probes, baceterial cells were labeled with streptavidin-functionalized magnetic nanoparticles. First results showed that the tool was specific and sensitive enough to trap labeled and diluted (0,04%) cells from a suspension at levels that are comparible to populations of interest found in complex environmental communities. This tool has also been adapted to study in situ horizontal gene transfer as well. The application of a cellular selection tool that labels targets with magnetic nanoparticles coupled to fluidic microsystems with integrated nano-magnets looks very promising for future studiesin environmental microbiology.