O transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TACTH) tem se mostrado mais eficaz como tratamento das formas graves da esclerose sistêmica (ES) do que a imunossupressão convencional (IS), porém os mecanismos imunológicos envolvidos com a resposta terapêutica não estão completamente elucidados. Células mononucleares do sangue periférico e soro/plasma foram coletados de 31 pacientes com ES antes e semestralmente, até 36 meses pós-transplante, e de 16 pacientes com ES não-transplantados tratados com IS. A função tímica foi avaliada por RT-qPCR dos valores de b- e signal joint (sj)-T-cell receptor excision circles (TREC), sendo a taxa de proliferação intratímica (n) calculada pela fórmula: n=LOG(sjTREC/bTREC)/LOG2. A história replicativa das células B e a função medular foram quantificadas pelos valores de coding-joint (Cj) e sj-kappa-deleting recombination excision circles (sjKREC) e a taxa de proliferação das células B no sangue periférico (N) foi calculada pela fórmula: N=LOG(Cj/sjKREC)/LOG2. O comprimento telomérico foi avaliado por RT-qPCR e estimado pela razão T/S (Telomere repeat copy number/Single-copy gene copy number). As células recém-emigradas do timo (RET) CD3+CD4+CD31+CD45RA+, T reguladoras (Tregs) CD4+CD25hiFoxP3+(GITR+/CTLA-4+), naïve CD19+CD27-IgD+, Bm2 CD19+CD38lowIgD+, B reguladoras (Bregs) CD19+CD24hiCD38hi, senescentes CD8+CD28- CD57+ e exaustas PD1+ foram quantificadas por citometria de fluxo. O TCR foi sequenciado por sequenciamento de nova geração e o perfil de citocinas séricas inflamatórias e pró- fibróticas foi avaliado por CBA-Flex e ELISA. Observamos que os valores de sjTREC e bTREC diminuíram aos 6 meses pós-TACTH, retornando a valores basais aos 12 meses, correlacionando com o número de RET e promovendo maior diversidade do TCR. Não houve mudança na taxa de divisão de timócitos. A contagem de Tregs aumentou aos 12 meses pósTACTH, correlacionando com valores de sjTREC e apresentando maior expressão de GITR e CTLA-4. A partir dos 12 meses, até o final do acompanhamento, os valores de sjKREC aumentaram, enquanto que os de Cj permaneceram estáveis, correlacionando com aumento da contagem de células B naïve e Bm2, e resultando em uma menor taxa de divisão de células B. Houve aumento de Bregs de 6 meses a um ano após o TACTH, cujos níveis correlacionaramse com aqueles de sjKREC, e apresentando maior produção de IL-10 mediante estímulo com CPG±CD40L do que antes do transplante. O comprimento telomérico diminuiu aos 6 meses pós-TACTH e correlacionou-se com níveis elevados de células senescentes que expressavam FoxP3, aliado a um aumento de expressão de PD1 pelas células T e redução dos níveis séricos de IL-6, IL-1b e proteína C reativa. Seis pacientes recaíram após o transplante, apresentando menor expressão de FoxP3, GITR e CTLA-4 pelas Tregs, diminuição da contagem de Breg e da diversidade do TCR. Adicionalmente, a remissão clínica foi associada a maior expressão de PD1 por células T e B e baixos níveis séricos de TGF-b, IL-6, IL-1b, IL-17A, MIP-1a, GCSF e IL-12. Portanto, o aumento de células T e B reguladoras geradas de novo pós-TACTH, associado à renovação do repertório de células T, alta expressão de PD1 e baixos níveis séricos de mediadores inflamatórios e prófibróticos, estão relacionadas com a resposta clínica dos pacientes com ES ao transplante. / Autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) is more effective for patients with severe systemic sclerosis (SSc) than conventional immunosuppression (IS). However, the immunological mechanisms associated with the therapeutic efficacy of AHSCT are not fully elucidated. Peripheral blood mononuclear cells and serum/plasma were collected from 31 SSc patients before and semiannually, until 36 months post-transplant, and from 16 nontransplanted SSc patients treated with IS. Thymic function was measured by RT-qPCR quantification of ?- and signal joint (sj)-T-cell receptor excision circles (sjTREC) and intrathymic T-cell division (n) was calculated by the formula: n=LOG(sjTREC/?TREC)/LOG2. Bcell replication history and bone marrow function were assessed by coding-joint (Cj) and sjkappa-deleting recombination excision circles (sjKREC). B-cell divisions in the peripheral blood (N) were calculated by the formula: N=LOG(Cj/sjKREC)/LOG2. CD3+CD4+CD31+CD45RA+ recent thymic emigrants (RTE), CD4+CD25hiFoxP3+ (GITR+/CTLA-4+) regulatory T-cells (Tregs), CD19+CD27-IgD+ naïve B-cells, CD19+CD38lowIgD+ Bm2 B-cells, CD19+CD24hiCD38hi regulatory B-cells (Bregs), CD8+CD28-CD57+ senescent cells and PD1+ exhausted cells were quantified by FACS (fluorescence-activated cell sorting). The T-cell receptor (TCR) was sequenced by New Generation Sequencing and the profile of inflammatory and pro-fibrotic serum cytokines was evaluated by CBA-Flex (cytometric bead-array) and ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). sjTREC and ?TREC values decreased at 6 months post-AHSCT, returning to pretransplant values at 12 months, correlating with RTE counts and associated with higher diversity of the TCR. There was no change in thymocyte division rates. At 12 months postAHSCT, Treg counts increased and correlated with sjTREC values, presenting increased expression of GITR and CTLA-4 when compared to pre-transplant levels. From 12 months until the end of follow-up, sjKREC values increased, while those of Cj remained stable, correlating with increased counts of naïve and Bm2 B-cells, resulting in reduced rate of B-cell division. There was an increase of Breg frequency from 6-months until one-year after AHSCT, correlating with sjKREC values and presenting higher IL-10 production after stimulation with CPG±CD40L than before transplantation. Telomere length decreased at 6 months post-transplant and correlated with elevated levels of FoxP3-expressing senescent cells, together with increased expression of PD1 by T-cells and reduced serum IL-6, IL-1b and C-reactive protein levels. Six patients relapsed after transplantation, presenting lower expression of FoxP3, GITR, CTLA-4 by Tregs, decreased Breg counts and reduced TCR diversity. In addition, clinical remission was associated with increased PD1 expression by T and B cells and low serum levels of TGF-?, IL-6, IL-1, IL-17A, MIP-1, G-CSF and IL-12. Therefore, newly-generated regulatory T and B cells after AHSCT, associated with T-cell repertoire renewal, high PD1 expression and low serum levels of inflammatory and profibrotic mediators associate with clinical outcomes of SSc patients after AHSCT.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da espessura do enxerto e da técnica de dois feixes na estabilidade da reconstrução do ligamento cruzado posterior (LCP) na lesão isolada do mesmo. Para isso foram utilizados nove joelhos de cadáver, onde foram estudadas cinco condições de avaliação: joelho com o LCP e demais ligamentos íntegros (Íntegro), LCP reconstruído com um feixe com enxerto do tendão quadricipital de 10mm de largura (Rec 1), LCP reconstruído com dois feixes com enxerto do tendão quadricipital de 10mm para o feixe ântero-lateral e enxerto duplo do tendão do semitendíneo de sete milímetros de diâmetro para o feixe póstero-medial (Rec 2), LCP reconstruído com um feixe com enxertos do tendão quadricipital de 10mm e do tendão duplo do semitendíneo de sete milímetros (Rec M) e joelho com lesão isolada do LCP (Lesado), sempre nesta ordem. Em cada condição foram avaliados o limite do deslocamento posterior da tíbia (LDPT) e a rigidez ao deslocamento posterior da tíbia ao se aplicar uma força de 134 N em sentido posterior na tíbia. Os ensaios foram realizados em uma máquina eletromecânica com o joelho em extensão, 30, 60 e 90° de flexão. A análise estatística foi realizada com o teste de ANOVA e de comparações múltiplas de Newman-Keuls. Em relação à condição Lesado todas as técnicas de reconstrução (Rec 1, Rec 2 e Rec M) reduziram significativamente o LDPT em todos os ângulos. Em relação à condição Íntegro, o LDPT da técnica Rec 1 foi significativamente maior em todos os ângulos, o LDPT da Rec 2 foi equivalente a 0 e 30° e significativamente maior a 60 e 90° e o LDPT da Rec M foi equivalente a 0, 30 e 60° e significativamente maior a 90°. O LDPT da condição Rec M foi significativamente menor (mais estável) que o da Rec 2 a 60 e 90°. O LDPT das técnicas Rec 2 e Rec M foi significativamente menor que o da condição Rec 1 em todos os ângulos testados. A rigidez de todas as técnicas e em todos os ângulos foi sempre significativamente menor que à do joelho íntegro e equivalente à do lesado. Concluiu-se que na reconstrução do LCP, em sua lesão isolada, o aumento da espessura do enxerto melhora significativamente a estabilidade e que a divisão do enxerto para reconstruir os dois feixes piora a estabilidade da reconstrução a 60 e 90° de flexão do joelho. / The purpose of this study was to evaluate the biomechanical effect of graft thickness and two-bundle technique on posterior cruciate ligament (PCL) reconstruction of nine human cadaveric knees. Five conditions were tested: intact knee, single-bundle reconstruction with a 10mm-quadriceps tendon(Rec 1), two-bundle reconstruction with a 10mm-quadriceps tendon for the anterolateral bundle and a 7-mm doubled semitendinosus tendon for the posteromedial bundle(Rec 2), single-bundle reconstruction with a 10-mm quadriceps tendon plus a 7-mm doubled semitendinosus tendon (Rec M) and PCL-deficient. Posterior tibial translation (PTT) and stiffness to posterior tibial translation were measured in response to a 134-N posterior tibial load at 0, 30, 60 and 90° of knee flexion. All reconstruction techniques reduced posterior tibial translation at all flexion angles when compared with PCL-deficient knees. When compared with the intact knee, PTT of Rec 1 was significantly higher at all angles, PTT of Rec 2 was not significantly different at full extension and 30° of flexion, PTT of Rec M was not significantly different at full extension, 30 and 60° of flexion. Stiffness of all techniques was always significantly lower than the intact knee at all flexion angles. PTT of the Rec 2 and Rec M techniques was always significantly lower (better stability) than the PTT of Rec 1. PTT of Rec M was significantly lower than the PTT of Rec 2 at 60 and 90°. We concluded that graft enlargement improves the reconstruction stability in isolated PCL lesions, whereas the graft division to perform a two-bundle technique worsens this stability at 60 and 90° of knee flexion.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-04-27T14:51:33Z No. of bitstreams: 1 kelliborgesdossantos.pdf: 3267301 bytes, checksum: ebaef8cc5229eeaa466bdd3b3e52d494 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-05-02T01:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kelliborgesdossantos.pdf: 3267301 bytes, checksum: ebaef8cc5229eeaa466bdd3b3e52d494 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-02T01:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kelliborgesdossantos.pdf: 3267301 bytes, checksum: ebaef8cc5229eeaa466bdd3b3e52d494 (MD5) Previous issue date: 2015-11-27 / Introdução: Nas últimas décadas, o transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (auto-TCTH) tem sido utilizado como uma potencial terapia de salvamento para pacientes portadores de linfomas. Atualmente, inúmeros tipos de protocolos de condicionamento para a realização do auto-TCTH são conhecidos e utilizados com a intenção de melhorar a sobrevida global (SG) e livre de doença (SLD) destes pacientes. Até os dias atuais, nenhum protocolo tem sido considerado superior, com melhores resultados que os outros. Objetivo: Determinar a dose máxima de lomustina tolerada em protocolo de condicionamento (lomustina, etoposide, citarabina e melfalan – LEAM) e avaliar as toxicidades deste protocolo em comparação a série histórica do serviço. Método: Trata-se de uma coorte prospectiva, do tipo 3:3, quantitativa. A primeira etapa do estudo foi realizada para a determinação da dose máxima tolerada (DMT) de lomustina. A segunda etapa, consistiu na comparação com a série histórica de pacientes submetidos ao transplante que utilizaram CBV (carmustina, etoposide e ciclofosfamida) previamente ao auto-TCTH. Resultados: Para determinar a dose máxima tolerada (DMT) de lomustina administrada no D-4, seguida de etoposide (1 g/m2 D-3), citarabina (4g/m2 D-2), e melfalano (140 mg/m2 D-1), foram submetidos ao protocolo um total de 14 pacientes. Foi realizado escalonamento da dose de lomustina a cada 200 mg/m2. A coorte inicial consistiu de lomustina na dose de 200 mg/m2 (L200), seguida de uma coorte com lomustina 400 mg/m2 (L400). Como L400 excedeu a DMT, uma terceira coorte foi criada com lomustina 300 mg/m2 (L300). Seis pacientes foram tratados em L200 (1 Toxicidade Limitante de Dose (TLD) – óbito por sepse), dois pacientes foram tratados em L400 (2 TLD, toxicidade gastrointestinal grau 4) e 6 pacientes foram tratados em L300 (1 TLD, neurológica grau 4, reversível), sendo lomustina 300mg/m2 considerada a DMT. Na segunda fase do estudo participaram 32 pacientes submetidos ao protocolo LEAM. As principais toxicidades encontradas entre os pacientes foram mucosite (53,1%), diarreia (68,8%) e toxicidade cutânea (34,4%). A seguir, os pacientes foram comparados a séria histórica, em que 64 pacientes foram submetidos ao protocolo CBV. Os grupos eram similares no que diz respeito ao estádio, diagnóstico médico idade e sexo. O início da neutropenia e o tempo de duração da mesma foi estatisticamente menor no grupo LEAM em comparação ao grupo CBV, p = 0,00 e 0,035 respectivamente. Não houve diferença entre as toxicidades encontradas nos dois grupos, no entanto, a sobrevida global dos pacientes submetidos ao protocolo LEAM foi superior em comparação ao grupo CBV (p = 0,050). Conclusão: O protocolo LEAM mostrou-se como um regime de condicionamento factível, de rápida administração, associado a curto período de neutropenia e aceitável toxicidade. A sobrevida global foi melhor no protocolo LEAM quando comparada a série histórica do serviço. / Introduction: In recent decades, Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation (auto-HSCT) has been used as a potential rescue therapy for patients with lymphoma. Currently, numerous types of conditioning protocols for performing auto-HSCT are known and used in order to improve the overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) of these patients. Until today, no protocol has been considered superior and produced better results than the others. Objective: Determine the maximum tolerated dose of lomustine in a conditioning protocol (lomustine, etoposide, cytarabine and melphalan – LEAM) and evaluate the toxicities of this protocol in comparison to the historical series of the service. Method: A quantitative, type 3.3 prospective cohort. The first step of the study was carried out to determine the maximum tolerated dose (MTD) of lomustine. The second step consisted in comparing it with the historical series of patients undergoing transplantation who used CBV (carmustine, etoposide and cyclophosphamide) prior to auto-HSCT. Results: To determine the maximum tolerated dose (MTD) of lomustine administered on D-4, followed by etoposide (1 g/m2 (D-3), cytarabine (4 g/m2 (D-2), and melphalan (140 mg/m2 (D-1), a total of 14 patients were submitted to the protocol. The lomustine dose was escalated according to 200 mg/m2 intervals. The initial cohort consisted of lomustine at a dose of 200 mg/m2 (L200), followed by a cohort with lomustine 400 mg/m2 (L400). Because L400 exceeded the MTD, a third cohort with lomustine in a dose of 300 mg/m2 was created (L300). Six patients were treated in L200 (1 DLT, died of sepsis), two patients were treated in L400 (2 DLT, grade 4 gastrointestinal toxicity) and 6 patients were treated in L300 (1 DLT, neurological grade 4, reversible), with lomustine 300mg/m2 being considered the MTD. In the second phase of the study, 32 patients submitted to the LEAM protocol participated. The main toxicities found among the patients were mucositis (53.1%), diarrhea (68.8 %) and dermal toxicity (34.4%). The patients were then compared to the historical series, in which 64 patients were submitted to the CBV protocol. The groups were similar with regard to the stage, medical diagnosis, age and sex. The beginning of neutropenia and its duration was statistically lower in the LEAM group when compared to the CBV group, p = 0.00 and 0.035, respectively. There was no difference between the toxicities found in the two groups, but the overall survival of the patients submitted to the LEAM protocol was higher when compared to the CBV group (p = 0.050). Conclusion: The LEAM protocol proved to be a viable conditioning regimen of rapid administration, associated with a short duration of neutropenia and acceptable toxicity. Overall survival was better in the LEAM protocol when compared to the historical series of the service.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-08-03T15:27:59Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-28T13:54:44Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-08-28T13:54:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2018-04-08 / Introdução: O uso de células progenitoras hematopoéticas mobilizadas no sangue periférico tornaram-se a fonte preferencial para transplante autólogo. Alguns fatores podem afetar a mobilização de células CD34+ no transplante autólogo de células progenitoras hematopoéticas (TACPH). Este estudo teve como objetivo avaliar a influência desses fatores e correlacionar com a contagem de células CD34+ pré-aférese. Método: Estudo prospectivo que envolveu a avaliação de pacientes submetidos a mobilização de células progenitoras hematopoéticas com fator de crescimento de granulócitos (G-CSF) para realizar o transplante autólogo. Foi realizada quantificação de células CD34+ no sangue periférico pré-aférese e no produto final. Foi determinado a quantidade de células CD34+ relacionada com menor número de coletas para se obter o valor necessário para a realização do transplante, além da associação com os dados clínicos e laboratoriais. Resultados: Do total de 34 pacientes, 85% tinham mais que 20.000 leucócitos/μl. Dos pacientes que apresentaram falha na mobilização, 100% apresentaram leucometria inferior a 20.000 leucócitos/μl. Houve diferença estatisticamente significativa na associação entre o CD34+ pré-aférese e as variáveis idade (p=0,025), leucometria (p<0,001) e células mononucleares (p=0,001) do sangue periférico. O CD34+ ≥ 14 células/μl pré-aférese teve relação com um melhor rendimento dessas células no produto final e com a necessidade de apenas uma coleta para se obter a quantidade necessária para realizar o TACPH. Conclusão: Esse estudo demonstra que a contagem de células CD34+ relacionada com a idade e a leucometria pré-aférese do paciente, foi o único fator associado estatisticamente com o número de coletas e com rendimento do produto final. / Introduction: The use of hematopoietic progenitor cells mobilized in the peripheral blood became the preferred source for autologous transplantation Some factors may affect the mobilization of CD34+ cells in autologous transplantation of hematopoietic progenitor cell (ATHPC). This study aimed to evaluate the influence of these factors and to correlate with the pre-apheresis CD34+ cell count. Method: This is a prospective study evaluating 34 patients submitted to the mobilization of hematopoietic progenitor cells with granulocyte growth factor (G-CSF). Quantification of CD34+ cells in the peripheral blood pre-apheresis and in the final product of the apheresis was performed. The amount of CD34+ cells related to fewer collections was determined to obtain the value needed for the transplantation, in addition to the association with clinical and laboratory data. Results: Out of the 34 patients, 85% had more than 20,000 leukocytes / μl. Of the patients who presented failure during mobilization, all presented < 20,000 leukocytes / μl. There was a statistically significant difference in the association between pre-apheresis CD34+ and the variables age (p = 0.025), leukocyte count (p <0.001) and mononuclear cells (p = 0.001) in peripheral blood. Pre-apheresis CD34+ ≥14 cells/μl was related to better yield of these cells in the final product and with the need for only one collection to obtain the minimum cumulative yield of 2 x 106 CD34+/Kg. Conclusion: This study demonstrates that the age-related CD34+ cell count and patient pre-apheresis leukocyte count was the only factor statistically associated with the number of collections and yield of the final product.

Orientador: Simone dos Santos Aguiar / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:24:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eid_KatiaAparecidadeBrito_D.pdf: 1187431 bytes, checksum: e62e4911ad1d92b3213551ba2a1b41a7 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Introdução: As células progenitoras periféricas hematopoiéticas (CPHP) é uma das alternativas de enxerto para a realização de transplante autólogo em crianças, adolescente e adulto jovem portadores de tumores sólidos e linfomas. Na mobilização, a dose clássica de G-CSF é 10µg/kg/peso do paciente SC em dose única. Acredita-se que doses maiores de G-CSF aplicadas duas vezes ao dia aumentariam o número de CD34+ coletadas com o menor número de leucaféreses. A tecnologia atual permite que seja realizado leucaférese em crianças com baixo peso (<10 kg). Objetivo: o mote do estudo foi avaliar se o G-CSF na dose de 15µg/kg peso do paciente ao dia e fracionado em duas doses, 10µg/kg e 5µg/kg, diminuiria o número de leucaférese realizada para atingir o mínimo de 3x106/kg/peso do paciente de CD34+ quando comparada com G-CSF na dose convencional, 10µg/kg/peso do paciente em dose única. Métodos: Os pacientes foram divididos em dois grupos. Grupo 10 formado por pacientes que receberam G-CSF 10µg/kg/peso SC ao dia em dose única às 6h e grupo 15 formado por pacientes que receberam G-CSF 15µg/kg/peso SC ao dia dividido em duas vezes, 10µg/kg SC às 6h e 5µg/kg SC às 18h. As leucaféreses foram realizadas em um separador celular automático de fluxo contínuo com anticoagulante ACD-A, foram processados 4 volemias em cada leucaférese. Pacientes com < 20 kg receberam priming de concentrado de hemácias filtradas e irradiadas (CHFI) durante as leucaféreses. A realização do transplante autólogo ocorreu com o número mínimo de 3x106/kg/peso de CD34+. Resultados: Sessenta e cincos pacientes portadores de tumores sólidos e linfomas foram avaliados, 39 pacientes receberam 10µg/kg/peso SC ao dia em dose única às 6h de G-CSF e 26 pacientes receberam 10µg/kg SC às 6h e 5µg/kg SC às 18h de G-CSF. Foram realizadas 146 leucaféreses, 110 (75,3%) no grupo 10 e 36 (24,7%) leucaféreses no grupo 15. No grupo 10 foi obtido uma mediana de 3 (1-7) leucaféreses e coletado uma média de 8,89x106/kg (± 9,59) de CD34+, o grupo 15 realizou uma mediana de 1 (1-3) leucaféreses e coletado uma média de 5,29x106/kg (± 4,95) de CD34+. Uma diferença estatística importante foi o número de leucaféreses (p<0,0001). Nenhum paciente apresentou intercorrências durante as leucaféreses. Os pacientes que receberam CHFI (<20 kg) não apresentaram hipovolemia nas leucaféreses realizadas. Conclusão: Para coletar o mínimo de 3x106/kg/peso de CD34+, a aplicação de G-CSF 15µg/kg/peso fracionada diminuiu significativamente o número de leucaférese realizada / Abstract: Introduction: The peripheral hematopoietic progenitor cells are a graft choice for performing autologous transplantation. In the mobilization, the classical dose of G-CSF is 10?g/kg of the patient in a single dose. There is a theory that higher doses of G-CSF applied twice daily could increase the number of collected CD34+ cells with a smallest number of leukapheresis. Objective: The aim of this study is to evaluate if a fractionated-dose of G-CSF at 15?g/kg of patient may reduce the number of leukapheresis for achieving the minimum target of 3 x 106/kg of CD34+ cells as compared to conventional dose of G-CSF. Methods: Patients were divided into two groups. Group 10: patients who received a single dose daily of G-CSF 10?g/kg and Group 15: patients who received twice dose daily of G-CSF 15?g/kg. The leukapheresis were processed in an automated cell separator. The autologous transplantation happened when the minimum number of 3x106/kg CD34+ was reached. Results: Group 10 enrolled 39 patients who received 10?g/kg of G-CSF and group 15 had 26 patients who received 15?g/kg fractionated of G-CSF. There were a total of 146 aphaeresis; 110 (75.3%) in group 10 and 36 (24.7%) group 15. Group 10 collected a median of 3 (1-7) leukapheresis and a mean of 8.89 x106/kg (± 9.59) CD34+, whereas group 15 had a median of 1 (1-3) leukapheresis and collected a mean of 5.29 x106/kg (± 4.95). The relevant difference statistic was the number of aphaeresis (p<0.0001). Conclusion: To collect a minimum target of 3x106/kg of CD34 +, the application of fractionated-dose of 15?g/kg G-CSF decreased significantly the number of leukapheresis performed / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutora em Ciências

Introdução: Modelos experimentais em suíno são essenciais para pesquisa e treinamento em transplante de fígado. No entanto, este animal apresenta instabilidade hemodinâmica grave durante a fase anepática, exigindo um curto período anepático (não apropriado para fins de treinamento) ou o uso de circulação extracorpórea (que está associado a significativas complicações intra-operatórias). Além disso, a maioria dos modelos em suíno é alogênico, o que não é nem eticamente nem economicamente adequado para treinamento cirúrgico. Objetivo: Desenvolver e testar um modelo de autotransplante hepático em suínos sem o uso de circulação extracorpórea. Métodos: Onze porcos da raça Sus domesticus foram submetidos a cirurgia simulada (SHAM; n = 3) ou autotransplante de fígado (grupo experimental (GE); n = 8) sem o uso de circulação extracorpórea. Após a realização de uma incisão em \"J\", o hilo hepático foi inteiramente dissecado abaixo do nível da artéria gastroduodenal e o fígado completamente mobilizado. A aorta supracelíaca foi então dissecada através do pilar esquerdo do diafragma. Nenhuma outra etapa foi realizada no grupo SHAM. No GE, a partir de então, procedeu-se o autotransplante ortotópico de fígado empregando-se a técnica convencional com duas anastomoses de veia cava, semelhante à técnica clássica utilizada na prática clínica. Durante a fase anepática, foi utilizando o clampeamento da aorta supracelíaca a fim de manter a estabilidade hemodinâmica e evitar o uso do by-pass. Os animais foram submetidos a eutanásia 1h após o término do procedimento cirúrgico. Parâmetros hemodinâmicos e exames laboratoriais foram sistematicamente coletados em 4 tempos distintos: basal, pré-reperfusão, 5min após reperfusão e ao término do experimento. Foi realizada a análise histopatológica do enxerto após a reperfusão. A análise estatística foi feita comparando amostras relacionadas, no GE, e duas amostras independentes, entre os grupos. Resultados: Empregando a técnica por nós padronizada, obteve-se 100% de sobrevida dos animais, todos estáveis hemodinamicamente. Os tempos médios de observação pós-reperfusão e anepático foram de 136±12,50min e 47,88±8,03min, respectivamente. Não houve diferença estatística na pressão arterial média (PAM) entre o início e término do experimento no GE, nem entre os grupos durante a fase anepática. Ao término do experimento, a PAM foi significantemente maior no grupo SHAM quando comparado ao GE. A análise comparativa dos exames laboratoriais entre os grupos demonstrou que o pH, o bicarbonato e o base excess foram significantemente inferiores no GE 5min após a reperfusão e ao término do experimento. O lactato mostrou-se ser significantemente inferior ao término do experimento no grupo SHAM. Conclusão: De acordo com os métodos utilizados no presente estudo, desenvolveu-se um modelo de autotransplante de fígado em suínos sem a utilização de mecanismo de circulação extracorpórea. Para tanto, utilizou-se o clampeamento da aorta supracelíaca durante o período anepático. O modelo proposto é factível por cirurgiões em treinamento e com baixa mortalidade / Background: Experimental swine models have been essential for liver transplantation research and training. However, it experiences severe hemodynamic instability during the anhepatic phase, requiring either a short anhepatic phase (not appropriate for training purposes) or an extracorporeal circulation (which is linked to significant intraoperative complications). Furthermore, most of swine models are allograft ones, which is neither ethically nor financially suitable for surgical training. Objective: To develop and test a liver autotransplantation model in pig without venovenous bypass. Methods: Eleven Sus domesticus pigs underwent either sham surgery (SHAM group; n=3) or liver autotransplantation without venovenous bypass (experimental group (GE); n=8) by resident or fellow from Digestive Organs Transplant Division. After performing a rightsided J-shaped incision, hepatic hilum was entirely dissected under the level of the gastroduodenal artery and liver completely mobilized. Supraceliac aorta was then dissected through the diaphragm\'s left crus. No further step was performed in SHAM group. In the GE, thereafter, a liver autotransplantation was performed applying conventional bicaval anastomosis technique, similar to the classic technique used in clinical setting. During anhepatic phase, supraceliac aorta cross-clamping maneuver was carried out to sustain hemodynamic stability and avoid venovenous bypass. Animals underwent euthanasia one hour after the end of surgical procedure. Hemodynamic variables and blood samples were systematically collected at 4 different times: baseline, pre-reperfusion, 5min after reperfusion and at the end of experiment. Histological analysis of the graft was performed after reperfusion. Statistical analysis was accomplished comparing related samples in the GE and two independent samples between groups. Results: Applying the technique standardized by us, 100% survival was accomplished, all the animals hemodynamically stable. The mean post-reperfusion observation and anhepatic phase times were 136 ± 12.50 min and 48.38 ± 7.80 min, respectively. There was no statistical difference in mean arterial pressure (MAP) between baseline and the end of the experiment time in the GE, nor between the groups during the anhepatic phase. At the end of the experiment, MAP was significantly higher in the SHAM group compared to the experiment group. Blood samples statistical analysis between groups showed that pH, bicarbonate and base excess were significantly lower at 5 min post-reperfusion time and at the end of the experiment in the GE. The lactate was shown to be significantly lower in the SHAM group at the end of the experiment. Conclusion: According to the methods applied in the present study, a model of liver autotransplantation in swine was developed without the use of an extracorporeal circulation mechanism. For this purpose, supraceliac aortic cross-clamping maneuver was carried out during the anhepatic phase. The advocated model is feasible for training purpose with low mortality

O diabetes mellitus do tipo 1 (T1D) é uma doença autoimune mediada por células T e caracterizada pela destruição seletiva das células ? pancreáticas produtoras de insulina. Células estromais mesenquimais (MSCs) e células tronco hematopoéticas (HSCs) são os principais componentes do nicho hematopoético na medula óssea. Estas células vêm sendo utilizadas nos últimos anos em transplantes autólogos para tratamento do T1D. O objetivo geral do presente trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica global de MSCs e HSCs de pacientes com T1D e compará-lo com células isoladas de indivíduos saudáveis através da técnica de microarray e programas específicos de bioinformática. As MSCs e HSCs foram isoladas da medula óssea de pacientes com T1D antes e após o tratamento com imunossupressão em altas doses seguida pelo transplante autólogo de células tronco hematopoéticas (AHSCT). As MSCs apresentaram valor elevado de expressão absoluta de diversas moléculas potencialmente relacionadas com suas funções de suporte à hematopoese. MSCs de pacientes diabéticos apresentaram perfil de expressão gênica global distinto das isoladas de indivíduos saudáveis, com hiper-regulação da sinalização via proteína G e hiporregulação da atividade transcricional. O receptor ?3 adrenérgico, assim como a sinalização simpática, foram hiper-expressos nas células dos pacientes. Genes que codificam moléculas que suportam a hematopoese e regulados pelo sistema nervoso simpático, VCAM1 e CXCL12, foram hiporregulados em nossa análise. Após o AHSCT, houve atenuação do perfil de expressão diferencial das MSCs dos pacientes, entretanto elas permaneceram com hiperatividade da sinalização via proteína G e déficit da atividade transcricional. As HSCs apresentaram altos níveis de expressão absoluta de diversas integrinas e receptores de citocinas e fatores de crescimento, potencialmente relacionados com funções na hematopoese. HSCs de pacientes com T1D apresentaram perfil de expressão gênica global distinto das de indivíduos saudáveis, com hiper-regulação de genes associados com a atividade transcricional. Os fatores de transcrição TCFL2 e p53, que têm papel fundamental na regulação do ciclo celular das HSCs, foram diferencialmente expressos entre as HSCs de pacientes diabéticos e controles. Assim, nossos resultados de expressão gênica global apontaram alterações intrínsecas nas HSCs e MSCs de pacientes diabéticos que podem estar relacionadas com a falha terapêutica dos transplantes autólogos. A implicação dessas alterações no desenvolvimento e patogênese do T1D permanece desconhecida e a realização de ensaios funcionais poderá esclarecer o significado biológico das mesmas. / Type 1 diabetes mellitus (T1D) is a T cell-mediated autoimmune disease, characterized by selective destruction of insulin-producing pancreatic ? cells. Mesenchymal stromal cells (MSCs) and hematopoietic stem cells (HSCs) are the main components of hematopoietic niches. In the last years, these cells are being used in autologous transplantation settings for T1D treatment. The main goal of this study was to evaluate the global gene expression profile of MSCs and HSCs from T1D patients, by using microarrays and bioinformatics specific programs. MSCs and HSCs were isolated from bone marrow of T1D patients before and after treatment with high dose immunossupression followed by hematopoietic stem cell transplantation. MSCs showed high absolute expression values of several molecules potentially related to their function of hematopoiesis support. MSCs from T1D patients exhibited distinct gene expression profile from control MSCs and presented up-regulation of the G protein-coupled receptor signaling pathway and down-regulation of transcriptional activity. The ?3 adrenergic receptor, as well the sympathetic nervous system signaling were up-regulated on patient´s cells. Genes that codify molecules which support hematopoeisis and are regulated by the symphatic nervous system, VCAM1 and CXCL12, were downregulated on our analysis. After AHSCT, there was an attenuation of the differential expression profile of MSCs from T1D patients, however they remained with G proteincoupled receptor signaling pathway hyperactivity and transcriptional activity deficit. HSCs exhibited high absolute expression values of integrins, cytokine receptors and growth factors, molecules potencially related to hematopoietic functions. HSCs from T1D patients showed distinct expression profile from control HSCs and demonstrated up-regulation of genes related to transcriptional activity. The transcription factors TCFL2 and p53, which have important role in regulating HSC cycle, were differentially expressed between HSCs from T1D patients and controls. Thus, our global gene expression analysis has revealed intrinsic alterations on MSCs and HSCs from T1D patients that could be related to the autologous transplant therapeutic failures. The implications of these alterations on the development and pathogenesis of T1D remain unknown and functional assays could unravel their biological meaning.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM-1) é uma doença autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva das células pancreáticas produtoras de insulina. A imunossupressão em altas doses seguida do transplante autólogo de células-tronco hematopoéticas (TACTH) constitui uma alternativa terapêutica recente e promissora para o DM-1 recém-diagnosticado, impedindo a progressão da destruição das células pancreáticas produtoras de insulina e induzindo independência insulínica por um período prolongado na maioria dos pacientes. O princípio dessa terapia baseia-se na eliminação das células autorreativas pela imunossupressão intensa e na reconstituição de um sistema imunológico novo e tolerante após o transplante. Com o objetivo de avaliar a função do timo e sua contribuição na geração do repertório de células T nos pacientes com DM-1 após o TACTH, nesse trabalho foram avaliados os níveis de T cell receptor excision circles (TRECs) em células T do sangue periférico e a diversidade do repertório de células T dos pacientes com DM-1 (n=23) antes e em diversos períodos após o transplante. A quantificação absoluta dos níveis de TRECs (número de moléculas de TRECs/100g de DNA) foi realizada pela técnica de PCR em tempo real e a avaliação do repertório de células T foi realizada pela técnica de TCRBV CDR3 Spectratyping. Dentre os vinte e três pacientes, vinte alcançaram a independência insulínica por períodos variáveis de tempo e três não responderam ao tratamento. Não foi observada a restrição do repertório de células T nos pacientes com DM-1 no período pré-transplante, ou seja, quando recém-diagnosticados. Foram identificadas cinco famílias V (7, 18, 19, 20 e 22) em expansão clonal nos pacientes com DM-1. As famílias V 7, 18, 19, 20 apresentaram-se em expansão clonal antes do transplante e se mantiveram com frequência elevada após o transplante, enquanto a família V 22 apresentou aumento da frequência somente nos períodos mais tardios após o transplante. Nos primeiros meses após o transplante, houve redução do número de moléculas de TRECs e restrição do repertório de células T. Contudo, um ano após o transplante, o número de moléculas de TRECs atingiram valores normais e o repertório de células T apresentou-se com ampla diversidade. Nossos resultados mostraram que o TACTH foi capaz de induzir mudanças na composição do repertório de células T dos pacientes com DM-1 após a terapia de IAD/TACTH, evidenciadas por alterações qualitativas e quantitativas dos picos de CDR3 do TCR, sugerindo a reconstituição de um repertório de células T diverso até dois anos pós-transplante. Embora tenha ocorrido reativação da função tímica após o transplante, evidenciada pelo aumento dos níveis de TRECs de um ano e meio a cinco anos pós-transplante, a diversidade do repertório das células T diminuiu a partir de dois anos e meio pós-transplante, sugerindo uma reconstituição tímica de novo de células T naive que expressam preferencialmente algumas cadeias V. Estas evidências imunológicas poderiam explicar a melhora clínica (independência insulínica) temporária observada na maioria dos pacientes após a terapia de IAD/TACTH. / Type 1 diabetes mellitus (T1D) is an organ-specific autoimmune disease characterized by insulin-producing pancreatic cell destruction. High-dose immunosuppression followed by autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) is a recent and promising therapeutic approach for treatment of T1D, preventing the progress of destruction of pancreatic cells and inducing insulin independence for a prolonged period in most patients. The rationale of the AHSCT is based on the elimination of autoreactive cells by the intense immunosuppression and on the reconstitution of a new and tolerant immune system after transplantation. Aiming at assessing the thymic role in the production of new T cell repertoire in T1D patients after AHSCT, in this study was evaluated the levels of T cell receptor excision circles (TRECs) in T cells of peripheral blood as well as the clonality and diversity of T cell repertoire in T1D patients (n=23) before and several periods after transplantation. The absolute quantification of TRECs levels (number of molecules of TRECs/100ng of DNA) was performed by real-time PCR and the analysis of T cell repertoire was performed by TCRBV CDR3 Spectratyping. Among the twenty-three patients, twenty achieved insulin independence for variable periods and three did not respond to the treatment. The T cell repertoire in T1D patients was not restricted in pre-transplantation, i.e., when newly diagnosed. It was identified five V families (7, 18, 19, 20 e 22) in the clonal expansion in T1D patients. The V families 7, 18, 19, 20 were in clonal expansion before transplantation and maintained with high frequency after transplantation, whereas the V 22 family increased its frequency only in the later periods after transplantation. It was observed that the numbers of molecules of TRECs decreased and the T cell repertoire was restricted in the early months after transplantation. However, the levels of TRECs were normalized and the T cell repertoire showed diversity one year after transplantation. Our results indicate that AHSCT was able to induce changes in the composition of the T cell repertoire of patients after AHSCT, evidenced by qualitative and quantitative changes in the composition of T-cell receptor -chain CDR3 peaks, suggesting the reconstitution of diverse T cell repertoire up to two years after transplantation. Although there was reactivation of thymic function after transplantation, as evidenced by increased levels of TRECs from one and a half year to five years after transplantation, the diversity of the T cells repertoire decreased from two and a half years after transplantation, suggesting a reconstruction of new naive T cells that preferentially express some V chains. These immunological evidences could explain the temporary clinical improvement (insulin independence) observed in most patients after IAD / AHSCT therapy.

Para avaliar a eficácia do método de pré-degeneração em nervos ciáticos de ratos durante diferentes intervalos de tempo, foram realizados estudos histomorfométricos de cortes laminares obtidos ao nível do enxerto e no segmento distal do nervo receptor. Os resultados foram comparados com a técnica convencional de enxertia nervosa. Verificou-se que o tempo de pré-degeneração interfere na regeneração de novos axônios e que o período mais adequado para sua utilização situou-se ao redor de 2 semanas no modelo experimental adotado / In order to evaluate the efficacy of a predegeneration method in rat sciatic nerves during different periods of time, histomorphometric studies were performed at the graft and distal segment sites of the recipient nerves. The results were compared with the conventional nerve grafting technique. It was shown that the period of predegeneration interfered in the regeneration of new axons and the most favorable time for its use is around 2 weeks, in this experimental model

Introdução: Este estudo tem o objetivo principal comparar os efeitos da crioterapia com enxerto ósseo e a crioterapia sem enxerto ósseo associada à cirurgia de enucleação e curetagem de lesões ósseas benignas da mandíbula, quanto à porcentagem de osso absorvido 6 meses após o procedimento cirúrgico. Os objetivos secundários são comparar os índices mandibulares panorâmicos nos dois momentos de avaliação e entre procedimentos utilizados; e, comparar os dois procedimentos quanto às proporções de complicações pós-operatórias. Métodos: Este estudo prospectivo foi realizado entre período de outubro de 2002 a dezembro de 2003, no Departamento de Odontologia do Hospital Amaral Carvalho, em pacientes adultos provenientes da região do Estado de São Paulo. Para tanto, 20 pacientes com lesões ósseas mandibulares benignas, com padrão de crescimento agressivos e expansivos, e, dimensões com intervalo de 25mm a 100mm em seu maior diâmetro, foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos, de 10 pacientes cada. Selecionamos para este estudo o ameloblastoma, o queratocisto odontogênico e o mixoma odontogênico devido às características clinicas e radiográficas serem semelhantes, e, o prognóstico das lesões serem bons mediante aos tratamentos propostos. Todos foram submetidos a tratamentos conservadores, através da enucleação e curetagem associada à crioterapia com nitrogênio líquido, na forma de spray, com 3 ciclos de um minuto de congelamento e intervalo de 5 minutos entre cada ciclo. O Grupo B - estudo recebeu enxerto ósseo autógeno imediato sobre as paredes ósseas remanescentes e o Grupo A - controle não recebeu. As áreas doadoras foram o mento e o ramo mandibular, ou a crista ilíaca, conforme as dimensões da lesão. O osso foi homogeneizado em particulador ósseo, para remover a variável de reabsorção. A avaliação radiográfica foi realizada em todos os pacientes através da radiografia panorâmica, no intervalo pré-operatório e pósoperatório de 6 meses. As medidas foram aferidas através do paquímetro eletrônico digital da LYMAN®. Segundo o método de Wical e Swoope (1974), foram identificados os indicadores de massa óssea mandibular para avaliar a Porcentagem de Osso Absorvido (%OA), e, segundo Benson et al., 1991, o Índice Panorâmico Mandibular (PMI). Resultados: A distribuição do tipo de lesão por grupo de tratamento foi equivalente, e a taxa entre os grupos foi de 65% ameloblastoma, 20% queratocisto odontogênico e 15% o mixoma odontogênico. O local da lesão com maior incidência foi de corpo e ramo mandibular com 85% entre grupos. A distribuição do gênero foi de 70% feminino no Grupo A e 70% masculino no Grupo B, no total de 50% para cada gênero entre grupos. A idade média entre os grupos foi de 28,25 anos, sendo a mediana de 29,50 anos Grupo B e 19 anos Grupo A. O valor médio da área da lesão avaliado foi de 1984,19mm2 Grupo A e 1035,59mm2 Grupo B. A porcentagem média de osso absorvido por grupo de tratamento 6 meses após a cirurgia foi de 52,94% no Grupo A e 21,70% Grupo B. Portanto, a altura óssea alveolar residual foi de 79,30% do nível préoperatório no grupo enxertado e 47,06% do nível pré-operatório no grupo não enxertado. As mudanças do Índice Mandibular Panorâmico ao longo dos momentos de avaliação foram similares nos dois grupos, não ocorrendo interação momento*grupo (p = 0,7684). O Grupo A mostrou complicações pós-operatórias com taxa de 30% para fratura patológica, 40% seqüestro ósseo e 30% infecção, em contrapartida não ocorreram no Grupo B. Entretanto, no Grupo A ocorreu 60% parestesia e 80% deiscência, enquanto o Grupo B mostrou em 80% e 40% dos casos. A taxa de recidiva e edema foi de 10% e 40% em ambos os grupos. Conclusões: O grupo tratado através da crioterapia com enxerto ósseo particulado tende a ter menos fratura patológica, seqüestro ósseo, infecção e deiscência, e maior altura óssea alveolar residual do que o grupo tratado pela crioterapia sem enxerto / Introduction: This study has the main objective to compare the effects of the cryotherapy with bone grafting and the cryotherapy without bone grafting associated to the enucleation surgery and curettage of benign bone mandibular lesions, with relationship to the bone percentage absorbed 6 months after the surgical procedure. The secondary objectives are to compare the panoramic mandibular index at the two moments of evaluation and between used procedures; and, to compare the two procedures concerning the proportions of postoperative complications. Methods: This prospective study was accomplished between October, 2002 and December, 2003, in the Department of Dentistry of the Hospital Amaral Carvalho, in adult patients in the area of the State of São Paulo. Twenty patients with benign mandibular bone lesions with aggressive and expansible growth pattern, and, dimensions with interval between 25mm and 100mm in its largest diameter, randomly were distributed in two groups, of 10 patients each. We selected for this study the ameloblastoma, the odontogenic keratocyst and the myxoma due to the clinical and radiographics characteristics are similar, and, the prognostic of lesions are good to the proposed treatments. All lesions after receiving enucleation and curettage were treated by liquid nitrogen cryotherapy in the form of a spray, with 3 freeze cycles of 1-minute freeze followed by a 5-minute thaw between each cycle. The Group B - study received immediate cancellous bone grafting on the residual bone walls and the Group A - control didn\'t receive. The graft donor sites were symphysis mandibulae, branch mandibulae and the iliac crest, according to the dimensions of the lesion. The bone was homogenized in bone crusher to remove the reabsorption variable. The radiographic evaluation was accomplished in all the patients through the panoramic radiograph, in the preoperative and postoperative interval of 6 months. The measures were confronted through the electronic digital caliper LYMAN®. According to the method of Wical and Swoope (1974), were identified the indicators of mandibular bone mass to evaluate the Percentage of Bone Height Remaining, and, according to Benson et al., 1991, the Panoramic Index Mandibular (PMI). Results: The distribution of the lesion type for treatment group was equivalent, and the rate between the groups was of 65% in ameloblastoma, 20% odontogenic keratocyst and 15% the odontogenic myxoma. The site of the lesion with larger incidence was of body and branch mandibular with 85% between groups. The distribution of the gender was of 70% feminine in the Group A and 70% masculine in the Group B, in the total of 50% for each gender between groups. The average age between the groups was of 28,25 years old, being the medium of 29,50 years old Group B and 19 years old in the Group A. The medium value of the area of the lesion was of 1984,19 mm2 Group A and 1035,59 mm2 Group B. The average percentage of bone absorbed by treatment group six months after the surgery was of 52,94% in the Group A and 21,70% in the Group B. Therefore, the residual alveolar bone height was of 79,30% on the preoperative level in the grafted group and 47,06% on the preoperative level in the no grafted group . The changes of the Panoramic Mandibular Index along the moments of evaluation were similar in the two groups, not showing interaction moment*group (p = 0, 7684). The Group A presented postoperative complications with rate of 30% for pathologic fracture, 40% bone sequestra and 30% infection, whereas it did not happen in the Group B. However, Group A showed 60% paresis 80% wound dehiscence while in the Group B it was observed in 80% and 40% of cases. An evaluation of the recurrences and swelling was of 10% and 40% in both groups. Conclusions: The treated group through the cryotherapy with cancellous bone grafting showed to have less pathologic fracture, bone sequestra, infection and wound dehiscence and result in greater residual alveolar bone height than the group treated by the cryotherapy without bone grafting.