Orientador: Joyce Maria Anichino-Baizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:05:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alessio_AlineMorandi_D.pdf: 8973520 bytes, checksum: 3a7a6ff893220f5bdd3d1d52da276f91 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As células endoteliais participam da hemostasia com efeitos pró e antitrombóticos, que podem ser estimulados por uma lesão endotelial. A presença de células endoteliais na circulação pode ser considerada um novo marcador de integridade vascular, como já descrito em várias patologias tais como: doenças cardiovasculares, doenças infecciosas, doenças imunes, transplantes, anemia falciforme. Os objetivos do nosso estudo foram: padronizar a identificação e quantificação das células endoteliais circulantes (CECs) e das células endoteliais progenitoras (CEPs) em um grupo de pacientes com trombose venosa profunda (TVP) ao diagnóstico (aguda, 1ª coleta) e após no mínimo 6 meses (2ª coleta), em um grupo de TVP crônica e em um grupo controle; padronizar um modelo animal de TVP induzida por lesão endotelial para avaliar as CECs e CEPs no sangue periférico e no trombo venoso. O grupo de TVP aguda foi composto por 9 pacientes [F: 7; M: 2; 45 anos (26 - 54 anos)], sendo recrutados 6 indivíduos para uma 2ª coleta [F: 5; M: 1; 47,5 anos (27 - 55 anos)], no grupo de TVP crônica foram incluídos 10 pacientes [F: 6; M: 4; 44,5 anos (28 - 56 anos)] e no grupo controle 11 voluntários [F: 9; M: 2; 29 anos (21 - 52 anos)]. A identificação das CECs e CEPs no sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. No modelo animal, a TVP foi induzida por lesão endotelial com uma solução de FeCl3 a 15%. Após a indução da TVP as CECs e CEPs foram avaliadas no sangue periférico nos tempos: 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 24 horas, 48 horas e 72 horas. O trombo venoso formado na veia cava inferior (VCI) foi avaliado pela coloração de Verhoff van Gienson e a presença de CECs e CEPs por imunofluorescência. Houve uma diferença estatística no número das CECs (P=0.001, CD31+CD144+CD45dimCD133-; P<0.001, CD31+CD146+CD45dimCD133-; P=0.002, CD31+VEGFR2+CD45dimCD133-) entre os grupos estudados, com um aumento importante nos pacientes com TVP aguda. Os grupos de TVP crônica e TVP 2ª coleta mostraram um aumento significativo de CECs em relação aos controles. Não houve diferença estatística no número das CEPs (CD34+VEGFR2+CD45dimCD133-) entre os grupos estudados, porém observou-se um aumento no grupo de TVP aguda. No modelo animal, a oclusão total da VCI foi verificada entre 15 minutos e 1 hora. Após 24 horas ocorreu uma diminuição progressiva da área do trombo formado [85,4% (24h); 65,4% (48h); 51,3% (72h)], e não foram observadas CECs e CEPs no mesmo. No sangue periférico, no tempo de 48 horas houve um aumento importante de CECs e CEPs quando comparado com os outros tempos estudados (P=0.001, Sca1-VEGFR2+CD45dim; P=0.004, CD34-VEGFR2+CD45dim; P<0.001,Sca1+VEGFR2+CD45dim; P<0.001, CD34+VEGFR2+CD45dim). Os resultados observados em camundongos e humanos sugerem que as CEPs podem ser recrutadas da medula óssea para a circulação, participando do processo de reparo endotelial. O aumento de CECs na fase em que se inicia o processo de recanalização no modelo animal, sugere que apesar da lesão endotelial inicial, as mesmas somente são liberadas quando o fluxo começa a ser restabelecido. Neste estudo concluímos que as CECs podem constituir um marcador de dano vascular. / Abstract: Endothelial cells participate in hemostasia and have pro and anti -thrombotic effects which can be stimulated by an endothelial lesion. The presence of endothelial cells in circulation can be considered a novel marker of vascular integrity, as described in several pathologies, such as: cardiovascular disease, infectious disease, immune diseases, transplants, and sickle cell anemia. The aims of our study were to: standardize the identification and quantification of circulating endothelial cells (CECs) and progenitor endothelial cells (EPCs) in a group of patients with Deep Vein Thrombosis (DVT) at diagnosis (acute, 1st collection) and after a minimum of six months (2nd collection), in a group with chronic DVT and in a control group; standardize an animal model with DVT induced by endothelial lesion in order to evaluate CECs and EPCs in peripheral blood and in venous thrombosis. The group of DVT was composed of 9 patients [F: 7; M: 2; 45 years old (y.o.) (26 - 54 y.o.)], of which six individuals were recruited for the 2nd collection [F: 5; M: 1; 47.5 y.o. (27 - 55 y.o.)]; in the chronic DVT group 10 patients were included [F: 6; M: 4; 44.5 y.o. (28 - 56 y.o.)]; and in the control group 11 volunteers were included [F: 9; M: 2; 29 y.o. (21 - 52 y.o.)]. The identification of CECs and EPCs in peripheral blood was carried out by flow cytometry. DVT was induced in the animal model by endothelial lesion using a FeCl3 solution at 15%. After DVT induction, CECs and EPCs were evaluated in peripheral blood at: 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 24 hours, 48 hours and 72 hours. The venous thrombus formed in the inferior cava vein (ICV) was evaluated using Verhoff van Gienson stain and the presence of CECs and EPCs was evaluated using immunofluorescence. There was a statistical difference in the number of CECs (P=0.001, CD31+CD144+CD45dimCD133-; P<0.001, CD31+CD146+CD45dimCD133-; P=0.002, CD31+VEGFR2+CD45dimCD133-) between the groups studied, with a significant increase in acute DVT patients. The chronic DVT and 2nd collection DVT groups demonstrated a significant increase in CECs in relation to the controls. There was no statistical difference in the number of EPCs (CD34+VEGFR2+CD45dimCD133-) among the groups studied, however an increase in the acute DVT group was observed. In the animal model, total ICV occlusion was observed between 15 minutes and 1 hour. After 24 hours a progressive decrease in the area of the formed thrombus occurred [85.4% (24h); 65.4% (48h); 51.3% (72h)], and no CECs or CEPs were observed. After 48hours, there was a significant increase in CECs and EPCs in peripheral blood when compared to other periods studied (P=0.001, Sca1-VEGFR2+ CD45dim; P=0.004, CD34-VEGFR2+CD45dim; P<0.001, Sca1+VEGFR2+CD45dim; P<0.001, CD34+VEGFR2+CD45dim). The results observed in mice and human beings suggest that EPCs can be recruited to circulation from the bone marrow, participating in a process of endothelial repair. The increase of CECs during the phase when the re-channeling process begins in the animal model, suggests that despite the initial endothelial lesion, CECs are liberated when the flow is reestablished. In the present study we concluded that CECs can represent a vascular damage marker. / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Ciências

Orientador: Nelci Fenalti Hoehr, Joyce M. Anichino-Baizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T11:11:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alessio_AlineMorandi_M.pdf: 5240817 bytes, checksum: f759b9c995ffcb5198175f672d2a40aa (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: o estrógeno atua na hemostasia promovendo efeitos pró e antitrombóticos, sua ação ocorre através de sua ligação a receptores nucleares específicos, denominados receptores 'alfa' e 'beta' do estrógeno (RE). A presença de polimorfismos nos genes que codificam o RE poderia modular a resposta do estrógeno, assim como a transcrição de genes e conseqüentemente a expressão. Existem fatores de risco adquiridos para a trombose venosa profunda (TVP) que estão associados a alterações do nível de estrógeno como: gravidez, puerpério, uso de anticoncepcional oral (ACO) e a terapia de reposição hormonal. Os objetivos deste estudo foram de associar polimorfismos nos genes dos RE 'alfa' e 'beta' em controles e mulheres e homens com TVP e avaliar a influência deles na atividade da proteína C (PC), proteína S (PS), antitrombina e concentração de fibrinogênio. Nas mulheres sob o uso de ACO, o genótipo AA do polimorfismo G1730A e, nas mulheres grávidas, os genótipos AA e GA do polimorfismo G1082A, ambos no gene do RE-~, podem ter um efeito protetor para o risco de TVP. Porém, o genótipo GG do polimorfismo G1730A tem uma influência no aumento da atividade da PS nas mulheres do grupo controle total e nas mulheres sob o uso de ACO; e os genótipos AA e AG do polimorfismo A351G no gene do RE-'alfa' , e o genótipo GG do polimorfismo G1082A tem um efeito no aumento da concentração de fibrinogênio nas mulheres grávidas. Contudo, a mutação G20210A no gene da protrombina, o fator V de Leiden e os polimorfismos do RE- foram fatores preditores de trombose venosa. Apesar da miscigenação brasileira, a PC apresentou diminuída em mulheres AITo-descendente. Nossos resultados sugerem que polimorfismos no gene dos RE-'beta' têm uma influência maior no risco para TVP. A contribuição deste trabalho é de grande importância, pois nenhum estudo associou o risco de TVP com os polimorfismos dos RE-'beta' / Abstract: Estrogen acts in haemostasis promoting pro and antithrombotic effects. Its action occurs through linking the specific nuclear receptors called 'alfa' and 'beta' estrogen receptor (ER). Polymorphisms in the genes that codify the ER a and ~could modulate estrogen response, as well as gene transcription and expression. There are acquired risk factors for deep venous thrombosis (DVT) that can alter the estrogen levels. These factors are oral contraceptives (OC), hormonal replacement therapy, pregnancy, and puerperium. The objectives of this study were to associate the polymorphisms in the genes of the a and ~ER in controls, women and rnen with DVT, and to evaluate the influence of these polyrnorphisms in protein C, protein S (PS), in antithrombin activity and fibrinogen concentration. Women under OC use with the AA genotype ofthe G1730A polyrnorphism, and pregnant women with the AA and GA genotypes of the G1082A polymorphism, both in the ER-~ gene, could have a protective effect for DVT risk. However, GG genotype of the G1730A polymorphisrn has an influence in the increase of the PS activity in women of the total control group and women under OC use; and the AA and AG genotypes of the A351G polymorphism in the ER-a gene, and the GG genotype of the G1O82A polymorphism have an effect in the increase of the fibrinogen leveI in pregnant women. However, the G20210A rnutation in the prothrombin gene, the Leiden V factor and the polymorphisms in the ER-'alfa' gene were predictor factors of venous thrombosis. Despite Brazilian miscegenation, PC activity was lower in Afro-descendent women. Our results suggest that the polymorphisrns in the ER-'beta' gene have a higher influence for DVT risk. The contribution of this study is of great importance, as no study has associated DVT risk with the ER polymorphisms yet / Mestrado / Patologia Clinica / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Ana Terezinha Guillaumon / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T00:25:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paschoa_AdilsonFerraz_D.pdf: 1209751 bytes, checksum: 841d1a79e90d1ef1c6bb14b58b807236 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O tromboembolismo venoso (TEV) afeta de 1 a 3 indivíduos por mil habitantes/ano. O conhecimento atual das trombofilias permite a associação com cerca de 40% dos casos de TEV. Há controvérsias quanto ao valor da pesquisa laboratorial de trombofilia para o benefício dos doentes com tromboembolismo venoso. Procuraram-se as variáveis preditivas para a pesquisa positiva de trombofilia e avaliar o impacto desses resultados nas decisões clínicas. Foram avaliados 84 doentes consecutivos com TEV confirmado por métodos de imagem no período entre janeiro de 2001 e novembro de 2003. Após o período previsto de anticoagulação definido por critérios clínicos, os doentes foram submetidos à pesquisa das principais causas de trombofilia. Os resultados laboratoriais permitiram a dois examinadores independentes reavaliar caso-a-caso a indicação de ¿mudança de conduta¿, caracterizada pela interferência no tempo de profilaxia secundária ou ¿atenção especial¿ para medidas de maior vigilância diante de situações de risco ou para a extensão da pesquisa aos familiares assintomáticos. A trombofilia foi encontrada em 35 dos 84 casos (41,66%), sendo que em 27 (32,12%) havia uma causa genética. O fator V Leiden foi a alteração mais freqüente (15,47%), seguida do conjunto de deficiência dos anticoagulantes naturais (11,9%). Não houve diferença significativa da freqüência de trombofilia relacionada à faixa etária nem diferença de idade de aparecimento do primeiro evento trombótico entre doentes trombofílicos e não trombofílicos. Houve significância estatística para ocorrência de trombofilia nos doentes com tromboflebite superficial, recorrência e na associação com fatores de risco não cirúrgicos. A ¿mudança de conduta¿ foi atribuída a 6 dos 84 doentes (7,14%), estatisticamente significativa para aqueles com recorrência em relação aos que tiveram apenas um episódio de TEV. A ¿atenção especial¿ foi atribuída a 34 dos 84 casos (40,47%).A tromboflebite superficial de aparecimento espontâneo, a ocorrência de TEV relacionada a causas não cirúrgicas e a recorrência foram os principais achados preditivos de trombofilia. A ¿mudança de conduta¿ aplicou-se a uma pequena porcentagem de doentes, e refletiu predominantemente a confirmação da necessidade de prolongamento da profilaxia secundária. A ¿atenção especial¿ diante de situações de risco e a extensão da profilaxia primária a familiares de primeiro grau assintomáticos expostos a situações de risco parecem-nos a melhor indicação para a pesquisa laboratorial da trombofilia. Palavras-chave: trombofilia, fator V Leiden, mutação G20210A, proteína S, proteína C, antitrombina, hiperhomocisteinemia, anticorpos antifosfolípides, tromboembolismo venoso / Abstract: The venous thromboembolism (VTE) affects 1 to 3 individuals per a thousand habitants/year. Nowadays its possible to associated VTE with a cause of thrombophilia in about 40% of patients. There are some inconclusive points about the real benefit of the laboratorial investigation on thrombophilia for patients with VTE. We tried to identify the variables that point to the positive test results and the impact of these results on clinical decisions.The screening for the more common causes of thrombophilia was applied to 84 consecutive patients with VTE confirmed by image examination between January 2001 and November 2003. After test results, two independent observers evaluated, in a case by case basis, the indication of a ¿change on prophylaxis¿, in order to modify the period of anticoagulant intake (secondary prophylaxis), or ¿special attention¿ when considering to have a higher medical surveillance before risk situations or for the extension of the research to the first degree asymptomatic relatives.Thrombophilia was found in 41.66% (35/84), and in 32.12% (27/84) it involved agenetic cause. The factor V Leiden was the more prevalent alteration, identified in 15.47% of the cases, followed by the natural anticoagulants disfunction (11.9%). There was no significative difference of thrombophilia frequency between ages, nor a difference of age in the onset of the first thrombotic event between thrombophilic and non-thrombophilic patients. There was a higher prevalence of thrombophilia in patients with superficial thrombophlebitis of spontaneous onset, in cases of recurrence and when associated with non-surgical predisponent factors. The ¿change on prophylaxis¿ resulted in 7.14% (6/84), and there was statistically significance for patients with recurrent episodes when compared to patients with just one. The ¿special attention¿ was applied in 40.47% (34/84). Spontaneous superficial thrombophlebitis, occurrence of VTE related to nonsurgical causes and recurrence, were the main findings which suggested thrombophilia. The ¿change of prophylaxis¿ was applied to a small percentage of patients. The ¿special attention¿ for risk situations and the extension of the primary prophylaxis to the asymptomatic family members seem to be the best indication for the laboratorial research on thrombophilia. Key words: thrombophilia, factor V Leiden, G20210A mutation, protein C, protein S, antithrombin, hyperhomocysteinaemia, antiphospholipids antibodies, venous thromboembolism / Doutorado / Cirurgia / Doutor em Cirurgia

Orientador: Joyce Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-13T01:42:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bittar_LuisFernando_M.pdf: 1309049 bytes, checksum: 8d7bbcbc4a659300d128bc58336cbb88 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Níveis elevados de fator VIII (FVIII) são um fator de risco independente e prevalente para trombose venosa profunda (TVP), e tem influência do FvW. A ADAMTS13 é responsável pela modulação do tamanho molecular do FvW, clivando os multímeros de altíssimo peso molecular. Alterações moleculares no gene da ADAMTS13 têm correlação com sua atividade. Neste estudo avaliamos a prevalência do polimorfismo A4751G no gene do FvW (região de ligação com a ADAMTS13), os polimorfismos C1797T e C1852G e a mutação C4006T no gene da ADAMTS13 em 435 pacientes com TVP (156M/279F; idade mediana=37) e 580 controles (170M/410F, idade mediana=35). Investigamos a relação entre os genótipos e a dosagem de FVIII e FvW no plasma e o risco de TVP. A dosagem de FVIII:C foi realizada por método coagulométrico de um estágio, e as dosagens de FVIII:Ag e FvW:Ag por método imunoenzimático. As alterações moleculares foram determinadas por PCR e digestão com enzimas específicas, ou SSCP e sequenciamento para confirmação. Pacientes com TVP mostraram níveis significantemente aumentados de FVIII:C (203.7 UI/dl vs. 127 UI/dl; p<0.001), FVIII:Ag (109.6 UI/dl vs. 82.4 UI/dl; p<0.001) e FvW:Ag (154.2 UI/dl vs. 108 UI/dl; p<0.001) quando comparados com o grupo controle. Não houve diferença significativa entre os grupos na prevalência das alterações moleculares estudadas. Os indivíduos com genótipo AG (FvW A4751G) apresentavam níveis significativamente reduzidos de FVIII:C (p=0.04). Embora também tenha demonstrado uma discreta associação com níveis diminuídos de FvW:Ag, esta não foi estatisticamente significativa (p= 0.07). Os indivíduos com genótipo CG (ADAMTS13 C1852G) apresentavam níveis significativamente aumentados de FVIII:Ag (p=0.05) e FvW:Ag (p= 0.01). Apesar da relação com diminuição do FVIII o polimorfismo A4751G não mostrou um efeito protetor para TVP. O polimorfismo ADAMTS13 C1852G está associado à diminuição desta metaloprotease, e sua associação com níveis aumentados de FVIII:Ag e FvW:Ag neste estudo favorece essa hipótese. / Abstract: Elevated levels of factor VIII (FVIII) are a prevalent and independent risk factor for deep venous thrombosis (DVT), and are affected by von Willebrand factor (vWF) levels. ADAMTS13 is responsible for the modulation of the molecular size of vWF, cleaving the ultra large multimers. Mutations and polymorphisms in the ADAMTS13 gene are related with its activity. This study evaluated the prevalence of polymorphism A4751G in the vWF gene, polymorphisms C1797T, C1852G and the mutation C4006T in the ADAMTS13 gene in 435 patients with DVT and 580 healthy controls. Subsequently, we investigated the relationship between the genotypes and plasma levels of FVIII and vWF and DVT risk. FVIII:C was measured by a one-stage clotting method, and FVIII:Ag and vWF:Ag were measured by chromogenic method. The molecular changes were determined by restriction endonucleases or single strand conformation polymorphism followed by sequencing. Statistical test:U Mann-Whitney, = 0.05. Patients with DVT had higher plasma levels of FVIII:C (mean 203,7 UI/dl vs. 127 UI/dl; p<0.001), FVIII:Ag (mean 109,6 UI/dl vs. 82,4 UI/dl; p<0.001) and vWF:Ag (154,2 UI/dl vs. 108 UI/dl; p<0.001) when compared to controls. We observed no statistical difference in the prevalence of all molecular changes studied between patients and controls. A4751G heterozygotes had significantly reduced levels of FVIII:C (p=0,04). Althought there was a slight association with reduced levels of vWF: Ag, this association was not statistically significant (p= 0,07). C1852G heterozygotes had significantly elevated levels of FVIII:Ag (p=0.05) and vWF:Ag (p= 0,01). Despite the relative decline of FVIII:C with the A4751G polymorphism there was no protective effect for DVT. The C1852G polymorphism is associated with a reduction of ADAMTS13, and its association with increased levels of FVIII: Ag and vWF: Ag observed in this study supports this hypothesis. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T06:35:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Araujo_GrazielaSilveira_M.pdf: 2289744 bytes, checksum: 6cde67a2a95fde59c04e1240833b9c41 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Em uma parcela de pacientes com quadro clínico hemorrágico ou trombótico, nenhum diagnóstico etiológico é estabelecido. Os pacientes com doença hemorrágica, muitas vezes importante, podem apresentar todos os exames de triagem e dosagem específica de fatores da coagulação dentro dos valores da normalidade. OBS.: O resumo na integra poderá ser visualizado no link ou texto completo da tese digital / Abstract: In a parcel of patients with hemorrhagic or thrombotic clinical picture, none etiologic diagnosis is established. The patients with hemorrhagic desorder, many times important, can present all inside the screening tests and specific dosage of factors of the coagulation of the values of normality. Note: the complete abstract is avaiable with the link or full eletronic digital theses or dissertations / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Joyce Maria Annichino Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bassora_FernandaDutraSantiago_D.pdf: 2667928 bytes, checksum: 612538a2c5c4e4e33577d2303de3a9c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A trombose venosa é definida como a oclusão de um vaso do sistema venoso. Três fatores básicos para a formação de um trombo no interior dos vasos são: alteração do fluxo sangüíneo, da parede vascular e/ou dos elementos sangüíneos. A trombose venosa e a embolia pulmonar, que ocorre como uma complicação subseqüente representa uma causa importante de morbidade e mortalidade em pacientes hospitalizados. A freqüência da trombose venosa foi estimada em aproximadamente 1/1000 na população em geral. Na maior parte dos casos existe uma tendência para trombose determinada pela presença de um fator causal herdado ou adquirida, ou pela interação desses fatores, bem como por variações genéticas que determinam alterações nos níveis das proteínas pró-coagulantes e anticoagulantes. Dados da literatura têm sugerido a associação de mecanismos inflamatórios com a fisiopatologia da trombose venosa profunda (TVP). Os monócitos, estimulados por citocinas ou endotoxinas, expressam fator tecidual, o maior indutor da coagulação sangüínea, e que também tem a função de sinalização para a mobilidade celular e vascular. Os leucócitos apresentam receptores capazes de ligar e ativar o fator X da coagulação, servindo como via alternativa para a formação de trombina. As plaquetas podem aderir ao endotélio intacto e através da liberação de mediadores e citocinas como interleucina (IL)-1 e Fator de necrose tumoral-a (TNF-a), induzindo a expressão de moléculas de adesão e fator tecidual pela célula endotelial. Com base nestes dados e considerando que a migração leucocitária é um dos principais eventos que caracterizam o processo inflamatório, justificamos a escolha de células mononucleares (monócitos e linfócitos) como células centrais do nosso estudo. Utilizando técnicas de separação de células mononucleares por centrifugação em gradiente de "Ficoll-Hypaque", extração do Ácido ribonucléico (RNA) total, hibridação em Ácido desoxiribonucléico complementar (cDNA) -Microarray, e validação usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo (qRT-PCR) avaliamos do perfil de expressão gênica de alguns mediadores inflamatórios nessas células e a possível relação com a trombose venosa. Neste trabalho, usando a tecnologia de Microarray encontramos 60 induzidos e 56 genes reprimidos diferencialmente expressos nos pacientes com TVP, estes genes que estavam relacionados à resposta imune, inflamação, proteólise e transcrição. Destes genes diferencialmente expressos, selecionamos nove relacionados com inflamação para validação usando a técnica de qRT-PCR. Destes, somente houve aumento de expressão do gene da caspase 4 (CASP4) nos pacientes com TVP, sendo que, esta diferença se manteve no subgrupo com TVP espontâneo. Neste mesmo subgrupo, também foi verificado o aumento da expressão no gene Elong factor 1, alpha 2(EEF1A2) / Abstract: Venous thrombosis is defined as a vessel occlusion of the venous system. Three basic factors for the formation of a thrombus inside the vessel are: changes in blood flow, vascular wall and / or blood elements. Venous thrombosis and pulmonary embolism, which occurs as a subsequent complication is a major cause of morbidity and mortality in hospitalized patients. The frequency of venous thrombosis was estimated to be approximately 1 / 1000 in the general population. In most cases there is a tendency for thrombosis determined by the presence of a causal factor inherited or acquired, or by the interaction of these factors, as well as genetic variations that determine changes in protein levels of procoagulants and anticoagulants. Literature data have suggested the association of inflammatory mechanisms in the pathophysiology of deep venous thrombosis (DVT). Monocytes, stimulated by cytokines or endotoxin, express tissue factor, the greater inducer of blood coagulation, and also have the function of signaling for cell motility and vascular. Leukocytes have receptors that can bind and activate coagulation factor X, serving as an alternative route for the formation of thrombin. Platelets can adhere to intact endothelium and through the release of mediators and cytokines such as interleukin (IL)-1 and Tumor necrosis factor-a (TNF-a), inducing expression of adhesion molecules and tissue factor by endothelial cells. Based on these data and considering that leukocyte migration is one of the main events that characterize the inflammatory process, we justify the choice of mononuclear cells (monocytes and lymphocytes) as the central cells of our study. Using techniques of separation of mononuclear cells by gradient centrifugation "Ficoll-Hypaque," extraction of total RNA, cDNA-Microarray hybridization, and validation using real time qPCR assessed the gene expression profile of some inflammatory mediators in these cells and the possible relationship with venous thrombosis. In this work using Microarray technology we found 60 genes upregulated and 56 downrelated differentially expressed in patients with DVT. Genes that were related to immune response, inflammation, proteolysis and transcription. Of these differentially expressed genes, we selected nine genes that were related with inflammation to validation using qRT- PCR technique. Just one of then, the caspase 4 (CASP4) genes was differentially increased in DVT patients, this increase kept in patients with spontaneous DVT and an increased of Elong factor 1, alpha 2 (EEF1A2) gene too / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:19:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flores-Nascimento_MarianeCristina_D.pdf: 2045016 bytes, checksum: 26506f3c6c426ff227cd481188662275 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A trombose venosa profunda (TVP) é uma doença multifactorial, e possui uma alta taxa de morbi-mortalidade devido a complicações como embolia pulmonar e a síndrome póstrombótica, e cerca de 25 % dos pacientes apresentarão recorrência em 5 anos. A identificação de novos fatores envolvidos na fisiopatologia da TVP pode ser convertida em implicações de grande importância no manejo destes pacientes, prevenção de recorrência e no desenvolvimento de novas terapias. O interesse em avaliar as plaquetas e as amostras de plasma se deve ao fato de que as funções plaquetárias não estão completamente compreendidas, e aparentemente o papel das plaquetas poderia ir além do seu envolvimento na hemostasia. Como o plasma potencialmente fornece uma janela para a observação do indivíduo como um todo, a análise proteômica tanto das plaquetas como do plasma poderia implementar o nosso conhecimento acerca da fisiopatologia da TVP. OBJETIVO: Neste estudo foram analisados os perfis proteicos de plaquetas e amostras de plasma de três pacientes com TVP, que foram comparados com os resultados obtidos a partir de amostras de 1 irmão e 1 vizinho para cada paciente, a fim de minimizar as interferências genéticas e ambientais. Estes pacientes apresentaram episódios espontâneos e recorrentes de TVP proximal e mencionaram um histórico familiar de distúrbios da coagulação. MÉTODOS: as plaquetas necessitaram ser lavadas e lisadas, e as amostras de plasmas tiveram a albumina depletada antes de as proteínas serem alquiladas, reduzidas, precipitadas com acetona e hidrolisadas com tripsina. Os peptídeos das plaquetas e das amostras de plasma foram fracionados por cromatografia de fase reversa e troca catiônica, respectivamente. Depois disto, os peptídeos plaquetários foram direcionados ao espectrômetro de massas LTQOrbitrap e a busca das proteínas foi realizadas através do Sorcerer/Sequest. Os peptídeos plasmáticos foram encaminhados ao espectrômetro de massas ESI Q-TOF Premier e as proteínas foram analisadas pelo Mascot. RESULTADOS: Cinco proteínas estiveram presentes apenas nas plaquetas dos pacientes, estando ausentes em todos os controles: a proteína ligante da Apolipoproteína A1, a sub-unidade ?1 do Coatômero, a Desidrogenase 11-17-? do Estradiol, a Leucotrieno A-4 Hidrolase e a Sorbitol Desidrogenase. Além disso, verificou-se que outras proteínas estiveram diferencialmente expressas em amostras de plasma pacientes e controles: a protease C4-A, o inibidor C1 da Inter-?-Tripsina, o inibidor H1 de cadeia pesada, a proteína Amilóide Sérica A, a glicoproteína ?-2-HS, a isoforma 2 da inter- ?-tripsina, a apolipoproteína A-IV e o inibidor de cadeia pesada H4. CONCLUSÕES: A avaliação de plaquetas e amostras de plasma de pacientes com TVP espontânea permitiu a identificação de proteínas diferencialmente expressas quando comparados a irmãos e vizinhos, que podem desempenhar importantes papéis na fisiopatologia da doença por se relacionarem a processos inflamatórios, imunes e no de transporte de lipídeos / Abstract: Deep venous thrombosis (DVT) is multi-causal disease associated to a high morbimortality due to complications as pulmonary embolism and post-flebitic syndrome, and about 25 % of the patients present recurrence in 5 years. The identification of new factors involved to the physiopathology of DVT can be translated into important implications for the management of these patients, prevention of recurrence, and for the development of new therapies. We were interested about platelets and plasma because the platelets functions are not completely understood and apparently their role goes beyond a hemostatic player, and as the plasma potentially provides a window into the individual's state of health and disease, both could improve our knowledge about the DVT physiopathology. AIM: In this study we analyzed the protein profile of platelets and samples of plasma of 3 DVT patients and compared to results obtained from 1 sibling and 1 neighbor for each patient in order to minimize the genetic and environmental interferences. These patients presented spontaneous and recurrent episodes of proximal DVT and mentioned a familiar history of coagulation disorders. METHODS: the platelets needed to be washed and lysed, and the plasmas samples required albumin depletion before the proteins being alkylated, reduced, precipitated with acetone and hydrolyzed by trypsin. The peptides were fractionated by reverse phase and cation exchange liquid chromatography for platelets and plasmas samples, respectively. After that, the platelets peptides were directed to LTQ-Orbitrap mass spectrometer and the proteins search were performed by Sorcerer/Sequest. The plasma peptides went to ESI Q-TOF Premier mass spectrometer and the proteins were searched by RESULTS: We identified 5 proteins that were present on platelets from patients and absent in all the controls: Apolipoprotein A1 Binding-Protein, Coatomer (?1 sub-unit), Estradiol 11-17-? Dehydrogenase, Leukotriene A-4 Hydrolase and Sorbitol Dehydrogenase. In addition, we verified 6 proteins that were differently expressed between patients and controls: C4-A plasma protease, C1 inhibitor Inter-alpha-trypsin, inhibitor heavy chain H1, the serum amyloid A, alpha-2-HS-glycoprotein, isoform 2 of inter-alphatrypsin, apolipoprotein A-IV and the inhibitor heavy chain H4. CONCLUSIONS: The evaluation of platelets and plasma samples from patients with spontaneous DVT allows the identification of proteins that are differently expressed when compared to siblings and neighbors, which can play important roles on the physiopathology of the disease due their relation to inflammatory, immune and lipid transportation / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Introdução: Pacientes submetidos à amputação de membro inferior por doença arterial obstrutiva periférica (DAOP) estão em risco para o desenvolvimento de trombose venosa profunda (TVP). Há poucos estudos na literatura sobre a incidência no pós-operatório precoce e quanto aos fatores de risco no desenvolvimento da TVP no membro amputado. Objetivo: A finalidade deste estudo é avaliar, de modo prospectivo, a incidência de trombose venosa profunda pós-operatória em até 35 dias, em pacientes submetidos à amputação de membro inferior por doença arterial obstrutiva periférica, sua relação com comorbidades e com óbito. Método: De setembro de 2004 a março de 2006, foram estudados 56 pacientes (29 homens; média de idade 67,25 anos) submetidos a 62 amputações (36 transtibiais e 26 transfemorais), utilizando-se eco-Doppler no pré-operatório e aproximadamente no 7º e 31° dia de pós-operatório. Resultado: Houve TVP em 16 (25,8%) membros amputados, sendo 10 casos em amputações transfemorais e 6 casos em transtibiais. A incidência cumulativa no período até 35 dias foi de 28% (Kaplan-Meier). Houve diferença significativa na incidência de TVP entre amputações transfemorais (37,5%) e transtibiais (21,2%), p = 0,04. Outro fator de risco para TVP foi idade igual ou superior a 70 anos (48,9 vs 16,8%, p=0,021). Houve 01 caso de embolia pulmonar sintomática não fatal em paciente com TVP já diagnosticada. Não houve relação entre outras comorbidades e TVP. A trombose venosa no membro amputado não influenciou na taxa de óbito que foi de 9,7%. Conclusões: A incidência de TVP no pós-operatório recente (até 35 dias) foi elevada principalmente em pacientes com idade igual e superior a 70 anos e nas amputações transfemorais. Os pacientes com DAOP submetidos a grandes amputações devem ser considerados de alto risco para TVP, mesmo após alta hospitalar. / Introduction: Patients undergoing amputation of the lower limb due to Peripheral Arterial Disease (PAD) are at risk for developing Deep Venous Thrombosis (DVT). There are few studies in the research literature on the incidence of DVT during the early postoperative period and the risk factors for the development of DVT in the amputation stump. Objective: The goal of this prospective study was to evaluate the incidence of deep venous thrombosis during the first 35 postoperative days in patients who had undergone amputation of the lower extremity due to PAD, and its relation to comorbidities and death. Method: From September 2004 to March 2006, fifty-six patients (29 men, mean age 67.25 years) underwent 62 amputations (36 below knee amputation BKA and 26 above knee amputation- AKA), and echo- Doppler scanning on preoperative, and approximately the seventh and 31st postoperative days. Results: DVT occurred in 16 (25.8%) of the amputated extremities, (10 AKA and 06 BKA). The cumulative incidence in the 35 day postoperative period was 28% (Kaplan-Meier). There was a significant difference in the incidence of DVT between AKA (37.5%) and BKA (21.2%), p = .04. Another DVT risk factor was age equal to or above 70 years (48.9 vs. 16.8%, p= .021). There was one case of symptomatic non-fatal pulmonary embolism in a patient already diagnosed with DVT. There was no relation between other comorbidities and DVT. Venous Thrombosis in the amputation stump did not influence the mortality rate which was 9.7%. Conclusions: The incidence of DVT in the early post-operative period (up to 35 days) was elevated mainly in patients 70 years of age or older and in AKA. Patients with PAD who have recently undergone major amputations should be considered at high risk for DVT, even after hospital discharge.

INTRODUÇÃO: Um grande número de estudos epidemiológicos têm demonstrado que o fibrinogênio é fator de risco consistente e independente para doença cardiovascular. O fibrinogênio, além de ser um determinante de trombose arterial foi considerado fator de risco de trombose venosa. Foram avaliados os níveis plasmáticos do fibrinogênio em indivíduos que apresentaram algum tipo de trombose não influenciada por reação de fase aguda ou resposta inflamatória. MÉTODOS: Neste estudo de caso-controle realizado entre julho de 2003 a abril de 2005 foram incluídos 39 pacientes, entre 25 e 65 anos, com diagnóstico objetivamente confirmado de trombose, sem antecedentes de neoplasia e colagenose. O tempo mínimo entre a evento e a coleta da amostra de sangue foi de 6 meses. O grupo controle foi constituído de doadores e funcionários voluntários do Hemocentro Regional de Juiz de Fora. A concentração plasmática de fibrinogênio e a medida da Proteína C Reativa foram realizados nos dois grupos. RESULTADOS:Os níveis médios de fibrinogênio foram significativamente maiores nos pacientes ( 316)que no grupo controle (259), p=0,0002. a média de idade foi 48,3 para os pacientes e 45,5 para o controle. A aplicação do teste qui quadrado demonstrou que não houve diferenças significativas nos grupos de pacientes e controles (30,8% e 27%, respectivamente) em relação ao tabagismo(pvalor = 0,72). A frequência de hipertensão foi significativamente maior no grupo de pacientes (28,2%) que no controle (5,4%) (p-valor=0,008). O teste t para a diferença dos níveis médios de fibrinogênio entre os grupos de trombose venosa e arterial não apresentou resultado estatisticamente significante (p-valor = 0,69). CONCLUSÃO: Com base nos dados deste estudo, os níveis de fibrinogênio estão relacionados com trombose, independente se arterial ou venosa. / INTRODUCTION: A great number of prospective epidemiologic studies have reported that fibrinogen is consistently and independently risk factor for the cardiovascular disease. The fibrinogen, a determinant of arterial thrombosis, was also considered a risk factor for the venous thrombosis. It was valued the fibrinogen plasmatic level in patients that had showed some kind of thrombosis event without influence by acute phase reactions or ongoing inflamatory responses. METHODS: In this cases-control study, fulfilled between july 2003 and april 2005, was included 39 patients, among 25 e 65 ears, with confirmed diagnosis of thrombosis and none neoplasis and collagenosis antecedent. Six months was the minimum time between event and blood sample collect. The control group was composed by blood donor and voluntary employee of the Hemocentro Regional de Juiz de Fora. The fibrinogen plasmatic concentration and the C-reactive proteins measure was made in both groups. RESULTS: The medium levels of fibrinogen were significantly higher in patients (316) than the control group (259), p=0,0002. The age average was 48,3 for the patients and 45,5 for the control. The “qui-quadrado" test application proved there wasn’t any significatives differences in both groups, patients (30,8%) and control (27%), in the relation with smoking (p-value = 0,72). The frequency of arterial hypertension was significantly higher in patient group (28,2%) than the control group (5,4%) (p-value = 0,008). The t-test for the differences of the fibrinogen average levels between venous and arterial thrombosis didn’t present any significant statistic result. CONCLUSION: Established in this research, the higher levels of fibrinogen are associated with thrombosis, independently if arterial or venous.

Introdução: Pacientes submetidos à amputação de membro inferior por doença arterial obstrutiva periférica (DAOP) estão em risco para o desenvolvimento de trombose venosa profunda (TVP). Há poucos estudos na literatura sobre a incidência no pós-operatório precoce e quanto aos fatores de risco no desenvolvimento da TVP no membro amputado. Objetivo: A finalidade deste estudo é avaliar, de modo prospectivo, a incidência de trombose venosa profunda pós-operatória em até 35 dias, em pacientes submetidos à amputação de membro inferior por doença arterial obstrutiva periférica, sua relação com comorbidades e com óbito. Método: De setembro de 2004 a março de 2006, foram estudados 56 pacientes (29 homens; média de idade 67,25 anos) submetidos a 62 amputações (36 transtibiais e 26 transfemorais), utilizando-se eco-Doppler no pré-operatório e aproximadamente no 7º e 31° dia de pós-operatório. Resultado: Houve TVP em 16 (25,8%) membros amputados, sendo 10 casos em amputações transfemorais e 6 casos em transtibiais. A incidência cumulativa no período até 35 dias foi de 28% (Kaplan-Meier). Houve diferença significativa na incidência de TVP entre amputações transfemorais (37,5%) e transtibiais (21,2%), p = 0,04. Outro fator de risco para TVP foi idade igual ou superior a 70 anos (48,9 vs 16,8%, p=0,021). Houve 01 caso de embolia pulmonar sintomática não fatal em paciente com TVP já diagnosticada. Não houve relação entre outras comorbidades e TVP. A trombose venosa no membro amputado não influenciou na taxa de óbito que foi de 9,7%. Conclusões: A incidência de TVP no pós-operatório recente (até 35 dias) foi elevada principalmente em pacientes com idade igual e superior a 70 anos e nas amputações transfemorais. Os pacientes com DAOP submetidos a grandes amputações devem ser considerados de alto risco para TVP, mesmo após alta hospitalar. / Introduction: Patients undergoing amputation of the lower limb due to Peripheral Arterial Disease (PAD) are at risk for developing Deep Venous Thrombosis (DVT). There are few studies in the research literature on the incidence of DVT during the early postoperative period and the risk factors for the development of DVT in the amputation stump. Objective: The goal of this prospective study was to evaluate the incidence of deep venous thrombosis during the first 35 postoperative days in patients who had undergone amputation of the lower extremity due to PAD, and its relation to comorbidities and death. Method: From September 2004 to March 2006, fifty-six patients (29 men, mean age 67.25 years) underwent 62 amputations (36 below knee amputation BKA and 26 above knee amputation- AKA), and echo- Doppler scanning on preoperative, and approximately the seventh and 31st postoperative days. Results: DVT occurred in 16 (25.8%) of the amputated extremities, (10 AKA and 06 BKA). The cumulative incidence in the 35 day postoperative period was 28% (Kaplan-Meier). There was a significant difference in the incidence of DVT between AKA (37.5%) and BKA (21.2%), p = .04. Another DVT risk factor was age equal to or above 70 years (48.9 vs. 16.8%, p= .021). There was one case of symptomatic non-fatal pulmonary embolism in a patient already diagnosed with DVT. There was no relation between other comorbidities and DVT. Venous Thrombosis in the amputation stump did not influence the mortality rate which was 9.7%. Conclusions: The incidence of DVT in the early post-operative period (up to 35 days) was elevated mainly in patients 70 years of age or older and in AKA. Patients with PAD who have recently undergone major amputations should be considered at high risk for DVT, even after hospital discharge.