La translation vers la clinique de nouveaux médicaments anti-cancéreux peut échouer à différentes étapes, notamment lors du passage des modèles animaux à l'humain. Pour améliorer la prédictibilité des tests précliniques, de nouveaux modèles in vitro humains recréant le microenvironnement tumoral sont nécessaires. Dans le cadre du mélanome cutané, les vaisseaux sanguins et lymphatiques dermiques sont des composantes essentielles à la progression tumorale, tout comme les cellules immunitaires. Nous avons émis l'hypothèse qu'il est possible de microvasculariser des substituts cutanés avec des capillaires sanguins et lymphatiques, puis d'appliquer ce contexte tissulaire à la modélisation du mélanome. Notre modèle, basé sur la méthode d'auto-assemblage, est constitué, dans un premier temps, de fibroblastes, de cellules endothéliales microvasculaires humaines et de kératinocytes. Deux types de réseaux ont été observés dans les substituts cutanés en coupe et sur tissu entier. Ils présentent des morphologies distinctes et sont caractérisés par des marquages CD31 (pan-endothéliale) et podoplanine (spécifique aux cellules lymphatiques). La capacité des cellules endothéliales à former des réseaux en fonction de leur origine, cellules de nouveau-né ou d'adulte, a été évaluée. Il a également été confirmé que la présence d'un épiderme formé de kératinocytes influe sur la formation des réseaux de capillaires sanguins et lymphatiques. Les peaux doublement microvascularisées ont permis l'étude du mélanome dans un microenvironnement humain in vitro. Ce modèle a été formé en ajoutant des sphéroïdes de mélanome aux substituts cutanés (6 lignées). Une fois incorporées dans le microenvironnement cutané, les tumeurs répondent à un traitement chronique (12 jours) au vemurafenib de façon dose-dépendante (diminution de la prolifération des cellules de mélanome et augmentation significative de l'apoptose). Par la suite, des cellules immunitaires humaines primaires (dérivées du sang périphérique) ont été incorporées dans la tumeur ainsi que dans le tissu environnant, résultant notamment en la présence de monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), lymphocytes CD8+ et cellules HLA-DR+. Ces tissus avec ou sans cellules immunitaires ont été stimulés avec du lipopolysaccharide (LPS), menant à une modification de la proportion des sous-populations immunes présentes dans le modèle. Ce modèle humain répondant à des thérapies anti-cancéreuses et pouvant contenir une composante immunitaire est un outil prometteur pour l'étude du mélanome ainsi que pour l'évaluation de futures molécules en oncologie, incluant des immunothérapies. / Clinical translation of new oncology compounds can fail at different stages, including the translation from animal to human studies. To improve the predictability of preclinical testing, new in vitro human models mimicking the tumor microenvironment are needed. In skin melanoma, blood and lymphatic capillaries are key features of tumor progression, as well as immune cells. We hypothesize that it is possible to microvascularize skin substitutes with both blood and lymphatic capillaries in order to use these tissues to model and study melanoma in vitro. Our self-assembled model was produced using primary human fibroblasts, microvascular endothelial cells and keratinocytes. Two subtypes of capillary networks were present in the reconstructed skin as observed after labeling on cryosections and whole mount samples. Their morphology differs, and they were characterized by immunostaining against CD31 (pan-endothelial) and podoplanin (lymphatic endothelial cells). The ability of endothelial cells from newborn or adult to form networks was assessed. It was also confirmed that the keratinocytes can affect the capillary networks, formed by blood and lymphatic endothelial cells. The microvascularized reconstructed skin allowed to study melanoma in a human microenvironment in vitro. The melanoma model was produced by adding melanoma spheroids to the skin substitutes (with 6 melanoma cell lines). After tumor incorporation in the 3D model, it was treated chronically (12 days) with vemurafenib and displayed a dose-dependent response (significant decrease of proliferation and increase of apoptosis). The last step was to incorporate human primary blood-derived immune cells in the tumor and in the surrounding skin, leading to the presence for example monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), CD8+ lymphocytes and HLA-DR+ cells. The different tissues were stimulated with LPS, leading to a modification of immune cell subpopulations in the model (with 4 different donors and 2 melanoma cell lines). This human melanoma model which responds to a known therapy and can include an immune component is a promising tool to study melanoma and to test new therapeutic compounds, including immunotherapies.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2006-2007 / La présence de lymphocytes T infiltrant (TILs) a été démontrée dans plusieurs types de cancer. Par contre, la fonctionnalité des TILs est affectée par de nombreux facteurs qui font du milieu tumoral un environnement inhibiteur pour ceux-ci. Notre hypothèse de travail était qu'il est possible de prendre avantage des TILs encore activés afin d'élaborer une stratégie anti-tumorale. Nous avons mis au point un système qui permet d'isoler spécifiquement les TILs activés. Pour ce faire, nous avons construit un vecteur contenant le gène codant pour la partie extracellulaire et transmembranaire du CD 19 (ACD19), que nous avons mis sous le contrôle du promoteur minimal de l'interleukine 2. Nous avons démontré que le ACD19 est exprimé de façon stable à la surface cellulaire, que le vecteur est inductible suite à l'activation des lymphocytes T et qu'il est possible d'isoler spécifiquement les cellules exprimant le ACD19. Finalement, nous avons caractérisé un modèle tumoral animal et déterminé les conditions nécessaires pour tester notre hypothèse in vivo.

Les tumeurs pulmonaires, qu’elles soient primaires (principalement représentées par le cancer du poumon non-à-petites cellules) ou secondaires (métastases), causent la mort de plusieurs centaines de milliers de personnes par an à travers le monde. Malgré les modalités de traitements existantes, un plateau thérapeutique a été atteint avec un taux de survie à 5 ans de maximum 15%. Actuellement, il est connu que le cancer du poumon non-à-petites cellules ainsi que les métastases sont intrinsèquement résistants à l’apoptose.<p>Pour apporter des réponses aux principales problématiques rencontrées avec l’administration systémique de la chimiothérapie conventionnelle qui est principalement constituée d’agents pro-apoptotiques, nous avons développé des formulations à base d’agents antinéoplasiques aux propriétés anticancéreuses non pro-apoptotiques qui sont destinées à être administrées de manière localisée par la voie inhalée. Il faut savoir que l’inhalation est la voie d’administration préférentielle des principales affections respiratoires telles que l’asthme, la bronchopneumonie chronique obstructive et la mucoviscidose. <p>La première partie de ce travail a consisté à produire et à évaluer des formulations à base de témozolomide destinées à être administrées chez la souris porteuse de pseudo-métastases pulmonaires (issues d’un mélanome expérimental, le modèle B16F10), soit via la voie intraveineuse (iv) conventionnelle soit via la voie inhalée à l’aide d’un dispositif endotrachéal approprié. La suspension pour inhalation a été produite à l’aide de technique de réduction de taille et a été stabilisée à l’aide de phospholipides compatibles avec la voie pulmonaire. L’activité anticancéreuse in vitro a été vérifiée pour le témozolomide formulé sous forme de suspension pour inhalation et de solution intraveineuse par rapport à du témozolomide non formulé sur des lignées de cellules cancéreuses de cancer humain NSCLC A549, de glioblastome humain T98G et de mélanome murin B16F10. Cette dernière lignée a été utilisée pour générer les pseudo-métastases pulmonaires chez la souris en injectant les cellules de mélanomes dans la voie systémique via la veine caudale. La reproductibilité de la dose et de l’aérosol générés à partir de la suspension pour inhalation à l’aide du dispositif d’administration endotrachéal et la déposition des gouttelettes dans les poumons de la souris ont pu être respectivement évaluées avec précision par une méthode de quantification du témozolomide qui a été validée par nos soins, par des techniques de diffraction laser et par des techniques de microscopie à fluorescence et d’analyse d’images histologiques. Enfin, l’activité antitumorale in vivo et la tolérance des traitements conventionnels ou localisés ont été vérifiées chez la souris porteuse de ces pseudo-métastases pulmonaires B16F10. Les résultats ont montré que le dispositif endotrachéal utilisé permettait de produire des doses et des aérosols reproductibles et de déposer les gouttelettes d’aérosol profondément dans les poumons des souris. De plus, lors de l’étude in vivo, les traitements administrés étaient bien tolérés et la dose de témozolomide administré sous forme de suspension pour inhalation à l’aide du dispositif endotrachéal avait permis d’obtenir une efficacité antitumorale similaire à une dose similaire de témozolomide administrée par la voie iv conventionnelle. De plus, 11% (3/27) de souris « long-survivantes » avaient été observées avec le groupe traité par inhalation trois fois par semaine pendant trois semaines consécutives et les poumons de ces long-survivants avaient présenté une éradication quasi complète des tumeurs pulmonaires. Ce phénomène n’avait pas été observé dans les groupes de souris traitées de manière conventionnelle.<p>Ensuite, la seconde partie de notre travail a consisté en l’élaboration du témozolomide sous forme de poudres sèches pour inhalation destinées à être délivrées à l’aide d’un dispositif à poudre sèche à usage humain. Pour ce faire, nous avons développé les poudres sèches pour inhalation à l’aide de techniques de réduction de taille pour microniser la poudre de départ et d’atomisation pour évaporer le solvant et élaborer un enrobage autour des particules micronisées. La nature de l’enrobage était soit hydrophile soit lipophile. Ensuite les caractéristiques physicochimiques telles que les propriétés thermiques, les propriétés cristallines, la distribution de taille particulaire et la morphologie des formulations de poudre sèche pour inhalation ont été évalués à l’aide de techniques appropriées telles que la calorimétrie différentielle à balayage, la diffraction des rayons X sur poudre, la diffraction de la lumière laser et la microscopie électronique à balayage. Les profils de déposition pulmonaire et de dissolution ont été respectivement déterminés in vitro à l’aide de l’essai de la pharmacopée européenne utilisant l’impacteur à cascade multi-étages et d’un test de dissolution adapté aux formes pulmonaires. Les quatre formulations élaborées présentaient des caractéristiques physicochimiques intéressantes pour la stabilité à long-terme de la substance active et des formulations. De plus, deux formulations de poudre sèche pour inhalation (les formulations F1 et F2) présentaient des propriétés aérodynamiques tout à fait attrayantes avec une fraction minimale de poudre déposée au niveau du tractus respiratoire supérieure et une fraction maximale de poudre déposée au niveau du tractus respiratoire inférieur où se localisent les tumeurs pulmonaires. De plus, l’ensemble des formulations ont montré que la fraction sélectionnée des particules fines des poudres sèches pour inhalation libérait 75% du témozolomide dans le liquide simulant le fluide pulmonaire endéans les dix premières minutes du test de dissolution in vitro adapté aux formes pulmonaires. <p>Enfin, nous avons comparé l’efficacité et la tolérance in vivo d’une de nos formulations de poudre sèche de témozolomide pour inhalation administrée soit sous forme de suspension, soit sous forme de poudre sèche, à l’aide du dispositif endotrachéal approprié chez la souris porteuse de pseudo-métastases pulmonaires. L’uniformité de la dose délivrée par les différents dispositifs a été évaluée à l’aide d’une technique quantitative validée. Les résultats de cette étude ont montré qu’en administrant une formulation de poudre sèche sous forme d’un mélange de poudres plutôt que sous forme d’une suspension liquide, les doses en témozolomide à administrer pour obtenir une efficacité comparable était au moins deux fois moins élevées. Cependant, le dispositif endotrachéal pour les formulations de poudre présentait plus de variabilité au niveau de la dose délivrée que le dispositif endotrachéal pour les formulations liquides ce qui induit une variabilité dans les doses délivrées. Pour clôturer ce travail, nous avons appliqué certaines techniques que nous avons développées pour le témozolomide à une nouvelle molécule de synthèse, le trivanillate polyphénolique 13c, qui montre des propriétés anticancéreuses intéressantes dans le cadre des tumeurs pulmonaires. En effet, une méthode quantitative a été développée et a été validée. Une étude de pré-formulation et des essais de formulation pour produire une suspension, des complexes d’inclusion et des microparticules lipidiques ont été entrepris avec de relativement bons résultats pour les complexes d’inclusion élaborés avec des gamma cyclodextrines qui permettaient d’augmenter la solubilité dans l’eau de la molécule de 13c d’un facteur d’au moins 1,5×106. De plus, les particules de 13c montraient la particularité de se solubiliser dans un mélange dichlorométhane/éthanol (1 :1 v/v) ce qui nous a permis d’élaborer des microparticules lipidiques pour lesquelles les propriétés de mouillage devront être améliorées dans l’avenir./<p>Primary lung tumors, mainly represented by non-small-cell lung cancers (cancers NSCLC), or secondary lung tumors (metastasis) cause the death of hundred thousand human beings worldwide. Despite the therapeutic modalities used, the five-year survival rate reaches only 15%. Nowadays, it is known that cancers NSCLC and metastasis are intrinsically resistant to apoptosis.<p>To overcome the main problems occurring with the systemic delivery of conventional chemotherapy which are mainly constituted of non-specific and non selective pro-apoptotic agents, we have developed some formulations based on non pro-apoptotic antineoplasic drugs which are designed to be delivered by a localized administration, the inhalation. Indeed, inhalation is the preferential route to treat the main pulmonary affections such as asthma, chronic obstructive pulmonary disease or cystic fibrosis.<p>The first part of this work consisted to produce and evaluate temozolomide-based formulations designed to be delivered to mice bearing pulmonary pseudo-metastases (using a experimental melanoma, the B16F10 model), either by the conventional intravenous (iv) route or by inhalation using an endotracheal device appropriate to mice. The suspension for inhalation was produced by means of a high pressure homogenizing technique using phospholipids compatible with the lungs to stabilize the suspension. The in vitro anticancer activity was evaluated for both temozolomide-based formulations in comparison with non-formulated temzolomide on three cancer cell lines, a human NSCLC cancer cells (A549), a human glioblastoma cancer cells (T98G) as positive control and a murine melanoma cancer cells (B16F10). The latter was used to generate lung tumors in mice by injecting the melanoma cells by iv. Reproducibility of delivered dose and generated aerosol by the endotracheal device from the suspension for inhalation and the deposition of droplets in the mouse lungs were precisely evaluated by means of a validated HPLC determination method, a laser diffraction technique and fluorescent microscopy and histological image analysis, respectively. Then, the tolerance and the antitumor efficacy of iv or inhaled temozolomide-based treatments were evaluated on mice bearing pulmonary pseudo-metastases B16F10. The results showed that endotracheal device produced reproducible doses and aerosols and that the aerosol droplets were deposited deeply in the mouse lungs. Moreover, the temozolomide-based treatments were well tolerated in terms of weight evolution and the inhaled based-temozolomide treatments were able to get the same antitumor efficacy in terms of median survival rate as the conventional iv based-temozolomide treatments delivered at a same frequency. Moreover with the group treated by inhalation three times a week during three consecutive weeks, 11% (3/27) mice survived with an almost complete eradication of lung tumors which was not observed with the groups treated by conventional route.<p>Then, the second part of our work consisted to produce temozolomide-based dry powders for inhalation able to be delivered with a dry powder inhaler for human use. We developed the dry powders for inhalation using a high-pressure homogenizing technique to micronize temozolomide particles and then spray-drying technique to coat temozolomide microparticles. The coating was either hydrophilic or lipophilic. Then, the physicochemical characteristics such as thermal or crystalline properties, the particle size distribution and the particle morphology were evaluated for the four dry powders for inhalation by means of differential scanning calorimetry, x-ray powder diffraction, laser light scattering and scanning electron microscopy, respectively. The in vitro pulmonary deposition and dissolution were respectively determined by European pharmacopeia assay for the aerodynamic assessment of fine particles using a multi-stage liquid impinger and by dissolution test optimized for inhaler products. The four formulations produced presented physicochemical properties promoting long-term stability of temozolomide and formulations.Moreover, two of them (dry powder without coating or with a thin lipid coating) showed attractive aerodynamic properties with a minimal fraction of powder deposited in the oropharyngeal and tracheal zones and maximal fraction deposited in the lungs (almost 50% of the nominal dose) where the lung tumors are localized. Moreover, fine particle fraction of all formulations showed a fast release and dissolution of temozolomide with more than 75% of temozolmide dissolved within 10 minutes in the simulated lung fluid during the in vitro dissolution test optimized for dry powders for inhalation.<p>Then, we compared the in vivo antitumor efficacy and tolerance of one of dry powders for inhalation on mice bearing pulmonary pseudo-metastases B16F10. The dry powder for inhalation was administered either by dispersing it as a extemporaneous suspension able to be delivered by the endotracheal device for liquid forms or by mixing it with a spray-dried diluent able to be delivered by the endotracheal device for dry powders. The uniformity of delivered dose by the different endotracheal device was evaluated by a validated quantitative method. The results showed that the delivery of the powder mixture presented the same antitumor efficacy as the extemporaneous suspension but for a half dose of temozolomide. However, the endotracheal device for dry powders presented a higher variability of delivered dose than the endotracheal device for liquid forms.<p>Finally, we apply the pulmonary application on a polyphenol developed in the Faculty of Pharmacy, the molecule 13c, that showed very interesting in vitro anticancer properties against lung tumors. So, a quantitative method was developed and was validated. A preformulation studie was performed and formulation developements are on-going.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les mutations du gène MEN1 prédisposent au syndrome des Néoplasies Endocriniennes Multiples de type 1 (NEM1), caractérisé par des tumeurs endocrines multiples. Les souris hétérozygotes pour Men1 développent des tumeurs similaires, ainsi que des cancers de la prostate et des glandes mammaires, avec une incidence faible. J'ai pu montrer que l'expression de la protéine menin, codée par ce gène, est totalement inactivée dans les carcinomes prostatiques développés chez ces souris et est associée à une dérégulation de l'expression du récepteur aux androgènes et une inactivation de l'inhibiteur des CDK p27, un gène cible connu de menin. Des souris WapCre-Men1 F/F, où le gène Men1 est invalidé dans les cellules mammaires, développent des néoplasies intraépithéliales mammaires (MIN) avec une forte incidence à partir de 9 mois. Une fuite d'expression du transgène WapCre dans l'hypophyse entraîne en plus le développement de prolactinomes chez ces souris, les conduisant à une mort prématurée. Par diverses analyses, j'ai pu déterminer que l'augmentation de l'incidence de ces lésions ne pouvait pas être seulement expliquée par l'influence des prolactinomes. De manière intéressante, j'ai pu mettre en évidence une nette diminution du marquage membranaire de beta-caténine, un partenaire connu de menin, ainsi que de E-cadhérine dans les lésions MIN, suggérant une altération de la cohésion cellulaire en absence de menin. L'ensemble des données obtenues pendant ma thèse indiquent un rôle potentiel de l'invalidation du gène Men1 dans le développement de carcinomes prostatiques et de néoplasies mammaires chez la souris

Les TNE-GEPs constituent un groupe de tumeurs hétérogènes pour lesquelles il convient d'élargir les approches thérapeutiques. Les thérapies ciblées, particulièrement l'inhibition de la voie mTOR par l'évérolimus, sont la référence pour les TNE-GEPs pancréatiques. Néanmoins, le bénéfice thérapeutique de l'évérolimus n'a pas été évalué dans le sous-groupe des carcinomes neuroendocrines GEPs peu différenciés (pdCNE-GEPs). A travers un modèle préclinique in vivo, nous montrons que l'inhibition de mTOR pourrait constituer une option thérapeutique pour les pdCNEGEPs. Ensuite, une étude protéomique a mis en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans la progression de TNE-GEPs. Certaines protéines identifiées présentent un rôle dans la régulation du cytosquelette. Parmi celles-ci, CRMP2 est un acteur clé de la voie de signalisation des sémaphorines de classe 3 (sema3). Un profil d'expression de ces sema3 montre que l'expression de la sema3F est diminuée dans les TNE-GEPs. La ré-expression de ce facteur dans des modèles cellulaires de TNEGEPs montre que la sema3F induit une baisse de la survie et de la prolifération. In vivo, la sema3F permet de ralentir le développement tumoral. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle de la voie de signalisation de la sema3F dans la progression des TNE-GEPs

Ce mémoire présente l’étude de certains effets pharmacologiques de nouveaux analogues synthétiques des cannabinoïdes. Un des objectifs de longue date des recherches sur les cannabinoïdes a été la découverte de puissants analogues synthétiques de substances naturelles, qui pourraient être développés comme médicaments. Cela nécessite, entre autres, qu’ils soient exempts d’effets psychotropes qui caractérisent l’usage récréatif du Cannabis. Le moteur derrière cet objectif a été la longue histoire de l’usage du Cannabis comme substance médicale, en particulier dans le traitement de la douleur et de l’inflammation. Parmi les nombreux effets pharmacologiques des cannabinoïdes, deux sont d’un grand intérêt thérapeutique : l’effet antiprolifératif sur les cellules tumorales et l’effet anti-angiogène. Dans ce mémoire, l’étude de ces deux effets a été réalisée sur des cultures cellulaires tumorales et endothéliales humaines. Les tests de prolifération sur les deux types de cellules n’ont pas montré de cytotoxicité. Ce qui a permis de poursuivre l’étude de l’effet anti-angiogène, et qui a mis fin à l’étude de l’effet anti-tumoral. L’inhibition de l’angiogénèse a été investiguée en réalisant des tests de recolonisation d’une zone dénudée dans une monocouche de cellules endothéliales et des tests de formation de microtubules sur matrice gélifiée. L’effet anti-angiogène n’a pas pu être évalué à cause de problèmes de contamination, néanmoins certaines molécules montrent un effet anti-migratoire. L’absence de cytotoxicité et l’analogie structurale avec le -tétrahydrocannabinol encourage à continuer l’investigation des effets pharmacologiques de ces nouvelles molécules synthétiques. Il serait aussi pertinent d’étudier, dans une thèse de doctorat, les mécanismes d’actions moléculaires par lesquels agissent ces molécules. / This thesis aims to assess the pharmacological effects of new synthetic cannabinoid analogs. A long-standing goal in cannabinoid research has been the discovery of potent synthetic analogs of the natural substances that might be developed as clinically useful drugs. This requires, among other things, that they be free of the psychotropic effects that characterize the recreational use of Cannabis. An important driving force for this goal is the long history of the use of Cannabis as a medicinal agent especially in the treatment of pain and inflammation. Among the many pharmacological effects of cannabinoids, two are of great therapeutic value: the anti-proliferative effect on tumor cells and anti-angiogenic effect. In this thesis, the study of these two effects has been conducted on tumoral and endothelial culture cell. The proliferation tests on both types of cells showed no cytotoxicity. This allowed further study of the anti-angiogenic effect, and ended the study of anti-tumoral effect. Inhibition of angiogenesis has been investigated by performing recolonization tests of a denuded area on endothelial cell monolayer and microtubules formation tests on gel matrix. This effect could not be evaluated because of contamination problems; however, some molecules show anti-migration effects. The absence of cytotoxicity and structural analogy with -tetrahydrocannabinol encourages the investigation in pharmacological effects of these new synthetic molecules. It would also be interesting to study in a doctoral thesis, the molecular mechanisms of action involved.

Le neuroblastome (NB) est la tumeur solide extracranienne la plus fréquente et mortelle chez les jeunes enfants. Il se caractérise par une résistance à la chimiothérapie possiblement en partie dû à la présence de cellules initiatrices de tumeurs (TICs). Des études ont mis en évidence le rôle de CD133 comme un marqueur des TICs dans divers types de cancers. Les buts de notre travail étaient d’abord de démontrer les vertus de TICs des cellules exprimant CD133 et ensuite, en utilisant une analyse globale du génome avec des polymorphismes nucléotidiques simples (SNPs), d’effectuer une analyse différentielle entre les TICs et les autres cellules du NB afin d’en identifier les anomalies génétiques spécifiques. Des lignées cellulaires de NB ont été triées par cytométrie de flux afin d’obtenir deux populations: une enrichie en CD133 (CD133high), l’autre faible en CD133 (CD133low). Afin de déterminer si ces populations cellulaires présentent des propriétés de TICs, des essais sur les neurosphères, les colonies en agar mou et les injections orthotopiques de 500 cellules sélectionnées dans 11 souris ont été réalisées. Après une isolation de l’ADN des populations sélectionnées, nous avons effectué une analyse génotypique par SNP utilisant les puces « Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 ». Pour vérifier l’expression des gènes identifiés, des Western Blots ont été réalisés. Nos résultats ont démontré que la population CD133 avait des propriétés de TICs in vitro et in vivo. L’analyse génotypique différentielle a permis d’identifier deux régions communes (16p13.3 and 19p13.3) dans la population CD133high ayant des gains et deux autres régions (16q12.1 and 21q21.3) dans la population CD133low possédant des pertes d’hétérozygoties (LOH). Aucune perte n’a été observée. Parmi les gènes étudiés, l’expression protéique d’éphrine-A2 était corrélée à celle de CD133 dans 6 tumeurs et 2 lignées cellulaires de NB. De plus, l’augmentation de la concentration d’anticorps anti-éphrine-A2 dans le milieu diminue la taille des neurosphères. Ainsi, la population CD133high, qui a des vertus de TICs, possède des caractéristiques génotypiques différentes par rapport à celle CD133low. La présence d’éphrine-A2 dans les cellules exprimant CD133 souligne son importance dans le développement des TICs. Ces résultats suggèrent la présence de potentielle cible pour de nouvelles thérapeutiques ciblant les TICs mise en évidence par l’étude génomique. / Neuroblastoma (NB) is the most common and deadly extracranial solid tumor of childhood characterized by a resistance to chemotherapy possibly due to the presence of tumor initiating cells (TICs). Studies showed the role of CD133 as a marker of TICs in various types of cancers. Our goals were first to demonstrate the stemness of TICs expressing CD133 and then, using a global genomic analysis with single nucleotide polymorphism (SNPs), to perform a differential analysis between TICs and other cells of NB to identify the specific genetic abnormalities. NB cell lines were sorted by flow cytometry to obtain two populations: one enriched in CD133 (CD133high), the other low in CD133 (CD133low). To determine whether these cell populations have TICs properties, we test the ability of cells to form either neurosphères or, colonies in soft agar and we also test their carcinogenic properties by orthotopic injections of 500 selected cells in 11 mice. After a DNA extraction on selected populations, a differential genotyping analysis has been made with Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0. To verify the expression of the genes identified, Western blots had been made. Our results have demonstrated that CD133high population presented TICs properties in vitro and in vivo. The differential genotyping analysis allowed identifying two gains common regions (16p13.3 and 19p13.3) in CD133high population and two others loss of heterozygosity (LOH) (16q12.1 and 21q21.3) in CD133low population . No losses were observed. Among the genes studied, ephrin-A2 protein expression was correlated to CD133 expression in 6 NB tumors and 2 NB cell lines. Also, ephrin-A2’s increased concentration influenced the neurospheres by decreasing their size. Thereby, CD133high population, which had TICs properties, possess different genotyping characteristics compared to CD133low population. The presence of ephrine-A2 in cells expressing CD133 emphasizes its importance in the development of TICs. These results suggest the presence of potential target for new therapies targeting the TICs demonstrated by the genomic study.

L’adénovirus a été étudié dans l’optique de développer de nouveaux traitements pour différentes maladies. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont des outils intéressants du fait qu’ils peuvent être produits en grandes quantités (1X1012 particules par millilitre) et de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes ou en division rapide. Les AdVs ont subi bon nombre de modifications pour leur permettre de traiter des cellules tumorales ou pour transporter des séquences génétiques exogènes essentielles pour le traitement de maladies monogéniques. Toutefois, les faibles niveaux d’expression du récepteur primaire de l’adénovirus, le CAR (récepteur à l’adénovirus et au virus coxsackie), réduit grandement l’efficacité de transduction dans plusieurs tumeurs. De plus, certains tissus normaux comme les muscles n’expriment que très peu de CAR, rendant l’utilisation des AdVs moins significative. Pour pallier à cette limitation, plusieurs modifications ont été générées sur les capsides virales. L’objectif de ces modifications était d’augmenter l’affinité des AdVs pour des récepteurs cellulaires spécifiques surexprimés dans les tumeurs et qui seraient exempts dans les tissus sains avoisinant. On peut mentionner dans les approches étudiées: l’utilisation de ligands bispécifiques, l’incorporation de peptides dans différentes régions de la fibre ou la substitution par une fibre de sérotypes différents. Notre hypothèse était que les domaines d’interaction complémentaire (K-Coil et ECoil) permettraient aux ligands de s’associer aux particules virales et d’altérer le tropisme de l’AdV. Pour ce faire, nous avons inclus un domaine d’interaction synthétique, le K-Coil,dans différentes régions de la fibre virale en plus de générer des mutations spécifiques pour abolir le tropisme naturel. Pour permettre la liaison avec les récepteurs d’intérêt dont l’EGF-R, l’IGF-IR et le CEA6, nous avons fusionné le domaine d’interaction complémentaire, le E-Coil, soit dans les ligands des récepteurs ciblés dont l’EGF et l’IGF-I, soit sur un anticorps à un seul domaine reconnaissant la protéine membranaire CEA6, l’AFAI. Suite à la construction des différents ligands de même que des différentes fibres virales modifiées, nous avons determiné tout d’abord que les différents ligands de même que les virus modifiés pouvaient être produits et que les différentes composantes pouvaient interagir ensemble. Les productions virales ont été optimisées par l’utilisation d’un nouveau protocole utilisant l’iodixanol. Ensuite, nous avons démontré que l’association des ligands avec le virus arborant une fibre modifiée pouvait entraîner une augmentation de transduction de 2 à 21 fois dans différentes lignées cellulaires. À cause de la difficulté des adénovirus à infecter les fibres musculaires occasionnée par l’absence du CAR, nous avons cherché à savoir si le changement de tropisme pourrait accroître l’infectivité des AdVs. Nous avons démontré que l’association avec le ligand bispécifique IGF-E5 permettait d’accroître la transduction autant dans les myoblastes que dans les myotubes de souris. Nous avons finalement réussi à démontrer que notre système pouvait induire une augmentation de 1,6 fois de la transduction suite à l’infection des muscles de souriceaux MDX. Ces résultats nous amènent à la conclusion que le système est fonctionnel et qu’il pourrait être évalué dans des AdVs encodant pour différents gènes thérapeutiques. / Adenoviruses have been studied as a way to develop new treatments for different diseases. Adenoviral vectors (AdV) are considered interesting tools for this propose, because they can be produced at high titers (1X1012 particles per millilitre) in laboratory and they have the capacity to infect non-dividing and dividing cells. AdV have been often modified in order to obtain the ability to kill tumour cells or to deliver exogenous genetic sequences essential to treat monogenic disease. However, weak expression of the primary adenovirus receptor, the CAR (Coxsackie and adenovirus receptor) reduces greatly the transduction efficiency of AdV for the tumour cells. Moreover, some normal tissues express low amount of CAR, like the skeletal muscle, reducing the appeal of using AdV as a gene delivery vehicle for this tissue. To address this problematic, many modifications were done on the adenoviral capsid. The goal of these modifications were to generate an AdV able to target specific cellular receptors that were expressed in tumour cells but not in normal cells. Several approaches were done to modify the tropism of AdV, such as incubation with a bispecific ligands, incorporation of peptides within the adenoviral fiber structure or substitution of the viral fiber with a different serotype fiber. The hypothesis of my project was to determine if an interaction domain fused within a ligand could bind the complementary domain incorporated on a virus and change the tropism of the AdV. The first step was to include a synthetic interaction domain, the K-Coil, within specific region of the adenoviral fiber, as well as inserting two point mutations to abolish the natural tropism. To target the EGF-R, IGF-IR and the CEA6, we fused the complementary interaction domain, the E-Coil, to the respective ligand known as the EGF and the IGF-I or to a single domain antibody (known as AFAI) that bind specifically to CEA6. The specific interaction between the E-Coil and K-Coil was used to associate the ligand with the fiber in order to retarget the AdV toward the selected receptor. We showed that the different ligands as well as the modified fibers could be produced and that both E-Coil and K-Coil expressing partners could interact together. We optimized the viral production by using an iodixanol purification protocol. More importantly, we clearly demonstrated that the ligand association with the fiber could increase the transduction efficiency between 2 to 21 fold against various tumour cells. The difficulty of adenovirus to infect muscle cells because of the lack of CAR expression brought us to evaluate the potential of our retargeted AdV to increase the transduction for the tissue. We showed that the use of IGF-E5 could increase the transduction efficiency in myoblasts as wells as in myotubes. We finally demonstrated that our retargeting system could increase the transduction efficiency for skeletal muscle by 1,6 fold in new born MDX mice. In conclusion, our results show that the retargeting system is indeed functional. This system could be assessed using vectors that express therapeutic genes.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’altération constitutionnelle des gènes BRCA1 et BRCA2 est détectée dans 20 à 30% des formes familiales de cancer du sein. La fréquence de mise en évidence d’une mutation BRCA2 selon des critères généalogiques reste modeste. La définition de caractéristiques tumorales communes aux tumeurs du sein survenant dans un contexte de prédisposition lié à BRCA2 a pour objectif l’identification de caractéristiques propres aux tumeurs BRCA2 permettant de mieux définir les indications de recherche de mutation de ce gène, et l’identification de facteurs impliqués dans la tumorigénèse des cancers du sein liés à BRCA2. L’étude des profils génomiques des tumeurs BRCA2 a caractérisé la délétion récurrente des bras longs des chromosomes 13 et 14. L’analyse supervisée des données d’expression entre les tumeurs BRCA2 et les tumeurs familiales BRCAX a identifié une signature spécifique des tumeurs BRCA2. Les exomes des chromosomes 13 & 14 pour 5 tumeurs informatives et leur ADN constitutionnel ont été séquencés afin d’identifier la ou les cibles des régions délétées. Cette analyse a permis la caractérisation de variants somatiques qui seront à étudier dans une large série de cas BRCA2 et contrôles pour conclure sur leur rôle dans la tumorigénèse liée à BRCA2.La caractérisation de pertes de matériel chromosomique spécifiques aux tumeurs BRCA2, rapportée dans plusieurs études, offre une perspective diagnostique avec le développement d’un test FISH utilisable en pratique clinique pour préciser les indications d’une recherche de mutation du gène BRCA2, mais suggère également la présence de gènes cibles candidats dont l’inactivation est requise lors de la cancérisation mammaire liée à BRCA2. / Germline BRCA1 and BRCA2 mutations account for 20-30% of familial breast cancer. The main indication for BRCA2 screening is a family history, but the mutation detection rate in patients selected this way is low. The identification of characteristics common to BRCA2-associated tumors would improve the criteria used to select patients for BRCA2 screening and could identify factors implicated in BRCA2-mutant breast cancer tumorigenesis. The analysis of BRCA2-mutant breast tumor genomic profiles identified deletions of chromosomes 13q and 14q as a common feature of BRCA2-tumors. Supervised gene expression analysis of BRCA2-mutant breast tumors and familial breast tumors without germline BRCA1 or BRCA2 mutations identified a specific BRCA2 gene signature. Exome sequencing of chromosomes 13q and 14q for 5 BRCA2-mutant tumors, and their associated germline DNA was performed in order to identify the target(s) of the specific genomic deletions in the BRCA2 tumors. This analysis characterized somatic variants that will be screened for in a larger cohort of BRCA2 and control tumors cases to explore their role in BRCA2-mutant breast cancer. Our study identified deletions of chromosomes 13q and 14q as a common feature of tumors with germline BRCA2 mutations, as has been observed in several previous studies. We suggest that FISH analysis for the deletion of these chromosomes would be a rapid and technically feasible first step to select tumors worth screening for germline BRCA2 mutations and we hypothesize that the inactivation of candidate genes located in these deleted regions allows the cell to resume division and progress thus contributing to tumorigenesis in BRCA2-mutant tumors.