As septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina. As septinas têm mostrado ter um papel importante na citocinese e outros processos celulares, incluindo a determinação da polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Todos os membros da família de septinas são compostos por três domínios: um N-terminal variável, um domínio central GTPase e uma região C-terminal que inclui sequências de coiled-coil. Septinas possuem uma característica de polimerizarem para formar complexos hetero-oligoméricos altamente organizados, in vivo e in vitro. Estruturas homo-oligoméricas também foram observadas, embora sua função ainda não esteja bem estabelecida. A Septina 2 humana (SEPT2) se acumula no sulco de clivagem de células em divisão, desde a anáfase até a telófase, além de interagir com a actina, e também está envolvida em doenças neurodegenerativas, como mal de Azheimer. Nesse estudo, a ORF que codifica SEPT2, bem como os fragmentos que codificam seus domínios, foram clonados, expressos em E.coli e purificados por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os produtos foram analisados por espectroscopia de dicroísmo circular, espalhamento de luz a ângulo fixo e espectroscopia de fluorescência extrínseca, usando Tioflavina-T, que é um marcador clássico para fibras amilóides. Em todos os casos, os produtos formaram homodímeros in vitro, e também agregaram em temperaturas fisiológicas. O desenovelamento térmico das proteínas recombinantes revelou a presença de uma população intermediária de desenovelamento, rica em folhas-β, e que ligam Tioflavina-T, sugerindo uma estrutura amiloidogênica para essa proteína, confirmada pelos programas de predição TANGO e WALTZ. Imagens dessas fibras foram obtidas usando Microscopia eletrônica de Transmissão, evidenciando uma agregação organizada das proteínas. Além disso, usando monocamadas de Langmuir, foi possível confirmar a ligação específica de SEPT2 ao fosfolipídeo fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PtdIns(4,5)P2). Essa ligação específica mantém a estrutura secundária de SEPT2, observada pela técnica PM-IRRAS, algo que não ocorre caso o lipídio seja inespecífico, sugerindo uma associação de SEPT2 com a membrana plasmática e podendo ter um papel na regulação das septinas. Por meio da técnica de duplo híbrido em levedura, identificamos proteínas que interagem com a SEPT2, como a MPBI e a DCTN2, auxiliando na elucidação de processos em que a SEPT2 possa participar. O conjunto dos resultados sobre a estabilidade, os processos de agregação de SEPT2 e a identificação de novos parceiros protéicos de interação, obtidos nesse trabalho, contribuíram para o melhor entendimento da função da SEPT2 e de seu envolvimento em desordens neurodegerenativas. / Septins are members of a conserved group of GTP-binding and filament-forming proteins. They are involved in a variety of cellular processes, such as microtubule regulation, vesicle trafficking, the formation of scaffolding platforms and actin dynamics. Human Septin 2 (SEPT2) has an N-terminal polybasic region responsible for lipid binding, a GTPase domain, and a C-terminal domain. SEPT2 is essential for cytokinesis and it is found in many tissues, mainly in the brain. Together with SEPT1 and SEPT4, it is accumulated in deposits known as neurofibrillary tangles in Alzheimers disease, which is evidence that SEPT2 may be involved in this process. In this study, the human SEPT2, and its domains, were cloned, expressed in E.coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. The proteins form homodimers in vitro, suggesting that the GTPase domain is enough to promote the oligomerization. Thermal unfolding revealed the formation of aggregates under physiological conditions, which have the ability to bind a specific amyloid dye, Thioflavin-T, suggesting them to be an amyloidal fiber. Besides, in silico prediction programs, TANGO and WALTZ, corroborate that SEPT2 contain regions with high probability of aggregation and amyloidogenic formation, respectively. Moreover, we observed 20-50 nm thick filamentous structures by electron microscopy of negatively stained. Using Langmuir monolayers at the cell membrane lipid packing, SEPT2 and SEPT2NG bound to the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Results from in situ PM-IRRAS experiments indicated that the secondary structure of SEPT2 is preserved upon interacting with PtdIns(4,5)P2, but not when interacting with DPPC - which is not specific for SEPT2 - at the air/water interface suggesting an association with the plasma membrane and a role in septin regulation. Furthermore, we also identified protein partners of SEPT2, from both human leukocyte and brain fetal cDNA libraries, using the yeast two-hybrid system. SEPT2 was shown to interact with: septins 6 and 4; a serine-protease and a MAP inhibitory protein; an ubiquitin-conjugating enzyme; and proteins related to cellular division. Thus, taken together this study contributed for the knowledgment of the stability and the aggregation kinetic of the SEPT2, leading to a better understanding of this protein and their role in neurodegenerative disorders.

A eficiência da reprodução sexual de plantas depende do correto desenvolvimento dos órgãos sexuais: estame e pistilo. Mecanismos moleculares complexos controlam a proliferação e expansão celular que resultam no correto desenvolvimento destes órgãos. Em nosso laboratório foi identificado um gene preferencialmente expresso no pistilo de Nicotiana tabacum, o gene 092H06. Este gene codifica uma pequena proteína de 68 aminoácidos, e função desconhecida. Análises anteriores sugerem que o produto proteico do gene 092H06 seja responsável por inibir o processo de expansão celular nos órgãos reprodutivos (Brito,2010). Para compreender o papel deste gene, no desenvolvimento do pistilo, foram realizados experimentos de qRT-PCR para determinar se os níveis de expressão de genes para -expansina, -expansina, ciclina B1.2 e actina, ligados aos processos de divisão e expansão celular, em plantas transgênicas de silenciamento e superexpressão do gene 092H06. Foram realizadas análises morfológicas nos estigmas/estiletes e ovários das plantas transgênicas de segunda geração (T2), por microscopia óptica. Os resultados mostram uma tendência de aumento no volume das células tanto nas plantas transgênicas de silenciamento, como nas de superexpressão. Entretanto, nas plantas de silenciamento ocorreu um aumento visível das estruturas reprodutivas, o que não foi observado nas plantas de superexpressão. Adicionalmente, foram realizados experimentos de citometria de fluxo, para verificar a ocorrência de endorreduplicação. Os resultados mostraram que não ocorreu endorreduplicação nas células das plantas transgênicas. No screening de uma biblioteca de duplo híbrido, usando 092H06 como isca, foram encontrados 4 candidatos a parceiros de interação: 1) biotin/lipolyl attachmente domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor e 4) RING/U-box. Para auxiliar no estudo da função do gene 092H06, a proteína recombinante 092H06-Histag foi produzida com sucesso, na forma solúvel, em E. coli. Os resultados alcançados neste trabalho contribuem para avançar o conhecimento sobre este novo gene expresso nos órgãos reprodutivos das plantas. / The efficiency of plant sexual reproduction depends on the correct development of the sexual organs: stamen and pistil. Complex molecular mechanisms control cell proliferation and expansion that result in the correct development of these organs. In our laboratory a gene preferentially expressed in Nicotiana tabacum pistil has identified, the 092H06 gene. This gene encodes a small protein of 68 amino acids of unknown function. Previous analyzes suggest that the protein product of the gene 092H06 is responsible for inhibiting the cell expansion process in the reproductive organs (Brito, 2010). To understand the role of this gene in pistil development, experiments of qRT-PCR to determinate the expression levels of the -expansins, -expansins, cyclin B1.2 and actin, genes which connected to the cell division and expansion processes, were carried out on transgenic plants silencing and overexpressing the 092H06 gene. Morphological analyzes on stigmas/styles and ovaries of second generation (T2) transgenic plants were performed by optical microscopy. The results show a tendency to increased cellular volume on the silencing transgenic plants, as well as on the overexpressing plants. However, in the silencing plants there was a visible increase of the reproductive structures, what has not been observed on the overexpressing plants. Additionally, flow cytometry experiments were carried out to verify the occurrence of endoreduplication. The results showed that no endoreduplication has occurred on the cells of the transgenic plants. The screening of a yeast two-hybrid assays, using 092H06 as bait, has found 4 interaction partners candidates: 1) biotin/lipolyl attachment domain-containing protein; 2) unknown protein; 3) trypsin proteinase inhibitor precursor and 4) RING/U-box. To assist the study of the 092H06 function, the recombinant 092H06-HIStag protein has been produced with success, in the soluble form, in E.col. The results obtained in this work contribute to advance the knowledge of this novel gene expressed on the plant reproductive organs.

Orientadores: Jorg Kobarg, Jose Andres Yunes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T22:20:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Trindade_DanielMaragno_D.pdf: 7352494 bytes, checksum: 5b03d143205e747b05e3d4b6a8ed8e34 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Staniocalcinas (STCs) representam uma pequena família de hormônios glicoprotéicos, encontrados em todos os vertebrados e composta por STC1 e STC2, que foram inicialmente implicados na homeostase de cálcio e recentemente também foram implicados em vários outros processos. Stanniocalcina-1 (STC1), o primeiro membro encontrado, foi originalmente descoberto em peixes ósseos e posteriormente identificado em humanos onde parece ter um papel, embora ainda obscuro, na carcinogênese e angiogênese. Nos seres humanos STC1 pode ser encontrado em duas formas: um dímero ou um grupo de variantes de alto peso molecular coletivamente chamados bigSTC. Uma vez que ambas as células leucêmicas e os tumores sólidos dependem vascularização, a angiogênese é um passo fundamental na interação tumorhospedeiro e essencial para a progressão do câncer. Análises prévias de microarray resultaram na identificação de vários genes ativados em células endoteliais da medula óssea (BMEC) modulados pela presença de células leucêmicas. Apresentamos aqui STC1 como um marcador microambiente de medula óssea (BMM) durante leucemia linfoblástica aguda (LLA) pela validação dos dados prévios de microarray através de PCR em tempo real quantitativos. Em vista da falta de informações funcionais e estruturais sobre STC1 realizamos: (1) um screen no sistema de duplo híbrido em levedura, a fim de encontrar algumas das proteínas que interagem com a STC1 humana, e (2) uma caracterização estrutural inicial à baixa resolução desta proteína. Fomos capazes de construir um mapa interação proteína-proteína, obtido a partir dos 22 interactantes encontrados em screen de duplo híbrido em levedura. As proteínas encontradas apresentam-se em vários compartimentos celulares nos quais STC1 já foi demonstrada para estar presente, e essas novas informações podem ajudar a esclarecer como e qual o papel STC1 desempenha nesses locais. A fim de fornecer informação estrutural sobre STC1, realizamos análises bioquímicas e estruturais da proteína recombinante STC1 com 6xHis tag produzida em células de inseto utilizando o sistema baculovírus. A análise de dicroísmo circular confirmou a predição in silico do elevado conteúdo de alfa-helices. A análise por espectrometria de massas forneceu os dados experimentais que confirmaram o padrão conservado de pontes dissulfeto anteriormente descrito para STC1 de peixes. Finalmente, os dados de espalhamento de raios-X a baixo ângulo demonstraram que, STC1 adota uma estrutura dimérica, ligeiramente alongada em solução fornecendo deste modo os primeiros dados estruturais à baixa resolução desta família de proteínas. Além disso, foi possível obter proteína suficiente e de elevado grau de pureza para realizar ensaios cristalização que resultaram em cristais os quais difrataram a boa resolução. / Abstract: Staniocalcins (STCs) represent a small family of glycoprotein hormones found in all vertebrates composed by STC1 and STC2, which have been initially implicated in calcium homeostasis and also recently implicated in several other processes. Stanniocalcin-1 (STC1), the first member found, was originally discovered in bony fishes and later identified in humans were it seems to have a role, although still unclear, in carcinogenesis and angiogenesis. In humans STC1 can be found in two forms: a dimer or a group of higher molecular weigh variants collectively called bigSTC. Since both leukemic cells and solid tumors depend on vascularization, angiogenesis is a fundamental step in tumor-host interaction and essential to the cancer progression. Previous microarray analysis resulted in the identification of several activated genes in bone marrow (BM) endothelial cells (BMEC) modulated by presence of leukemic cells. Here we present STC1 as a BM microenvironment marker during acute lymphoblastic leukemia (ALL) by validating previous microarray data by quantitative RealTime-PCR. In view of the lack of functional and structural information on STC1 we performed (1) a yeast two hybrid screen in order to find some of the human STC1 interacting proteins and (2) a initial structural lowresolution characterization of this protein. We were able to construct a protein-protein interaction map, derived from the 22 interactants found in our yeast two-hybrid screen. The proteins found are located in several cellular compartments in which STC1 has already been shown to be present, and the new information might help to clarify how and which role it performs at these sites. As a means to provide structural information about STC1, we performed biochemical and structural analyses of recombinant STC1 6xHis tagged protein produced in insect cells by using the baculovirus system. Circular dichroism analysis confirmed the in silico predicted high alpha-helical content. By mass spectroscopy analysis we provided experimental data that confirmed the conserved disulfide pattern previously described for fish STC1. Finally Small Angle X-ray Scattering data demonstrated that STC1 adopts a dimeric, slightly elongated structure in solution, providing there by the first low resolution structural data of this family of proteins. Additionally, we could obtain enough protein of high purity to perform crystallization trials that resulted in crystals diffracting at good resolution. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A biologia da reprodução de plantas é um campo de grande interesse, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes). O pistilo é o órgão reprodutivo feminino, composto de estigma, estilete e ovário. Devido à importância central do pistilo no sucesso da reprodução de plantas, faz-se necessário um melhor conhecimento dos genes e processos que regulam seu desenvolvimento e funcionamento. Estudos comparativos da expressão gênica nos órgãos vegetativos e reprodutivos de Nicotiana tabacum revelaram genes de expressão preferencial nos órgãos reprodutivos, entre eles alguns codificando proteínas de função ainda desconhecida. Um destes genes foi caracterizado e denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), por apresentar um papel importante no desenvolvimento do estigma/estilete, atuando como um inibidor de ciclo celular tecido-específico (DePaoli et al., 2011). O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares pelos quais NtSCI1 regula o ciclo celular, investigando seus parceiros de interação. Em um ensaio de pull-down, utilizando-se extrato proteico nuclear de estigmas/estiletes de N. tabacum, vários putativos reguladores de ciclo celular foram identificados, sendo a interação entre NtSCI1 e NtCDKG;2 confirmada por BiFC e localizada no nucléolo. Uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido de levedura, foi construída com sucesso. O screening desta biblioteca, utilizando BD-NtSCI1 como \"isca\", permitiu a identificação de vários parceiros de interação com NtSCI1, entre eles: uma helicase de RNA DEAD-BOX, a proteína 14-3-3D2, dois fatores de transcrição (HOMEOBOX-22 e STOREKEEPER), um fator de splicing portador do domínio SWAP, uma quinase de adenosina e uma transposase. As interações entre NtSCI1 e os três primeiros parceiros citados já foram confirmadas por BiFC (observadas no núcleo e nucléolo) e a interação entre NtSCI1 e Nt14-3-3D2 foi confirmada também por co-imunoprecipitação. O envolvimento de NtSCI1 com a regulação do ciclo celular foi corroborado pela interação entre NtSCI1 e a proteína NtCICLINA-L1 (subunidade regulatória de CDKG;2), confirmada por duplo-híbrido e por BiFC, no nucléolo. A interação entre NtSCI1 e NtCICLINA-RELATED também foi confirmada por BiFC. Para entender a dinâmica de NtSCI1 no nucléolo, foi estudada a localização subcelular da proteína de fusão NtSCI1-GFP durante as fases do ciclo celular. NtSCI1-GFP foi observada no nucléolo de células BY-2 em interfase e prófase, desaparecendo na metáfase e anáfase e reaparecendo no nucléolo no final da telófase, mostrando que a presença de NtSCI1 na célula é controlada pelo ciclo celular. A construção de uma primeira versão do interactoma de NtSCI1 mostrou seu envolvimento direto e indireto com proteínas relacionadas ao metabolismo de RNAs, controle da transcrição e regulação do ciclo celular. Estes resultados sugerem que NtSCI1 possa atuar no controle do ciclo celular de forma não canônica, por meio de múltiplos processos paralelos que interconectam aspectos da regulação da transcrição e o processamento de RNAs com o controle do ciclo celular. / The biology of plant reproduction is a field of great interest, since most of the food consumed by humans is composed of reproductive parts of plants (fruits and seeds). The pistil is the female reproductive organ, composed of stigma, style and ovary. Due to the central importance of the pistil in the success of plant reproduction, a better knowledge of the genes and processes that regulate pistil development and function is necessary. Comparative studies of gene expression in vegetative and reproductive organs of Nicotiana tabacum have revealed genes preferentially expressed in the reproductive organs, among them some encoding proteins of unknown function. One of these genes was characterized and denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), since it has an important role in stigma/style development, acting as a tissue-specific cell-cycle inhibitor (DePaoli et al., 2011). The objective of the present work was to study the molecular mechanisms through which NtSCI1 regulates the cell cycle investigating its interaction partners. In a pull-down assay, using nuclear protein extracts from N. tabacum stigmas/styles, several putative cell cycle regulators were identified. Among them, the interaction between NtSCI1 and NtCDKG;2 was confirmed by BiFC and localized in the nucleolus. A N. tabacum stigma/style cDNA library in the yeast two-hybrid system was successfully constructed. The screening of this library, using BD-NtSCI1 as bait, allowed the identification of several NtSCI1 interaction partners, among them: a DEAD-BOX RNA helicase; the 14-3-3D2 protein; two transcription factors (HOMEOBOX-22 and STOREKEEPER); a splicing factor containing a SWAP domain; an adenosine kinase; and a transposase. The interactions between NtSCI1 and the first three mentioned partners have already been confirmed by BiFC (observed in the nucleus and nucleolus) and the interaction between NtSCI1 and Nt14-3-3D2 was also wconfirmed by co-immunoprecipitation. The NtSCI1 involvement in cell cycle regulation was corroborated by the interaction between NtSCI1 and the NtCYCLIN-L1 (a regulatory subunit of CDKG;2), which was confirmed by two-hybrid and BiFC in the nucleolus. The interaction between NtSCI1 and NtCYCLIN-RELATED was also confirmed by BiFC. To understand the dynamics of NtSCI1 in the nucleolus, the subcellular localization of the fusion protein NtSCI1-GFP was studied during the different cell cycle phases. NtSCI1-GFP was observed in the nucleolus of BY-2 cells at interphase and prophase, disappearing at metaphase and anaphase and reappearing in the nucleolus at the end of telophase, showing that NtSCI1 presence in the cell is controlled by the cell cycle. The construction of the first version of NtSCI1 interactome showed its direct and indirect involvement with proteins related to RNA metabolism, transcription control and cell cycle regulation. These results suggest that NtSCI1 may act in cell cycle control in a non-canonical way, through multiple parallel processes interconnecting aspects of transcription regulation, RNA processing and cell cycle control.

O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.

Les dommages oxydatifs de l’ADN sont impliqués dans les processus pathologiques que sont le cancer, les maladies neurodégénératives ou le vieillissement. Ces dommages résultent en partie de l’action des espèces réactives de l’oxygène (ERO), qui proviennent du métabolisme cellulaire ou d’agents exogènes (physiques ou chimiques), et qui conduisent à différents types de lésions parmi lesquelles l’oxydation des bases de l’ADN (8-oxoguanine, 8-oxoG) ou la formation de sites abasiques AP (apurique/apyrimidique). Ces lésions, qui si elles ne sont pas éliminées conduisent à des processus de mutagenèse ou de mort cellulaire, sont prises en charge spécifiquement par le système de réparation de l’ADN par excision de base ou BER. Le BER est initié par l’action d’une ADN glycosylase, telles que la 8-oxoG-ADN glycosylase (Ogg1) chargée d’éliminer la 8-oxoG, une lésion très abondante. Une étude par « double-hybride » initiatrice de ce projet a révélé l’existence d’une interaction in vivo chez S. cerevisiae entre la protéine yOgg1 et la sous-unité catalytique de l’ADN polymérase réplicative Polε (yPol2), également impliquée dans la voie BER chez la levure. Nos travaux démontrent que yOgg1 et yPol2 interagissent bien physiquement entre elles et de façon spécifique. Une étude par troncations et mutagenèse dirigée nous a permis d’identifier le domaine 3’→5’ exonucléase de yPol2 comme faisant partie de la forme tronquée minimale de yPol2 capable d’interagir avec yOgg1. La poche du site actif de yOgg1 et/ou son voisinage immédiat pourrait contenir pour partie le site d’interaction pour yPol2. Nous observons d’ailleurs une corrélation nette entre l’activité de yOgg1 et sa capacité à interagir avec yPol2 dans la levure. De même, l’activité 3’→5’ exonucléase de yPol2 pourrait être liée à son interaction avec yOgg1. D’un point de vue fonctionnel, yPol2 stimulerait l’activité AP lyase de yOgg1 et le couplage entre l’activité ADN glycosylase et AP lyase de l’enzyme, permettant ainsi une meilleure coordination de l’étape d’excision du nucléoside endommagé et l’étape de resynthèse de l’ADN dans la voie BER. / Oxidative DNA damages are involved in pathological processes such as cancer, neurodegenerative diseases and aging. Part of these damages results from the action of reactive oxygen species (ROS), which are produced by cellular metabolism or (physical or chemical) exogenous agents. They lead to different types of DNA lesions including DNA base oxidation (8-oxoguanine, 8-oxoG) and abasic site formation (AP, apuric/apyrimidic). If not removed, these lesions lead to mutagenesis or cell death. Most of base lesions are dealt specifically by the base excision repair (BER) pathway. BER is initiated by a DNA glycosylase, such as 8-oxoG-DNA glycosylase (Ogg1) which is responsible for the removal of 8-oxoG. In previous unpublished work, a yeast two-hybrid study revealed the existence in S. cerevisiae of an interaction between yOgg1 and the catalytic subunit of the replicative DNA polymerase Polε (yPol2), also involved in the BER pathway in eukaryotes. Our work shows that yOgg1 and yPol2 physically and specifically interact with each other. Truncation and site-directed mutagenesis studies allowed us to identify the 3 ' → 5' exonuclease activity domain of yPol2 as part of the minimal form of yPol2 still able to interact with yOgg1. The active site of yOgg1 and/or its immediate vicinity may contain part of its interaction domain with yPol2. Besides, we observe a clear correlation between yOgg1 catalytic activity and its ability to interact with yPol2 in vivo. Similarly, the 3'→5' exonuclease activity of yPol2 could be useful to its interaction with yOgg1. From a functional point of view, yPol2 stimulates in vitro the AP lyase activity of yOgg1 and the coupling of both DNA glycosylase and AP lyase enzyme activity. The interaction yOgg1/yPol2 could allow a better coordination of damaged nucleoside excision and DNA re-synthesis steps in BER.

O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.

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Au cours des processus de croissance folliculaire et d'ovulation, les cellules stéroïdogéniques, y compris les cellules de granulosa (CG), jouent un rôle crucial dans la maturation et la libération de l'ovocyte. Notre laboratoire a identifié et caractérisé pour la première fois tribbles pseudokinase 2 (TRIB2) dans les CG de follicules ovariens. Des études ont démontré que TRIB2 joue un rôle dans la coordination de la mitose et la morphogenèse chez la drosophile alors que chez la souris, son expression dans les cellules du cumulus serait liée à la maturation ovocytaire. Cependant, le rôle exact de TRIB2 dans la fonction des CG et ses effets sur les voies de signalisation impliquées dans la croissance folliculaire restait à être défini. La présente étude de doctorat avait donc pour but d’étudier la fonction et les partenaires de liaison de TRIB2 dans les CG de follicules ovariens bovins. À l’aide d’un modèle d’étude in vivo consistant en des CG obtenues à partir de follicules à différents stades de développement, nous avons démontré une régulation à la baisse de TRIB2 par l’hormone lutéinisante (LH) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) aussi bien au niveau du messager que de la protéine. De plus, les analyses utilisant un modèle in vitro de CG en culture ont montré que la FSH stimule l'expression de TRIB2 tandis que l'inhibition de TRIB2 via CRISPR/Cas9 entraîne une réduction significative de la prolifération des CG (P<0,05). Les analyses Western blot ont montré une augmentation des niveaux de phosphorylation d’ERK1/2 (MAPK3/1) et p38MAPK (MAPK14) suite à la surexpression de TRIB2. Ces résultats suggèrent un rôle de TRIB2 dans la croissance folliculaire et la modulation des voies MAPK. Avec l’approche double hybride chez la levure, nous avons identifié CALM1, INHBA, INPPL1, NT5E, SCD, SDHB et RAB14 comme partenaires de liaison de TRIB2. Les analyses RT-PCR ont montré que ces partenaires sont régulés différemment au cours du développement folliculaire et les manipulations de l’expression de TRIB2 (inhibition ou surexpression) résulte en une régulation différente (augmentation ou diminution) de l’expression des partenaires dans les CG. Ces résultats suggèrent un rôle de TRIB2 dans la régulation de cibles effectrices en lien avec la fonction des CG et le développement folliculaire. Enfin, un modèle de CG provenant de vaches en période post-partum a été utilisé pour mieux comprendre le contrôle de l’activité des CG. Des analyses complémentaires avec ce modèle ont révélé une réduction significative de TRIB2 chez les vaches ayant un taux élevé de BHB (>1.4mmol/L) comparé à celles ayant un faible taux de BHB (<1.2mmol/L). Cette réduction était concomitante à une augmentation d’interleukines pro-inflammatoires et une réduction d’interleukines anti-inflammatoires dans les CG. L’ensemble de ces résultats supporte un rôle de TRIB2 dans la modulation de la signalisation MAPK dans les CG, apporte une preuve solide que TRIB2 pourrait agir comme un régulateur de la prolifération et de la fonction des CG et de l’expression de gènes cibles, et suggère que TRIB2 pourrait affecter la stéroïdogenèse au cours du développement folliculaire et lors de la période post-partum. / During the processes of follicular growth and ovulation, steroidogenic cells, including granulosa cells, play a crucial role in the maturation and release of the oocyte. Our lab identified and characterized for the first time tribble pseudokinase 2 (TRIB2) in GC of ovarian follicles. Previous studies have shown that TRIB2 plays a role in the coordination of mitosis and morphogenesis in Drosophila while in mice its expression in cumulus cells is linked to oocyte maturation. However, the exact mechanism of action of TRIB2 as well as its function and effects on signaling pathways in GC during follicular growth remained to be defined. This study aimed therefore to further investigate TRIB2 function and identify its binding partners in GC. TRIB2 inhibition and overexpression experiments were conducted using, respectively, CRISPR/Cas9 technology and the pQE1 system. Using an in vivo model consisting of GC obtained from follicles at different stages of development, we demonstrated a downregulation of TRIB2 by the endogenous luteinizing hormone (LH) and human Chorionic Gonadotropin (hCG) at both the messenger and protein levels. In addition, analyzes using an in vitro model of cultured GC, we showed that FSH stimulates the expression of TRIB2 while inhibition of TRIB2 via CRISPR-Cas9 resulted in a significant reduction in GC proliferation (P<0.05). Western blot analyzes showed an increase in the phosphorylation levels of ERK1/2 (MAPK3/1) and p38MAPK (MAPK14) following TRIB2 overexpression. These results suggested a role of TRIB2 in follicular growth and modulation of MAPK pathways. In the second part of the thesis, we identified CALM1, INHBA, INPPL1, NT5E, SCD, SDHB and RAB14 as binding partners of TRIB2 in GC using the yeast two-hybrid approach. RT-qPCR analyzes showed that all of these partners are present in the dominant follicles but are differently regulated during follicular development. Moreover, TRIB2 manipulation (inhibition or overexpression) results in a different regulation (up- or down-regulation) of these partners expression in GC. These results suggest a role of TRIB2 in the regulation of effector targets genes related to follicular development and GC activity. In the third part of the thesis, a GC model from postpartum cows was also used to better understand the control of GC activity. Further analyses using this model revealed a significant decrease of TRIB2 in cows with high level of BHB (>1.4 mmol/L) as compared to those with a low BHB levels (<1.2 mmol/L). This reduction of TRIB2 was concomitant with an increase in pro-inflammatory interleukins and a reduction in anti-inflammatory interleukins in GC. Overall, these results support a role of TRIB2 in the modulation of MAPK signaling in GC, provide strong evidence that TRIB2 could act as a regulator of GC proliferation and function as well as expression of target genes in GC, and suggests that TRIB2 might affect steroidogenesis during follicular development and during the post-partum period.

Proteinmethylierung spielt eine immer größere Rolle in der Regulierung zellulärer Prozesse. Die Entwicklung effizienter proteomweiter Methoden zur Detektion von Methylierung auf Proteinen ist limitiert und technisch schwierig. In dieser Arbeit haben wir einen neuen Hefe-Zwei-Hybrid-Ansatz (Y2H) entwickelt, der Proteine, die miteinander wechselwirken, mit Hilfe von Sequenzierungen der zweiten Generation identifiziert (Y2H-Seq). Der neue Y2H-Seq-Ansatz wurde systematisch mit dem Y2H-Seq-Ansatz verglichen. Dafür wurde ein Bait-Set von 8 Protein-Arginin-Methyltransferasen, 17 Protein-Lysin-Methyltransferasen und 10 Demethylasen gegen 14,268 Prey-Proteine getestet. Der Y2H-Seq-Ansatz ist weniger arbeitsintensiv, hat eine höhere Sensitivität als der Standard Y2H-Matrix-Ansatz und ist deshalb besonders geeignet, um schwache Interaktionen zwischen Substraten und Protein-Methyltransferasen zu detektieren. Insgesamt wurden 523 Wechselwirkungen zwischen 22 Bait-Proteinen und 324 Prey-Pr oteinen etabliert, darunter 11 bekannte Methyltransferasen-Substrate. Netzwerkanalysen zeigen, dass Methyltransferasen bevorzugt mit Transkriptionsregulatoren, DNA- und RNA-Bindeproteinen wechselwirken. Diese Daten repräsentieren das erste proteomweite Wechselwirkungsnetzwerk über Protein-Methyltransferasen und dienen als Ressource für neue potentielle Methylierungssubstrate. In einem in vitro Methylierungsassay wurden exemplarisch mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen die methylierten Aminosäurereste einiger Kandidatenproteine bestimmt. Von neun getesteten Proteinen waren sieben methyliert, zu denen gehören SPIN2B, DNAJA3, QKI, SAMD3, OFCC1, SYNCRIP und WDR42A. Wahrscheinlich sind viele Methylierungssubstrate im Netzwerk vorhanden. Das vorgestellte Protein-Protein-Wechselwirkungsnetzwerk zeigt, dass Proteinmethylierung sehr unterschiedliche zelluläre Prozesse beeinflusst und ermöglicht die Aufstellung neuer Hypothesen über die Regulierung Molekularer Mechanismen durch Methylierung. / Protein methylation on arginine and lysine residues is a largely unexplored posttranslational modification which regulates diverse cellular processes. The development of efficient proteome-wide approaches for detecting protein methylation is limited and technically challenging. We developed a novel workload reduced yeast-two hybrid (Y2H) approach to detect protein-protein interactions utilizing second generation sequencing. The novel Y2H-seq approach was systematically evaluated against our state of the art Y2H-matrix screening approach and used to screen 8 protein arginine methyltransferases, 17 protein lysine methyltransferases and 10 demethylases against a set of 14,268 proteins. Comparison of the two approaches revealed a higher sensitivity of the new Y2H-seq approach. The increased sampling rate of the Y2H-seq approach is advantageous when assaying transient interactions between substrates and methyltransferases. Overall 523 interactions between 22 bait proteins and 324 prey proteins were identified including 11 proteins known to be methylated. Network analysis revealed enrichment of transcription regulator activity, DNA- and RNA-binding function of proteins interacting with protein methyltransferases. The dataset represents the first proteome-wide interaction network of enzymes involved in methylation and provides a comprehensively annotated resource of potential new methylation substrates. An in vitro methylation assay coupled to mass spectrometry revealed amino acid methylation of candidate proteins. Seven of nine proteins tested were methylated including SPIN2B, DNAJA3, QKI, SAMD3, OFCC1, SYNCRIP and WDR42A indicating that the interaction network is likely to contain many putative methyltransferase substrate pairs. The presented protein-protein interaction network demonstrates that protein methylation is involved in diverse cellular processes and can inform hypothesis driven investigation into molecular mechanisms regulated through methylation.