Câncer se destaca no contexto de patologias por ser uma das doenças que mais acometem mortes por ano, sendo caracterizada como um conjunto de doenças multifatoriais que tem em comum o crescimento desordenado de células que invadem tecidos e órgãos, podendo espalhar-se para outras regiões do corpo, dando origem às metástases. Uma importante etapa da cascata metastática é a transição epitélio-mesenquimal (EMT), um processo bem orquestrado que resulta na perda do fenótipo epitelial e aquisição do fenótipo mesenquimal pelas células tumorais, que adquirem carácter invasivo e migratório, além de se tornarem mais resistentes às drogas. Durante este processo, ocorrem inúmeras alterações celulares que modificam a estabilidade proteica e/ou promovem sua translocação subcelular, o transporte de proteínas para a membrana, alterações no citoesqueleto e incluindo o envio de proteínas para degradação pelo proteassoma. A desregulação de fatores de transcrição e modificação pós traducional de proteínas são fatores que podem levar à EMT. Após a eficiente indução da EMT in vitro utilizando o inibidor de histonas deacetilase (SAHA) em células de adenocarcinoma de mama MCF-7, foram realizadas análises proteômicas envolvimento os inibidores relacionados ao sistema ubiquitina proteassoma, MG132 e P5091. A modulação por inibição de USP7 resultou em variação da expressão de diversas proteínas biomarcadoras da EMT (SNAIL, ?-Catenina, CDK1) e proteínas envolvidas no ciclo celular (P53 e CDK1). O estudo proteômico permitiu a correlação do processo da EMT por SAHA com as vias de modificações pós traducionais relacionadas ao sistema ubiquitina proteassoma, e ainda propõe USP7 como alvo de estudos detalhados para EMT com potencial proposta terapêutica / Cancer stands out in the context of pathologies because it is one of the diseases that most affect deaths per year, being characterized as a set of multifactorial diseases that has in common the disordered growth of cells that invade tissues and organs, being able to spread to other regions of the body, giving rise to metastases. An important step in the metastatic cascade is the epithelial-mesenchymal transition (EMT), a well-orchestrated process that results in the loss of the epithelial phenotype and acquisition of the mesenchymal phenotype by the tumor cells that acquire a more invasive and migratory character, and become more resistant to drugs. During this process, numerous cellular alterations occur that modify the protein stability and/or promote its subcellular translocation, the transport of proteins to the membrane, changes in the cytoskeleton and including the sending of proteins for degradation by the proteasome. Deregulation of transcription factors and posttranslational modification of proteins are factors that can lead to EMT. After an efficient induction of EMT using the histone deacetylase inhibitor (SAHA) in MCF-7 breast adenocarcinoma cells, proteomic analyzes were performed involving inhibitors related to the ubiquitin proteasome system, MG132 and P5091. Modulation by inhibition of USP7 resulted in varying expression of various EMT biomarker proteins (SNAIL, ?-Catenina, CDK1) and cell cycle (P53 e CDK1). The proteomic study allowed the correlation of the SAHA EMT process with the posttranslational modifications pathways related to the ubiquitin proteasome system and also proposes USP7 as the target of detailed studies for EMT with potential therapeutic proposal

A esquistossomose mansônica é a segunda maior endemia parasitária do mundo em termos de extensão das áreas endêmicas e do número de pessoas infectadas com 200 milhões de pessoas acometidas. Esta doença é causada pelo parasito trematódeo Schistosoma mansoni, o qual apresenta adequados mecanismos de resposta ao estresse envolvendo a regulação da expressão gênica e proteica, reparo ou substituição de moléculas danificadas, recuperação do balanço redox, controle do ciclo celular e apoptose. O sistema ubiquitina- proteassoma é importante para manter a homeostase proteica durante o estresse celular. Inibidores do proteassoma podem interferir em processos como crescimento, progressão do ciclo celular e replicação, e os seus efeitos vem sendo caracterizados em muitos parasitos. Nosso laboratório demonstrou que MG132 reduz o número de esquistossômulos, a carga parasitária e a ovoposição em camundongos infectados com S. mansoni. Neste trabalho, são descritos os efeitos in vitro do estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico em vermes adultos de S. mansoni. Observou-se alteração no perfil de expressão proteica durante estresse oxidativo e térmico, sendo identificadas dezoito proteínas upreguladas nestas condições. Estas proteínas estão envolvidas em muitas vias intracelulares como dobramento de proteínas, proteólise, ligação a íons cálcio, regulação de proteínas e resposta a estresse. Além disso, o estresse oxidativo gerou mudanças em vermes adultos de S. mansoni em processos como produção de ovos, motilidade, morfologia do tegumento, viabilidade e pareamento dos vermes. O estresse químico induzido com Curcumina, IBMX e MG132 aumentou a produção de ROS intracelular e alterou o perfil de expressão de enzimas antioxidantes em S. mansoni. As enzimas SmGPx1 e SmPGx2 tiveram a expressão aumentada no estresse com Curcumina e IBMX, enquanto que SmSOD e SmTGR foram induzidas no estresse com Curcumina. As enzimas do proteassoma SmHul5 e SmUbp6 tiveram a expressão modulada durante o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico. Em adição, a análise de expressão no ciclo de vida de S. mansoni revelou que estes genes apresentam um nível alto de expressão em esporocistos, esquistossômulos e miracídios. Estes resultados sugerem que estas proteínas acessórias do proteassoma participam da resposta ao estresse e desenvolvimento do parasito. O nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6 foi cerca 9 e 16 vezes menor em relação ao controle no estresse químico induzido com IBMX, respectivamente, sugerindo a desmontagem do proteassoma. Por outro lado, Curcumina, MG132, estresse oxidativo e choque térmico aumentaram o nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6. Além disso, o nível de expressão da proteína de maturação do proteassoma (SmPOMP) aumentou no estresse com Curcumina, MG132 e estresse oxidativo, sugerindo a síntese de novas populações de proteassoma. Em relação ao estresse oxidativo, nós demonstramos o aumento no nível proteico de proteassoma 20S e da subunidade alfa-3 do proteassoma sugerindo que em S. mansoni as proteínas oxidadas são degradadas pelo proteassoma 20S. Além do mais, nós observamos que vermes adultos de S. mansoni parecem utilizar mecanismos de resposta similares para diferentes estresses. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico modificam o perfil de expressão de genes relacionados ao sistema ubiquitina-proteassoma e sugerem que o proteassoma é importante para as respostas celulares ao estresse neste parasito. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease caused by blood flukes (genus Schistosoma) and affecting 200 million people worldwide. This disease continues to rank, following malaria, at the second position of the world\'s parasitic diseases in terms of the extent of endemic areas and the number of infected people. There are different types of stress and the organisms have many mechanisms to respond to these stressor agents. The responses involve the regulation of gene and protein expression and consist in events such as repair or substitution of damaged molecules, recovery of redox balance, cell cycle control and apoptosis. The proteasomal system is important to support the protein homeostasis during the cellular stress. Effect of proteasome inhibitors has been described in many protozoans, either inhibiting growth or cell cycle progression, or blocking replication. Our laboratory\'s results have shown that MG132 reduces the number of lung stage schistosomula, the worm burden and consequently decreases oviposition in S. mansoni-infected mice. Here, we describe the in vitro effects of oxidative stress, heat shock and chemical stress in S. mansoni adult worms. We report that the oxidative stress and heat shock cause drastic changes in the protein profile of S. mansoni adult worms, and we identified a total of eighteen upregulated proteins in these conditions. These proteins are involved with many intracellular pathways as protein folding, proteolysis, calcium ion binding, regulator proteins and stress response. In addition, oxidative stress induced with H2O2 generated significative changes in the adult worms concerning process such as egg production, motor activity, tegument morphology, viability and pairing of worms. Chemical stress induced with Curcumin, IBMX and MG132 increases ROS production and changes the gene expression profile of antioxidant enzymes of S. mansoni adult worms. The enzymes SmGPx1 and SmGPx2 were upregulated in Curcumin and IBMXinduced chemical stress, and both SmSOD and SmTGR were upregulated- Curcumin. The proteasomal enzymes SmHul5 and SmUbp6 had their gene expression modified during oxidative stress, heat shock and chemical stress. Besides of, expression analyses in the S. mansoni life cycle indicate that genes are different express in sporocyst, schistosomula and miracidia. These results suggest these accessory proteins proteasome participates of stress response and parasite development. The expression level of SmHul5 and SmUbp6 were 16 and 9 times less than the control in chemical stress induced by IBMX, and we suggest that these results are due to the proteasome disassembling. On the other hand, Curcumin, MG132, oxidative stress e heat shock increases the expression of SmHul5 and SmUbp6. Furthermore, the expression level of maturation proteasome protein (SmPOMP) increases in stress induced by Curcumin, MG132 and oxidative stress suggesting new proteasome synthesis. In addition, we demonstrate increase the both 20S level and alpha-3 subunit proteasome in the oxidative stress, suggesting that in S. mansoni oxidized protein formed due to oxidative damage are degrade by proteasome 20S. We observed that S. mansoni adult worms utilize similar mechanisms to respond different stresses. Ours results demonstrate that oxidative stress, heat shock and chemical stress modified the expression profile of genes related with the ubiquitinproteasome system and suggest that the proteasome is important to responses the cellular stresses in the parasite.

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do T3 e do seu análogo GC-24, agonista TR<font face=\"symbol\">b seletivo, na proteólise muscular mediada pela via ubiquitina-proteassoma. Avaliamos o efeito do T3 e GC-24 no trofismo radial de fibras musculares, no nível de ubiquitinação e na expressão de genes envolvidos na via ubiquitina-proteassoma. Para tanto foram utilizados, ratos Wistar divididos em 4 grupos (Controle, 12 horas, 1 e 7 dias) e tratados com T3 e GC-24. Determinou-se a área de secção transversa dos cortes histológicos através do programa \"Image Pro-Plus\". O nível de ubiquitinação foi determinado através de Western Blot para proteína ubiquitinada e a expressão gênica por PCR em Tempo real. T3 e GC-24 promoveram redução do diâmetro das fibras musculares e aumentaram o nível de proteínas ubiquitinadas em ambos os músculos. Com relação à expressão gênica, T3 e GC-24 modularam a expressão dos genes analisados de maneira diferenciada, demonstrando que GC-24 é capaz de modular genes pouco ou não responsivos ao T3. / Triiodothyronine (T3) is known to play a key role in the function of several tissues/organs via the thyroid hormone receptor isoforms a/pha (TRa) and beta (TRI3). Abnormalities in skeletal muscle function have been associated with increased leveis of T3, which is a major sarcopenia (Ioss of sarcomeres). Although the phenomenon of sarcopenia induced by T3 has been widely reported, little is known about the molecular mechanisms invo/ved in proteolysis induced by T3. In this study we have investigated the effects of T3 and GC-24, a novel synthetic TRI3¬selective compound, on the ubiquitin proteasome pathway. We analyzed the effect of T3 and GC-24 on the radial trophism, ubiquitination leveis and gene expression of the ubiquitin-proteasome pathway, which are important regulators of muscle proteolysis in the skeletal muscle. We have addressed the ubiquitin ligases (Atrogin¬1, MuRF-1 and E3a) and the deubiquitinating enzymes (UBP45, UBP69 and USP28). Wistar male rats (170-200g) were divided in 4 groups (Control, 12, 1 and 7 days). Rats received T3 (30l-\'g/100g) and GC-24 (16 I-\'g/1 OOg). After decapitation, EDL and soleus muscles were removed for histological ana/ysis, protein expression and gene expression. Cross sectional area was determined in histological sections through the software \"Image-Pro Plus. The ubiquitination leveis was determined by Western Blot and gene expression determined by Real Time PCR analysis. T3 and GC-24 reduced the diameter of the muscle fibers vs control group. Both T3 and GC-24 incresed the ubiquitination leveis, in the soleus and EDL. Regarding gene expression analysis, T3 and GC-24 modulate the gene expression in a differential manner. In the soleus, T3 increased Atrogin-1 and E3 alpha gene expression, while did not alter Murf-1 gene expression. On the other hand, in EDL Atrogin-1 gene expression is not altered, while E3 alpha and Murf-1 are elevated by T3. In the soleus and EDL deubiquitinating gene expression is mostly not altered, exception made for UBP 45, which is reduced by T3 in soleus muscle. GC-24, increased gene expression of E3a and MuRF-1 in the soleus, while did not alter Atrogin-1 gene expression. However, in EDL muscle, GC-24 increased Atrogin-1 and E3a mRNA, while did not alter MuRF-1. Finally, GC-24 decreased UBP 45 gene expression in EDL muscle and USP 28 gene expression was robustly elevated by GC-24 in both muscles analyzed. This data shows that GC-24 is able to strongly modulate genes that are less responsive or even unresponsive to T3, pointing that the GC-24-TRb complex might trans-activate differently target genes. However, both T3 and GC-24 are able to modulate the muscle proteolysis.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-10-05T19:17:14Z No. of bitstreams: 1 475514 - Texto Completo.pdf: 1720487 bytes, checksum: d25e86525eb79aae71491a51f3662cf9 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-05T19:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 475514 - Texto Completo.pdf: 1720487 bytes, checksum: d25e86525eb79aae71491a51f3662cf9 (MD5) Previous issue date: 2015-08-07 / The healthy neuronal function and synaptic modification need both the synthesis and degradation of proteins. Evidence indicates that the protein turnover mediated by proteasome activity is involved in synaptic plasticity and long term memory. However, their role in different stages of memory is still under discussion, and previous studies did not evaluate the possible need of protein degradation in recognition memory. In this work, we have shown that proteasome inhibitor, lactacystin, infused in the CA1 area of the hippocampus at two specific time periods during consolidation affect the retention of the recognition memory in mice. The administration of lactacystin did not affect the reconsolidation of memory. These findings provide the first evidence for the importance of proteasome activity in memory recognition, indicating that the protein breakdown in the hippocampus is required during two specific time windows in memory consolidation, contributing to a better understanding of protein turnover's role in memory formation. Changes of brain iron levels have been observed in neurodegenerative diseases. It has been demonstrated by our research group, that iron overload in the neonatal period results in severe and persistent memory deficits in adulthood. Protein degradation mediated by the ubiquitin proteasome system plays an important role in regulating various cellular processes and their involvement has been implicated in pathogenesis of neurodegenerative diseases. So in this study was also evaluated the effects of iron exposure in the neonatal period on the expression of proteasome subunits ?1, ?2, and ?5 and polyubiquitinated proteins in brains of rats at 15 days of life and adulthood. Two types of hippocampal-dependent memory and recognition aversive were analyzed in adult animals. We confirm earlier evidence that iron administered in the neonatal period affect both the aversive memory and recognition memory. The levels of proteins polyubiquitinated found to be high in the hippocampus, but not in the cortex of adult animals treated with iron. The gene expression of the subunits ?1 and ?5 were affected by age in the hippocampus, which is higher in the early stages of development, accompanied by a related increase with age polyubiquitinated protein levels in adult rats. In the cortex, the gene expression of all three subunits of the proteasome was significantly higher in old adult than in neonatal age. Together, these results suggest that the expression of the subunits of the proteasome and are regulated activity of age-dependent manner. This was the first study to investigate the protein degradation system in the brain of rats newborns and also the first to study the proteasome subunits comparing neonatal and adult ages. Exposure to iron in the neonatal period produces long lasting harmful effects on the functioning of the ubiquitin-proteasome system, which may be related to deficiency of the iron induced memory, providing evidence that this system can be considered a target for the treatment of deficits memory. / A fun??o neuronal saud?vel e a modifica??o sin?ptica precisam tanto da s?ntese quanto da degrada??o de prote?nas. Evid?ncias indicam que o turnover de prote?nas mediado pela atividade do proteassoma est? envolvido na plasticidade sin?ptica e na mem?ria de longa dura??o. No entanto, seu papel nas diferentes fases da mem?ria continua em discuss?o, e estudos anteriores n?o avaliaram a poss?vel necessidade da degrada??o de prote?nas na mem?ria de reconhecimento. Nesse trabalho, n?s mostramos que o inibidor de proteassoma, lactacistina, infundido na ?rea de CA1 do hipocampo em dois per?odos de tempo espec?ficos durante a consolida??o, prejudica a reten??o da mem?ria de reconhecimento em ratos. A administra??o da lactacistina n?o afetou a reconsolida??o da mem?ria. Estas descobertas fornecem a primeira evid?ncia para a import?ncia da atividade do proteassoma na mem?ria de reconhecimento, indicando que a degrada??o de prote?nas no hipocampo ? necess?ria durante duas janelas de tempo espec?ficas na consolida??o da mem?ria, contribuindo para a melhor compreens?o do papel do turnover de prote?na na forma??o da mem?ria. Altera??es dos n?veis de ferro cerebral t?m sido observadas em doen?as neurodegenerativas. J? foi demonstrado pelo nosso grupo de pesquisa, que a sobrecarga de ferro no per?odo neonatal resulta em graves e persistentes d?ficits de mem?ria na vida adulta. A degrada??o das prote?nas mediada pelo sistema ubiquitina-proteassoma desempenha um importante papel na regula??o de v?rios processos celulares e seu comprometimento tem sido implicado na patog?nese de doen?as neurodegenerativas. Ent?o, nesse estudo, tamb?m foram avaliados os efeitos da exposi??o de ferro no per?odo neonatal sobre a express?o das subunidades do proteassoma ?1, ?2, e ?5 e das prote?nas poliubiquitinadas em c?rebros de ratos aos 15 dias de vida e na idade adulta. Dois tipos de mem?ria dependente do hipocampo, aversiva e de reconhecimento, foram analisados em animais adultos. Confirmamos as evid?ncias anteriores, de que o ferro administrado no per?odo neonatal prejudica tanto a mem?ria aversiva quanto a mem?ria de reconhecimento. Os n?veis de prote?nas poliubiquitinadas encontraram-se elevados no hipocampo, mas n?o no c?rtex, de animais adultos tratados com ferro. A express?o g?nica das subunidades ?1 e ?5 foram afetadas pela idade no hipocampo, sendo maior nos primeiros est?gios de desenvolvimento, acompanhado por um aumento relacionado com a idade nos n?veis de prote?na poliubiquitinada em ratos adultos. No c?rtex, a express?o g?nica das tr?s subunidades do proteassoma foi significativamente mais elevada na idade adulta do que na idade neonatal. Em conjunto, esses resultados sugerem que a express?o das subunidades e a atividade do proteassoma s?o regulados de forma dependente da idade. Este, foi o primeiro estudo a investigar o sistema de degrada??o de prote?nas em c?rebros de ratos neonatos e tamb?m, o primeiro a estudar as subunidades do proteassoma comparando as idades neonatal e adulta. A exposi??o ao ferro no per?odo neonatal produz efeitos nocivos duradouros sobre o funcionamento do sistema ubiquitina-proteassoma, que pode estar relacionado com a defici?ncia de mem?ria induzida pelo ferro, fornecendo evid?ncias de que esse sistema pode ser considerado um alvo para o tratamento dos d?ficits de mem?ria.

Orientador: Maeli Dal Pai / Banca: Luís Fernando Marins / Banca: Ian Porto Gurgel Amaral / Banca: Robson Francisco Carvalho / Banca: Danilo Pinhal / Resumo: O pacu (Piaractus mesopotamicus) apresenta excelentes características zootécnicas como rápido crescimento, parâmetro que está diretamente relacionado com o aumento da musculatura estriada esquelética. Pesquisas envolvendo a caracterização de genes musculares têm sido realizadas utilizando-se tecnologias moleculares, em espécies de peixes modelo como o Zebrafish que possui o genoma sequenciado. No pacu, espécie que não possui o genoma sequenciado, esta falta de informação genética dificulta a realização de pesquisas relacionadas com a identificação das vias de sinalização que regulam o desenvolvimento, o crescimento e a manutenção do fenótipo muscular. Além disso, a falta de informação promove uma limitação para o desenvolvimento de programas de melhoramento para esta espécie. Os principais objetivos do presente estudo foram: 1) aumentar os recursos genéticos disponíveis para a espécie, 2) comparar os transcriptomas dos tipos de músculo, vermelho e branco explorando as vias de sinalização que controlam os tipos de fibras musculares 3) investigar a expressão de deubiquitinas pertencente a família do sistema de Proteases ubiquitinas-específicas (USP) no músculo branco em resposta ao jejum e realimentação. Com o sequenciamento, obteve-se aproximadamente 0.6Tb de leituras a partir de bibliotecas do músculo esquelético vermelho e branco. Aproximadamente, 665 milhões de leituras foram utilizadas para a realização da montagem, resultando em 504.065 contigs com um comprimento médio de 1,334bp e N50 = 2,772bp; 47% do transcriptoma foi anotado com êxito, onde pode-se identificar cerca de 15.000 genes considerados únicos e aproximadamente 8000 sequências com região codificante completas. Dentre os genes identificados destacam-se 319 genes de vias metabólicas e 380 microssatélites. Novecentos e ciquenta e seis e 604 genes foram diferencialmente expressos entre o músculo vermelho e branco, respectivamente. / Abstract: Pacu (Piaractus mesopotamicus) has excellent husbandry features like rapid growth. This parameter is directly related to the increase of skeletal muscle. Researches involving the characterization of muscle genes have been performed using molecular technologies, in species of fish such as zebrafish model that has sequenced the genome. In pacu, a species that does not have the sequenced genome, this lack of genetic information makes it difficult to conduct research related to the identification of signaling pathways that regulate development, growth and maintenance of muscle phenotype. Moreover, the lack of information promotes a limitation for the development of breeding programs for this species. The main objectives of this study were: 1) to increase the available genetic resources for the species, 2) compare the transcriptomes of red and white muscle types, exploring the signaling pathways that control the types of muscle fibers 3) to investigate the expression of deubiquitins belonging to the family of ubiquitin-specific proteases system (USP) in muscle in response to fasting and feedback. With the sequencing, it was obtained approximately 0.6Tb readings from red skeletal muscle and white libraries. Approximately 665 million readings were used to perform the assembly, resulting in 504 065 contigs with an average length of N50 = 1,334bp and 2,772bp; 47% of the transcriptome was noted successfully, which can be identified about 15,000 genes considered as unique and approximately 8000 sequences coding complete region. Among the identified genes, we could observe 319 metabolic pathways genes and 380 microsatellite. Nine hundred fifty six and 604 genes were differentially expressed between red and white muscle, respectively. We identified 442 pairs of paralogs genes resulting from genomic duplication at the base source of teleost fish. It was possible to identify differential expression of paralogous genes include the types of fibers... / Doutor

A esquistossomose mansônica é a segunda maior endemia parasitária do mundo em termos de extensão das áreas endêmicas e do número de pessoas infectadas com 200 milhões de pessoas acometidas. Esta doença é causada pelo parasito trematódeo Schistosoma mansoni, o qual apresenta adequados mecanismos de resposta ao estresse envolvendo a regulação da expressão gênica e proteica, reparo ou substituição de moléculas danificadas, recuperação do balanço redox, controle do ciclo celular e apoptose. O sistema ubiquitina- proteassoma é importante para manter a homeostase proteica durante o estresse celular. Inibidores do proteassoma podem interferir em processos como crescimento, progressão do ciclo celular e replicação, e os seus efeitos vem sendo caracterizados em muitos parasitos. Nosso laboratório demonstrou que MG132 reduz o número de esquistossômulos, a carga parasitária e a ovoposição em camundongos infectados com S. mansoni. Neste trabalho, são descritos os efeitos in vitro do estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico em vermes adultos de S. mansoni. Observou-se alteração no perfil de expressão proteica durante estresse oxidativo e térmico, sendo identificadas dezoito proteínas upreguladas nestas condições. Estas proteínas estão envolvidas em muitas vias intracelulares como dobramento de proteínas, proteólise, ligação a íons cálcio, regulação de proteínas e resposta a estresse. Além disso, o estresse oxidativo gerou mudanças em vermes adultos de S. mansoni em processos como produção de ovos, motilidade, morfologia do tegumento, viabilidade e pareamento dos vermes. O estresse químico induzido com Curcumina, IBMX e MG132 aumentou a produção de ROS intracelular e alterou o perfil de expressão de enzimas antioxidantes em S. mansoni. As enzimas SmGPx1 e SmPGx2 tiveram a expressão aumentada no estresse com Curcumina e IBMX, enquanto que SmSOD e SmTGR foram induzidas no estresse com Curcumina. As enzimas do proteassoma SmHul5 e SmUbp6 tiveram a expressão modulada durante o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico. Em adição, a análise de expressão no ciclo de vida de S. mansoni revelou que estes genes apresentam um nível alto de expressão em esporocistos, esquistossômulos e miracídios. Estes resultados sugerem que estas proteínas acessórias do proteassoma participam da resposta ao estresse e desenvolvimento do parasito. O nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6 foi cerca 9 e 16 vezes menor em relação ao controle no estresse químico induzido com IBMX, respectivamente, sugerindo a desmontagem do proteassoma. Por outro lado, Curcumina, MG132, estresse oxidativo e choque térmico aumentaram o nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6. Além disso, o nível de expressão da proteína de maturação do proteassoma (SmPOMP) aumentou no estresse com Curcumina, MG132 e estresse oxidativo, sugerindo a síntese de novas populações de proteassoma. Em relação ao estresse oxidativo, nós demonstramos o aumento no nível proteico de proteassoma 20S e da subunidade alfa-3 do proteassoma sugerindo que em S. mansoni as proteínas oxidadas são degradadas pelo proteassoma 20S. Além do mais, nós observamos que vermes adultos de S. mansoni parecem utilizar mecanismos de resposta similares para diferentes estresses. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico modificam o perfil de expressão de genes relacionados ao sistema ubiquitina-proteassoma e sugerem que o proteassoma é importante para as respostas celulares ao estresse neste parasito. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease caused by blood flukes (genus Schistosoma) and affecting 200 million people worldwide. This disease continues to rank, following malaria, at the second position of the world\'s parasitic diseases in terms of the extent of endemic areas and the number of infected people. There are different types of stress and the organisms have many mechanisms to respond to these stressor agents. The responses involve the regulation of gene and protein expression and consist in events such as repair or substitution of damaged molecules, recovery of redox balance, cell cycle control and apoptosis. The proteasomal system is important to support the protein homeostasis during the cellular stress. Effect of proteasome inhibitors has been described in many protozoans, either inhibiting growth or cell cycle progression, or blocking replication. Our laboratory\'s results have shown that MG132 reduces the number of lung stage schistosomula, the worm burden and consequently decreases oviposition in S. mansoni-infected mice. Here, we describe the in vitro effects of oxidative stress, heat shock and chemical stress in S. mansoni adult worms. We report that the oxidative stress and heat shock cause drastic changes in the protein profile of S. mansoni adult worms, and we identified a total of eighteen upregulated proteins in these conditions. These proteins are involved with many intracellular pathways as protein folding, proteolysis, calcium ion binding, regulator proteins and stress response. In addition, oxidative stress induced with H2O2 generated significative changes in the adult worms concerning process such as egg production, motor activity, tegument morphology, viability and pairing of worms. Chemical stress induced with Curcumin, IBMX and MG132 increases ROS production and changes the gene expression profile of antioxidant enzymes of S. mansoni adult worms. The enzymes SmGPx1 and SmGPx2 were upregulated in Curcumin and IBMXinduced chemical stress, and both SmSOD and SmTGR were upregulated- Curcumin. The proteasomal enzymes SmHul5 and SmUbp6 had their gene expression modified during oxidative stress, heat shock and chemical stress. Besides of, expression analyses in the S. mansoni life cycle indicate that genes are different express in sporocyst, schistosomula and miracidia. These results suggest these accessory proteins proteasome participates of stress response and parasite development. The expression level of SmHul5 and SmUbp6 were 16 and 9 times less than the control in chemical stress induced by IBMX, and we suggest that these results are due to the proteasome disassembling. On the other hand, Curcumin, MG132, oxidative stress e heat shock increases the expression of SmHul5 and SmUbp6. Furthermore, the expression level of maturation proteasome protein (SmPOMP) increases in stress induced by Curcumin, MG132 and oxidative stress suggesting new proteasome synthesis. In addition, we demonstrate increase the both 20S level and alpha-3 subunit proteasome in the oxidative stress, suggesting that in S. mansoni oxidized protein formed due to oxidative damage are degrade by proteasome 20S. We observed that S. mansoni adult worms utilize similar mechanisms to respond different stresses. Ours results demonstrate that oxidative stress, heat shock and chemical stress modified the expression profile of genes related with the ubiquitinproteasome system and suggest that the proteasome is important to responses the cellular stresses in the parasite.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-12-30T14:31:06Z No. of bitstreams: 1 Antonio Luis de Oliveira Petersen Avaliação do 17-AAG... 2015.pdf: 4140982 bytes, checksum: b2369d43c8af2a304d5953f23f604a99 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2015-12-30T14:31:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Antonio Luis de Oliveira Petersen Avaliação do 17-AAG... 2015.pdf: 4140982 bytes, checksum: b2369d43c8af2a304d5953f23f604a99 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-30T14:31:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio Luis de Oliveira Petersen Avaliação do 17-AAG... 2015.pdf: 4140982 bytes, checksum: b2369d43c8af2a304d5953f23f604a99 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose é uma doença endêmica no Brasil causada por parasitos protozoários do gênero Leishmania. A quimioterapia continua sendo a forma mais efetiva de tratamento com os antimoniais pentavalentes sendo usados há mais de 70 anos como a primeira linha de tratamento. O uso deste e de outros fármacos apresenta efeitos adversos graves, os esquemas terapêuticos empregados são desconfortáveis, além de relatos do aumento de casos de resistência. A proteína de choque térmico 90 (HSP90) é um membro da família das chaperonas presente em células eucarióticas e bactérias. Essa proteína é fundamental para o dobramento e estabilização de diferentes proteínas, chamadas genericamente de proteínas cliente. Essa chaperona vem sendo considerada um importante alvo molecular para o tratamento de diferentes doenças parasitárias. Nessa tese, o inibidor específico da atividade ATPásica da HSP90, o 17-allilamino-17-demethoxigeldanamicina (17- AAG) foi testado em parasitos do gênero Leishmania. Inicialmente, avaliamos o efeito em cultura axênica e observamos que o 17-AAG causa a morte desses parasitos em concentrações inferiores às necessárias para causar a morte de macrófagos. Observamos também que o tratamento com 17-AAG promove a morte intracelular dos parasitos em concentrações que variam de 25 a 500 nM nos tempos de 24 e 48 h, sendo também eficaz contra a forma amastigota em tempos mais tardios como 96 h de infecção. Os parasitos morrem independentemente da produção de moléculas microbicidas pelo macrófago, como superóxido e óxido nítrico, que tiveram sua produção reduzida em 61 e 58 %, respectivamente. O tratamento com 17-AAG também reduziu a produção de mediadores próinflamatórios como TNF-α, IL-6 e MCP-1 em 35, 35 e 92 %, respectivamente. Utilizando o modelo de camundongos BALB/c infectados por Leishmania braziliensis na orelha demonstramos que o tratamento com 17-AAG causou redução do tamanho da lesão cutânea em 0,5 mm e da carga parasitaria no local da infecção em 25 %, no entanto, não foi capaz de reduzir a carga parasitaria no linfonodo drenante. Análise por microscopia eletrônica de transmissão de macrófagos infectados e tratados com 17-AAG revelou alterações características de um processo autofágico com vacuolização do citoplasma e formação de vacúolos com dupla membrana, além da presença de figuras de mielina. Utilizando parasitos transgênicos observamos que 17-AAG induz um aumento de 30 % na formação de autofagossomos, que tem a sua capacidade de fusão com glicossomos e lisossomos reduzida. Além disso, parasitos ATG5 knockout, incapazes de formar autofagossomos foram cerca de 90% mais resistentes à morte induzida pelo AAG em relação a parasitos selvagens. Observamos, também, que o tratamento com MG132, um inibidor da atividade do proteassoma, assim como o 17-AAG induziu o acúmulo de proteínas ubiquitinadas de parasitos, especialmente em 8 parasitos incapazes de formar autofagossomos, sugerindo um papel da autofagia na degradação de proteínas ubiquitinadas. Por último, observamos que o MG132 foi capaz de induzir a formação de autofagossomos sugerindo uma ligação entre o acúmulo de proteínas ubiquitinadas e a indução da via autofágica. Em conjunto, nossos resultados indicam que o HSP90 é um alvo molecular que dever ser explorado no tratamento das leishmanioses. / Leishmaniases are endemic disease in Brazil caused by protozoan parasites from the genus Leishmania. Chemotherapy remains the most effective way of treatment and pentavalent antimonials, used for more than 70 years, remaining as first choice drugs for leishmaniasis treatment. The use of this and other drugs causes severe side effects, therapeutic regimens employed for leishmaniasis treatment are unpleasant, besides an increase number of resistance cases. The Heat Shock Protein 90 (HSP90) is a member of the chaperone family present in bacteria and eukaryotic cells. This protein is essential for the folding and stabilization of different proteins, known as client proteins. This chaperone has been considered an important molecular target for the treatment of different parasitic diseases. In this thesis, the specific inhibitors of the ATPase activity from the HSP90, 17-allylamino- 17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), were tested against parasites from the genus Leishmania. First we evaluated its effect on axenic culture and observed that 17- AAG induces parasite cell death in lowerconcentrations than those needed to induce macrophage cell death. We also observed that 17-AAG intracellular parasite death in concentrations ranging from 25 to 500 nM after 24 or 48 h, being also able to kill amastigotes in latter times of infection, such as 96 h. The parasites die independently of the production of microbicide molecules, such as superoxide and nitric oxide, which had their production reduced by 61 and 58 %, respectively. 17- AAG treatment also reduced the production of pro-inflammatory molecules such as TNF-α, IL-6 e MCP-1 in 35, 35 and 98 %, respectively. Using the murine model of BALB/c mice infected with Leishmania braziliensis in the ear showed that treatment of 17-AAG reduces the size of the lesion in 0,5 mm and the parasite load in the ear in 25 %, however, the treatment wasn’t able to reduce the parasite load in the draining lymph node. Transmission electron microscopy analysis of infected macrophages treated with 17-AAG revealed alterations typical of autophagic process with cytoplasm vacuolization, formation of vacuoles with double membranes, besides the presence of myelin figures. Using transgenic parasites we observed that 17-AAG induces an increase of 35 % in the autophagosome formation witch have their ability to fuse with glycosome and lisosome reduced. However, in comparison to wild type parasites, ATG5 knockout parasites that are unable to form autophagosome were 90% more resistant to 17-AAG-induced cell death. We also observed that MG132 treatment, a proteasome inhibitor, like 17-AAG induced ubiquitined proteins accumulation in parasites, especially in parasites unable to form autophagosome, suggesting a role of autophagy in degradation of ubiquitinated proteins. Lastly, we observed that MG132 induced autophagosome formation, suggesting a link between ubiquitinated and induction of the autophagic pathway. In sum, our results indicate that HSP90 is a molecular target that should be explored as a treatment for leishmaniasis.

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-14. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:05Z : No. of bitstreams: 1 000869173.pdf: 2452278 bytes, checksum: 85fd789b99aa751120a5330cb5ab3a02 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O pacu (Piaractus mesopotamicus) apresenta excelentes características zootécnicas como rápido crescimento, parâmetro que está diretamente relacionado com o aumento da musculatura estriada esquelética. Pesquisas envolvendo a caracterização de genes musculares têm sido realizadas utilizando-se tecnologias moleculares, em espécies de peixes modelo como o Zebrafish que possui o genoma sequenciado. No pacu, espécie que não possui o genoma sequenciado, esta falta de informação genética dificulta a realização de pesquisas relacionadas com a identificação das vias de sinalização que regulam o desenvolvimento, o crescimento e a manutenção do fenótipo muscular. Além disso, a falta de informação promove uma limitação para o desenvolvimento de programas de melhoramento para esta espécie. Os principais objetivos do presente estudo foram: 1) aumentar os recursos genéticos disponíveis para a espécie, 2) comparar os transcriptomas dos tipos de músculo, vermelho e branco explorando as vias de sinalização que controlam os tipos de fibras musculares 3) investigar a expressão de deubiquitinas pertencente a família do sistema de Proteases ubiquitinas-específicas (USP) no músculo branco em resposta ao jejum e realimentação. Com o sequenciamento, obteve-se aproximadamente 0.6Tb de leituras a partir de bibliotecas do músculo esquelético vermelho e branco. Aproximadamente, 665 milhões de leituras foram utilizadas para a realização da montagem, resultando em 504.065 contigs com um comprimento médio de 1,334bp e N50 = 2,772bp; 47% do transcriptoma foi anotado com êxito, onde pode-se identificar cerca de 15.000 genes considerados únicos e aproximadamente 8000 sequências com região codificante completas. Dentre os genes identificados destacam-se 319 genes de vias metabólicas e 380 microssatélites. Novecentos e ciquenta e seis e 604 genes foram diferencialmente expressos entre o músculo vermelho e branco, respectivamente. / Pacu (Piaractus mesopotamicus) has excellent husbandry features like rapid growth. This parameter is directly related to the increase of skeletal muscle. Researches involving the characterization of muscle genes have been performed using molecular technologies, in species of fish such as zebrafish model that has sequenced the genome. In pacu, a species that does not have the sequenced genome, this lack of genetic information makes it difficult to conduct research related to the identification of signaling pathways that regulate development, growth and maintenance of muscle phenotype. Moreover, the lack of information promotes a limitation for the development of breeding programs for this species. The main objectives of this study were: 1) to increase the available genetic resources for the species, 2) compare the transcriptomes of red and white muscle types, exploring the signaling pathways that control the types of muscle fibers 3) to investigate the expression of deubiquitins belonging to the family of ubiquitin-specific proteases system (USP) in muscle in response to fasting and feedback. With the sequencing, it was obtained approximately 0.6Tb readings from red skeletal muscle and white libraries. Approximately 665 million readings were used to perform the assembly, resulting in 504 065 contigs with an average length of N50 = 1,334bp and 2,772bp; 47% of the transcriptome was noted successfully, which can be identified about 15,000 genes considered as unique and approximately 8000 sequences coding complete region. Among the identified genes, we could observe 319 metabolic pathways genes and 380 microsatellite. Nine hundred fifty six and 604 genes were differentially expressed between red and white muscle, respectively. We identified 442 pairs of paralogs genes resulting from genomic duplication at the base source of teleost fish. It was possible to identify differential expression of paralogous genes include the types of fibers... / CAPES: 1450/13-1 BEX / FAPESP: 2012/02489-4

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do T3 e do seu análogo GC-24, agonista TR<font face=\"symbol\">b seletivo, na proteólise muscular mediada pela via ubiquitina-proteassoma. Avaliamos o efeito do T3 e GC-24 no trofismo radial de fibras musculares, no nível de ubiquitinação e na expressão de genes envolvidos na via ubiquitina-proteassoma. Para tanto foram utilizados, ratos Wistar divididos em 4 grupos (Controle, 12 horas, 1 e 7 dias) e tratados com T3 e GC-24. Determinou-se a área de secção transversa dos cortes histológicos através do programa \"Image Pro-Plus\". O nível de ubiquitinação foi determinado através de Western Blot para proteína ubiquitinada e a expressão gênica por PCR em Tempo real. T3 e GC-24 promoveram redução do diâmetro das fibras musculares e aumentaram o nível de proteínas ubiquitinadas em ambos os músculos. Com relação à expressão gênica, T3 e GC-24 modularam a expressão dos genes analisados de maneira diferenciada, demonstrando que GC-24 é capaz de modular genes pouco ou não responsivos ao T3. / Triiodothyronine (T3) is known to play a key role in the function of several tissues/organs via the thyroid hormone receptor isoforms a/pha (TRa) and beta (TRI3). Abnormalities in skeletal muscle function have been associated with increased leveis of T3, which is a major sarcopenia (Ioss of sarcomeres). Although the phenomenon of sarcopenia induced by T3 has been widely reported, little is known about the molecular mechanisms invo/ved in proteolysis induced by T3. In this study we have investigated the effects of T3 and GC-24, a novel synthetic TRI3¬selective compound, on the ubiquitin proteasome pathway. We analyzed the effect of T3 and GC-24 on the radial trophism, ubiquitination leveis and gene expression of the ubiquitin-proteasome pathway, which are important regulators of muscle proteolysis in the skeletal muscle. We have addressed the ubiquitin ligases (Atrogin¬1, MuRF-1 and E3a) and the deubiquitinating enzymes (UBP45, UBP69 and USP28). Wistar male rats (170-200g) were divided in 4 groups (Control, 12, 1 and 7 days). Rats received T3 (30l-\'g/100g) and GC-24 (16 I-\'g/1 OOg). After decapitation, EDL and soleus muscles were removed for histological ana/ysis, protein expression and gene expression. Cross sectional area was determined in histological sections through the software \"Image-Pro Plus. The ubiquitination leveis was determined by Western Blot and gene expression determined by Real Time PCR analysis. T3 and GC-24 reduced the diameter of the muscle fibers vs control group. Both T3 and GC-24 incresed the ubiquitination leveis, in the soleus and EDL. Regarding gene expression analysis, T3 and GC-24 modulate the gene expression in a differential manner. In the soleus, T3 increased Atrogin-1 and E3 alpha gene expression, while did not alter Murf-1 gene expression. On the other hand, in EDL Atrogin-1 gene expression is not altered, while E3 alpha and Murf-1 are elevated by T3. In the soleus and EDL deubiquitinating gene expression is mostly not altered, exception made for UBP 45, which is reduced by T3 in soleus muscle. GC-24, increased gene expression of E3a and MuRF-1 in the soleus, while did not alter Atrogin-1 gene expression. However, in EDL muscle, GC-24 increased Atrogin-1 and E3a mRNA, while did not alter MuRF-1. Finally, GC-24 decreased UBP 45 gene expression in EDL muscle and USP 28 gene expression was robustly elevated by GC-24 in both muscles analyzed. This data shows that GC-24 is able to strongly modulate genes that are less responsive or even unresponsive to T3, pointing that the GC-24-TRb complex might trans-activate differently target genes. However, both T3 and GC-24 are able to modulate the muscle proteolysis.

Orientador: Licio Augusto Velloso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T19:17:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bombassaro_Bruna_M.pdf: 2789722 bytes, checksum: 84c9ac89c77f8ea14c7c63e6f9bfdfc6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A proteína PGC1? é um co-ativador de transcrição gênica que desempenha papel importante na regulação de uma série de fenômenos metabólicos que compreendem desde o controle da termogênese e mitocondriogênese até a regulação da secreção de insulina e a produção hepática de glicose. Como vários dos fenômenos biológicos controlados direta ou indiretamente pela PGC1? tem importância vital, a regulação dos níveis de PGC1? nos tecidos deve ser finamente ajustada. Nos últimos anos, inúmeros estudos exploraram os mecanismos envolvidos com o controle da expressão gênica e tradução da PGC1?. Entretanto, apenas alguns poucos estudos avaliaram a degradação da mesma. Um dos mais importantes mecanismos envolvidos com a regulação funcional e da meia-vida de proteínas é a ubiquitinação, que pode direcionar proteínas alvo ao proteassoma para degradação ou a outras modificações pós-traducionais. O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação de uma proteína com atividade deubiquitinase e ubiquitina ligase, a A20, na manutenção da homeostase do tecido adiposo de animais submetidos à dieta rica em gordura e voluntários humanos magros e obesos antes e após cirurgia de redução de peso. Foram utilizados o tecido adiposo branco visceral e subcutâneo e o tecido adiposo marrom de camundongos Swiss machos submetidos a 16 semanas de dieta hiperlipídica e o tecido adiposo subcutâneo de voluntários magros e obesos antes e após a cirurgia bariátrica. Esses tecidos foram avaliados quanto ao conteúdo protéico e expressão gênica da proteína A20, e sua associação com a PGC1? por imunoprecipitação e imunofluorescência, bem como a ubiquitinação desta última. Os resultados obtidos a partir do tecido adiposo de humanos mostram uma diminuição na expressão da proteína A20 nos pacientes antes e após a cirurgia bariátrica com relação aos voluntários magros. A PGC1? aparece mais ubiquitinada nos pacientes obesos em relação e a associação entre A20 e PGC1? parece aumentar com o ganho de peso na mesma proporção que o conteúdo protéico de PGC1? parece diminuir. No tecido adiposo subcutâneo de camundongos obesos, observamos uma diminuição de PGC1? bem como redução da marcação por cadeias de poliubiquitina desta proteína, associado a um aumento de A20 e aumento da associação de A20 com PGC1?. Camundongos obesos foram também tratados com um oligonucleotídeo antisense (ASO) para A20, resultando na redução de sua expressão gênica. Os animais tratados apresentaram uma piora na tolerância à glicose no teste de GTT o que ocorreu concomitantemente a redução de PGC1?. Nossos resultados indicam que, no tecido adiposo, a A20 se associa a PGC1? e a redução da sua expressão resulta em redução da expressão da PGC1? o que é acompanhando de uma piora no controle homeostático da glicose / Abstract: Peroxisome proliferator-activated receptor ? coactivator 1 alpha (PGC-1?) plays an important role in whole body metabolism and, particularly in glucose homeostasis. Its expression is tightly regulated and, small variations in tissue levels can have a major impact in a number of physiological and pathological conditions. Recent studies have shown that the ubiquitin/proteasome system plays a role in the control of PGC-1? degradation. Here we evaluated the interaction of PGC-1? with the protein A20, which plays a dual-role in the control of the ubiquitin/proteasome system acting as a deubiquitinase and as an E3 ligase. We employed immunoprecipitation, quantitative real-time PCR and immunofluorescence staining to evaluate PGC-1?, A20, PPAR? and ubiquitin in the adipose tissue of humans and mice. Our results show that, in distinct sites of the adipose tissue A20 binds to PGC-1?. At least in the subcutaneous fat of humans and mice the levels of PGC-1? decrease during obesity, while its physical association with A20 increases. The inhibition of A20 leads to a reduction of PGC-1? and PPAR? expression, suggesting that A20 acts as a protective factor against PGC-1? disposal. Thus, we provide evidence that mechanisms regulating PGC-1? ubiquitination are potentially involved in the control of the function of this transcriptional co-activator / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências