Ischemic stroke is a leading cause of death and long-term disability in the world. Although many pathological aspects of mechanisms are considered to be involved in the stroke, accumulating evidences implicated that inflammation accounts for its progression and complications. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and nitric oxide are considered as key mediators produced by cells like microglia in the pathogenesis of the disease. Therefore, the development of therapies targeting at the suppression of nitric oxide and TNF-α productions may ameliorate the severity of ischemic stroke. Gastrodia and Uncaria Decoction (GUD) is a traditional herbal decoction that is commonly used in the therapy of post-ischemic stroke in China. Although it shows great efficacy in clinical treatment, few studies have been conducted to investigate the mechanisms of action of GUD. Furthermore, GUD contains a complex mixture of constituents and the effects of these compounds are unknown. In this study, individual herbs from GUD were extracted and the bioactive fractions were further separated using liquid-liquid partition, silica gel chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC). The inhibitory effect of the extracts on lipopolysaccharide (LPS)-stimulated nitric oxide production in BV-2 microglial cells was utilized as the biological marker for the screening. After several rounds of purification, a purified bioactive compound was isolated. After spectroscopic analysis by nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry, the compound was identified as genipin (1R,4aS,5,7aS-tetrahydro-1-hydroxy-7-(hydroxymethyl)-cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid, methyl ester). Mechanisms of the suppressive action on signaling pathways were investigated in the LPS-activated BV-2 cells. Our results demonstrated that genipin can dose-dependently inhibit LPS-stimulated nitric oxide overproduction. It can also suppress mRNA levels and protein expressions of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and TNF-αupon LPS-induction. In addition, the phosphorylations of phosphoinositide-3 kinase (PI3K) and protein kinase B (Akt) were suppressed. In contrast, the phosphorylations of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), nuclear translocation of nuclear factor-κB (NF-κB) p65 and degradation of inhibitory κB-α (IκB-α) were not affected by genipin. Finally, genipin protected murine Neuro-2a neuroblast against neurotoxicity stimulated by the conditioned media transferred from LPS-challenged BV-2 cells. In conclusion, the anti-inflammatory effects of genipin are via the modulation of PI3K/Akt signaling pathway. Genipin and its synthetic analogues may have great potential for developing into new drugs in treating ischemic stroke. In addition, genipin can be used as the chemical marker to standardize the extract of Eucommia ulmoides Oliver as anti-inflammatory agents for treating inflammatory conditions associated with ischemic stroke. / published_or_final_version / Paediatrics and Adolescent Medicine / Master / Master of Philosophy

Resumo: Não disponível / Abstract: Uncaria tomentosa (Willd.) DC (Rubiaceae) is a large woody vine that is native to the Amazon and Central American rainforests and is widely used in traditional medicine for its immunomodulatory and anti-inflammatory activities. The present work used in vivo immunotoxic and in vitro immunomodulatory experiments to investigate the effects of a pentacyclic oxindole alkaloid extract from U. tomentosa bark on lymphocyte phenotype, Th1/Th2 cytokine production, cellular proliferation and cytotoxicity. For the in vivo immunotoxicity testing, BALB/c male mice were treated once a day with 125, 500 or 1250 mg/kg of U. tomentosa extract for 28 days. For the in vitro protocol, lymphocytes were cultured with 10 to 500 μL/mL of the extract for 48 h. The extract increased the cellularity of splenic white pulp and the thymic medulla and increased the number of T helper lymphocytes and B lymphocytes. Also, a large stimulatory effect on lymphocyte viability was observed. However, mitogen-induced T lymphocyte proliferation was significantly inhibited at higher concentrations of U. tomentosa extract. Furthermore, an immunological polarization toward a Th2 cytokine profile was observed. These results suggest that the U. tomentosa aqueous-ethanol extract was not immunotoxic to mice and was able to modulate distinct patterns of the immune system in a dose-dependent manner / Orientador: Rosa Marlene Viero / Coorientador: Alexandrina Sartori / Banca: Carla Adriene da Silva Franchi / Banca: Ana Lúcia Tozzi-Spinardi Barbisan / Banca: Isis Machado Hueza / Banca: Efigênia Queiroz de Santana / Doutor

Made available in DSpace on 2016-04-27T12:29:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 cintia_mello_ioc_mest_2015.pdf: 2747649 bytes, checksum: 92f3eedd9bed909aa684e19d506eabf4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A incidência de dengue em todo o mundo tem aumentado nas últimas décadas. As respostas imunológicas exacerbadas desempenham um papel crucial para a sua fisiopatologia, tais como a indução do extravasamento plasmático, originado principalmente pela produção de uma cascata de citocinas inflamatórias e que podem induzir distúrbios de coagulação e alteração da permeabilidade vascular levando, eventualmente, a hemorragias graves e ao choque. Os produtos naturais, que têm propriedades imunomoduladoras descritas na etnofarmacologia, podem promover o controle da replicação viral e uma redução de citocinas que induzem a permeabilidade endotelial, o que poderia resultar em manifestações clínicas mais leves. O objetivo deste estudo foi investigar se compostos provenientes de uma planta medicinal poderiam modular a resposta imune inata associada com características imunopatológicas na infecção pelo vírus Dengue (DENV), usando um modelo de infecção in vitro com linhagens contínuas de hepatócitos humanos (Huh-7). Métodos e Resultados: Após infecção das células-alvo Huh-7 pelo DENV-2, as culturas foram tratadas com lotes únicos de extratos hidroalcoólicos de Uncaria sp. (UGC ou UGF), em diferentes concentrações. A taxa de células contendo antígenos virais foi determinada após períodos de incubação por imunofluorescência vírus específica e citometria de fluxo A proteína viral não estrutural (NS1), indicativa de replicação viral, foi detectada nos sobrenadantes de cultura de células assim como as citocinas/quimiocinas MIF, IL-8 e IL-6, todas determinadas por ensaios de ELISA. Nos mesmos sobrenadantes, a produção do fator inflamatório óxido nítrico foi determinada indiretamente pela detecção de nitrito (Reação de Griess). Além disso, foram observados por citometria de fluxo alterações de viabilidade celular, apoptose e necrose, utilizando marcações pelo kit LIVE/DEAD e por Anexina V e Iodeto de propídio (PI). Foram observados efeitos antivirais de UGC e UGF, estatisticamente significantes, em comparação com células não tratadas, em concentrações que reduziram a frequência de células positivas para o antígeno viral e a quantidade de NS1 secretada. Efeitos imunomoduladores significantes foram mostrados pela redução da secreção de MIF, IL-8 e IL-6. Houve um aumento na produção de nitrito em culturas infectadas e tratadas com os dois extratos em diferentes concentrações, além de redução das taxas de apoptose e necrose, significantes. Conclusão: Existem compostos ativos na espécie vegetal que possuem capacidades antiviral e imunomoduladora. Sendo assim, mostraram-se potenciais candidatos para o desenvolvimento de um produto para tratamento da dengue. Apoiado por FIOCRUZ / RPT11D; IOC / PROEP; CNPq; FAPERJ; CAPES / The incidence of dengue worldwide has increased in recent decades. The exacerbated immune responses play a crucial role in the infection pathophysiology, such as the induction of plasma extravasation. It is caused mainly by the production of a cascade of inflammatory cytokines that can induce coagulation disorders and alterations in vascular permeability leading, eventually, to severe hemorrhages and shock. Natural products, which have immunomodulatory properties described in ethnopharmacology, can promote the control of viral replication and a reduction of cytokines that induce endothelial permeability, which could result in milder clinical manifestations. The aim of this study was to investigate whether compounds from a medicinal plant could modulate the innate immune response associated with immunopathological characteristics in infection Dengue virus (DENV), using an in vitro model of infection with continuous lines of human hepatocytes (Huh-7). Methods and Results: After infection of Huh-7 target cells by DENV-2, cultures were treated with single lots hydroalcoholic extracts of Uncaria sp. (UGC or UGF), at different concentrations. The rate of cells containing viral antigens was determined after incubation periods by virus-specific immunofluorescence and flow cytometry. Viral non-structural protein (NS1), indicative of viral replication, was detected in cell culture supernatants and cytokines/chemokines, MIF, IL-8 and IL-6, all determined by ELISA assays In the same supernatants, the production of inflammatory factor nitric oxide was determined indirectly by nitrite (Griess reaction). Moreover, cells were analyzed by flow cytometry for cell viability changes, apoptosis and necrosis, by using LIVE/DEAD and Annexin V and Propidium iodide (PI) kits. Antiviral effects were observed by UGC and UGF, statistically significant, compared to untreated cells at concentrations that reduced the rate of viral antigen positive cells, and the amount of the secreted NS1. Significant immunomodulatory effects were shown by the reduction in secretion of MIF, IL-8 and IL-6. An increase in nitrite production in infected and treated cells was observed with the two extracts in different concentrations. In addition, reduced rates of apoptotic and necroptic cells were significant. Conclusion: There are active compounds in plant species that have antiviral and immunomodulatory capabilities. Therefore, were potential candidates for the development of a product for treatment of dengue. Supported by FIOCRUZ/RPT11D; IOC/PROEP; CNPq; FAPERJ; CAPES / 2017-01-27

The extracts of stem and root of the Uncaria tomentosa plant present several properties. Among them, the anti-inflammatory property is very important since it has been studied and widely observed in cases of rheumatoid arthritis (RA) treatment. The model of arthritis induced by complete Freund s adjuvant (CFA) in rats is a model widely used in searches for new therapies for chronic inflammatory arthropathies, such as RA, which in turn, is a chronic inflammatory disease, immune-mediated and with rather complex physiopathology. During the inflammatory process, a complex and hierarchical cytokines network rules this process triggering a Th1 type immune response. Among the mediators that modulate the action of lymphocytes during inflammatory process, we emphasize ATP, ADP, AMP and the nucleoside adenosine, which are essentials to the initiation and maintenance of inflammatory responses. The effects of these molecules are promoted by the action of specific purinergic receptors and controlled by an enzyme complex on the cell surface. The objective of this study was to evaluate the effect of the Uncaria tomentosa extract on the metabolism of adenine nucleotides through the activity of ectoenzymes involved in the ATP metabolism in lymphocytes of rats submitted to an experimental model of rheumatoid arthritis.The animals were divided into four groups, namely, control (C), extract (E), arthritis (AR) and arthritis associated with extract (AR+E). Fifteen days after AR induction by CFA, the U. tomentosa dry extract was administered two times a day at the dose of 150mg/kg for 45 days. After treatment, the blood was collected by cardiac puncture and the lymphocytes were isolated to E-NTPDase and ADA activity determination, and the serum used to purine level measurement. Results show an increase in the E-NTPDase activity in rats with CFA induced arthritis compared to control. Rats treated only with Uncaria tomentosa extract showed E-NTPDase and E-ADA activity maintained in basal levels. In rats with RA treated with Uncaria tomentosa, the extract was able to prevent the increase on the E-NTPDase activity, although the ATP and adenosine levels were decreased and ADP levels were increased in extracellular medium. The increase in E-NTPDase activity might be related to the attempt to maintain basal levels of ATP and ADP in basal levels in the extracellular medium, since the RA induction causes tissue damage and consequently large amounts of ATP in the cell. This way, the Uncaria tomentosa extract was able to prevent the increase in the E-NTPDase activity promoting RA induction. / Os extratos do caule e da raiz da planta Uncaria tomentosa possuem diversas propriedades, dentre elas a propriedade anti-inflamatória, sendo bastante utilizados em casos de artrite reumatóide (AR). O modelo de artrite induzida por adjuvante completo de Freund (CFA) em ratos é um modelo bastante empregado na investigação de novas terapias para artropatias inflamatórias crônicas, como a AR, que por sua vez, é uma doença crônica inflamatória, imunomediada e com fisiopatologia bastante complexa. Durante o processo inflamatório, uma rede complexa e hierarquizada de citocinas rege este processo desencadeando uma resposta imunológica essencialmente do tipo Th1. Dentre os mediadores capazes de modular as ações dos linfócitos, durante um processo inflamatório, destacam-se o ATP, o ADP, o AMP e o nucleosídeo adenosina, essenciais para o início e manutenção das respostas inflamatórias. Os efeitos destas moléculas são promovidos através da ativação de receptores purinérgicos específicos e controlados por um complexo enzimático localizado na superfície das células. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do extrato de Uncaria tomentosa no metabolismo de nucleotídeos da adenina através da atividade de ectoenzimas envolvidas na hidrólise do ATP em linfócitos de ratos submetidos a modelo experimental de AR. Os animais foram divididos em 4 grupos, controle (C), extrato (E), artrite (AR) e artrite associado ao extrato (AR+E). Quinze dias após a indução da AR por CFA, o extrato seco de U. tomentosa foi administrado por gavage 2 vezes ao dia na dose de 150mg/Kg durante 45 dias. Após o tratamento, o sangue foi coletado por punção cardíaca e os linfócitos foram separados para a realização da atividade da E-NTPDase e ADA, e o soro utilizado para a quantificação dos nucleotídeos e nucleosídeo. Os resultados demonstraram um aumento na atividade da E-NTPDase em ratos com AR induzida por CFA quando comparado ao controle. Já nos ratos tratados somente com o extrato de Uncaria tomentosa pode-se observar que o mesmo manteve a atividade da E-NTPDase e da E-ADA a níveis basais. Nos ratos com AR e tratados com o extrato pode-se observar que o mesmo foi capaz de prevenir o aumento da atividade da E-NTPDase, embora o nível de ATP e adenosina se encontram diminuídos e do ADP aumentado no meio extracelular. O aumento na atividade da E-NTPDase estaria relacionado com a tentativa de manter as concentrações basais de ATP e ADP no meio extracelular, uma vez que a indução da AR causa dano tecidual e consequentemente a liberação de grandes quantidades de ATP presentes no interior da célula. Dessa forma, o extrato de Uncaria tomentosa foi capaz de prevenir o aumento da atividade da E-NTPDase causado pela indução da AR.

Reports of the use of cat's claw (Uncaria tomentosa) in patients with cancer, in conjunction with traditional therapies such as chemotherapy and radiotherapy, show decrease in adverse effects to these therapies (such as hair loss, weight loss, nausea, secondary infections, and skin problems). Subsequent research showed that cat's claw may help in the restoration of cellular DNA, preventing cell damage caused by chemotherapy; it also acts as an immunomodulator and antioxidant. Studies also show that cat's claw may have a direct effect in stimulating myeloid. The therapeutic dose of chemotherapy is often limited by toxicities, neutropenia being the most observed at high risk of infection. Pharmacological interventions able to reduce or prevent adverse effects may have a substantial impact on the treatment of cancer. In this context, it follows the objectives of this research: to study the pathophysiology of colorectal cancer and evaluate the effect of Uncaria tomentosa, used as an adjunct in the treatment of colorectal cancer in hematological, immunological, oxidative stress and DNA damage. The results (i) confirm previous studies that indicate the influence of the immune system in the evolution of colorectal cancer and showed the relative risk of poor clinical response of the group of women, since they have lower levels of T CD8+ cells and low hemoglobin levels; (ii) it showed that the adaptive process of tumor cells to glycolytic metabolism as a result of poor oxygenation, resulting in increased lipid peroxidation measured by TBARS content and that this parameter is not an early indicator of clinical response, (iii) it proves that Uncaria tomentosa has the property of stimulating myeloid proliferation, similar to colony stimulating factor of granulocytes, being effective in recovery from neutropenia induced by chemotherapy in animal models, (iv), although, in the dose of 300 mg of dry extract per day, Uncaria tomentosa was not effective in altering the immune response, in improving the levels of oxidative stress and in reducing DNA damage, and in minimizing the side effects of chemotherapy of colorectal cancer patients. The Uncaria tomentosa is efficient in reducing neutropenia caused by chemotherapy, by stimulate the proliferation of myeloid precursors, further studies are needed to determine in which treatment regimens its use may be effective. / Os relatos da utilização da unha de gato (Uncaria tomentosa) em pacientes com câncer, em conjunto com terapias tradicionais, como quimioterapia e radioterapia, referem atenuação sobre os efeitos adversos a essas terapias (como perda de cabelo, perda de peso, náuseas, infecções secundárias e problemas de pele). Pesquisas demonstraram que a unha de gato pode ajudar na restauração do DNA celular, prevenir os danos celulares causados por quimioterápicos, atuar como imunomodulador e antioxidante. Estudos também demonstram que a unha de gato pode ter um efeito mieloestimulante direto. A dose terapêutica dos quimioterápicos é frequentemente restrita pelos efeitos tóxicos, sendo a neutropenia a forma mais observada, aumentando o risco de infecções. As intervenções farmacológicas capazes de reduzir ou prevenir os efeitos adversos podem ter um impacto substancial sobre o tratamento do câncer. Neste contexto situam-se os objetivos deste trabalho: estudar a fisiopatologia do câncer colón retal e avaliar o efeito da Uncaria tomentosa, utilizada como adjuvante no tratamento do câncer colón retal, nos parâmetros hematológicos, imunológicos, estresse oxidativo e danos ao DNA. Os resultados (i) corroboram estudos prévios que indicam a influencia do sistema imune na evolução do câncer cólon retal e revelaram o risco relativo de pior resposta clínica do grupo das mulheres, por apresentarem menores valores de células T CD8+ e baixos níveis de hemoglobina; (ii) demonstram que o processo adaptativo das células tumorais ao metabolismo glicolítico, em consequência da oxigenação deficiente, resulta em maior peroxidação lipídica, mensurada pelo conteúdo de TBARS e que este parâmetro é um indicador precoce da não resposta clínica; (iii) comprovam que a Uncaria tomentosa possui propriedade de estímulo a proliferação mielóide, semelhante ao fator estimulante de colônias de granulócitos, sendo eficiente na recuperação da neutropenia induzida por quimioterapia, em modelo animal; (iiii) mas, na dose de 300 mg de extrato seco/dia, a Uncaria tomentosa não é efetiva em alterar a resposta imunológica; em melhorar os níveis do estresse oxidativo e reduzir os danos ao DNA; em minimizar os efeitos colaterais da quimioterapia dos pacientes com câncer cólon retal. A Uncaria tomentosa é eficiente em reduzir a neutropenia causada por quimioterapia, por estimular a proliferação dos precursores mielóides, sendo necessários outros estudos para determinar em quais esquemas terapêuticos o seu uso pode ser efetivo.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

A espécie Uncaria tomentosa (Rubiaceae) é reconhecida por diversos povos sul-americanos, devido a sua importância etnofarmacológica. Na sua maioria, os estudos realizados com U. tomentosa empregam como matéria prima vegetal a casca, devido à fração rica em alcalóides. Entre os constituintes químicos relatados para a espécie destacam-se os flavonóides, triterpenos e alcalóides, aos quais é atribuído um número significativo de propriedades terapêuticas. A escassez de metodologias analíticas para o doseamento do teor de alcalóides de U. tomentosa motivou a realização do presente trabalho, que visa à validação de metodologia analítica para matéria prima vegetal (DVSM), extrato seco (ESC) e cápsulas contendo extrato seco de Uncaria tomentosa DC. O estudo propôs a utilização de metodologia espectrofotométrica e cromatográfica para a quantificação de teores totais de alcalóides. Para fins de identificação da espécie foram utilizados métodos cromatográficos por CCD, preconizados para flavonóides e alcalóides. O perfil por CCD encontrado para a DVSM, liofilizado e ESC foi diferente do relatado na bibliografia. O teor de alcalóides do extrato seco comercial (ESC), utilizando método espectrofométrico foi de 8,41 mg/g, apresentando uma taxa de recuperação de 100,45%. Paralelamente, foi desenvolvido e validado um método de análise por CLAE para o ESC, que permitiu a quantificação da fração alcaloídica, expressa como isomitrafilina. O teor de alcalóides totais encontrado foi de 14,58 mg/g e apresentou taxa de recuperação de 99,95 a 100,44%. No teste de robustez do método analítico por CLAE, o ESC apresentou variações significativas com a variação do pH e da temperatura. O ESC contido em cápsulas de gelatina foi testado quanto à estabilidade térmica, por um período de 90 dias, a 50 ± 2 ºC e 90 ± 5% de umidade relativa. O perfil de alcalóides totais foi obtido por CLAE e ao ser comparado com o ESC, não exposto a condições extremas, apresentou teores equivalentes, porém, com mudança no perfil da fração alcaloídica, o que pode caracterizar produtos de degradação. Um perfil similar foi observado quando o ESC foi exposto à luz UVC por 90 dias. / Uncaria tomentosa DC (Rubiaceae; cat’s claw) is a climbing bush widespreads in the tropical South American countries, in which its etnopharmacological importance is largely recognized. The main phytochemical studies on U. tomentosa revealed a meaningful alkaloid fraction in its aerial parts and especially on its bark. Besides that, other relevant components were also isolated from its bark, including flavonoids and triterpenes, to which several pharmacological properties were formerly ascribed. Notwithstanding the crescent importance in the research of novel drugs, it is to denote the lack of official and validated analytical methods intended for the determination of the alkaloids content in U. tomentosa. Thus, the aim of this work was the development and validation of analytical method which allow the analysis and content determination of the main alkaloids in the vegetal raw material (DVSM), a commercial dry extract as well as in gelatin hard capsules containing it. For this purpose, a spectrophotometric method and a chromatographic one were developed and afterwards validated. In both cases the total alkaloids content was expressed as isomitraphiline (reference standard). The identification by CCD analysis was carried out on basis to several methods related earlier in the literature for flavonoids and alkaloids. In general, the comparison from CCD profiles of genuine samples of U. tomentosa bark depicted in the literature, DVSM, dry extract and ESC profiles led to partial dissimilar results, which reinforce the need of additional efforts in this way. The alkaloids content calculated spectrophotometrically for the commercial dry extract (ESC) was 8,41 mg/g, with a recover of 100,45%. For the HPLC method, the total alkaloids content correspond to the sum of the area under the peaks previously characterized as alkaloids. The alkaloids content calculated for the same extract by HPLC was 14.58 mg/g, with a recover rate of 99,95 to 100,44%. The method as a whole fulfills the usual ICH validation requirements. The stability test under stress conditions of pH and temperature for the ESC presented a significant variation of the individual area of some peaks. The original peaks assigned to isomitraphiline, pteropodine and isopteropodine showed a decrease in intensity and a concomitant appearance of new peaks, originated from breakdown process presumably. A similar profile was observed by exposing ESC samples to the wave short UV radiation during 90 days. There are also evidences in favor of degradation signals in non-treated ESC samples.

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma liana tropical nativa da Amazônia brasileira e peruana. A espécie é reconhecida pelas suas propriedades antiinflamatória imunoestimulante, antiviral e antitumoral, geralmente atribuídas aos polifenóis e, principalmente, à fração de alcaloides oxindólicos pentacíclicos. No âmbito tecnológico, visando o desenvolvimento de produtos derivados com maior valor agregado, são poucos os subsídios encontrados na literatura científica, afora alguns relatos atrelados a patentes e registros de produtos. Nesse contexto, o presente trabalho objetivou a obtenção e caracterização de frações enriquecidas de alcaloides, saponinas e polifenóis a partir das cascas de U. tomentosa, mediante o emprego de técnicas de separação em fase sólida e de métodos analíticos validados. A matéria prima foi extraída por maceração em EtOH a 40%, por quatro dias. Depois de filtrado e concentrado, o extrato bruto foi liofilizado (EBL). Para fins analíticos, o EBL foi reconstituído em EtOH a 40% e caracterizado quanto a presença de alcaloides oxindólicos, saponinas triterpênicas e polifenóis. Os quatro principais picos relativos aos alcaloides oxindólicos presentes no EBL foram quantificados por CLAE-UV e o teor total, expresso em mitrafilina, foi de 1,48 g%. Os principais picos atribuídos às saponinas foram analisados por CLAE-DAD e o teor total, expresso em α-hederina, foi de 18,37 g%. O teor de polifenóis totais, determinado pelo método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, foi estimado em 31,93 g%. Para a separação da fração polifenólica, o emprego de PVPP mostrou ser mais eficiente do que bentonita, carvão ativado ou caseína. A fração enriquecida de alcaloides oxindólicos foi obtida por separação em resina fortemente aniônica. O teor de alcaloides totais corresponde por cerca de 90% (m/m) desta fração. A fração de saponinas triterpênicas foi obtida mediante separação em resina fortemente catiônica, com teor aproximado de 78% (m/m), considerando o somatório das áreas dos picos de interesse. A proposta de uma técnica comparativa, fazendo uso de resina hidrofóbica, resultou em uma fração saponosídica enriquecida com um rendimento superior, porém com um menor teor de saponinas totais, em torno de 75% (m/m). / Uncaria tomentosa is a tropical liana native form Brazilian and Peruvian rain forests. The specie is recognized by its immune stimulant, anti-viral, anti- inflammatory and anti-cancer properties often attributed to the polyphenolic fraction and manly to the peculiar pentaciclic oxindole alkaloidal fraction. On the technological field, aiming the transformation of the raw material into standardized and high aggregate value products a few efforts can be encountered in the literature, excepting a couple of patents and product registration related information. In this context the present work aimed to the obtainment and characterization of enriched fractions of alkaloids, saponins and polyphenols from the stem barks of U. tomentosa, through solid phase separations techniques and validated analytical methods. The raw material extraction was extracted by a four days maceration in a 40% hydroethanolic solution. After the filtration and concentration, the crude extract was lyophilized (EBL). For analytical purposes the EBL was resuspended in a 40% hydroethanolic solution and characterized for the presence of oxindole alkaloids, triterpenic saponins and polyphenols. The four main peaks attributed to the oxindole alkaloids in EBL were quantified by UV-HPLC and the total content, expressed as mitraphiline, was about 1.48 g%. The main peaks attributed to the saponins were analysed by DAD-HPLC and the total content, expressed as α-hederin, was about 18.37 g%. The total polyphenolic content, determined by the Folin-Ciocalteu colorimetric assay, was estimated at 31.93 g%. For the polyphenols separation the use of PVPP showed to be more efficient than bentonite, active carbon or casein treatment. The enriched fractions of the oxindole alkaloids was obtained through a strongly anionic resin separation. The total alkaloid content of this fraction was about 90% (w/w). The saponin enriched fraction was obtained through a strongly cationic resin separation and the total saponin content was about 78% (w/w). The suggestion of a comparative technique employing a hydrophobic resin resulted on a saponosidic enriched fraction with higher yield but a lower saponin content of about 75% (w/w).

Uncaria tomentosa (Willd) DC. é uma árvore nativa das Américas Central e do Sul, onde é popularmente conhecida como "unha-de-gato". Sua casca é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento de diversas doenças, como gastrite, asma e artrite. Quanto à sua composição química é descrita a presença de alcalóides indólicos e oxindólicos, compostos polifenólicos e derivados do ácido quinóvico. Este trabalho teve como objetivo obter em separado frações enriquecidas dos referidos grupos químicos de Uncaria tomentosa, empregando o procedimento de extração em fase sólida, bem como a validação dos métodos analíticos aplicados a cada fração bioativa. Adicionalmente, as frações enriquecidas foram avaliadas quanto ao potencial efeito antiproliferativo contra linhagens de células de glioma e atividade imunoadjuvante empregando como modelo vacinas virais contendo BoHV-5, respectivamente em ensaios in vitro e in vivo. Todos os métodos de análise necessários para o acompanhamento e controle de qualidade da matéria-prima e produtos de transformação foram validados de forma satisfatória. O procedimento de separação/purificação empregando resina de poliestireno demonstrou resultados robustos e reprodutíveis e permitiu a separação de frações ricas em compostos fenólicos, alcalóides e triterpenos. Em outro plano, foi possível constatar a isomerização dos alcalóides pentacíclicos em meio aquoso por efeito do processo de secagem empregando elevadas temperaturas. O método de análise para a quantificação de polifenóis foi discriminatório quando aplicado aos extratos obtidos de diferentes órgãos de U. tomentosa. As frações fenólica e alcaloídica foram capazes de diminuir a porcentagem de células viáveis das linhagens de glioma C6 e U138-MG após período de tratamento de 48 e 72 h, respectivamente. Complementarmente, estas frações não afetaram as células não-tumorais na mesma extensão em que afetam as células cancerosas. No tocante à avaliação da atividade imunoadjuvante, um pequeno efeito foi observado apenas na resposta imune dos animais imunizados com a fração triterpênica. / Uncaria tomentosa (Willd) DC. is a climbing tree native from Central and South America, where is commonly known as “uña-de-gato” or “cat’s claw”. Its bark is widely used in traditional medicine for the treatment of gastritis, asthma and arthritis. Concerning its chemical composition is worth mentioning the presence of indole and oxindole alkaloids, phenolic compounds and quinovic acid derivatives. This work aims to obtain enriched fractions of the three main chemical groups of Uncaria tomentosa above described using solid phase extraction procedure, as well as the validation of specific assay methods. In parallel, potential antiproliferative effect against glioma cell lines and imunoadjuvant activity using BoHV-5 viral vaccine are evaluated by in-vitro and in-vivo models, in that order. All analytical methods required for monitoring and end-process quality control were validated satisfactorily. The separation/purification procedure using a polystyrene resin gave promising results and allowed the separation of phenolics, alkaloids and triterpenes fractions. Fractions yield were in all satisfactory and the processes were robust and reproducible. It could confirm the alkaloid isomerization in aqueous milieu by effect of the temperature process. The LC method for assay of polyphenols was discriminatory when applied to extracts from different organs of U. tomentosa. The fractions of phenolic and alkaloids compounds were able to decrease the percentage of cells in C6 and U138-MG glioma lineages after a 48h and 72h-treatment, respectively. Moreover, these fractions did not affect non-tumoral cells to the extent that they affect tumor cells. With regard to the imunoadjuvant activity evaluation a moderate effect was detected on immune responses of immunized animals with triterpenes fraction.

A espécie Uncaria tomentosa (Rubiaceae) é reconhecida por diversos povos sul-americanos, devido a sua importância etnofarmacológica. Na sua maioria, os estudos realizados com U. tomentosa empregam como matéria prima vegetal a casca, devido à fração rica em alcalóides. Entre os constituintes químicos relatados para a espécie destacam-se os flavonóides, triterpenos e alcalóides, aos quais é atribuído um número significativo de propriedades terapêuticas. A escassez de metodologias analíticas para o doseamento do teor de alcalóides de U. tomentosa motivou a realização do presente trabalho, que visa à validação de metodologia analítica para matéria prima vegetal (DVSM), extrato seco (ESC) e cápsulas contendo extrato seco de Uncaria tomentosa DC. O estudo propôs a utilização de metodologia espectrofotométrica e cromatográfica para a quantificação de teores totais de alcalóides. Para fins de identificação da espécie foram utilizados métodos cromatográficos por CCD, preconizados para flavonóides e alcalóides. O perfil por CCD encontrado para a DVSM, liofilizado e ESC foi diferente do relatado na bibliografia. O teor de alcalóides do extrato seco comercial (ESC), utilizando método espectrofométrico foi de 8,41 mg/g, apresentando uma taxa de recuperação de 100,45%. Paralelamente, foi desenvolvido e validado um método de análise por CLAE para o ESC, que permitiu a quantificação da fração alcaloídica, expressa como isomitrafilina. O teor de alcalóides totais encontrado foi de 14,58 mg/g e apresentou taxa de recuperação de 99,95 a 100,44%. No teste de robustez do método analítico por CLAE, o ESC apresentou variações significativas com a variação do pH e da temperatura. O ESC contido em cápsulas de gelatina foi testado quanto à estabilidade térmica, por um período de 90 dias, a 50 ± 2 ºC e 90 ± 5% de umidade relativa. O perfil de alcalóides totais foi obtido por CLAE e ao ser comparado com o ESC, não exposto a condições extremas, apresentou teores equivalentes, porém, com mudança no perfil da fração alcaloídica, o que pode caracterizar produtos de degradação. Um perfil similar foi observado quando o ESC foi exposto à luz UVC por 90 dias. / Uncaria tomentosa DC (Rubiaceae; cat’s claw) is a climbing bush widespreads in the tropical South American countries, in which its etnopharmacological importance is largely recognized. The main phytochemical studies on U. tomentosa revealed a meaningful alkaloid fraction in its aerial parts and especially on its bark. Besides that, other relevant components were also isolated from its bark, including flavonoids and triterpenes, to which several pharmacological properties were formerly ascribed. Notwithstanding the crescent importance in the research of novel drugs, it is to denote the lack of official and validated analytical methods intended for the determination of the alkaloids content in U. tomentosa. Thus, the aim of this work was the development and validation of analytical method which allow the analysis and content determination of the main alkaloids in the vegetal raw material (DVSM), a commercial dry extract as well as in gelatin hard capsules containing it. For this purpose, a spectrophotometric method and a chromatographic one were developed and afterwards validated. In both cases the total alkaloids content was expressed as isomitraphiline (reference standard). The identification by CCD analysis was carried out on basis to several methods related earlier in the literature for flavonoids and alkaloids. In general, the comparison from CCD profiles of genuine samples of U. tomentosa bark depicted in the literature, DVSM, dry extract and ESC profiles led to partial dissimilar results, which reinforce the need of additional efforts in this way. The alkaloids content calculated spectrophotometrically for the commercial dry extract (ESC) was 8,41 mg/g, with a recover of 100,45%. For the HPLC method, the total alkaloids content correspond to the sum of the area under the peaks previously characterized as alkaloids. The alkaloids content calculated for the same extract by HPLC was 14.58 mg/g, with a recover rate of 99,95 to 100,44%. The method as a whole fulfills the usual ICH validation requirements. The stability test under stress conditions of pH and temperature for the ESC presented a significant variation of the individual area of some peaks. The original peaks assigned to isomitraphiline, pteropodine and isopteropodine showed a decrease in intensity and a concomitant appearance of new peaks, originated from breakdown process presumably. A similar profile was observed by exposing ESC samples to the wave short UV radiation during 90 days. There are also evidences in favor of degradation signals in non-treated ESC samples.