A oxidação do ácido úrico (7,9-diidro-1H-purina-2,6,8(3H)-triona) pela mieloperoxidase (MPO) gera o radical de urato que, em presença do radical ânion superóxido combinam para formar o hidroperóxido de urato (HOOU). Considerando os altos níveis de MPO, ácido úrico e superóxido na placa de ateroma espera-se que o ácido úrico seja oxidado a HOOU neste microambiente inflamatório. O HOOU é um oxidante mais forte que o peróxido de hidrogênio e pode oxidar grupos tiólicos de proteínas como a proteína dissulfeto isomerase (PDI). Como consequência à oxidação da PDI, ocorre uma modulação positiva sobre a NADPH oxidase (Nox) com aumento da produção de superóxido por neutrófilos. Sendo assim, a formação do HOOU no leito vascular poderia elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o urato colabora para a progressão da aterosclerose em pacientes com hiperuricemia. Para investigar a interação do HOOU com a PDI, padronizou-se a síntese química do HOOU através de um sistema de fotooxidação do tipo I, utilizando urato, riboflavina (fotossensibilizador) e luz UVA. Inicialmente padronizou-se o tipo de irradiação e tempo de reação com o melhor rendimento para a síntese do HOOU. O HOOU formado e seu produto de redução o álcool 5-hidroxiisourato foram separados, identificados e caracterizados através de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massa (LC/MS). Após a purificação, determinou-se o coeficiente de absortividade molar em 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1) e o tempo de meia-vida, aproximadamente 41 minutos à 22°C do HOOU. O HOOU foi capaz de reagir seletivamente com o aminoácido metionina e com o tripeptídeo glutationa. Além disso, o HOOU não forma adutos estáveis com a glutationa, sendo que toda glutationa consumida foi transformada em glutationa dissulfeto. Quando incubado com a PDI (10 µM), cerca de 70 e 100% do total de HOOU (3 µM) foi consumido após 30 e 120 segundos, respectivamente, enquanto que a PDI (23 µM) teve seus grupos tiólicos oxidados após a incubação com 140 µM HOOU por 30 min a 22°C. O HOOU oxidou os resíduos de cisteína dos dois sítios catalíticos da PDI com uma constante de velocidade da reação de 1,5 ± 0,04 x 103 M-1.s-1, demonstrando uma interação favorável com essa proteína no meio biológico e um possível papel modulatório do HOOU sobre a via PDI-Nox. Interessantemente, o ácido úrico aumentou a produção de superóxido e o consumo de oxigênio de células HL-60 diferenciadas em neutrófilos (dHL-60) e ativadas com acetato de miristato de forbol (PMA). Essa regulação poderia ser mediada através da formação do HOOU durante o \"burst\" oxidativo dos neutrófilos que oxidaria a enzima PDI induzindo um consequente aumento da atividade da Nox. / The oxidation of the uric acid (7,9-dihidro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione) by myeloperoxidase (MPO) generates the urate radical. In inflammatory conditions the superoxide reacts with urate radical to form the urate hydroperoxide (HOOU). Taking into account the high amount of MPO, urate and superoxide in the atheroma plaque, it is likely that HOOU is being formed in this inflammatory environment. The HOOU is a strong oxidizing agent and can react with thiol groups from proteins, like the protein disulfide isomerase (PDI). As a consequence of its oxidation, PDI positively modulates NADPH oxidase (Nox) and increases superoxide production by neutrophils. Therefore, the formation of HOOU in the vascular sheet would contribute to tissue damage and would explain the positive correlation between hyperuricemia and the risk for cardiovascular disease. To investigate the interaction of HOOU with PDI, we performed the chemical synthesis of the compound by the Type I photooxidation, using UVA irradiation and riboflavin as a photosensitizer. Initially, we standardized the irradiation light and the time of the reaction that produced the highest income. The HOOU and its reduced product 5-hydroxiisourate were separate, identified and characterized by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC/MS). We also determine the molar extinction coefficient of HOOU at 308 nm (ε308 = 6537 ± 377 M-1.cm-1). The half-life of the compound was 41 min at 22°C. The HOOU selectively oxidized methionine and glutathione. The reaction of HOOU with glutathione did not form any stable adducts. Thus, all consumed glutathione generated glutathione disulfide. When incubated with PDI (10 µM), 70 and 100% of the total amount of HOOU (3 µM) was consumed within 30 and 120 seconds, respectively. Besides, the PDI (23 µM) had its thiol groups oxidized after incubation with 140 µM HOOU for 30 min at 22°C. The HOOU oxidized the cysteine residues from the catalytical sites of PDI with a second order rate constant of 1.5 ± 0.04 x 103 M-1.s-1. This result suggests a favorable interaction of HOOU with this protein in the biological system, as well as a possible modulatory role of HOOU on the PDI-Nox pathway. Interestingly, urate increased superoxide production and oxygen consumption by neutrophil-like cells (differentiated HL-60 cells). This effect could be mediated by the formation of HOOU during the neutrophil oxidative burst, followed by the oxidation of PDI, a positive regulation of Nox and an increase in superoxide production.

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Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Titre de l'écran-titre (visionné le 2 sept. 2008). Bibliogr.

There are localised proteins (so-called urate transporters) in the renal proximal tubules and in the intestine, which excrete and reabsorb uric acid. Polymorphisms in the genes coding these proteins can result in the disruption of the transport function and development of hyperuricemia and gout. However the serum level of uric acid is also determined by other factors which include the intake of exogenous purines in food, synthesis of endogenous purines and degradation of nucleic acids, but also certain conditions. In 250 patients with primary hyperuricemia and gout we used Sanger sequencing to analyse the exons and adjacent intron regions in ten genes coding urate transporters: ABCG2, ABCC4, SLC2A9, SLC22A12, SLC22A11, SLC22A13, SLC17A1, SLC17A3, SLC22A6 and SLC22A8. We examined a possible connection between the identified genetic variants and primary hyperuricemia and gout based on a comparison of allele frequencies with the European population, according to topological models, according to programs predicting the functional impacts of variants and searches in specialised literature. We also took into account the conclusions of functional studies analysing the impact of nonsynonymous variants in the ABCG2 and SLC2A9 genes. We also focused on the effect of the concomitant occurrence of several...

Nous avons montré les performances et les limitations en électrochimie des deuxnouvelles BODs de Bacillus pumilus et de Magnaporthe oryzae. La BOD de M.oryzae commence à réduire l’O2 à un potentiel de + 0,50 V vs. Ag/AgCl et B. pumilusà + 0,44 V vs. Ag/AgCl. La BOD de M. oryzae est peu sensible à la concentration dephosphate de sodium dans l’hydrogel rédox mais est sensible au chlore, à l’urate etaux fortes température. La BOD de B. pumilus a une activité élevée en présence dechlore et à 50 °C mais est sensible à la concentration de phosphate dans l’hydrogel.Cette sensibilité est compensée par une meilleure stabilité en présence d’urate, ainsielle ne perd que 9 % d’activité après 3 heures dans le sérum de veau. La BOD de M.oryzae immobilisée sans médiateur est plus performante que B. pumilus. Sonutilisation dans des nouveaux carbones poreux contenant des nanoparticules d’or amis en évidence l’effet des conditions de séchage des enzymes et de la méthode desynthèse des nanoparticules. Les meilleures performances sont obtenues pour unséchage à 25 °C sous vide et une synthèse séquentielle des nanoparticules. Nousavons combiné ces deux BODs dans une nouvelle cathode bi-enzymatique. Au ratiooptimal de 50 %v de chaque BOD, elle opère à + 0,50 V vs. Ag/AgCl avec un courantde -0,86 ± 0,01 mA.cm-2 dans les conditions physiologiques. Elle a une forte activité àhaute température et en présence de chlore et une stabilité intermédiaire enprésence d’urate. Dans les mêmes conditions nous avons réalisé une cathode bienzymatiqueavec B. pumilus et la laccase de Podospora anserina. Elle estégalement plus performante que les cathodes mono-enzymatiques correspondantes. / Here we showed the performances and the limits in electrochemistry of the two newBODs from Bacillus pumilus and Magnaporthe oryzae. The onset potential for theoxygen reduction with the BOD from M. oryzae is + 0.50 V vs. Ag/AgCl and with B.pumilus is + 0.44 V vs. Ag/AgCl. The BOD from M. oryzae is not sensitive to theconcentration of sodium phosphate in redox hydrogel but is sensitive to chloride,urate and high temperatures. The BOD from B. pumilus has a high activity in thepresence of chloride and at 50 °C, but is sensitive to the concentration of phosphatein the hydrogel. This sensitivity is offset by an improved stability in the presence ofurate, so it loses only 9 % of activity after 3 hours in calf serum. The BOD from M.oryzae immobilized without mediator outperforms B. pumilus. Its use in new porouscarbon materials containing gold nanoparticles showed the effect of enzymes dryingconditions of the synthesis method of the nanoparticles. The best performance isobtained for a drying at 25 °C under vacuum and a sequential synthesis ofnanoparticles. We combined these two BODs in a new bi-enzymatic cathode. At theoptimal ratio of 50 %v of each BOD, it operates at + 0.50 V vs. Ag/AgCl with a currentdensity of -0.86 ± 0.01 mA.cm-2 under physiological conditions. It has a high activityat high temperatures and in the presence of chloride and an intermediate stability inthe presence of urate. Under the same conditions we conceived a bi-enzymaticcathode with B. pumilus and laccase Podospora anserina. It is also more efficientthan the single-enzymatic corresponding cathodes.

Em condições inflamatórias do sistema vascular, altas concentrações de mieloperoxidase somada à presença do ácido úrico, sugerem a formação local do oxidante hidroperóxido de urato. A ação desse peróxido já foi demonstrada sobre glutationa e peroxirredoxinas, tornando plausível a possibilidade de que outras proteínas tiólicas também pudessem ser alvo de oxidação. A proteína dissulfeto isomerase é uma ditiol-dissulfeto oxidoredutase e chaperona, localizada principalmente no retículo endoplasmático, onde participa do enovelamento de proteínas nascentes. Além disso, um pool dessas enzimas foi identificado na superfície da célula e no meio extracelular (secretada) e parece ser especialmente importante em eventos vasculares como ativação e agregação de plaquetas, trombose e remodelamento vascular. Primeiramente, foi investigado se o hidroperóxido de urato era capaz de oxidar a PDI. Pelo ensaio do DTNB foi verificado que os tióis livres da proteína eram consumidos após reação com o peróxido e, em seguida, por nLC-MS/MS os resíduos de cisteínas dos sítios catalíticos foram identificados como os principais alvos de oxidação. Embora não tenham sido verificadas outras modificações além de dissulfetos, foi observado que o tratamento com hidroperóxido promoveu agregação e inativação da proteína. Os estudos subsequentes envolveram uma linhagem de células endoteliais (HUVECs). Análises preliminares de citotoxicidade (detecção da atividade da enzima lactato desidrogenase no sobrenadante e incorporação de sondas fluorescentes ao DNA) mostraram que tratamentos com concentrações de até 400 µM de hidroperóxido de urato não são letais às células em cultura. Usando alquilantes impermeáveis à membrana celular foi mostrado que o hidroperóxido de urato oxida não só a proteína dissulfeto isomerase, mas também proteínas tiólicas totais expressas na superfície das HUVECs. Experimentos de wound healing foram feitos para avaliação da capacidade de migração das células mediante o tratamento com hidroperóxido de urato, mas nenhuma diferença foi observada. Contudo, a incubação das células com os agentes oxidantes hidroperóxido de urato e diamida, inibidores de PDI e integrina e um alquilante de tiol, resultaram, pelo menos nos trinta primeiros minutos, em menor capacidade de adesão das células à fibronectina. Além disso, as células tratadas com hidroperóxido de urato se tornaram mais sensíveis ao destacamento da placa de cultura e apresentaram alteração na morfologia. O tratamento com o peróxido também afetou a homeostase redox das HUVECs, observado pela diminuição da razão GSH/GSSG. Finalmente foram apresentadas evidênciasindiretas de que o ácido úrico é substrato da peroxidasina, uma heme peroxidase abundantemente expressa no sistema vascular. Primeiro, pelo ensaio do Amplex Red foi observado que a presença de ácido úrico na mistura reacional resultou em menor taxa de oxidação do reagente. Depois, por LC-MS/MS, também em amostra na qual o ácido úrico estava presente, foi identificado o hidroxiisourato, álcool resultante da decomposição do hidroperóxido de urato. Todo o conjunto de dados deverá contribuir para o maior entendimento da participação do hidroperóxido de urato em processos oxidativos vasculares − especialmente a oxidação de proteínas − que pode ser um dos mecanismos responsáveis pela alteração da função endotelial e da homeostase vascular. / During vascular inflammatory conditions, high amounts of myeloperoxidase added to the presence of uric acid, suggest the local formation of urate hydroperoxide. Its oxidative action has already been demonstrated on glutathione and peroxiredoxins, making plausible the possibility that other thiol proteins could also be a target for oxidation. The protein disulfide isomerase is a dithiol-disulfide oxidoreductase and chaperone, located mainly in the endoplasmic reticulum, where it is involved in the correct folding of nascent proteins. Also, a pool of these enzymes has been identified in cell surface and the extracellular (secreted) milieu and appears to be important in vascular events, such as platelet activation and aggregation, thrombosis and vascular remodeling. First, it was investigated whether urate hydroperoxide was capable of oxidizing PDI. By the DTNB assay, it was found that the free thiols of the protein were consumed after reaction with the peroxide and then, by nLC-MS / MS, the active redox cysteine residues were identified as the main oxidation targets. Although no modifications other than disulfides have been found, hydroperoxide treatment has been shown to promote protein aggregation and inactivation. Subsequent studies involved an endothelial cell line (HUVECs). Preliminary cytotoxicity analyzes (detection of lactate dehydrogenase enzyme activity in the supernatant and incorporation of fluorescent probes into DNA) have shown that treatments with concentrations up to 400 µM are not lethal to cells in culture. Then, using alkylating agents impermeable to the cell membrane, urate hydroperoxide was shown to oxidize not only PDI but also total thiol proteins expressed on HUVECs surface. Wound healing experiments were performed to evaluate cell migration after treatment with urate hydroperoxide, but no difference was observed. However, incubation of the cells with the oxidizing agents urate hydroperoxide and diamide, inhibitors of both PDI and integrin and a thiol alkylator, resulted, at least for the first thirty minutes, in reduced cell adhesion to fibronectin. In addition, cells treated with urate hydroperoxide became more sensitive to detachment from the culture dish and exhibited alterations in morphology. Treatment with the peroxide also affected the redox homeostasis of the HUVECs, observed by a decrease in the GSH / GSSG ratio. Finally, indirect evidence was presented that uric acid is a substrate of peroxidasin, a heme peroxidase abundantly expressed in the vascular system. First, with the Amplex Red assay it was observed that the presence of uric acid in the reaction mixture resulted in lower oxidation rates of the reagent. Then, by LC-MS / MS, hydroxyisourate, which is the alcohol derived from urate hydroperoxide decomposition, was also identified in samples containing uric acid. Taken together, the data presented should contribute to a better understanding of the involvement of urate hydroperoxide in vascular oxidative processes − especially protein oxidation − that may be one mechanism associated to disturbances in endothelial function and vascular homeostasis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Gout, or gouty arthritis, has been associated of a range of comorbidities as hypertension and kidney diseases. Some studies have indicated that certain antihypertensive drugs, such as angiotensin I-converting enzyme inhibitors (ACEi), increase the risk of gout. Notably, ACEi block the metabolism of several peptides, in particular bradykinin hydrolysis. Bradykinin is also a substrate for kininase I, which forms des-Arg-kinin B1R agonists. Therefore, ACE inhibition can activate the B1R pathway. Moreover, ACEi are allosteric enhancers of kinin receptors and B1R are linked to inflammatory cardiovascular diseases. However, despite the body of evidence demonstrating a clear contribution of the kinin system to the pathogenesis of some arthritic conditions, the role of the kinin B1 receptor in monosodium urate (MSU) crystals crystal-induced gout is currently unknown, especially in respect to ACEi. Thus, the aim of the present study was to verify the role of the bradykinin B1 receptors and the effect of ACEi on acute gout induced by MSU crystals in rodents. Painful (overt pain and allodynia) and inflammatory parameters (joint edema, leukocyte trafficking, interleukin-1β levels) of acute gout attacks were assessed several hours after intra-articular (IA) injection of MSU (1.25 or 0.5 mg/articulation) in the ankle of rats or mice, respectively. The role of B1R was investigated by pharmacological antagonism or gene deletion. In addition, B1R immunoreactivity on ankle tissue and sensory neurons, kininase I activity and des-Arg9-bradykinin synovial levels were also measured. Similar tools were used to investigate the effects of ACEi on low dose of MSU (0.0125 mg/articulation)-induced inflammation. Bouth, bradykinin B1R antagonism or gene deletion largely reduced all painful and inflammatory signs of gout. Furthermore, MSU increased not only the B1R expression in articular tissues, but also the content of the B1 agonist des-Arg9-bradykinin and the activity of the B1 agonist-forming enzyme kininase I. Finally, low dose of MSU crystals (which did not induced inflammation in control animals) was capable of causing signs of acute gout attacks in ACEi-treated animals, which was B1R-dependent. Concluding, bradykinin B1R activation contributes to acute gouty attacks, including the ones facilitated by ACEi. Thus, B1R is a potential therapeutic target for treatment and prophylaxis of gout, especially in patients taking ACEi. / A gota, ou artrite gotosa, está associada à ocorrência de diversas comorbidades como doenças renais e cardiovasculares. Alguns dos fármacos utilizados para o tratamento destas comorbidades podem ainda precipitar ataques agudos de gota. Um exemplo são os inibidores da enzima cininase II ou enzima conversora de angiotensina (iECA). Muitos dos efeitos cardioprotetores dos iECA são mediados pelos receptores B1 para cininas. Além disso, a inibição da ECA é capaz de bloquear a hidrólise da bradicinina, que por sua vez é também um substrato para a formação do agonista do receptor B1, des-Arg9-bradicinina, pela ação da enzima cininase I. Apesar dos estudos demonstrando o envolvimento do sistema das cininas na gota e do papel do receptor B1 na iniciação e manutenção da inflamação, não se conhece a relação do receptor B1 com a gota, especialmente durante a inibição da ECA. Assim, o presente estudo tem por objetivo verificar o papel do receptor B1 para cininas durante o ataque agudo de gota induzido por cristais de urato monossódico (MSU) em roedores, incluindo aqueles tratados com iECA. Para isso, a dor (alodínia ao toque e comportamento doloroso espontâneo) e alguns parâmetros inflamatórios (edema articular, concentração de proteínas, infiltração leucocitária, avaliação da cinética de leucócitos e níveis de interleucina-1β) causados pelo ataque agudo de gota foram avaliados em diferentes tempos após a injeção intra-articular (IA) de uma alta dose de MSU no tornozelo de roedores. O papel do receptor B1 foi investigado através de seu antagonismo farmacológico, pela utilização de roedores com deleção gênica do receptor e pela inibição da enzima cininase I. Ainda, a expressão do receptor B1 no tecido do tornozelo e neurônios sensoriais, atividade da enzima cininase I e os níveis de des-Arg9-bradicinina foram analisados no fluido sinovial dos roedores submetidos ao modelo de gota. Ferramentas semelhantes foram utilizadas para a investigação do envolvimento dos receptores B1 na inflamação causadas pela inibição da ECA em animais submetidos a injeção IA de uma baixa dose de MSU, que não apresentava efeito per se. Tanto o uso de antagonistas do receptor B1, como sua deleção gênica, foram capazes de reduzir a inflamação neste modelo de gota. Além disso, o MSU causou um aumento na expressão de receptores B1 na articulação, e também um aumento dos níveis do agonista B1, des-Arg9-bradicinina e da atividade da enzima cininase I. Por último, a baixa dose de MSU foi capaz de causar um ataque agudo de gota em animais pré-tratados com iECA, por um mecanismo que envolve a ativação de receptores B1. Concluímos que a ativação do receptor B1 contribui para o desenvolvimento do ataque agudo de gota, incluindo aqueles que são precipitados pelo tratamento com iECA. Assim, o B1 apresenta um potencial terapêutico para o tratamento e profilaxia da gota, especialmente em indivíduos que fazem uso de iECA.

Uric acid excretion disorders are the most common cause of primary dysuricemia. The kidneys eliminate two-thirds of uric acid production and the other third is eliminated in the gastrointestinal tract. Renal reabsorption and secretion occur through the polarised epithelial cells in the proximal tubules. Uric acid transporters are expressed on these cell membranes. Reabsorption deficiency leads to hypouricemia and elevated fraction excretion associated with urolithiasis, nephrolithiasis or acute renal injury. Decreased uric acid secretion in the kidneys and small intestine leads to hyperuricemia, which develops into gout in 10% of individuals. Genome wide association studies detected a strong effect of SLC22A12 (URAT1), SLC2A9 (GLUT9) reabsorbing transporters and ABCG2 (ABCG2) secreting transporter on uric acid serum concentration variability. This thesis aimed to map out urate transporter allelic variants in a cohort of primary dysuricemia patients and identification of the variants causing defective uric acid excretion. Six non-synonymous variants were described in SLC22A12 (URAT1) and SLC2A9 (GLUT9) genes in hypouricemic individuals, which had not been identified previously in any population studies. Significant decreases in uric acid transport have been demonstrated experimentally in vitro,...

Uric acid excretion disorders are the most common cause of primary dysuricemia. The kidneys eliminate two-thirds of uric acid production and the other third is eliminated in the gastrointestinal tract. Renal reabsorption and secretion occur through the polarised epithelial cells in the proximal tubules. Uric acid transporters are expressed on these cell membranes. Reabsorption deficiency leads to hypouricemia and elevated fraction excretion associated with urolithiasis, nephrolithiasis or acute renal injury. Decreased uric acid secretion in the kidneys and small intestine leads to hyperuricemia, which develops into gout in 10% of individuals. Genome wide association studies detected a strong effect of SLC22A12 (URAT1), SLC2A9 (GLUT9) reabsorbing transporters and ABCG2 (ABCG2) secreting transporter on uric acid serum concentration variability. This thesis aimed to map out urate transporter allelic variants in a cohort of primary dysuricemia patients and identification of the variants causing defective uric acid excretion. Six non-synonymous variants were described in SLC22A12 (URAT1) and SLC2A9 (GLUT9) genes in hypouricemic individuals, which had not been identified previously in any population studies. Significant decreases in uric acid transport have been demonstrated experimentally in vitro,...