Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-20T16:44:55Z No. of bitstreams: 1 Tunes.pdf: 27891545 bytes, checksum: 4feb76814de1de7da1d4a476de6f2134 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-20T16:45:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tunes.pdf: 27891545 bytes, checksum: 4feb76814de1de7da1d4a476de6f2134 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T16:45:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tunes.pdf: 27891545 bytes, checksum: 4feb76814de1de7da1d4a476de6f2134 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / No Brasil, a doença de Chagas e as leishmanioses têm importante impacto na saúde pública. Os fármacos usados no tratamento dessas enfermidades apresentam limitações que tornam necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Nesse sentido, no presente estudo foram selecionados sete produtos naturais bioativos (PNB) e um derivado de produto natural (dPNB) e suas atividades tripanocida e leishmanicida foram determinadas e/ou confirmadas. A eleuterine, a tiofenonaftoquinona (TNQ) e a aurentiacina foram descritas como leishmanicidas pela primeira vez, sendo suas atividades antiamastigota de 99, 99 e 98 %, respectivamente. O lapachol, a chalcona 1 e a chalcona 2 tiveram o efeito leishmanicida confirmado com atividade de 85, 99 e 99 %, respectivavente. Nenhuma substância foi considerada ativa no modelo de T. cruzi utilizado. Devido às quantidades de substâncias disponíveis, apenas o lapachol e a TNQ tiveram seus mecanismos de ação leishmanicida estudados. As concentrações inibitórias de 50% (CI50) da TNQ foram inferiores àquelas do lapachol em promastigotas (2 e 25 μM), amastigotas recuperadas de lesão (22 e 224 μM) e amastigotas intracelulares (7,4 e 84 μM). A razão entre a CI50 em amastigotas intracelulares e macrófagos foi utilizada para o cálculo do índice de seletividade, sendo este 3,8 para o lapachol e 7,7 para a TNQ. Os PNB e dPNB leishmanicida foram avaliados quanto à atividade inibitória da enzima tripanotiona redutase (TR), sendo que nenhum foi capaz de inibir a enzima. Os efeitos induzidos por TNQ e lapachol sobre a atividade mitocondrial de promastigotas foram avaliados por citometria de fluxo e respirometria. O tratamento com lapachol induziu perda do potencial de membrana mitocondrial e reduziu o consumo de oxigênio pelos parasitos. Por sua vez, a TNQ não alterou esses parâmetros. Análises de microscopia eletrônica de transmissão mostraram que o tratamento com lapachol ou TNQ induziu danos no complexo de Golgi e na bolsa flagelar, formação de vesículas e perfil de autofagia. O lapachol, mas não a TNQ, também induziu alterações ultraestruturais nas mitocôndrias das promastigotas. Em conjunto, os resultados permitem propor que a mitocôndria seja um importante alvo celular para o lapachol. Uma vez que a TNQ não causou alterações na mitocôndria dos parasitos, mas induziu danos em outras organelas, pode-se propor que seu mecanismo de ação esteja relacionado à indução de estresse oxidativo. Este trabalho reforça a importância dos PNB na descoberta de novas substâncias bioativas, as quais podem ser objeto de estudos de mecanismos de ação, a fim de se expandir o conhecimento disponível para o processo de desenvolvimento de novos fármacos usados para o tratamento de endemias que afligem milhões de pessoas como as leishmanioses e a doença de Chagas. / In Brazil, Chagas disease and leishmaniasis cause great impact on public health. The drugs currently used to treat these diseases have limitations that make necessary the search for new therapeutic alternatives. In this context, seven bioactive natural products (BNP) and one derivative (BNPd) were selected for investigations. Their trypanocidal and leishmanicidal activities were detected or confirmed. Eleutherine, naphthothiophenquinone (TNQ) and aurentiacin had their leishmanicidal activity described for the first time in this study, reducing almost 100% of the parasites growth. Lapachol, chalcone 1 and chalcone 2 had their leishmanicidal activity confirmed. None were active on T. cruzi intracellular amastigote and trypomastigote model. Because of the available amounts of compounds, only lapachol and TNQ had their leishmanicidal mechanism of action studied. The inhibitory concentrations of 50% of the parasite growth (IC50) induced by TNQ were inferior of that of lapachol in promastigotes (2 μM and 25 μM), lesion derived amastigotes (22 μM and 224 μM) and intracellular amastigotes (7.4 μM and 84 μM). The ratio between the IC50 on macrophages and intracellular amastigotes was used to calculate the selectivity index, lapachol’s was 3.8 and TNQ’s was 7.7. The leishmanicidal BNP and BNPd were evaluated as to their ability to inhibit trypanothione reductase (TR) and none of the compounds were able to inhibit the enzyme. The effects induced by the compounds on promastigotes mitochondrial activity were assessed using flow citometry and respirometry. Treatment using lapachol induced loss of mitochondrial membrane potential and reduced oxygen consumption by the parasites. On the other hand, TNQ did not alter those parameters. Transmission electron microscopy showed that lapachol and TNQ induced damage to the Golgi complex, flagellar pocket, formation of vesicles and autophagy profile. Lapachol, but not TNQ, induced ultrastrucutral alterations on promastigotes mitochondria. These results suggest that mitochondria are an important target for lapachol. As TNQ did not alter the parasites mitochondrial function or structure, but induced important ultrastructural alterations in other organelles, we can assume that its mechanism of action could be related to induction of oxidative stress. The present work reinforces the importance of BNP in the discovery of new active compounds that can be used for mechanism of action studies, contributing to the knowledge required for drug development to treat diseases that afflict millions of people worldwide such as leishmaniasis and Chagas diseases

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-23T13:09:21Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_ClariceCarvalhoAlves.pdf: 3366605 bytes, checksum: 500faa250a99b7c383180d2bec4de2e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-11-23T13:09:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_ClariceCarvalhoAlves.pdf: 3366605 bytes, checksum: 500faa250a99b7c383180d2bec4de2e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-23T13:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_ClariceCarvalhoAlves.pdf: 3366605 bytes, checksum: 500faa250a99b7c383180d2bec4de2e8 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brazil / O desenvolvimento de uma vacina para a esquistossomose, juntamente com a quimioterapia, seria de grande impacto para o controle e eliminação da doença. Nesse sentido, vários antígenos do parasito já foram testados a fim de avaliar a capacidade dos mesmos em induzirem proteção contra a infecção pelo Schistosoma mansoni. Porém, apesar de alguns antígenos apresentarem bons resultados na proteção contra a infecção, esses nunca foram testados em modelos experimentais previamente expostos a antígenos do parasito. No caso da esquistossomose, isso seria importante já que os moradores de áreas endêmicas, população alvo de uma vacina para a doença, passam por repetidas infecções ao longo de suas vidas. Diante dessa necessidade, duas proteínas de tegumento de Schistosoma mansoni, Sm22.6 e Sm29, merecem destaque já que têm sido associadas à resistência à infecção e reinfeção em moradores de áreas endêmicas, e por terem induzido proteção parcial em ensaios envolvendo a imunização de camundongos C57BL/6 naïve. Portanto, este trabalho objetivou avaliar a habilidade das proteínas recombinantes, Sm22.6 e Sm29, em induzirem proteção em animais BALB/c que já tenham sido previamente infectados e tratados. Nós também avaliamos a capacidade das proteínas Sm22.6r e Sm29r em induzirem proteção em camundongos BALB/c naïve, já que nos trabalhos anteriores essas foram testadas em animais da linhagem C57BL/6. Nossos resultados demonstraram que, diferentemente dos trabalhos anteriores, a imunização de animais BALB/c naïve com Sm22.6r ou Sm29r não foi capaz de induzir proteção. Apesar disso, através de um ensaio de imunofluorescência, foi possível observar que os anticorpos produzidos, em resposta à imunização com Sm22.6r ou Sm29r, foram capazes de reconhecer a forma nativa dessas proteínas, na superfície do parasito. A imunização de animais, infectados e tratados, com Sm22.6r+Freund, embora tenha desencadeado uma resposta imune robusta, também não foi capaz de conferir imunidade protetora. Por outro lado, camundongos, infectados/tratados, imunizados com Sm29r+Freund apresentaram significativa redução da carga parasitária (proteção de 26%-48%) após três doses da vacina. Esta formulação vacinal induziu uma produção significativa das citocinas IL-2, IFN-γ, IL-17 e IL-4; uma resposta humoral vigorosa com produção de IgG, IgG1, IgG2a e IgE específicos; e um aumento significativo no percentual de células TCD4+ de memória central. Os adjuvantes Alum e MPL também foram formulados juntamente com a Sm29r. Os resultados demonstraram que somente a formulação vacinal Sm29r+Alum foi capaz de conferir proteção (29%-37%), desencadeando uma produção significativa de IL-2, IL-17 e IL-10, e um aumento do percentual de células TCD4+ produtoras de IFN-γ. Além disso, esses animais apresentaram níveis significativos de anticorpos específicos IgG, IgG1, IgG2a e IgE e um aumento significativo no percentual de células B de memória. Nossos resultados confirmam o papel imunoprotetor da proteína Sm29r, reforçando seu potencial como candidata vacinal. / The development of a vaccine against schistosomiasis together with chemotherapy would have a great impact in the disease control and elimination. In this sense, several parasite antigens have been tested in order to assess its ability to induce protection against Schistosoma mansoni infection. Despite the great results observed after mice immunization with those antigens, they have never been tested in mice previously exposed to the parasite antigens. In the case of schistosomiasis, this is an important assessment to be done, since the residents of endemic areas, target population of a schistosomiasis vaccine, are exposed to several infections through life. In this context, two parasite tegument proteins, Sm22.6 and Sm29, are promising candidates, that have been associated with resistance to infection and reinfection in individuals living in endemic areas, and also induce partial protection against schistosomiasis in immunization trials using C57BL/6 naïve mice. Therefore, this work aimed to evaluate Sm22.6r and Sm29r ability to induce protection in BALB/c mice previously infected with S. mansoni and treated with Praziquantel. We also evaluated the Sm22.6r and Sm29r ability to induce protection in BALB/c naïve mice, since, previous studies were performed in C57BL/6 strain. Unlike previous works, our results showed that neither immunization with Sm29r nor immunization with Sm22.6r induced reduction in parasite burden in BALB/c naïve mice. Nevertheless, an immunofluorescence staining assay demonstrated that antibodies produced in response to mice immunization with rSm22.6 or rSm29 were able to recognize the native proteins in the parasite surface. In infected and treated mice, the immunization with Sm22.6r plus Freund failed to induce protection, despite the robust immune response observed. In the other hand, infected and treated mice, immunized with Sm29r+Freund, presented a significant reduction in parasite burden (26%- 48% of protection). This immunization trial induced a significant production of IL-2, IFN-γ, IL-17 and IL-4 cytokines; a vigorous humoral response with a production of increased levels of specific IgG, IgG1, IgG2a and IgE antibodies; and a significant increase in the percentage of TCD4+ memory cells. Sm29r were also formulated with Alum and MPL adjuvants. The results of trials using these formulations demonstrated that only Sm29r+Alum vaccine formulation was able to confer protection (29%-37%), inducing a significant production of IL-2, IL-17 and IL-10 cytokines, and an increase in the percentage of TCD4+ IFN-γ + cells. Moreover, these animals produced higher levels of specific IgG, IgG1, IgG2a and IgE, and a significant increase in the percentage of B memory cells. Our results demonstrated that Sm29r retains its ability to induce protection in previously infected/treated mice, reinforcing its potential as a vaccine candidate.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-04-12T19:03:42Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_EmersondeCastroBarbosa.pdf: 6431092 bytes, checksum: 15243f7b5580193cfc7b7ad5b935a77a (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-04-12T19:06:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_EmersondeCastroBarbosa.pdf: 6431092 bytes, checksum: 15243f7b5580193cfc7b7ad5b935a77a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T19:06:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_EmersondeCastroBarbosa.pdf: 6431092 bytes, checksum: 15243f7b5580193cfc7b7ad5b935a77a (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Produtos naturais são potenciais fontes alternativas para o desenvolvimento de antivirais para o tratamento da dengue, assim como de outras doenças causadas por vírus da família Flaviviridae ou mesmo para um amplo espectro de viroses. Neste estudo foi feita a triagem da atividade in vitro contra o Dengue virus 2 (DENV-2) de 3101 extratos, provenientes de plantas e de fungos da Coleção de Amostras para Bioensaios da Fiocruz. Para tal, células BHK-21 foram infectadas com DENV-2 e tratadas simultaneamente com 25 μg/mL de extrato sendo o resultado analisado por dois métodos: observação do grau de inibição do efeito citopático (ECP) por microscopia óptica e análise da viabilidade celular pelo ensaio colorimétrico do MTT. Dentre os 3101 extratos testados, 115 extratos apresentaram atividade antiviral contra DENV-2 e foram selecionados para a determinação da respectiva concentração efetiva 50 (CE 50). Cinquenta e cinco destes extratos foram obtidos de plantas pertencentes a 20 famílias distintas: Amaryllidaceae (3), Annonaceae (1), Asteraceae (5), Begoniaceae (1), Clusiaceae (1), Combretaceae (1), Erythroxylaceae (1), Fabaceae 4), Lythraceae (2), Malpighiaceae (8), Malvaceae (1), Melastomataceae (2), Melochia (1), Myrtaceae (3), Rubiaceae (8), Sapindaceae (9), Ochnaceae(1), Primulaceae (1), Vitaceae (1), Vochysiaceae (1). Os demais extratos (60) foram obtidos de culturas de fungos endofíticos coletados no Brasil, no continente Antártico e no Deserto do Atacama, ainda não identificados. Até o momento, os extratos vegetais mais promissores foram obtidos de plantas da família Amaryllidaceae (IS = 32,15) e da família Fabaceae (IS = 20,47) e (IS = 24,47). Vinte extratos fúngicos apresentaram valores de CE 50 que variaram entre 3,1 a 12,5 μg/mL e sem citotoxicidade aparente até a concentração de 100 μg/mL. Nossos resultados mostram que tais plantas e fungos são fontes promissoras de substâncias com ação antiviral contra DENV. / Natural products are potential alternat ive sources for the development of antiviral drugs for dengue treatment of, as well as for other diseases caused by viruses of the Flaviviridae family or even caused by a br oad spectrum of viruses. In this study, were performed an in vitro screening for activity against Dengue virus (DENV-2) of 3101 extracts fr om plants and fungi belonging to Fiocruz Minas extract sample collection. To this end, BHK-21 cells infected with DENV-2 were simultaneously treated with 25 μg/mL of extract and t he results analyzed by two methods: observing the degree of inhibiti on of DENV cytopathic effect (CPE) by optical microscopy and also by analysis of cell viability MTT colorimetric assay. Among the 3101 extracts tested, 115 extrac ts showed antiviral activity against DENV-2 and were selected for determination of its half maximal effective concentration (EC 50 ). Fifty-five of these extracts ar e taken from plants belonging to 20 different families: Amaryllidaceae (3), Annonaceae (1), Asteraceae (5), Begoniaceae (1), Clusiaceae (1), Combretaceae (1), Erythroxylaceae (1), Fabaceae (4), Lythraceae (2), Malpighiaceae (8), Malvaceae (1), Melastomataceae (2), Melochia (1), Myrtaceae (3), Rubiaceae (8), Sapindaceae (9), Ochnaceae (1), Primulaceae (1) Vitaceae (1), Vochysiaceae (1). The other extracts (60) were obtained from endophytic fungal cu ltures collected in Brazil, from Antarctic and the Atacama Desert soils, not identified yet. To date, the most promis ing plant extracts were obtained from plants of the Amaryllidaceae family (IS = 32.15) and Fabaceae (IS = 20.47) and (IS = 24.47). Twent y fungal extracts showed EC 50 values ranging from 3.1 to 12.5 mg/mL without any apparent cyt otoxicity up to the concentration of 100 μg/mL. Our results show that these pl ants and fungi are prom ising sources of substances with antiviral action against Dengue virus.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcelo_lyra_ipec_dout_2013.pdf: 10453682 bytes, checksum: b9ea286c54dc58ea1120e40d6282f61b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Neste estudo comparamos esquemas de alta e baixa dose de antimoniato de meglumina (AM) para o tratamento da forma cutânea de leishmaniose tegumentar americana, em pacientes oriundos do estado do Rio de Janeiro. OBJETIVO: Comparar a eficácia representada pela cura imediata (epitelização em 120 dias), tardia (cicatrização em 360 dias) e definitiva (ausência de reativação ou lesão mucosa em 720 dias) e toxicidade (clínica, laboratorial e eletrocardiográfica) com duas diferentes doses de tratamento com AM para leishmaniose cutânea (LC) e comparar os critérios de cura clínica aqui adotados com aqueles estabelecidos pelo Ministério da Saúde. MÉTODO: Ensaio clínico de não inferioridade, controlado, randomizado, cego e de fase III, com 60 pacientes com LC alocados em dois grupos de tratamento: (A) 20mg Sb5+/kg/dia por 20 dias e (B) 5mg Sb5+/kg/dia por 30 dias administrados por via intramuscular. RESULTADOS: Pacientes dos grupos A e B apresentaram, respectivamente: Cura imediata 90,0% e 86,7%, com tempo médio de epitelização de 58,7 e 54,9 dias; cura tardia por intenção de tratar 76,7% e 73,3%; e cura tardia por análise de protocolo 84,6% e 75,9%. Dos 53 pacientes que apresentaram epitelização em até 120 dias, 44 (83,4%) evoluíram para cura tardia. Quando avaliados conjuntamente, os efeitos adversos (EA) clínicos, laboratoriais e eletrocardiográficos foram mais frequentes no grupo A que no grupo B (médias 7,9 e 4,7) e mais graves [RR= 2,22 (IC 95% 1,22-4,06) p=0,0045] no grupo A. Os EA clínicos graus 2 e 3 foram mais frequentes no grupo A; RR=6,5 (IC 95% 1,60-26,36) p=0,001 Os EA laboratoriais foram mais frequentes RR=1,39 (IC 95% 0,99-1,93) p=0,05 e mais graves (graus 2, 3 ou 4) RR=4,67 (IC 95% 1,49-14,59) p=0,0016 no grupo A. Hiperlipasemia foi a alteração laboratorial mais frequente e mais grave. Pacientes do grupo A apresentaram um RR=4,0, p=0,006 de desenvolver hiperlipasemia moderada a grave, com fração atribuível de 75%. Dez pacientes (16,7%) necessitaram suspender o tratamento temporariamente por apresentarem QTc >0,46ms, entretanto não houve diferença entre os grupos.CONCLUSÃO: A dose de 5mg Sb5+/kg/dia mostrou-se menos tóxica, mais segura e de menor custo no tratamento da LC, especialmente em idosos e pacientes com co-morbidades, atualmente com restritas opções terapêuticas. Entretanto, a hipótese de não inferioridade da dose baixa em relação a dose alta não pôde ser comprovada A epitelização com 120 dias, seguida de progressiva melhora no sentido da cicatrização em 360 dias sugere um possível benefício com a flexibilização dos critérios de cura da LC / In this study, we compare schemes of high and low dose of meglumine antimoniate (MA) for the treatment of cutaneous form of American tegumentary leishmaniasis in patients from Rio de Janeiro. OBJECTIVE: To compare the efficacy represented by immediate healing ( epithelialization in 120 days) , late healing (scarring within 360 days ) and final healing (no reactivation or mucosal lesion in 720 days) and clinical , laboratory and electrocardiographic toxicity with two different schemes of treatment with MA for cutaneous leishmaniasis (CL ) and compare the clinical cure criteria adopted here with those established by the Ministry of Health. METHOD : Randomized, controlled, blind, phase III clinical trial, of non-inferiority with 60 patients presenting CL divided into two treatment groups: (A) 20 mg Sb5+ / kg / day for 20 days and (B) 5 mg Sb5+ / kg / day for 30 days administered intramuscularly. RESULTS : Patients in groups A and B presented, respectively : immediate healing of 86.7 % and 90.0 % , with a mean time of epithelialization of 58.7 and 54.9 days; late healing by intention to treat of 76.7 % and 73.3%; and late healing by protocol analysis of 84.6 % and 75.9 % .From 53 patients who presented epithelialization within 120 days , 44 (83.4 %) had late healing . When considered together, the clinical, laboratory andelectrocardiographic adverse effects (AE) were more frequent in group A than in group B ( mean 7.9 and 4.7 ) and more severe [RR = 2.22 (IC CI 95% 1.22-4.06 ) p = 0.0045] in group A. The clinical AE grades 2 and 3 were more frequent in group A; RR = 6.5 ( CI 95% 1.60- 26.36 ) p = 0.001 . The laboratorial AE were more frequent RR = 1.39 ( CI 95% 0,99 - 1.93 ) p = 0.05 and more severe (grades 2 , 3 or 4 ) RR = 4.67 ( CI 95% 1.49 - 14.59 ) p = 0.0016 in group A. Hyperlipasemia was the most frequent and severe laboratory abnormality , patients in group A had a RR = 4.0, p = 0.006 of developing moderate to severe hyperlipasemia, with attributable fraction of 75 % . Ten patients ( 16.7% ) had to discontinue treatment temporarily since they presented QTc > 0.46 ms , however there was no difference between the groups.CONCLUSION : Although the hypothesis of noninferiority between schemes has not been formally proven , these findings subsidize the use of the 5mgSb5+ / kg / day dose, less toxic , safer and less expensive to treat CL , especially in the elderly and patients with co - morbidities , currently with restricted therapeutic options . Epitelization in 120 days, followed by progressive improvement towards healing within 360 days suggests a possible benefit with the relaxation of criteria for cure of CL.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T12:56:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T12:56:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:52Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf.txt: 157030 bytes, checksum: c1e93a8d2c64e66d80837be88c555677 (MD5) Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A dengue é uma doença viral transmitida de mosquitos para humanos sendo a arbovirose mais prevalente em países tropicais e subtropicais, atingindo milhões de pessoas em diferentes regiões do mundo. A dengue é causada pelo Dengue vírus (DENV), membro da família Flaviviridae, que possuem 4 sorotipos geneticamente distintos conhecidos como DENV 1-4. Uma vacina eficiente necessita de gerar resposta imune tetravalente balanceada. Para alcançarmos essa imunidade tetravalente balanceada,trabalhamos com a hipótese de que proteínas quimérica s expressando epítopos imunogênicos dos quatro sorotipos do DENV possam ser utilizadas no desenvolvimento de uma vacina segura e/ou um sistema de diagnóstico eficiente. Para este estudo onze proteínas quiméricas foram desenhadas contendo regiões de proteínas com potencial imunogênico derivado do envelope, capsídeo, membrana e/ou da proteína não estrutural NS1, dos quatro sorotipos do DENV. Tais regiões foram selecionadas in silico utilizando- se o algoritmo BepiPred. Regiões com alta homologia entre os quatro sorotipos do DENV foram preferencialmente incluídas, mas regiões antigênicas de um ou mais sorotipos do DENV também foram utilizados. As proteínas quiméricas foram construídas pela adição de resíduos de aminoácidos entre as sequências selecionadas, chamados de espaçadores, para que a estrutura dos epítopos expressos fosse mantida. A sequência final de aminoácidos foi traduzida e a sequência de nucleotídeos foi otimizada utilizando o algoritmo LETO 1.0 (Entelechon). Todas as onze proteínas quiméricas foram produzidas utilizando os vetores de expressão pET 28 TEV, pQE-9 ou pET-21ª, transformados em E. coli BL21 ou M15 e foram purificadas por cromatografia de afinidade utilizando resina de níquel para realização de ensaios de Western blot e ELISA para testar a reatividade das proteínas com soros de indivíduos já infectados pelo DENV e indivíduos nunca infectados e testes de imunogenicidade através da imunização de camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6. Nossos resultados mostraram um reconhecimento específico de cinco proteínas quiméricas com soros de pacientes sabidamente infectados pelo DENV-1, DENV-2 ou DENV-3. Além disso, a imunização de camundongos com a proteína quimérica EnvEpII, mostrou que esta proteína foi capaz de estimular uma produção robusta de anticorpos IgG1, IgG2a e IgG2c nas duas linhagens de camundongos testadas e de anticorpos neutralizantes em C57BL/6. Além disso, foi observada a ativação de células T CD4+ e CD8+ em BALB/c e o aumento dos níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-17 e IFNγ, quando camundongos foram imunizados com a proteína EnvEpII. Nossos resultados demonstram que desenhar, sintetizar, expressar e purificar proteínas quiméricas em sistemas bacterianos é viável e, dessa forma, proteínas artificiais podem ser estudadas como candidatas para o desenvolvimento de vacinas e/ou sistemas de diagnóstico contra doenças infecciosas / Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and the most prevalent arbovirus in tropical and subtropical countries, infecting thousands individuals annually in different regions of the world. Dengue is caused by Dengue virus (DENV), members of the Flaviviridae familyand is composed by 4 genetically distinct serotypes referred to as DENV 1–4. A safe vaccine demands a balanced tetravalent immune response. To address the balanced immune response, we hypothesized that chimeric proteins with potential immunogenic epitopes from the four DENV serotypes can be used to develop a safe dengue vaccine and/or an efficient diagnostic system. We designed eleven chimeras, for this the most potentially immunogenic regions of proteins derived from envelope, capsid, membrane and/or non-structural protein 1, NS1, from all DENV serotypes were in silico selected using the BepiPred algorithm. High homology regions among the four DENV serotypes were preferentially included, but antigenic regions from single or pairs of DENV serotypes were also used. The chimeras were constructed by adding non immunogenic amino acid residues between the selected sequences, named spacers residues, thus the expressed epitopes structure was maintained. The final chimeric amino acid sequence was back translated and the nucleotide sequence was optimized using the LETO 1.0 algorithm (Entelechon). All the eleven chimeric proteins were produced using the expression vectors pET 28 TEV, pQE-9 and pET-21a, transformed in E. coli BL21 or M15, and purified by Nickel-affinity chromatography to perform the Western blot and ELISA assays to test their reactivity with sera of DENV-infected patients and DENV-negative sera and to test their immunogenicity through the immunization of mice strains BALB/c and C57BL/6. Our results showed a specific recognition of five proteins by sera DENV-1, DENV-2 or DENV-3 infected patients. Moreover, the immunization using the chimera EnvEpII, shows that this protein are able to stimulate a robust production of antibodies IgG1, IgG2a and IgG2c in both mice strains tested and neutralizing antibodies were produced in C57BL/6. We also noted the activation of T cells CD4+ and CD8 + in BALB/c and the production of IL-2, IL-4, IL-17 and IFNγ when we immunized the mice with EnvEpII. Our results indicating that design, synthesize, express and purify artificial proteins in bacterial systems is viable and, thus, these proteins can be studied as candidates for the development of vaccines and/or diagnostic systems against infectious diseases.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T16:33:37Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T16:33:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T16:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:27:36Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf.txt: 2885 bytes, checksum: 53b9b6cc9653fe21e615e546bbbab789 (MD5) Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A hemofilia A (HA) congênita é um distúrbio hemorrágico com transmissão hereditária ligado a deficiência do fator VIII (FVIII). O tratamento da HA é baseado na reposição do FVIII, requerendo infusões intravenosas de concentrados de FVIII exógeno. Durante o tratamento, alguns pacientes desenvolvem uma resposta imune que produz anticorpos anti-FVIII (inibidores). Os inibidores neutralizam a atividade procoagulante do FVIII e diminuem a eficiência do tratamento. Apesar da relevância dos inibidores, os mecanismos imunológicos associados aos inibidores ainda não foram completamente elucidados. Neste trabalho analisou-se o perfil de citocinas intracitoplasmáticas de células do sistema imune inato e adaptativo de pacientes com HA e inibidores [HA-FVIII(+)] e com HA sem inibidores [HA-FVIII(−)]. Os resultados mostraram uma menor frequência de monócitos e neutrófilos TNF-, monócitos IL-5eneutrófilos IL-4e uma maior frequência de neutrófilos linfócitos T CD4+, T CD8+e T CD19+IL-10em pacientes do grupo HAα-FVIII(+). Em pacientes do grupo HAα-FVIII(−) observou-se uma maior frequência de monócitos TNF-elinfócitos B IL-4e uma menor frequência de linfócitos T CD4+e T CD8+IL-10. Observou-se o predomínio de um padrão anti-inflamatório/regulador no grupo HAα-FVIII(+) e um padrão pró-inflamatório no grupo HAα-FVIII(−), sugerindo que o microambiente celular pode ser um elemento importante associado à capacidade de desenvolvimento de inibidores. Analisou-se também a presença de micropartículas plasmáticas (MPs) em pacientes com HA. Os resultados mostraram uma maior frequência de MPs derivadas de células endoteliais, granulócitos e linfócitos T em pacientes do grupo HAα-FVIII(−) e uma maior frequência de MPs derivadas de hemácias em pacientes do grupo HAα-FVIII(+). O predomínio de MPs no grupo HAα-FVIII(−) pode ser relacionado ao aumento da ativação celular e influência do microambiente pró-inflamatório. MPs derivadas de hemácias induziram a investigação da presença de anticorpos em hemácias de pacientes com HA. Os resultados demonstraram que pacientes do grupo HAα-FVIII(+) têm uma maior frequência de anticorpos na superfície de hemácias. Em função deste resultado, investigou-se a presença de anticorpos anti-FVIII em concentrados de hemácias de pacientes do grupo HA-FVIII(+). Foi possível detectar anticorpos anti-FVIII em concentrados de hemácias, sugerindo que essas células podem interagir com anticorpos anti-FVIII. Determinou-se ainda, a avidez de anticorpos anti-FVIII de pacientes do grupo HAα-FVIII(+). Os resultados demonstraram avidez superior de anticorpos IgG total e IgG1 anti-FVIII quando comparados a IgG4. Foi observada também uma correlação negativa entre os índices de avidez de anticorpos IgG4 anti-FVIII de pacientes grave saos títulos de Bethesda, sugerindo que existem variações na avidez dos anticorpos anti-FVIII dependendo do perfil dos pacientes com HA. No contexto da avaliação da resposta imune contra o FVIII, foi possível identificar biomarcadores fenotípicos celulares e humorais característicos de pacientes com e sem inibidores que podem contribuir para o monitoramento do desenvolvimento e manutenção de anticorpos inibidores do FVIII / Congenital hemophilia A (HA) is a bleeding disorder with hereditary transmission associated to deficiency of factor VIII (FVIII). The treatment of HA is based on replacement of FVIII, requiring exogenous FVIII intravenous infusions. During the treatment some patients develop an immune response that produces anti-FVIII antibodies (inhibitors). Inhibitors neutralize the procoagulant activity of FVIII and affect the treatment efficiency. Despite the relevance of inhibitors, the immunological mechanisms associated to inhibitors are still unknown. In this work, the intracytoplasmic cytokine pattern of innate and adaptive cells from patients with HA and inhibitors [HAα-FVIII(+)] and with HA and without inhibitors [HAα-FVIII(−)] was analyzed. Results showed a lower frequency of TNF-α+monocytes and neutrophils, IL-5+ monocytes and IL-4+neutrophils and an increased frequency of IL-10+neutrophils, lymphocytes T CD4+, T CD8+and T CD19+in HAα-FVIII(+) group. In HAα-FVIII(−) group was observed an increased frequency of TNF-α+monocytes and IL-4+lymphocytes B and a lower frequency of IL-10+lymphocytes T CD4+and T CD8+. A predominance of an anti-inflammatory/regulatory pattern in HAα-FVIII(+) patients and a mixed pattern, with a bias toward inflammatory cytokine profile, in HAα-FVIII(−) patients was observed. The occurrence of these profiles seems to be associated to the capacity of inhibitors development. The presence of plasmatic microparticles (MPs) in HA patients was also analyzed. The results showed increased levels of circulating MPs derived from endothelial cells, granulocytes, and T lymphocytes in patients without FVIII inhibitors and MPs from erythrocytes were higher in patients with inhibitors. The predominance of MPs in HAα-FVIII(−) patients probably was provided by the increased of cellular activation due to an inflammatory microenvironment. MPs from erythrocytes induced to the investigation of the presence of antibodies in the surface of erythrocytes of HA patients. The results demonstrated that HAα-FVIII(+) patients have a higher frequency of antibodies in the surface of erythrocytes. Due to this result, the presence of anti-FVIII antibodies in erythrocytes concentrates in HAα-FVIII(+) patients was investigated. It was possible to detect anti-FVIII antibodies in erythrocytes concentrates, suggesting that FVIII can interact with anti-FVIII antibodies. The avidity of anti-FVIII antibodies in HAα-FVIII(+) patients was also determined. Results demonstrated a high avidity of anti-FVIII total IgG and IgG1 antibodies when compared to IgG4. A negative correlation between the avidity of anti-FVIII IgG4 antibodies in severe patients and Bethesda titer was observed, suggesting that there are variations in the avidity of anti-FVIII antibodies depending on the profile of HA patients. In the context of the evaluation of the immune response directed to FVIII, it was possible to identify phenotypic cellular and humoral biomarkers profiles of patients with and without inhibitors, thereby contributing to tracking the development and maintenance of FVIII inhibitors antibodies.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T14:33:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_VitorMiranda_CPqRR2016.pdf: 25783006 bytes, checksum: 6dba14fa941ca70fa7ddaa50145c6789 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T14:54:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_VitorMiranda_CPqRR2016.pdf: 25783006 bytes, checksum: 6dba14fa941ca70fa7ddaa50145c6789 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T14:54:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_VitorMiranda_CPqRR2016.pdf: 25783006 bytes, checksum: 6dba14fa941ca70fa7ddaa50145c6789 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-29T17:20:08Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Dissertacao_BCM_VitorMiranda_CPqRR2016.pdf.txt: 5144 bytes, checksum: af452bc1e75e1e62019b2414b4f384d9 (MD5) Dissertacao_BCM_VitorMiranda_CPqRR2016.pdf: 25783006 bytes, checksum: 6dba14fa941ca70fa7ddaa50145c6789 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A inflamação constitui um mecanismo de defesa local, porém, a falta de controle dessa reação pode causar severos danos aos tecidos. As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem se diferenciar em múltiplos tipos celulares in vitro e in vivo, contribuindo, por exemplo, para o reparo de tecidos. Além disso, vários estudos demonstraram que as CTMs interagem com células da imunidade inata e adaptativa, levando a modulação negativa de várias funções efetoras, contribuindo assim, para a redução da inflamação. Entretanto, o efeito dessas células sobre a resposta inflamatória associada com doenças infecciosas e parasitárias, como a esquistossomose, ainda é pouco conhecido. Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das CTMs derivadas do tecido adiposo (CTM-TA) na reação granulomatosa decorrente da esquistossomose mansoni experimental. Para isto, as CTM-TA foram caracterizadas fenotípica e funcionalmente, por meio da citometria de fluxo, bem como pela indução da diferenciação osteogênica e adipogênica. Posteriormente, as CTM-TA foram injetadas por via intravenosa em camundongos C57BL/6 infectados por Schistosoma mansoni, tratados ou não com praziquantel (PZQ). Após 15, 30 e 60 dias do tratamento, foram feitas análises histológicas do baço e fígado dos camundongos, bem como do perfil leucocitário e dosagem da enzima alanina aminotransferase (ALT) sérica. Os resultados mostraram que a recuperação do grupo de camundongos infectados e tratados com as CTM-TA associadas ao PZQ foi superior ao do grupo tratado apenas com PZQ. Observamos também melhorias na estrutura histológica do fígado, na arquitetura do espaço portal, redução do infiltrado inflamatório portal, na simplificação da constituição celular dos granulomas, fase do granuloma avançada e fibrosa com cicatrização parcial das lesões, melhoria da atividade inflamatória periportal e do parênquima. Além disso, observamos diminuição significativa dos níveis séricos da enzima ALT, e do tamanho dos granulomas, no tratamento associado. Em conclusão, os resultados mostraram que as CTM-TA controlaram a resposta inflamatória decorrente da infecção pelo S. mansoni , principalmente quando associadas ao praziquantel. / Inflammation is a local defense mechanism, but, the lack of control of this reaction can cause severe tissue damage. Mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into multiple cell types in vitro and in vivo, contributing, for example, for tissue repair. Furthermore, several studies have demonstrated that MSCs can interact with cells of the innate and adaptive immune system leading to a down-modulation of various effector functions, thus collaborating to reduce inflammation. However, the effect of these cells on the inflammatory response associated with infectious and parasitic diseases, such as schistosomiasis, has not been widely studied. So, the objective of this study was to evaluate the effect of MSCs derived from adipose tissue (MSC-AT) in granulomatous reaction due to the experimental schistosomiasis. Initially, MSC-AT were characterized phenotypically and functionally by flow cytometry, as well as for their osteogenic and adipogenic differentiation. Thereafter, MSC-AT was injected intravenously into C57BL / 6 mice infected with Schistosoma mansoni, treated or not with praziquantel (PZQ). After 15, 30 and 60 days of treatment, histologic analysis of the spleen and liver of the mice were taken and the number of blood leukocytes and dosage of the enzyme alanine aminotransferase (ALT) levels. The results showed that recovery from the group of infected mice and treated with MSC-AT associated PZQ was superior to group treated with PZQ. We also observed improvements in the histological structure of the liver, the architecture of the portal space, reduction of inflammatory infiltrate portal, simplifying cell formation of granulomas, advanced granuloma phase and fibrous partial healing of injuries, improvement of periportal inflammatory activity and parenchymal. In addition, we observed a significant reduction in serum levels of ALT enzyme, and granuloma size, the associated treatment. In conclusion, our results showed that MSC-AT control the inflammation associated with S. mansoni infection, particularly when associated with praziquantel.

TOGASHI, R. H. Atividade biológica das lectinas de sementes de erythrina fusca e velutina, de algas marinhas hypnea musciformes, bryothamnion seaforthii e triquetrum e do produto natural diterpeno casbano, em culturas de pseudomonas aeruginosa. 2010. 82 F. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2010. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-07T15:29:49Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_rhtogashi.pdf: 31631991 bytes, checksum: f1ded1dee8bb4f2cc72557b303d61a93 (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-08T12:09:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_rhtogashi.pdf: 31631991 bytes, checksum: f1ded1dee8bb4f2cc72557b303d61a93 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-08T12:09:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_rhtogashi.pdf: 31631991 bytes, checksum: f1ded1dee8bb4f2cc72557b303d61a93 (MD5) Previous issue date: 2010 / In this study the biological activity of seeds lectins from Erythrina velutina and fusca, marine algae Hypnea musciformis, Bryothamnion seaforthii and triquetrum and the diterpene casbane, a natural product isolated from Croton nepetaefolius was evaluated upon Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145. We compared the in vitro effect of lectins and diterpene casbane on colonies of P. aeruginosa in microtiter plates. Investigated the action of lectins from marine algae H. musciforme of seeds of Erythrina velutina, and diterpeno casbano in the process of formation of P. aeruginosa biofilm on polystyrene plates, and identified among lectins: E. velutina, H. musciforme and diterpene casbane, the one with greater potential for application in controlling the growth of colonies of P. aeruginosa. The lectins tested were able to inhibit growth and biofilm formation of P. aeruginosa in the studied conditions. Moreover, diterpene casbane at a concentration of 500 mg/mL in 18 hours, was able to inhibit the growth of P. aeruginosa in 40%, compared to positive control. This inhibition was observed until a concentration of 125 mg/mL. However, the inhibition of biofilm formation of P. aeruginosa there was no observed at the concentrations used in this study / Neste trabalho avaliamos a atividade biológica de lectinas de sementes de Erythrina fusca e velutina, de algas marinhas Hypnea musciformes, Bryothamnion seaforthii e triquetrum e do diterpeno casbano, um produto natural isolado de Croton nepetaefolius, sobre Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145. Foi comparada a ação in vitro das 5 lectinas e do diterpeno casbano, sobre colônias de P. aeruginosa, em placas de poliestireno. Investigada a ação das lectinas de alga marinha H.musciforme, de sementes de Erythrina velutina, e do diterpeno casbano, no processo de formação do biofilme bacteriano de P.aeruginosa, em placas de poliestireno; e identificado entre as lectinas de E.velutina, H.musciforme e diterpeno casbano, aquele com maior potencial de aplicação no controle do crescimento de colônias de P. aeruginosa. As lectinas testadas não foram capazes de inibir o crescimento e a formação de biofilme de Pseudomonas aeruginosa nas condições experimentadas. Por outro lado, diterpeno casbano, na concentração de 500 μg/mL em 18 horas, foi capaz de inibir o crescimento de P. aeruginosa em 40%, comparado ao controle positivo. Esta inibição foi observada até uma concentração de 125 μg/mL. Entretanto, não foi observada inibição da formação do biofilme da P. aeruginosa nas concentrações utilizadas neste estudo

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:22:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319268.pdf: 10421961 bytes, checksum: b13aea4c97b83748cdd4e6f36fc89111 (MD5) Previous issue date: 2013 / A terapia por diodo emissor de luz (LEDT, do inglês Light-EmittingDiode Therapy) tem sido clinicamente utilizada como uma alternativa àterapia com laser de baixa intensidade (LLLT) no tratamento de lesõesde tecidos moles, bem como no alívio da dor. No entanto, há umacarência de dados científicos sobre os possíveis mecanismos fisiológicose moleculares responsáveis pelo efeito da LEDT no controle da dor dediferentes etiologias. Neste contexto, o presente estudo procurou avaliara ação analgésica da LEDT em modelos de nocicepção aguda e crônicaem camundongos, bem como investigar alguns dos possíveismecanismos fotobiológicos envolvidos neste efeito. Na primeira série deexperimentos os camundongos foram submetidos ao modelo de dorneuropática induzida por esmagamento do nervo isquiático (ENI). Nosétimo dia pós-operatório, depois de determinar a dose analgésica(densidade de energia em Joules), a LEDT (950 nm, 80 mW/cm2, 2,5J/cm2) foi irradiada, diariamente, durante um período de 15 dias, na pelesobre o local do esmagamento do nervo. Em comparação com o grupocontrole (ENI), a LEDT reduziu a hipersensibilidade ao estímulomecânico induzida pelo ENI, mas não acelerou a recuperação funcionalmotora nem a regeneração do nervo afetado. Na segunda série deexperimentos, os camundongos foram submetidos ao modelo de dorpós-operatória induzida por incisão plantar (IP) e tratados com a LEDT(950 nm, 80 mW/cm2 irradiância) em densidades de energia de 1 a 13J/cm2. Os resultados demonstraram que o LEDT (950 nm, 80 mW/cm2),na densidade de energia de 9 J/cm2, apresentou os efeitos maissignificativos contra a hipersensibilidade ao estímulo mecânico. Alémdisto, foi demonstrado que a atividade analgésica da LEDT envolveu (1)a ativação de receptores opioides periféricos com, ao menos em parte, aparticipação de opioides secretados por leucócitos recrutados para o sítioda lesão, (2) a ativação da via L-arginina/Óxido nítrico e, (3) a ativaçãoperiférica e central de receptores adenosinérgicos A1 e canabinoidesCB1, bem como de receptores CB2 periféricos. Na terceira e última sériede experimentos, os camundongos submetidos ao modelo da Síndromeda dor complexa regional do tipo I (SDCR-I) induzida por isquemiareperfusão(IR) da pata foram tratados com a LEDT (950 nm decomprimento de onda, 80 mW/cm2 irradiância, 9 J/cm2). Os resultadosdemonstram que a LEDT reduziu significativamente ahipersensibilidade aos estímulos mecânico e ao frio. Além disso, otratamento com a LEDT aumentou os níveis da citocina antiinflamatóriaIL-10, sem afetar os níveis das citocinas IL-1ß, TNF-a eIL-1ra; e por fim, a LEDT promoveu a redução dos níveis demarcadores do estresse oxidativo (carbonilação de proteínas eequivalentes MDA) e o restabelecimento do sistema antioxidanteenzimático (enzimas superóxido dismutase e catalase). Em conjunto,estes resultados estendem dados da literatura sobre os mecanismossubjacentes ao efeito analgésico da terapia por diodo emissor de luz(LEDT) e sugerem que esta terapia pode ser um complemento útil para otratamento da dor de diferentes etiologias.<br> / Abstract : Light-Emitting Diode Therapy (LEDT) has been clinically used as analternative to low level laser therapy (LLLT) in the treatment of softtissue injuries as well as in pain relief. Nevertheless, there is a lackscientific data on the possible physiological and molecular mechanismsresponsible for LEDT control of pain of different etiologies. In thiscontext, the present study evaluated the analgesic activity of LEDT inmouse models of acute and chronic nociception, as well as investigatedsome of the possible photobiological mechanisms involved in this effect.In the first series of tests, mice were subjected to the sciatic nerve crushmodel (SNC) of neuropathic pain. On the seventh post-operative day,after determining analgesic dose (energy density in Joules), LEDT (950nm, 80 mW/cm2, 2.5 J/cm2) was irradiated, daily for a period of 15 days,on the skin over the crush site. Compared to control (SNC) group,LEDT reduced mechanical hypersensitivity induced by SNC but failedto accelerate motor functional recovery and nerve regeneration. In thesecond round of tests, mice were subjected to the plantar incision (PI)model of postoperative pain and treated with LEDT (950 nmwavelength, 80 mW/cm2 irradiance) in energy densities of 1 through 13J/cm2. The results demonstrate that LEDT (950 nm, 80 mW/cm2) at theenergy density of 9 J/cm2 presented the most significant effects againstmechanical hypersensitivity. Analyses of its mechanisms indicated thatLEDT analgesic activity involves, (1) activation of peripheral opioidreceptors with, at least in part, the recruitment of opioid-containingleukocytes to the PI site, (2) activation of the L-arginine/NO pathwayand, (3) activation of peripheral and central adenosinergic A1 andcannabinoid CB1 receptors, as well as peripheral CB2 receptors. In thethird and last round of tests, mice were submitted to the model ofComplex Regional Pain Syndrome Type I induced by paw ischemiareperfusionand treated with LEDT (950 nm wavelength, 80 mW/cm2irradiance, 9 J/cm2). The results indicate that LEDT significantlyreduced the behavioral signs of mechanical and cold hypersensitivity. Inaddition, the treatment increased the levels of the anti-inflammatorycytokine IL-10, without affecting (IL)-1ß, TNF-a and IL-1ra levels; aswell as decreased the levels of oxidative stress markers (proteincarbonyls and MDA equivalents) and of the antioxidant enzymaticsystem (superoxide dismutase and catalase). Taken together, theseresults extend previous literature data on the mechanisms behind theanalgesic effect of Low Level Light Therapy and suggest that this LEDTmight be a useful complement to the treatment of pain of differentetiologies.

Orientador : Prof. Dr. Roberto Andreatini / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Defesa: Curitiba, 30/03/2017 / Inclui referências / Resumo: A ansiedade está relacionada a alteração nas vias de neurotransmissão. Tem-se que substâncias disponíveis para o tratamento apresentam múltiplos efeitos adversos. Assim, busca-se alternativas para o tratamento. Destacando os óleos essenciais do gênero Citrus, como o óleo de Citrus sinensis. O objetivo deste estudo foi examinar o efeito ansiolítico da inalação do óleo essencial de laranja doce (Citrus sinensis) em modelos de ansiedade. Bem como, a relação deste efeito com os sistemas de neurotransmissão. Foram utilizados camundongos machos Swiss. Os animais foram submetidos a 15 minutos de inalação, com óleo essencial (Citrus sinensis), antes dos testes Esconder Esferas, Hipofagia Induzida por Neofobia, Caixa Claro-Escuro, Labirinto em Cruz Elevado, Campo Aberto e Caixa de Movimentação Espontânea. Posteriormente, foram realizados desafios farmacológicos para testar a influência dos sistemas de neurotransmissão (noradrenérgico, gabaérgico, canabinóide, serotonérgico e nitrinérgico) no efeito tipo ansiolítico do óleo essencial. Adicionalmente foi realizada a análise NADPH-diaforase, no córtex cerebral dos animais. As conclusões acerca do estudo demonstram que o óleo essencial de Citrus sinensis apresentou efeito ansiolítico, no modelo de Esconder Esferas, na concentração de 5% e 10%. O teste da Caixa Claro-Escuro indicou que o tratamento com o óleo essencial aumentou significativamente o tempo de permanência no lado claro. Parâmetro consistentemente relacionado, neste modelo, a um efeito tipo ansiolítico. O teste de Hipofagia Induzida por Neofobia demonstrou uma diminuição do tempo de latência para iniciar a ingesta, sendo este um indicativo de efeito ansiolítico. No teste do Campo Aberto os animais, não apresentaram alteração da atividade locomotora, sendo, entretanto, observada alteração da emocionalidade (diminuição significativa do número de bolos fecais). Sugerindo um efeito tipo ansiolítico do óleo essencial de C. sinensis no campo aberto. E no teste do Labirinto em Cruz Elevado os animais demonstraram um aumento do número de entradas e da porcentagem de entradas nos braços abertos. Novamente, não foi observada alteração da atividade locomotora na caixa de movimentação o que é coerente com ausência de alteração do número de entradas nos braços fechados neste modelo, parâmetro considerado índice de atividade locomotora no modelo. Neste modelo, este perfil é condizente com um efeito tipo ansiolítico. O pré-tratamento com picrotoxina não influenciou o efeito do óleo essencial de C. sinensis no modelo esconder esferas, indicando a não participação GABAérgica neste efeito. O resultado do sistema noradrenérgico pode ser considerado inconclusivo. O pré-tratamento com WAY100635 bloqueou o efeito tipo ansiolítico apresentado pelo óleo essencial de C. sinensis, indicando que o sistema serotonérgico mediaria o efeito ansiolítico do óleo essencial de C. sinensis. O antagonista AM251 reverteu o efeito tipo ansiolítico do óleo essencial. Este resultado sugere que o sistema canabinóide participe do efeito tipo ansiolítico do óleo essencial de C. sinensis. Novamente, o óleo essencial de C. sinensis a 5% e o 7-NI apresentaram efeito tipo ansiolítico no modelo esconder esferas, sem alterar significativamente a atividade locomotora. Observou-se que camundongos que receberam inalação de óleo essencial de C. sinensis apresentaram menor expressão de NADPH-diaforase no córtex cerebral. Este resultado é coerente com os resultados encontrados no modelo esconder esferas. Finalmente, a compilação de todos os resultados deste estudo permite sugerir que o óleo essencial de Citrus sinensis (laranja doce), administrado por via inalatória, apresentou efeito tipo ansiolítico em vários modelos de ansiedade, e tal efeito, possivelmente, parece estar sendo mediado pelos sistemas de neurotransmissão nitrinérgico, serotonérgico e canabinóide. Palavras-chave: Ansiedade. Óleo essencial. Citrus sinensis. Esconder Esferas. / Abstract: Anxiety is related to changes in neurotransmission pathways. It has been found that substances available for treatment have multiple adverse effects. Thus, alternatives to treatment are sought. Highlighting the essential oils of the genus Citrus, such as Citrus sinensis oil. The objective of this study was to examine the anxiolytic effect of inhalation of sweet orange essential oil (Citrus sinensis) on anxiety models. As well, the relationship of this effect with neurotransmission systems. Swiss male mice were used. The animals were submitted to 15 minutes of inhalation with essential oil (Citrus sinensis), before the tests Marble burying, Neophobia-Induced Hypophagia, Light-Dark Box, Elevated plus maze, Open Field and Spontaneous Movement Box. Subsequently, pharmacological challenges were performed to test the influence of neurotransmission systems (noradrenergic, gabaergic, cannabinoid, serotonergic and nitrinergic) on the anxiolytic of essential oil. In addition, NADPH-diaphorase analysis was performed in the cerebral cortex of the animals. The conclusions about the study showed that the essential oil of Citrus sinensis showed an anxiolytic effect, in the test of Hide Spheres, in the concentration of 5% and 10%. The Light-Dark Box test indicated that the treatment with the essential oil significantly increased the residence time on the light side. Parameter more consistently related to an anxiolytic effect. The Neophobia-Induced Hypophagia test demonstrated a decrease in the latency time to start the intake, which is indicative of an anxiolytic effect. In the open field test, the animals showed no alteration of the locomotor activity, but an alteration on emotional (significant decrease in the number of stool) was observed. Suggesting an anxiolytic effect of C. sinensis essential oil in the open field. And in the Elevated plus maze test the animals showed an increase in the number of entries and the percentage of entries in the open arms. Again, no change in the locomotor activity was observed in the movement box, which is consistent with the absence of a change in the number of entries in the closed arms in this model, a parameter considered as an index of locomotor activity in the model. In this model, this profile is consistent with an anxiolytic effect. Pretreatment with picrotoxin did not influence the effect of the essential oil of C. sinensis on the test of Marble burying, indicating the GABAergic non-participation in this effect. The outcome of the noradrenergic system may be considered inconclusive. Pre-treatment with WAY100635 blocked the anxiolytic effect of C. sinensis essential oil, indicating that the serotonergic system would mediate the anxiolytic effect of the essential oil of C. sinensis. The AM251 antagonist reversed the anxiolytic effect of the essential oil. This result suggests that the cannabinoid system participates in the anxiolytic effect of the essential oil of C. sinensis. Again, the essential oil of 5% C. sinensis and 7-NI presented an anxiolytic effect in the test of Marble burying, without significantly altering the locomotor activity. It was observed that mice receiving inhalation of C. sinensis essential oil showed lower expression of NADPH-diaphorase in the cerebral cortex. This result is consistent with the results found in the test of Marble burying. Finally, the compilation of all the results of this study suggests that the essential oil of Citrus sinensis (sweet orange), inhalation, presented an anxiolytic effect in several anxiety models, and this effect possibly seems to be mediated by Nitrinergic, serotonergic and cannabinoid neurotransmission. Key words: Anxiety. Essential oil. Citrus sinensis. Marble burying.