A esquistossomose é uma das mais relevantes doenças induzidas por helmintos, acometendo cerca de 207 milhões de pessoas em todo o mundo. O Praziquantel e o Oxamniquine são os fármacos empregados no tratamento, mas além de não impedirem re-infecções, não atuam nos estágios imaturos do verme. Portanto, o desenvolvimento de uma estratégia de vacinação eficaz representa um componente essencial para o controle e erradicação desta doença. Neste sentido, tivemos como objetivo estudar a resposta imunológica induzida pela imunização com a vacina DNA-Sm14 em associação com a DNA-Hsp65 utilizando protocolos de imunização prime-boost, sendo eles heterólogo ou homólogo. A utilização das vacinas em prime-boost heterólogo não alterou a produção de IgG2a, mas diminuiu a produção de IFN- e IL-10 dos animais quando comparados aos que receberam apenas DNA-Sm14. Após infecção, a estratégia prime-boost heterólogo não foi eficaz em reduzir a carga parasitária dos animais, enquanto a vacinação com DNA-Sm14 reduziu parcialmente o número de vermes. Na vacinação prime-boost homóloga utilizando as duas vacinas, observamos que a modificação da estratégia também não alterou a produção de IgG2a, mas reduziu a produção de IFN- pelas células recuperadas do espaço bronco-alveolar, quando comparada com os animais que receberam DNA-Sm14. Após infecção, a imunização com DNA-Sm14/DNA-Hsp65 não alterou a carga parasitária dos animais, mas sistemicamente reduziu o número de eosinófilos. Quando avaliado o perfil de células de memória dos animais vacinados, verificamos aumento do número de células T CD8+ e menor número de células T CD4+ no baço dos animais imunizados com as duas vacinas simultaneamente. Em suma, a utilização das vacinas DNA-Sm14 e DNA-Hsp65 nas estratégias prime-boost heterólogo ou homólogo não foi capaz de gerar proteção contra infecção experimental por S. mansoni, e sugerimos que em parte, a diminuição de IFN-, IL-10, aumento da razão IgG1/IgG2a e a estimulação de células T CD8+ ao invés de CD4+, podem ter contribuído para baixa eficácia dos protocolos vacinais testados. / Schistosomiasis is one of the most important diseases due to helminthes, affecting approximately 207 million people worldwide. The treatment is based on Praziquantel and Oxamniquine drugs, however these drugs do not avoid reinfections and are inefficient against worm immature stages. Therefore, the development of an efficient vaccination strategy is an essential component in the control of this disease. The aim of this work was to study the immune response induced by immunization with DNA-Sm14 vaccine in combination with DNA-Hsp65 using prime-boost protocols, which were heterologous or homologous. The heterologous prime-boost vaccination did not modify IgG2a production, but decreased IFN- and IL-10 production compared to animals that received only DNA-Sm14. After infection, this prime-boost strategy was not effective in reducing the worm burden of animals, while vaccination with DNA-Sm14 induced partial reduction. Using both vaccines in the homologous prime-boost model, we found that the modification of the strategy did not alter IgG2a production, although reduced IFN- production by cells recovered from the broncho-alveolar space compared to DNA-Sm14 immunized mice. After infection, immunization with DNA-Sm14/DNA-Hsp65 didnt modify the animals parasitic burden, however systemically, reduced eosinophils number. When the profile of memory cells in vaccinated animals was evaluated, we verified increased numbers of CD8+ T cells and lower numbers of CD4+ T cells in the spleen of animals immunized with both vaccines simultaneously. In conclusion, the vaccines DNA-Sm14 and DNA-Hsp65 in both strategies, prime-boost heterologous or homologous, were not able to generate protection against experimental infection with S. mansoni, and we propose that, partly, the decrease of IFN-, IL-10 levels, increase of IgG1/IgG2a ratio and the stimulation of CD8+ T cells rather than CD4+, may have contributed to the low efficacy of the vaccination protocols tested.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 juliana_silva_ioc_mest_2015.pdf: 9301991 bytes, checksum: 154a53db0411f9dac834feb27f65b697 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A dengue constitui um sério problema de saúde pública, principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Uma grande dificuldade para se estudar essa doença é a falta de um modelo animal que reproduza os efeitos da infecção observados em humanos. Apesar disso, um dos modelos mais utilizados para testes de vacinas contra a dengue se baseia na inoculação em camundongos por via intracerebral (i.c.) de vírus neuroadaptado. No entanto, poucos estudos avaliaram o efeito da infecção i.c. e/ou proteção gerada por protótipos vacinais em diferentes órgãos, tais como fígado, um dos órgãos comprometidos pela dengue em humanos. O nosso grupo construiu a vacina de DNA, pcTPANS1, que induziu altos níveis de sobrevivência em camundongos desafiados por via i.c. com vírus da dengue 2 (DENV2). Diante disso, o presente trabalho se propõe avaliar aspectos da patogênese no cérebro, cerebelo, fígado e pulmão, no modelo de camundongos BALB/c inoculados pela via i.c. com uma dose letal de DENV2, em diferentes dias após infecção (d.p.i.). Adicionalmente, tais análises foram estendidas para animais imunizados com a vacina pcTPANS1 e desafiados com DENV2. Detectamos alterações histopatológicas no cérebro/cerebelo (edema, hemorragia, gliose reacional, microglia hiperplásica e hipertrofiada e infiltrado mononuclear na pia-máter, no neurópilo e perivasculares), no fígado (edema, hemorragia, balonização hepatocitária, infiltrado mononuclear, hiperplasia e hipertrofia de células de Kupffer) e no pulmão (edema, hemorragia, infiltrados mononucleares peribronquiolares, aumento do número de macrófagos alveolares e espessamento de septo interalveolar) Alguns destes danos foram quantificados, utilizando uma escala subjetiva com atribuição de diferentes graus, revelando diferenças significativas. Os animais inoculados com DENV2 também apresentaram um aumento dos níveis séricos das enzimas hepáticas ALT e AST, principalmente de AST ao final da infecção, com diferenças significativas em relação aos controles. Por outro lado, em todos os tecidos dos camundongos vacinados com pcTPANS1 observamos uma melhora progressiva dos danos, quando comparados com os animais somente infectados. Também detectamos a presença do DENV2 no cérebro/cerebelo, no sangue e no pulmão dos animais em ensaios in vitro de infecção de células Vero e/ou por RT-PCR em tempo real. Nos animais somente infectados, observamos no cérebro/cerebelo altos títulos de partículas virais infecciosas e cópias de RNA viral. Já no soro, o maior percentual de animais com a presença de DENV2 foi entre o 90 e 110 d.p.i.. Por outro lado, não foi possível a detecção do vírus no fígado, e no pulmão a detecção foi muito baixa. Entretanto, verificamos a presença do antígeno NS3 de DENV2 não só no tecido nervoso, mas também no hepático, através de ensaios de imunohistoquímica. Em contrapartida, os animais vacinados com pcTPANS1 e desafiados com o vírus apresentaram uma redução drástica na viremia com DENV2. De um modo geral, os nossos estudos podem contribuir para uma melhor compreensão da patogênese da dengue, assim como servir de parâmetro para a avaliação da proteção induzida pela vacina pcTPANS1, bem como de outras vacinas / The dengue is a serious public health problem, mainly in tropical and subtropical regions of the world. One of the great difficulty to study this disease is the lack of an animal model that mimics the infection effects observed in humans. Nevertheless, one of the most widely used model for vaccine tests against dengue is based on the inoculation of mice by the intracerebral route (i.c.) with neuroadapted virus. However, few studies have evaluated the effects of i.c. infection and/or protection generated by vaccine prototypes in different organs, such as the liver, one of the compromised organ in dengue in humans. Our group have constructed a DNA vaccine, pcTPANS1, which induced high survival rates in mice challenged by the i.c. inoculation with dengue virus 2 (DENV2). Therefore, the present work aim to evaluate aspects of the pathogenesis in the brain, cerebellum, liver and lung in the BALB/c mouse model intracerebrally inoculated with a lethal dose of DENV2, at different days post infection (d.p.i.). In addition, these analyzes were extended to pcTPANS1-immunized animals challenged with DENV2. We detect histopathological changes in the brain/cerebellum (hemorrhage, edema, reactive gliosis, hyperplasic and hypertrophied microglia and mononuclear infiltrate in the pia-mater, neuropile and perivascular), the liver (hemorrhage, edema, hepatocyte ballooning, mononuclear infiltrate, hyperplasia and hypertrophy of Kupffer cells) and the lung (hemorrhage, edema, peribronchial mononuclear infiltrates, increased number of alveolar macrophages and thickening of interalveolar septa). Some of these damages were quantified using a subjective scale with different degrees and revealing significant differences. Animals inoculated with DENV2 also showed increased serum levels of the liver enzymes AST and ALT, mainly AST on the end of infection, with significant differences compared to controls. On the other hand, in all the tissues of pcTPANS1-vaccinated mice, we observed a progressive improvement of damages when compared with only infected animals. We also detected the presence of DENV2 in the brain/cerebellum, blood and lung of animals by in vitro assays of infected Vero cells and/or by real time RT-PCR. In only infected animals, we observed high titers of infectious viral particles and viral RNA copies in brain/cerebellum. In serum, the highest percentage of animals with infeccious DENV2 particles was found between 90 and 110 d.p.i.. However, it was not possible to detect the virus in the liver, and the detection in lung was very low. Despite of this, we verified the presence of DENV2 antigen, NS3, not only in nervous tissue but also in liver, by immunohistochemistry assays. In contrast, pcTPANS1-vaccinated animals challenged with the virus showed a drastic reduction of viremia with DENV2. In general, our studies may contribute to a better understanding of dengue pathogenesis, and also serve as a parameter for evaluation of the vaccine-induced protection with pcTPANS1, as well as with other vaccines.

Câncer cervical é a terceira causa de morte em mulheres no mundo, e a quarta causa de morte em mulheres no Brasil. Seu principal agente etiológico é o vírus do papiloma humano (HPV), e diversos estudos estão sendo feitos na tentativa de desenvolver abordagens terapêuticas que combatam tumores induzidos por HPV. Nesse contexto, surgem às vacinas de DNA, capazes de induzir resposta imune específica contra esse tipo de tumores em camundongos. Entretanto essas vacinas apresentam baixa imunogenicidade em humanos, sendo necessária estudar abordagens que aumentem a potência dessas vacinas. Eletroporação in vivo (EP) é um método de entrega de vacinas de DNA, capaz de elevar potência das mesmas. Nosso grupo desenvolveu uma imunoterapia baseada em DNA (pgDE7h), e quando associamos a EP em nossa imunização pela via intramuscular, observamos aumento do efeito antitumoral e da frequência T CD8+E7-específicas e citotóxicas, migração de células para o sítio de inoculação do DNA, indução de células T polifuncionais e de memória, além de maior avidez de células T ativadas. / Cervical cancer is the third leading cause of death in women worldwide, and the fourth leading cause of death in women in Brazil. Its main etiological agent is human papilloma virus (HPV), and several studies are being done in trying to develop therapeutic approaches that fight tumors induced by HPV. In this context, there are the DNA vaccines are capable of inducing specific immune response against this type of tumors in mice. However, these vaccines have a low immunogenicity in humans, it is required to study approaches to increase the potency of these vaccines. In vivo electroporation (EP) is a method of delivering DNA vaccines, capable of raising power of the same. Our group has developed a DNA-based immunotherapy (pgDE7h), and when associate EP in our immunization by intramuscularly observed increase antitumor effect and frequency CD8+E7-specific and cytotoxic, cell migration for the inoculation site of the DNA polyfunctional T cell induction and memory, and higher avidity for activated T cells.

A esquistossomose é uma das mais relevantes doenças induzidas por helmintos, acometendo cerca de 207 milhões de pessoas em todo o mundo. O Praziquantel e o Oxamniquine são os fármacos empregados no tratamento, mas além de não impedirem re-infecções, não atuam nos estágios imaturos do verme. Portanto, o desenvolvimento de uma estratégia de vacinação eficaz representa um componente essencial para o controle e erradicação desta doença. Neste sentido, tivemos como objetivo estudar a resposta imunológica induzida pela imunização com a vacina DNA-Sm14 em associação com a DNA-Hsp65 utilizando protocolos de imunização prime-boost, sendo eles heterólogo ou homólogo. A utilização das vacinas em prime-boost heterólogo não alterou a produção de IgG2a, mas diminuiu a produção de IFN- e IL-10 dos animais quando comparados aos que receberam apenas DNA-Sm14. Após infecção, a estratégia prime-boost heterólogo não foi eficaz em reduzir a carga parasitária dos animais, enquanto a vacinação com DNA-Sm14 reduziu parcialmente o número de vermes. Na vacinação prime-boost homóloga utilizando as duas vacinas, observamos que a modificação da estratégia também não alterou a produção de IgG2a, mas reduziu a produção de IFN- pelas células recuperadas do espaço bronco-alveolar, quando comparada com os animais que receberam DNA-Sm14. Após infecção, a imunização com DNA-Sm14/DNA-Hsp65 não alterou a carga parasitária dos animais, mas sistemicamente reduziu o número de eosinófilos. Quando avaliado o perfil de células de memória dos animais vacinados, verificamos aumento do número de células T CD8+ e menor número de células T CD4+ no baço dos animais imunizados com as duas vacinas simultaneamente. Em suma, a utilização das vacinas DNA-Sm14 e DNA-Hsp65 nas estratégias prime-boost heterólogo ou homólogo não foi capaz de gerar proteção contra infecção experimental por S. mansoni, e sugerimos que em parte, a diminuição de IFN-, IL-10, aumento da razão IgG1/IgG2a e a estimulação de células T CD8+ ao invés de CD4+, podem ter contribuído para baixa eficácia dos protocolos vacinais testados. / Schistosomiasis is one of the most important diseases due to helminthes, affecting approximately 207 million people worldwide. The treatment is based on Praziquantel and Oxamniquine drugs, however these drugs do not avoid reinfections and are inefficient against worm immature stages. Therefore, the development of an efficient vaccination strategy is an essential component in the control of this disease. The aim of this work was to study the immune response induced by immunization with DNA-Sm14 vaccine in combination with DNA-Hsp65 using prime-boost protocols, which were heterologous or homologous. The heterologous prime-boost vaccination did not modify IgG2a production, but decreased IFN- and IL-10 production compared to animals that received only DNA-Sm14. After infection, this prime-boost strategy was not effective in reducing the worm burden of animals, while vaccination with DNA-Sm14 induced partial reduction. Using both vaccines in the homologous prime-boost model, we found that the modification of the strategy did not alter IgG2a production, although reduced IFN- production by cells recovered from the broncho-alveolar space compared to DNA-Sm14 immunized mice. After infection, immunization with DNA-Sm14/DNA-Hsp65 didnt modify the animals parasitic burden, however systemically, reduced eosinophils number. When the profile of memory cells in vaccinated animals was evaluated, we verified increased numbers of CD8+ T cells and lower numbers of CD4+ T cells in the spleen of animals immunized with both vaccines simultaneously. In conclusion, the vaccines DNA-Sm14 and DNA-Hsp65 in both strategies, prime-boost heterologous or homologous, were not able to generate protection against experimental infection with S. mansoni, and we propose that, partly, the decrease of IFN-, IL-10 levels, increase of IgG1/IgG2a ratio and the stimulation of CD8+ T cells rather than CD4+, may have contributed to the low efficacy of the vaccination protocols tested.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_michel_quevedo_fagundes.pdf: 823551 bytes, checksum: 36c28ca5bd55c0c0403915db568e103e (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Leptospirosis is considered a global problem regarding both veterinary medicine and public health. In Brazil, the disease has greater impact in vulnerable populations, living in slums of great cities, where high morbidity and mortality occur. This situation requires the establishment of new intervention policies in order to reduce cases. Available vaccines to prevent the disease in humans and animals are notoriously underachieving, producing short term, serovar specific protection and collateral effects. New strategies are being employed to develop novel vaccines against leptospirosis, such as the characterization of recombinant proteins, construction of DNA vaccines, and use of alternative adjuvants. Surface exposed proteins LipL32, LigB, and LigA are highly conserved and found only in pathogenic serovars, therefore these were selected to be used in this study. LigA and LipL32 genes were cloned into the pVAX eukaryote expression vector to be used as DNA vaccines. rLigBNI and rLipL32 were assessed as subunit recombinant antigens using propolis as a co-adjuvant. Hamsters were immunized and the response was assessed through qPCR, ELISA, and lethal challenge. DNA vaccine containing the LipL32 gene, and the subunit rLigBNI vaccine had the highest results in the immune-stimulation assays. Furthermore, these imunogens were able to significantly protect animals against lethal challenge, demonstrating their potential for leptospirosis vaccine development. / A leptospirose é considerada um problema global para a saúde pública e veterinária. No Brasil, a enfermidade possui maior impacto em populações vulneráveis, as quais estão distribuídas nas favelas das grandes cidades, onde tradicionalmente ocorre elevada morbidade e mortalidade. Desta forma, torna-se necessário o estabelecimento de novas efetivas de intervenção para a redução dos casos. As vacinas disponíveis para a prevenção da enfermidade em humanos e animais são comprovadamente limitadas, já que induzem imunidade pouco duradoura e sorovar-específica, além de provocarem efeitos colaterais. Novas estratégias para o desenvolvimento de uma vacina contra a leptospirose têm sido empregadas, como a caracterização de proteínas recombinantes, a construção de vacinas de DNA e o teste de novos adjuvantes para modulação da resposta imune. Neste contexto, as proteínas de membrana externa LipL32, LigB e LigA foram selecionadas para este trabalho, pois são conservadas e encontradas somente entre sorovares patogênicos de Leptospira. Assim, os genes lipL32 e ligA foram clonados no vetor de expressão em eucariotos pVAX para a obtenção de vacinas de DNA, e as proteínas rLigBNI e rLipL32 foram testadas utilizando o própolis como co-adjuvante na forma de vacinas de subunidade. Após a produção das vacinas, hamsters foram vacinados e a resposta imune foi avaliada através de ELISA, qPCR e desafio. Dentre as preparações testadas, a resposta imune teve níveis mais elevados e significativos para a vacina de DNA contendo o gene lipL32 e para a vacina de subunidade de LigBNI. Além disso, estas vacinas foram capazes de proteger significativamente os animais contra o desafio homólogo, mostrando o potencial destas formulações para o desenvolvimento de uma vacina recombinante para a leptospirose.

Made available in DSpace on 2016-03-28T12:34:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 482.pdf: 2912409 bytes, checksum: 09e4a092c2f0236480e1f73f9d7ad68f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Diante da necessidade de se produzir mais inovações tecnológicas voltadas à saúde pública no Brasil, analisou-se o caso da vacina de DNA contra o vírus da febre amarela, desenvolvida na Fiocruz-Pernambuco entre 2005 e 2008. Foram elaboradas estruturas analíticas específicas e os dados foram coletados mediante entrevistas, análise documental, bibliográfica e de registros em arquivos. Verificou-se que no ano 2000 a organização era mais voltada à geração de conhecimentos, mas a partir de 2002 ocorreram os seguintes eventos que levaram ao estabelecimento das parcerias e das linhas e técnicas de pesquisa que possibilitaram a invenção da vacina: adoção de uma nova estratégia, contratação de consultor em universidade estrangeira, criação de laboratório, priorização de alocação de recursos, captação de recursos em projetos colaborativos, manutenção de instalações em padrões de qualidade, seleção de profissionais com habilidades complementares, e promoção de incorporação de novas tecnologias de pesquisa. A invenção se baseou em informações oriundas da formação educacional dos inventores, experiência em instituição estrangeira, ferramentas de bioinformática, literatura científica, análise e experimentação dentro da organização e em instituições parceiras. As próximas etapas do projeto necessitarão de competências nas áreas de marketing estratégico, pesquisa da vacina candidata, Pesquisa e Desenvolvimento da formulação, propriedade intelectual, desenv. do processo, desenv. de negócios, desenv. analítico, desenv. de sistemas e testes biológicos, assuntos regulatórios no País, 'upstream process', 'downstream processing', formulação e envase, desenv. clínico, e coordenação/integração. No entanto, a capacitação nacional parece frágil em dez dessas funções / Assim, para produzir no País mais inovações tecnológicas voltadas à saúde pública, é necessário, além da capacitação das instituições de pesquisa, a construção de novas aptidões nas demais instituições ligadas ao complexo industrial da saúde nacional

O presente projeto propõe a avaliação de respostas imunológicas induzidas por uma vacina de DNA bivalente para o controle de infecções por HIV e HSV. A vacina genética codifica a proteína gD do vírus HSV-1 geneticamente fusionada à proteína Gag (p24) do HIV, rica em epítopos reconhecidos por células T CD8+. A vacina de DNA pRE4p24 codifica a proteína p24 inserida em região próxima à porção C-terminal da proteína gD-1, permitindo que a proteína recombinante seja expressa na superfície da célula transfectada. A localização da proteína recombinante foi confirmada na superfície das células HEK-293T transfectadas por ensaios de imunofluorescência. Camundongos imunizados com a vacina foram capazes de gerar respostas de anticorpos específicos após três doses administradas pelas vias intramuscular (i.m.), intradérmica com seringa (i.d.) ou intradérmico por biobalística (gg). Foram analisadas as respostas imunológicas mediadas por linfócitos T CD8+ p24-específicas e, em função dos resultados obtidos, sendo a via i.m. escolhida como a mais promissora para os ensaios subsequentes. Na tentativa de aumentar a imunogenicidade da vacina, particularmente, para respostas celulares, foi avaliado o efeito da co-administração da formulação vacinal com outros plasmídeos que expressam citocinas (pIL-2, pIL-12 ou pGM-CSF), o teste de um vetor vacinal baseado no plasmídeo multicópia pVAX (pgDp24) e o emprego de um gene sintético para promover o aumento da expressão da proteína gD em células de mamíferos (pgDhp24). Por fim, desenvolvemos um modelo murino para a avaliação funcional de respostas citotóxicas antígeno-específicas a partir de uma linhagem tumoral capaz de expressar a proteína p24 do HIV. Camundongos Balb/c imunizados com o pgDp24 apresentaram um retardo no crescimento tumoral em relação aos animais não imunizados além de proteção parcial a desafios letais com HSV-1. / The present thesis aims to evaluate the immunological responses induced by a bivalent DNA vaccine to the control HIV and HSV infectious. This genetic vaccine codes the gD protein from the HSV-1 virus envelope genetically fused with HIV Gag (p24) protein, which has various epitopes recognized by human and murine T CD8+ cells. The DNA vaccine, named pRE4p24, codes for p24 protein, inserted close to the C-terminal region of gD-1 protein, leading to the expression of the recombinant protein on the surface of the transfected cells. The location of the recombinant protein was confirmed with transfected HEK-293 cellsby immunofluorescence assays. Mice immunized with the vaccine generated antigen-specific antibody responses after three doses administered intramuscularly (i.m), intradermally with a syringe (i.d) or intradermally by gene gun (bioballistic) (gg). The immunological responses mediated by specific-T CD8+ p24 lymphocytes were evaluated and, according to the data obtained, the i.m administration was chosen for the next assays. Aiming the improvement of the vaccine immunogenicity, particularly for cellular responses, the effect of co-administration with other plasmids was assessed with: plasmids that express cytokines (pIL-2, pIL-12 or pGM-CSF); a vaccine vector based on pVAX (pgDp24); and a vector encoding a synthetic gene capable to increase the expression of gD protein in mammalian cells (pgDhp24). Finally, we developed a murine model for the functional evaluation of antigen-specific cytotoxic responses using a tumor cell line which expresses the p24 protein. Balb/c mice, immunized with pgDp24 had a reduced tumor growth when compared to non-immunized mice. In addition, vaccinated mice showed partial protection to a lethal challenge with HSV-1.

Orientadores: Hyun Mo Yang, Silvia Martorano Raimundo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Insituto de Matemática, Estatística e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-08-18T12:55:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sabino_MarcioRodrigues_M.pdf: 1310178 bytes, checksum: a2f78a77882031aeada8b32f6276f07e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O interesse em modelar a dinâmica de transmissão da Tuberculose (TB) é principalmente pelo fato de que a TB representa um grande problema de Saúde Pública em todo o mundo. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a TB é a principal causa de mortalidade por doenças infecciosas, sendo responsável por mais de 2 milhões de óbitos a cada ano (WHO, 2007). Outro motivo, muito importante desse estudo é o fato da descoberta da "vacina gênica (ou vacina de DNA)" pelo grupo de pesquisas do pesquisador Célio Lopes Silva, coordenador do Laboratório de Vacinas Gênicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP. A vacina, ainda em fase de experimento e padronização pode se tornar a maior promessa de combate a doenças infecciosas para as quais até hoje não existe prevenção segura, como é o caso da TB. Neste trabalho apresentam-se estudos epidemiológicos da TB, as principais características da ação da vacina na epidemiologia da doença e, posteriormente, a formulação de um modelo matemático para descrever a dinâmica da transmissão da TB usando a vacina gênica como estratégia de controle da doença. A suposição básica do modelo é que a vacinação é adotada não somente como proteção para os indivíduos suscetíveis, mas também como tratamento para os indivíduos infectados e infecciosos. Apresenta-se uma análise do modelo geral determinando-se os pontos de equilíbrio do sistema e as condições de estabilidades destes pontos: analiticamente para o equilíbrio trivial, e numericamente, para o equilíbrio não trivial. Através de uma simplificação do modelo geral, foi também possível mostrar analiticamente a estabilidade global dos pontos de equilíbrio trivial e não trivial através da função de Lyapunov. Foram estimados alguns parâmetros do modelo, utilizando-se os dados que descrevem o cenário da TB no Brasil entre 1980 e 2007. Por fim, através deste ajuste, determinou-se os valores críticos de vacinação para o controle da doença / Abstract: The interest in modeling the transmission dynamics of the Tuberculosis(TB) is mainly due to the fact that TB is a major public health problem worldwide. According to World Health Organisation, TB is the leading cause of mortality from infectious diseases, accounting for more than 2 million deaths each year (WHO, 2007). Another reason, very important to this study is the discovery of "genetic vaccines" (or "DNA vaccine") by the research group of the researcher Celio Lopes Silva, coordinator of the Laboratory of genetic vaccines of the Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, USP. The vaccine, still under experimentation and standardization, is a great promise for combating infectious diseases for which today there is no safe prevention, such as TB. This work presents epidemiological studies of TB, the main characteristics of the action of the vaccine on the epidemiology of the disease and then, a mathematical model formulation to describe the dynamics of TB transmission by using the genetic vaccine as a strategy for disease control. The basic assumption of the model is that vaccination is adopted not only as protection for susceptible individuals, but also as a treatment for infected and infectious individuals. An analysis of the general model is presented, by determining the equilibrium points of the system and the conditions of stability of these points: analytically for the trivial equilibrium point, and numerically for the endemic equilibrium point. By simplifying the general model, it was also possible to show analytically the global stability of the trivial and nontrivial equilibrium points with Lyapunov functions. Were estimated parameters of the model, using the data describing the scenario of TB in Brazil between 1980 and 2007. Finally, with these settings, critical values of vaccination for disease control were determined / Mestrado / Matematica Aplicada / Mestre em Matemática Aplicada

O presente projeto propõe a avaliação de respostas imunológicas induzidas por uma vacina de DNA bivalente para o controle de infecções por HIV e HSV. A vacina genética codifica a proteína gD do vírus HSV-1 geneticamente fusionada à proteína Gag (p24) do HIV, rica em epítopos reconhecidos por células T CD8+. A vacina de DNA pRE4p24 codifica a proteína p24 inserida em região próxima à porção C-terminal da proteína gD-1, permitindo que a proteína recombinante seja expressa na superfície da célula transfectada. A localização da proteína recombinante foi confirmada na superfície das células HEK-293T transfectadas por ensaios de imunofluorescência. Camundongos imunizados com a vacina foram capazes de gerar respostas de anticorpos específicos após três doses administradas pelas vias intramuscular (i.m.), intradérmica com seringa (i.d.) ou intradérmico por biobalística (gg). Foram analisadas as respostas imunológicas mediadas por linfócitos T CD8+ p24-específicas e, em função dos resultados obtidos, sendo a via i.m. escolhida como a mais promissora para os ensaios subsequentes. Na tentativa de aumentar a imunogenicidade da vacina, particularmente, para respostas celulares, foi avaliado o efeito da co-administração da formulação vacinal com outros plasmídeos que expressam citocinas (pIL-2, pIL-12 ou pGM-CSF), o teste de um vetor vacinal baseado no plasmídeo multicópia pVAX (pgDp24) e o emprego de um gene sintético para promover o aumento da expressão da proteína gD em células de mamíferos (pgDhp24). Por fim, desenvolvemos um modelo murino para a avaliação funcional de respostas citotóxicas antígeno-específicas a partir de uma linhagem tumoral capaz de expressar a proteína p24 do HIV. Camundongos Balb/c imunizados com o pgDp24 apresentaram um retardo no crescimento tumoral em relação aos animais não imunizados além de proteção parcial a desafios letais com HSV-1. / The present thesis aims to evaluate the immunological responses induced by a bivalent DNA vaccine to the control HIV and HSV infectious. This genetic vaccine codes the gD protein from the HSV-1 virus envelope genetically fused with HIV Gag (p24) protein, which has various epitopes recognized by human and murine T CD8+ cells. The DNA vaccine, named pRE4p24, codes for p24 protein, inserted close to the C-terminal region of gD-1 protein, leading to the expression of the recombinant protein on the surface of the transfected cells. The location of the recombinant protein was confirmed with transfected HEK-293 cellsby immunofluorescence assays. Mice immunized with the vaccine generated antigen-specific antibody responses after three doses administered intramuscularly (i.m), intradermally with a syringe (i.d) or intradermally by gene gun (bioballistic) (gg). The immunological responses mediated by specific-T CD8+ p24 lymphocytes were evaluated and, according to the data obtained, the i.m administration was chosen for the next assays. Aiming the improvement of the vaccine immunogenicity, particularly for cellular responses, the effect of co-administration with other plasmids was assessed with: plasmids that express cytokines (pIL-2, pIL-12 or pGM-CSF); a vaccine vector based on pVAX (pgDp24); and a vector encoding a synthetic gene capable to increase the expression of gD protein in mammalian cells (pgDhp24). Finally, we developed a murine model for the functional evaluation of antigen-specific cytotoxic responses using a tumor cell line which expresses the p24 protein. Balb/c mice, immunized with pgDp24 had a reduced tumor growth when compared to non-immunized mice. In addition, vaccinated mice showed partial protection to a lethal challenge with HSV-1.

Introdução: O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço avançado é uma doença de difícil tratamento. Apesar dos avanços nas técnicas de diagnóstico e tratamento nos últimos 30 anos não ocorreram ganhos significativos em sobrevida. A falha no tratamento ocorre principalmente pela recidiva locorregional e freqüentemente impede a realização de tratamentos de resgate. Com o desenvolvimento da imunoterapia novas abordagens tem sido descritas para o combate ao câncer. Estudos em animais demonstraram a redução de tumores com a utilização de vacinas de DNA contendo a HSP-65 do Mycobacterium leprae. Neste estudo avaliou-se a utilização desta proteína em pacientes portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço em estádio avançado e fora de possibilidades terapêutica curativa pelos métodos convencionais. Objetivos: Testar a viabilidade de realização da injeção intratumoral do DNA HSP65 nesse grupo de doentes, avaliar a resposta tumoral através da análise comparativa do volume, pesquisar a transfecção do DNA HSP65 do M. Leprae e verificar se o tratamento realizado apresentou impacto na evolução dos pacientes. Casuística e métodos: Foram incluídos 21 pacientes em três grupos. Cada grupo recebeu diferentes doses da vacina de DNA HSP-65 do Mycobacterium leprae: 150, 600 e 400µg, através de aplicações intratumorais guiadas por ultra-som com Doppler. Foram realizadas tomografias computadorizadas antes e após o tratamento, para avaliação da resposta tumoral através da comparação de volume tumoral. Realizaram-se biópsias antes e após o tratamento, e o material foi submetido a reação em cadeia da polimerase (Rt-PCR) para identificar a transfecção do DNA injetado. Durante o protocolo os pacientes foram acompanhados para observação de eventos adversos que pudessem ser relacionados à medicação. Resultados: Dos 21 pacientes, sete faleceram antes do término do protocolo. Nos 13 pacientes passíveis de análise, ocorreram quatro respostas parciais e estabilidade da lesão em um caso. Em nove casos houve progressão da doença. Dois pacientes encontram-se vivos em seguimento a mais de oitocentos dias do inicio do protocolo. Os eventos adversos ocorridos foram principalmente aumento da dor local e edema. Não foi possível comprovar a transcrição do DNA injetado no Rt-PCR pela ocorrência de um resultado falso positivo. Conclusões: A aplicação foi segura na dose de 400µg por aplicação. Não foi possível comprovar a transfecção de DNA de HSP65. Nos pacientes que apresentaram diminuição do volume tumoral parece ter havido benefício clínico. / Introduction: The squamous cell carcinoma of the head and advanced neck is an disease difficult to treat. Despite the advances in diagnosis and treatment in last the 30 years had not occurred major survival improvements. The treatment failure occurs mainly locorregionaly and recurrences frequently canot be rescued. immunotherapy has had encouraging results in the last years. Studies in animals had demonstrated the reduction of tumors with the DNA vaccine containing HSP-65 of the Mycobacterium leprae. In this study we evaluate the use of this protein in patients with avdanced head and neck carcinoma, stages II and IV without possibilities of curative treatment. Objectives: To test the viability of accomplishment of the intratumoral injection of DNA HSP65 in this group of patients, test its effectiveness through the comparative analysis of the volume, to verify transfeccion of the DNA injected and to see if the carried through treatment presented impact in the evolution of the patients. Patients and methods: 21 patients in 3 groups of doses 150,600 and 400µg of the vaccine of DNA HSP-65 of M leprae, through intratumoral applications guided by USG Doppler repeated 3 times every 21 days. CT scans before and after the treatment had been carried through, for evaluation of the tumoral response through the comparison of tumoral volume. We also did biopsis before and after the treatment, and the material was submitted the Rt-PCR in search of tranfeccion of the injected DNA. During the protocol the patients had been evalueted to rule observe adverse events that could be related to the medication. Results: Of 21 patients, seven died before the end of the protocol. In the 13 suitable for analysis, 4 partial responses and stability of the disese in 1 case had occurred. In 9 cases the tumors progressed. Two patients are still alive, with more than eight hundred days of the beginning of the protocol. The adverse events occurred mainly as an increase of local pain and edema. It was not possible to prove the transcription of the DNA injected in the Rt-PCR because of the occurrence of positive a false result. Conclusions: The application was secure in the dose of 400mcg . We saw reduction of tumoral volume in 5 of the 13 patients suitable for analysis, four partial responses and one stable disease. In the patients who had presented reduction of the tumoral volume there seems to be clinical benefit. It was not possible to prove the transfeccion of the injected DNA.