O ensaio turbidimétrico tem como princípio a redução da densidade óptica em suspensões microbianas, decorrente o incremento na concentração do antibiótico. No ensaio convencional trabalha-se com tubos de ensaio que demandam longo tempo para visualização da resposta. Assim, o método empregando microplacas com leitura cinética para a dosagem de antibióticos é de interesse considerável, uma vez que possibilita reduzir quantidade de material e tempo de análise necessários e permite o ensaio de grande número de amostras simultaneamente, com leitura e cálculo automatizado. O objetivo deste trabalho é desenvolver o método de doseamento microbiológico de vancomicina empregando microplacas e modo de leitura cinético, assim como validar o método desenvolvido, através da avaliação dos parâmetros de especificidade e seletividade, linearidade, faixa ou intervalo linear, exatidão e precisão. Adicionalmente foi contemplado desenvolvimento paralelo entre o método convencional e o cinético, de forma a permitir respaldo positivo quanto à validação. Sendo assim, através do estudo dos parâmetros de validação do método cinético, trabalhou-se em condições estabelecidas abrangendo curva-padrão de vancomicina com concentrações entre 0,6 e 1,0 µg/mL, e emprego de meio de cultura caldo de caseína-soja inoculado com Bacillus subtilis (ATCC 6633) na proporção de 5%. Foram obtidos resultados satisfatórios em 5 horas de incubação. Conclui-se que o ensaio em microplacas permite avaliar, com vantagens, a atividade do antibiótico frente ao microrganismo-teste, permitindo facilidade operacional e maior rapidez na obtenção dos resultados. / The principle of the turbidimetric assay is to reduce the optical density of microbial suspensions, due to the increase in the concentration of antibiotic. In the conventional test works with tubes that require long time to display the answer. Thus, the method using microplates with kinetic reading for the dosage of antibiotics is of considerable interest, since it allows possible to reduce the amount of material and analysis time required and allows for testing of large numbers of samples simultaneously, with automated reading and calculating. The aim of this work is to develop the method of microbiological assay of vancomycin using microplates and kinetic reading mode, and to validate the method developed by evaluating the parameters of specificity and selectivity, linearity, linear range, accuracy and precision. Also included was the parallel development between the conventional method and the kinetic, to enable positive support for the validation. Thus, by studying the validation parameters of the kinetic method, worked under conditions laid down covering vancomycin standard curve with concentrations between 0.6 and 1.0 mg / mL, and soybean-casein broth inoculated with 5% of Bacillus subtilis (ATCC 6633). Satisfactory results were obtained with 5 hours incubation. In conclusion, the microplate assay allows to evaluate, with advantages, the activity of the antibiotic against the microorganism, allowing greater operational ease and rapidity of obtaining results.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-30T17:56:53Z No. of bitstreams: 1 Porto, Daniele Ferreira [Dissertação, 2014].pdf: 1240957 bytes, checksum: 014bd9c8587ee46053ae0e4023717210 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T17:56:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Porto, Daniele Ferreira [Dissertação, 2014].pdf: 1240957 bytes, checksum: 014bd9c8587ee46053ae0e4023717210 (MD5) / Complicações por doenças infecciosas têm sido relacionadas ao uso excessivo de antibióticos. A Nanotecnologia apresenta avançadas estratégias no tratamento de diferentes enfermidades, devido ao tamanho nanométrico, capaz de atravessar diversas membranas biológicas anteriormente impermeáveis realizando a entrega direcionada de agentes antimicrobianos. Polímeros biodegradáveis a base de poli (ε-caprolactona) (PCL) e poli (ácido lático-co-glicolídeo) (PLGA) têm sido amplamente empregados na preparação de nanosistemas carreadores de fármacos. Este estudo objetivou desenvolver nanopartículas poliméricas carreadoras de vancomicina (VAN) e avaliar sua atividade antibacteriana. Para tal foi empregado um planejamento experimental que permitiu combinar diferentes condições de preparação utilizando PCL como material de parede. Foi delineado um planejamento fatorial fracionado (2k-1 + 3), o qual avaliou a influência de variáveis independentes – razão polímero/ativo (PCL/VAN), tempo de ultrassom e volume de solvente orgânico – sobre as respostas – tamanho de partícula, polidispersão, concentração de VAN encapsulada e eficiência de encapsulação. As NP foram preparadas de acordo com o método de múltipla emulsificação com difusão do solvente e analisadas com base nas respostas obtidas, bem como através da avaliação de ensaios in vitro, tais como cinética de liberação e determinação da atividade antimicrobiana. A caracterização física foi realizada através das análises de calorimetria exploratória diferencial (DSC) e espectroscopia do infravermelho (IV-TF). Os resultados mostraram que o terceiro ensaio do planejamento (2k-1 +3) reuniu condições experimentais para produzir PCL-NP otimizadas e que somente a variável PCL/VAN apresentou efeito significativo, influenciando o aumento da concentração de VAN encapsulada. As condições identificadas para a otimização das NP de PCL foram reproduzidas utilizando-se PLGA a fim de realizar um estudo comparativo. Além disso, foi possível observar que houve diferença significativa entre os parâmetros avaliados com ambos os polímeros (p-valor< 0,05, ANOVA). Os espectros de IV-TF gerados pela VAN e NP poliméricas sugeriram que o antimicrobiano foi encapsulado na matriz das NP. Estes resultados foram confirmados pelos termogramas de DSC, além de indicar ausência de interação significativa entre VAN e PLGA. O perfil de liberação in vitro da VAN encapsulada com PLGA, apresentou padrão bifásico de liberação. Os valores das concentrações inibitórias mínimas da VAN e das NP poliméricas observados sugerem que a capacidade de inibição do crescimento bacteriano da VAN foi preservada, independente das condições de produção e da encapsulação nas diferentes NP. Deste modo, conclui-se que o PLGA apresenta vantagens no processo de nanoencapsulação em relação ao PCL, o que o torna um polímero promissor no desenvolvimento de novos sistemas de liberação controlada de VAN / Complications from infectious diseases have been related to overuse of antibiotics. Nanotechnology has advanced strategies in the treatment of different diseases due its nanoscale size able to cross different impermeable biological membranes performing targeted delivery of antimicrobial agents. Biodegradable polymers based in poly (ε-caprolactone) (PCL) and poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) have been widely employed in the preparation of Drug Carriers Nanosystems. This study aimed to develop polymeric nanoparticle carrier of vancomycin (VAN) and evaluate its antibacterial activity. In this sense it was employed an experimental design to combine different preparation conditions using PCL as wall material. It was outlined a fractional factorial design (2k-1 + 3), which evaluated the influence of independent variables polymer/active ratio (PCL/VAN), ultrasound time and organic solvent volume on the particle size, polydispersity, VAN loaded concentration and the encapsulation efficiency responses. NP were prepared according to the emulsification multiple with solvent diffusion method and analyzed based on the obtained responses, and by evaluating in vitro assays, such as release kinetics and antimicrobial activity determination. Physical characterization was performed by Differential Scanning Calorimetry (DSC) and infrared spectroscopy (FT-IR). The results showed the third test (2k-1 +3) gathered experimental conditions to produce optimized PCL-NP and only PCL/VAN variable presented significant effect, influencing the VAN loaded concentration. The identified conditions for PCL-NP optimization were reproduced using PLGA in order to perform a comparative study. Furthermore, it was observed significant difference between polymers parameters (p-value < 0.05, ANOVA). The FT-IR spectra generated by the VAN and polymeric NP suggested the encapsulation of antimicrobial in the NP matrix. These results were confirmed by DSC thermograms, besides indicating absence of significant interaction between VAN and PLGA. The in vitro release profile of VAN encapsulated with PLGA showed a biphasic release pattern. The minimum inhibitory concentration results suggested the ability of bacterial growth inhibition of VAN was preserved, regardless of production conditions and encapsulation in different NP. It was able to conclude that PLGA has advantages in the nanoencapsulation process to the PCL, which makes it a promising polymer to develop new VAN sustained release systems

Orientador: Daniela Ponce / Resumo: A prevalência da Lesão Renal Aguda (LRA) associada ao uso da vancomicina é muito variável e diferentes fatores relacionados ao paciente e ao tratamento (tempo e dose) podem potencializar a ocorrência da nefrotoxicidade. Estudos relacionaram o desempenho de biomarcadores urinários como preditores diagnósticos e prognósticos de LRA na insuficiência cardíaca (ICC), no pós-operatório de cirurgia cardíaca e na sepse, porém, pouco se sabe sobre o desempenho dos novos biomarcadores na LRA associada ao uso da vancomicina. / Abstract: The prevalence of acute kidney injury (AKI) related to vancomycin is variable and different risk factors related to the patient and the treatment (time and dose) may potentiate the occurrence of nephrotoxicity. Studies related the performance of urinary biomarkers as predictors of diagnostic and prognostic AKI in congestive heart failure (CHF), in the postoperative period of cardiac surgery and in sepsis, however, little is known about the performance of the new urinary biomarkers in vancomycin related AKI. / Mestre

O tratamento de infecções por Staphylococcus aureus tem sido problemático devido ao surgimento de cepas resistentes a múltiplios antibióticos. O antibiótico de escolha para o tratamento de infecções por S. aureus resistente a oxacilina é o glicopeptídeo vancomicina. Desde o primeiro isolamento de cepas com sensibilidade reduzida a vancomicina (VISA) em 1997, tem havido crescente preocupação com a disseminação da resistência a este antibiótico. Os mecanismos moleculares que levam à resistência de baixo nível a vancomicina ainda não foram elucidados. A detecção deste fenótipo na rotina de laboratório clínico é laboriosa, pois as técnicas disponíveis são de difícil execução e interpretação. Até agora, não há relato de transmissão horizontal de infecção por VISA, e todas as cepas com este fenótipo foram isoladas de pacientes que faziam o uso prolongado de vancomicina. Uma deficiência no locus regulador de genes acessórios (agr) foi postulado como fator de risco para a aquisição do fenótipo VISA por uma cepa sensível a este antibiótico. Para este estudo, foram selecionadas 47 cepas de S. aureus, com sensibilidades variadas a vancomicina, inclusive 5 cepas VISA isoladas no Brasil. Determinou-se nas cepas as concentrações inibitórias mínimas de vancomicina e oxacilina, a atividade hemolítica em ágar sangue de carneiro e de coelho, a capacidade de aderir ao poliestireno e o polimorfismo do locus agr. Determinou-se a integridade do locus agr por PCR-RFLP e sequenciamento de bases em 13 cepas representativas das 47 estudadas. A integridade do locus regulador acessório sarA também foi avaliada por sequenciamento de bases nestas 13 cepas. Foram escolhidas 18 cepas sensíveis a vancomicina com variadas características fenotípicas e estas foram submetidas à indução de resistência a vancomicina através da passagem seriada em concentrações crescentes deste antibiótico. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6 &#181;g/mL de vancomicina foi avaliada em 8 cepas através de ensaios de flutuação. Não observou-se correlação entre a aquisição de resistência a vancomicina com as atividades hemolíticas ou capacidade de adesão das cepas. A maioria das cepas (82,9%) apresentou-se como pertencente ao grupo polimórfico agr I, inclusive as cepas VISA. Duas cepas não conseguiram ser induzidas à resistência a vancomicina. O tempo levado para a aquisição de resistência não se correlacionou com nenhuma característica fenotípica ou genotípica de um grupo de cepas. A taxa de mutação que leva à capacidade de crescimento em 6&#181;g/mL de vancomicina apresentou-se maior para uma cepa pertencente ao clone endêmico brasileiro (CEB) cujo locus agr pertence ao grupo I e não apresentou variação de acordo com funcionalidade ou tipo do locus agr. Apenas uma das cepas VISA apresentou uma mutação no locus agr que o torna disfuncional. Os loci agr das outras cepas estudadas apresentaram-se íntegros. O locus sarA das cepas estudadas apresentou-se íntegro e com polimorfismos funcionais agrupados de acordo com a linhagem clonal das cepas. Pôde-se concluir que a integridade funcional do locus agr não é uma condição sine qua non para a aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina por parte de uma cepa sensível a este antibiótico. O grupo polimórfico agr II não tem maior predisposição à aquisição de resistência de baixo nível a vancomicina, como havia sido sugerido por alguns trabalhos disponíveis na literatura. / The treatment of staphylococcal infections has lately been a strenuous undertaking due to the resistance of Staphylococcus aureus to multiple antibiotics. The antimicrobial drug of choice for the treatment of methicillin resistant S. aureus (MRSA) is the glycopeptide vancomycin. Since the first isolation of S. aureus with reduced susceptibility to vancomycin (VISA) in 1997, there has been growing concern as to the dissemination of this resistance phenotype among isolates of this species. The molecular mechanisms that result in low level resistance to vancomycin have not yet been completely elucidated. The correct detection of this phenotype in the clinical laboratory is tricky, for the techniques available for this purpose are hard to execute and interpret. Until now, lateral transmission (dissemination) of VISA has not been reported and all strains bearing this phenotype have been isolated from patients who had been making prolonged use of vancomycin. A deficiency in the accessory gene regulator (agr) has been proposed as a risk factor for the acquisition of a VISA phenotype by a susceptible strain. For this study, 47 nosocomial VISA strains, that had been isolated in another study, were used. These strains were isolated from multiple geographical regions of Brazil, and included 5 VISA strains. The minimal inhibitory concentrations (MIC) of vancomycin and oxacillin, as well as haemolysis in sheep and rabbit agar, adhesion to polystyrene and agr polymorphism were determined in all of these strains. The integrity of the agr locus was determined by PCR-RFLP and by nucleotide sequencing in a sample of 13 strains chosen to be representative of the 47 strains studied. The integrity of the Staphylococcal accessory regulator sarA was also determined by nucleotide sequencing in these 13 strains. Another representative sample of 18 strains that were susceptible to vancomycin were submitted to induction of resistance to vancomycin by serial passage in increasing concentrations of this drug. The mutation rate of a mutation that leads to the ability of growing in a concentration of 6 &#181;g/mL of vancomycin was determined for 8 strains by fluctuation assays. There was no correlation between the acquisition of resistance to vancomycin with either haemolysis or adhesion to polystyrene. Most strains (82.9%) bore a group I agr polymorphism, including all of the VISA strains. Two strains could not be induced to resistance. The time taken for each strain to acquire resistance to vancomycin did not correlate with any phenotypic or genotypic characteristic pertaining to a group of strains. The rate of mutation that leads to the ability of growing in 6&#181;g/mL of vancomycin proved to be higher for a strain belonging to the Brazilian Endemic Clone (BEC) bearing an agr group I polymorphism, and did not vary according to presence or type of agr locus. Only one of the VISA strains presented a mutation in the agr locus that renders it disfunctional. The agr loci of the other strains studied presented themselves to be intact. The sarA loci of the strains evaluated were intact however presented functional polymorphisms that were groups according to the clonal lineage of the strains. It can thus be concluded that the functional integrity of the agr locus is not a sine qua non condition for the acquisition of low level resistance to vancomycin by a susceptible strain. Bearing of an agr group II polymorphism does not predispose a strain to acquire resistance to vancomycin, as has been previously suggested in literature.

O gênero Staphylococcus está intimamente relacionado às infecções hospitalares onde existe a presença de implantes médicos, em especial os cateteres venosos centrais (CVC). Nestas infecções, a habilidade de formar biofilme é considerada um importante fator de virulência entre Staphylococcus. Biofilmes são agregados microbianos envolvidos por uma matriz polimérica extracelular que confere proteção contra a ação do sistema imunológico e ação dos antimicrobianos, dificultando assim o tratamento das infecções relacionadas a implantes médicos. Os objetivos deste estudo foram: (i) avaliar a formação de biofilme em 222 isolados de Staphylococcus spp. de CVC através de dois métodos fenotípicos [ágar Congo Red (ACR) e microplacas com cristal violeta] e estabelecer possíveis marcadores genéticos de formação de biofilme, através da pesquisa dos genes icaA, icaD, aap e atlE, (ii) estabelecer um teste de suscetibilidade através da técnica de microdiluição em caldo para avaliar a concentração inibitória mínima de vancomicina necessária para erradicar o biofilme formado (CMEB), e comparar estes valores com os resultados obtidos através da técnica de concentração inibitória mínima (CIM) em crescimento planctônico.Das 222 amostras analisadas, encontramos 64,5% (143/222) de isolados formadores de biofilme. A detecção de biofilme em S. epidermidis foi de 64,5% e 54% pelos métodos de microplaca e ACR respectivamente, utilizando microplacas com cristal violeta como padrão ouro. Encontramos os genes icaA e icaD na grande maioria (92% - 132/143) dos isolados produtores, o que confirma a importância destes genes na formação de biofilme. Em um total de 37 S. aureus a produção de biofilme ocorreu em 81,1% (30/37) dos isolados, sendo que entre os MRSA a taxa foi de 88,9% e entre os MSSA de 78,6%. Os genes icaA e icaD estavam presentes em 25/30 das amostras formadoras de biofilme. Nos demais Staphylococcus spp. coagulase negativos não epidermidis foi observada uma taxa de produção de biofilme de 35,6% (6/19). Os isolados formadores de biofilme foram classificados em três categorias: forte, moderado e fraco. Entre os isolados forte e moderadamente produtores de biofilme foram observados uma maior razão CMEB / CIM (> 32) frente à vancomicina. Entre isolados biofilme negativos, não encontramos diferenças nos valores de CMEB e CIM. Embora a forma de crescimento em biofilme no processo infeccioso já tenha sido bem comprovada, os laboratórios de microbiologia clínica realizam testes de suscetibilidade em isolados na forma xii planctônica. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo, indicam que a CIM pode não ser o parâmetro mais adequado para guiar a terapêutica. Sendo assim, é extremamente importante avaliar a suscetibilidade à vancomicina, em casos de infecções relacionadas à CVC, na forma de biofilme bacteriano (CMEB). / Staphylococcus is closely related to hospital infections, where the presence of medical implants exists, here represented by central venous catheter (CVC). In these infections, the ability to form biofilm is considered an important virulence factor among Staphylococcus. Biofilms are structured communities of microbial species involved by an extracellular polymeric matrix, which protects against the immunologic system and antimicrobial actions, making it harder to treat those infections related to medical implants. The goals of this study were: (i) to evaluate the biofilm formation in 222 isolates of Staphylococcus spp. of CVC through both phenotypic methods [agar Congo Red (ACR) and microtiter plates] and establish possible genetic markers of biofilm formation, through the research of the icaA, icaD, aap and atlE genes, by PCR, (ii) establish susceptibility in biofilm, through of the microdilution test to evaluate the minimal inhibitory concentration of vancomycin to eradicate the biofilm formed - Minimal Biofilm Eradication Concentration (MBEC) and to compare these results with the values found to the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) in growth planctonic. From the 222 analyzed samples, we found 64.5% (143/222) of isolates biofilm producers. The detection of the biofilm formation in the S. epidermidis was 64.5% and 54% by the microtiter plate and ACR methods, respectively, using microtiter plates as gold standard. We found icaA and icaD genes in most (92%) of the biofilm producing isolates, which confirms that those genes are essential for this kind of formation. In a total of 37 S. aureus, the biofilm production was observed in 81.1% (30/37) of the isolates. Concerning the MRSA we found 88.9% and among MSSA were observed 78.6% of biofilm-producing. The icaA and icaD genes were present in 25/30 of the samples biofilm producers. On the other Staphylococcus spp. coagulase negatives non-epidermidis, it was observed a number of 35.6% (6/19). The biofilm producing isolates were classified in three categories: strong, moderate and weak. Among the strong and moderate biofilm producing isolates, we could observe a higher ratio MBEC/MIC (>32) in relation to the vancomycin. Among negative biofilm isolates we found matching values for MBEC and MIC. Although the form of growth in biofilm among the infection process has already been well proven, the clinical microbiology laboratories perform susceptibility testing on isolates in the xiv planktonic form. Thus, the results of this study indicate that the MIC cannot be the most appropriate parameter to guide therapy. It is therefore extremely important to evaluate the susceptibility to vancomycin in cases of infection related to CVC, in the form of bacterial biofilms (MBEC).

O gênero Staphylococcus está intimamente relacionado às infecções hospitalares onde existe a presença de implantes médicos, em especial os cateteres venosos centrais (CVC). Nestas infecções, a habilidade de formar biofilme é considerada um importante fator de virulência entre Staphylococcus. Biofilmes são agregados microbianos envolvidos por uma matriz polimérica extracelular que confere proteção contra a ação do sistema imunológico e ação dos antimicrobianos, dificultando assim o tratamento das infecções relacionadas a implantes médicos. Os objetivos deste estudo foram: (i) avaliar a formação de biofilme em 222 isolados de Staphylococcus spp. de CVC através de dois métodos fenotípicos [ágar Congo Red (ACR) e microplacas com cristal violeta] e estabelecer possíveis marcadores genéticos de formação de biofilme, através da pesquisa dos genes icaA, icaD, aap e atlE, (ii) estabelecer um teste de suscetibilidade através da técnica de microdiluição em caldo para avaliar a concentração inibitória mínima de vancomicina necessária para erradicar o biofilme formado (CMEB), e comparar estes valores com os resultados obtidos através da técnica de concentração inibitória mínima (CIM) em crescimento planctônico.Das 222 amostras analisadas, encontramos 64,5% (143/222) de isolados formadores de biofilme. A detecção de biofilme em S. epidermidis foi de 64,5% e 54% pelos métodos de microplaca e ACR respectivamente, utilizando microplacas com cristal violeta como padrão ouro. Encontramos os genes icaA e icaD na grande maioria (92% - 132/143) dos isolados produtores, o que confirma a importância destes genes na formação de biofilme. Em um total de 37 S. aureus a produção de biofilme ocorreu em 81,1% (30/37) dos isolados, sendo que entre os MRSA a taxa foi de 88,9% e entre os MSSA de 78,6%. Os genes icaA e icaD estavam presentes em 25/30 das amostras formadoras de biofilme. Nos demais Staphylococcus spp. coagulase negativos não epidermidis foi observada uma taxa de produção de biofilme de 35,6% (6/19). Os isolados formadores de biofilme foram classificados em três categorias: forte, moderado e fraco. Entre os isolados forte e moderadamente produtores de biofilme foram observados uma maior razão CMEB / CIM (> 32) frente à vancomicina. Entre isolados biofilme negativos, não encontramos diferenças nos valores de CMEB e CIM. Embora a forma de crescimento em biofilme no processo infeccioso já tenha sido bem comprovada, os laboratórios de microbiologia clínica realizam testes de suscetibilidade em isolados na forma xii planctônica. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo, indicam que a CIM pode não ser o parâmetro mais adequado para guiar a terapêutica. Sendo assim, é extremamente importante avaliar a suscetibilidade à vancomicina, em casos de infecções relacionadas à CVC, na forma de biofilme bacteriano (CMEB). / Staphylococcus is closely related to hospital infections, where the presence of medical implants exists, here represented by central venous catheter (CVC). In these infections, the ability to form biofilm is considered an important virulence factor among Staphylococcus. Biofilms are structured communities of microbial species involved by an extracellular polymeric matrix, which protects against the immunologic system and antimicrobial actions, making it harder to treat those infections related to medical implants. The goals of this study were: (i) to evaluate the biofilm formation in 222 isolates of Staphylococcus spp. of CVC through both phenotypic methods [agar Congo Red (ACR) and microtiter plates] and establish possible genetic markers of biofilm formation, through the research of the icaA, icaD, aap and atlE genes, by PCR, (ii) establish susceptibility in biofilm, through of the microdilution test to evaluate the minimal inhibitory concentration of vancomycin to eradicate the biofilm formed - Minimal Biofilm Eradication Concentration (MBEC) and to compare these results with the values found to the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) in growth planctonic. From the 222 analyzed samples, we found 64.5% (143/222) of isolates biofilm producers. The detection of the biofilm formation in the S. epidermidis was 64.5% and 54% by the microtiter plate and ACR methods, respectively, using microtiter plates as gold standard. We found icaA and icaD genes in most (92%) of the biofilm producing isolates, which confirms that those genes are essential for this kind of formation. In a total of 37 S. aureus, the biofilm production was observed in 81.1% (30/37) of the isolates. Concerning the MRSA we found 88.9% and among MSSA were observed 78.6% of biofilm-producing. The icaA and icaD genes were present in 25/30 of the samples biofilm producers. On the other Staphylococcus spp. coagulase negatives non-epidermidis, it was observed a number of 35.6% (6/19). The biofilm producing isolates were classified in three categories: strong, moderate and weak. Among the strong and moderate biofilm producing isolates, we could observe a higher ratio MBEC/MIC (>32) in relation to the vancomycin. Among negative biofilm isolates we found matching values for MBEC and MIC. Although the form of growth in biofilm among the infection process has already been well proven, the clinical microbiology laboratories perform susceptibility testing on isolates in the xiv planktonic form. Thus, the results of this study indicate that the MIC cannot be the most appropriate parameter to guide therapy. It is therefore extremely important to evaluate the susceptibility to vancomycin in cases of infection related to CVC, in the form of bacterial biofilms (MBEC).

Introdução: Enterococcus faecium resistente à vancomicina (EFRV) surgiu como um importante patógeno multirresistente e de etiologia potencialmente letal nas infecções associadas aos cuidados de saúde em todo o mundo. Objetivo: O objetivo deste estudo de coorte retrospectivo foi avaliar os fatores associados à mortalidade em pacientes com bacteremia causadas por EFRV em um grande hospital de referência terciária no sul do Brasil. Métodos: Foram avaliados todos os casos documentados de bacteremia identificados entre maio de 2010 e julho de 2012. Regressão de Cox foi realizada para determinar se as características relacionadas ao hospedeiro ou o tratamento antimicrobiano estavam associadas com a mortalidade por qualquer causa em 30 dias. No total, 35 pacientes documentados com bacteremia por EFRV foram identificados durante o período de estudo. Resultados: A mediana do escore APACHE-II da população do estudo foi 26 (IQR 10). A mortalidade global em 30 dias foi de 65,7%%. Todos isolados de EFRV eram sensíveis à linezolida, daptomicina e quinopristina - dalfopristina. A linezolida foi o único agente antimicrobiano com atividade in vitro contra EFRV que foi administrada à coorte. Após a análise multivariada, o tratamento com linezolida (HR 0,08, 95% CI, 0,02-0,27) e a presença de insuficiência renal aguda no início da bacteremia (HR 4,01, 95% CI, 1,62-9,94) foram associadas de forma independente com o desfecho principal. Conclusão: Apresentação com insuficiência renal aguda e ausência de tratamento com um antibiótico eficaz representa um risco de mortalidade em pacientes com bacteremia por EFRV. / Background: Vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VREF) has emerged as a relevant multidrug-resistant pathogen and potentially lethal etiology of health care-associated infections worldwide. Objective: The objective of this retrospective cohort study was to assess factors associated with mortality in patients with VREF bacteremia in a major tertiary referral hospital in southern Brazil. Methods: All documented cases of bacteremia identified between May 2010 and July 2012 were evaluated. Cox regression was performed to determine whether the characteristics related to the host or antimicrobial treatment were associated with the all-cause 30-day mortality. In total, 35 patients with documented VREF bacteremia were identified during the study period. Results: The median APACHE-II score of the study population was 26 (IQR 10). The overall 30-day mortality was 65.7%. All VREF isolates were sensitive to linezolid, daptomycin and quinopristin-dalfopristin. Linezolid was the only antimicrobial agent with in vitro activity against VREF that was administered to the cohort. After multivariate analysis, linezolid treatment (HR, 0.08; 95%CI, 0.02 – 0.27) and presence of acute kidney injury at the onset of bacteremia (HR, 4.01; 95%CI, 1.62 – 9.94) were independently associated with the main outcome. Conclusion: Presentation with acute kidney injury and lack of treatment with an effective antibiotic poses risk for mortality in patients with VREF bacteremia.

Introdução: Enterococcus faecium resistente à vancomicina (EFRV) surgiu como um importante patógeno multirresistente e de etiologia potencialmente letal nas infecções associadas aos cuidados de saúde em todo o mundo. Objetivo: O objetivo deste estudo de coorte retrospectivo foi avaliar os fatores associados à mortalidade em pacientes com bacteremia causadas por EFRV em um grande hospital de referência terciária no sul do Brasil. Métodos: Foram avaliados todos os casos documentados de bacteremia identificados entre maio de 2010 e julho de 2012. Regressão de Cox foi realizada para determinar se as características relacionadas ao hospedeiro ou o tratamento antimicrobiano estavam associadas com a mortalidade por qualquer causa em 30 dias. No total, 35 pacientes documentados com bacteremia por EFRV foram identificados durante o período de estudo. Resultados: A mediana do escore APACHE-II da população do estudo foi 26 (IQR 10). A mortalidade global em 30 dias foi de 65,7%%. Todos isolados de EFRV eram sensíveis à linezolida, daptomicina e quinopristina - dalfopristina. A linezolida foi o único agente antimicrobiano com atividade in vitro contra EFRV que foi administrada à coorte. Após a análise multivariada, o tratamento com linezolida (HR 0,08, 95% CI, 0,02-0,27) e a presença de insuficiência renal aguda no início da bacteremia (HR 4,01, 95% CI, 1,62-9,94) foram associadas de forma independente com o desfecho principal. Conclusão: Apresentação com insuficiência renal aguda e ausência de tratamento com um antibiótico eficaz representa um risco de mortalidade em pacientes com bacteremia por EFRV. / Background: Vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VREF) has emerged as a relevant multidrug-resistant pathogen and potentially lethal etiology of health care-associated infections worldwide. Objective: The objective of this retrospective cohort study was to assess factors associated with mortality in patients with VREF bacteremia in a major tertiary referral hospital in southern Brazil. Methods: All documented cases of bacteremia identified between May 2010 and July 2012 were evaluated. Cox regression was performed to determine whether the characteristics related to the host or antimicrobial treatment were associated with the all-cause 30-day mortality. In total, 35 patients with documented VREF bacteremia were identified during the study period. Results: The median APACHE-II score of the study population was 26 (IQR 10). The overall 30-day mortality was 65.7%. All VREF isolates were sensitive to linezolid, daptomycin and quinopristin-dalfopristin. Linezolid was the only antimicrobial agent with in vitro activity against VREF that was administered to the cohort. After multivariate analysis, linezolid treatment (HR, 0.08; 95%CI, 0.02 – 0.27) and presence of acute kidney injury at the onset of bacteremia (HR, 4.01; 95%CI, 1.62 – 9.94) were independently associated with the main outcome. Conclusion: Presentation with acute kidney injury and lack of treatment with an effective antibiotic poses risk for mortality in patients with VREF bacteremia.

O gênero Staphylococcus está intimamente relacionado às infecções hospitalares onde existe a presença de implantes médicos, em especial os cateteres venosos centrais (CVC). Nestas infecções, a habilidade de formar biofilme é considerada um importante fator de virulência entre Staphylococcus. Biofilmes são agregados microbianos envolvidos por uma matriz polimérica extracelular que confere proteção contra a ação do sistema imunológico e ação dos antimicrobianos, dificultando assim o tratamento das infecções relacionadas a implantes médicos. Os objetivos deste estudo foram: (i) avaliar a formação de biofilme em 222 isolados de Staphylococcus spp. de CVC através de dois métodos fenotípicos [ágar Congo Red (ACR) e microplacas com cristal violeta] e estabelecer possíveis marcadores genéticos de formação de biofilme, através da pesquisa dos genes icaA, icaD, aap e atlE, (ii) estabelecer um teste de suscetibilidade através da técnica de microdiluição em caldo para avaliar a concentração inibitória mínima de vancomicina necessária para erradicar o biofilme formado (CMEB), e comparar estes valores com os resultados obtidos através da técnica de concentração inibitória mínima (CIM) em crescimento planctônico.Das 222 amostras analisadas, encontramos 64,5% (143/222) de isolados formadores de biofilme. A detecção de biofilme em S. epidermidis foi de 64,5% e 54% pelos métodos de microplaca e ACR respectivamente, utilizando microplacas com cristal violeta como padrão ouro. Encontramos os genes icaA e icaD na grande maioria (92% - 132/143) dos isolados produtores, o que confirma a importância destes genes na formação de biofilme. Em um total de 37 S. aureus a produção de biofilme ocorreu em 81,1% (30/37) dos isolados, sendo que entre os MRSA a taxa foi de 88,9% e entre os MSSA de 78,6%. Os genes icaA e icaD estavam presentes em 25/30 das amostras formadoras de biofilme. Nos demais Staphylococcus spp. coagulase negativos não epidermidis foi observada uma taxa de produção de biofilme de 35,6% (6/19). Os isolados formadores de biofilme foram classificados em três categorias: forte, moderado e fraco. Entre os isolados forte e moderadamente produtores de biofilme foram observados uma maior razão CMEB / CIM (> 32) frente à vancomicina. Entre isolados biofilme negativos, não encontramos diferenças nos valores de CMEB e CIM. Embora a forma de crescimento em biofilme no processo infeccioso já tenha sido bem comprovada, os laboratórios de microbiologia clínica realizam testes de suscetibilidade em isolados na forma xii planctônica. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo, indicam que a CIM pode não ser o parâmetro mais adequado para guiar a terapêutica. Sendo assim, é extremamente importante avaliar a suscetibilidade à vancomicina, em casos de infecções relacionadas à CVC, na forma de biofilme bacteriano (CMEB). / Staphylococcus is closely related to hospital infections, where the presence of medical implants exists, here represented by central venous catheter (CVC). In these infections, the ability to form biofilm is considered an important virulence factor among Staphylococcus. Biofilms are structured communities of microbial species involved by an extracellular polymeric matrix, which protects against the immunologic system and antimicrobial actions, making it harder to treat those infections related to medical implants. The goals of this study were: (i) to evaluate the biofilm formation in 222 isolates of Staphylococcus spp. of CVC through both phenotypic methods [agar Congo Red (ACR) and microtiter plates] and establish possible genetic markers of biofilm formation, through the research of the icaA, icaD, aap and atlE genes, by PCR, (ii) establish susceptibility in biofilm, through of the microdilution test to evaluate the minimal inhibitory concentration of vancomycin to eradicate the biofilm formed - Minimal Biofilm Eradication Concentration (MBEC) and to compare these results with the values found to the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) in growth planctonic. From the 222 analyzed samples, we found 64.5% (143/222) of isolates biofilm producers. The detection of the biofilm formation in the S. epidermidis was 64.5% and 54% by the microtiter plate and ACR methods, respectively, using microtiter plates as gold standard. We found icaA and icaD genes in most (92%) of the biofilm producing isolates, which confirms that those genes are essential for this kind of formation. In a total of 37 S. aureus, the biofilm production was observed in 81.1% (30/37) of the isolates. Concerning the MRSA we found 88.9% and among MSSA were observed 78.6% of biofilm-producing. The icaA and icaD genes were present in 25/30 of the samples biofilm producers. On the other Staphylococcus spp. coagulase negatives non-epidermidis, it was observed a number of 35.6% (6/19). The biofilm producing isolates were classified in three categories: strong, moderate and weak. Among the strong and moderate biofilm producing isolates, we could observe a higher ratio MBEC/MIC (>32) in relation to the vancomycin. Among negative biofilm isolates we found matching values for MBEC and MIC. Although the form of growth in biofilm among the infection process has already been well proven, the clinical microbiology laboratories perform susceptibility testing on isolates in the xiv planktonic form. Thus, the results of this study indicate that the MIC cannot be the most appropriate parameter to guide therapy. It is therefore extremely important to evaluate the susceptibility to vancomycin in cases of infection related to CVC, in the form of bacterial biofilms (MBEC).

Introdução: Enterococcus faecium resistente à vancomicina (EFRV) surgiu como um importante patógeno multirresistente e de etiologia potencialmente letal nas infecções associadas aos cuidados de saúde em todo o mundo. Objetivo: O objetivo deste estudo de coorte retrospectivo foi avaliar os fatores associados à mortalidade em pacientes com bacteremia causadas por EFRV em um grande hospital de referência terciária no sul do Brasil. Métodos: Foram avaliados todos os casos documentados de bacteremia identificados entre maio de 2010 e julho de 2012. Regressão de Cox foi realizada para determinar se as características relacionadas ao hospedeiro ou o tratamento antimicrobiano estavam associadas com a mortalidade por qualquer causa em 30 dias. No total, 35 pacientes documentados com bacteremia por EFRV foram identificados durante o período de estudo. Resultados: A mediana do escore APACHE-II da população do estudo foi 26 (IQR 10). A mortalidade global em 30 dias foi de 65,7%%. Todos isolados de EFRV eram sensíveis à linezolida, daptomicina e quinopristina - dalfopristina. A linezolida foi o único agente antimicrobiano com atividade in vitro contra EFRV que foi administrada à coorte. Após a análise multivariada, o tratamento com linezolida (HR 0,08, 95% CI, 0,02-0,27) e a presença de insuficiência renal aguda no início da bacteremia (HR 4,01, 95% CI, 1,62-9,94) foram associadas de forma independente com o desfecho principal. Conclusão: Apresentação com insuficiência renal aguda e ausência de tratamento com um antibiótico eficaz representa um risco de mortalidade em pacientes com bacteremia por EFRV. / Background: Vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VREF) has emerged as a relevant multidrug-resistant pathogen and potentially lethal etiology of health care-associated infections worldwide. Objective: The objective of this retrospective cohort study was to assess factors associated with mortality in patients with VREF bacteremia in a major tertiary referral hospital in southern Brazil. Methods: All documented cases of bacteremia identified between May 2010 and July 2012 were evaluated. Cox regression was performed to determine whether the characteristics related to the host or antimicrobial treatment were associated with the all-cause 30-day mortality. In total, 35 patients with documented VREF bacteremia were identified during the study period. Results: The median APACHE-II score of the study population was 26 (IQR 10). The overall 30-day mortality was 65.7%. All VREF isolates were sensitive to linezolid, daptomycin and quinopristin-dalfopristin. Linezolid was the only antimicrobial agent with in vitro activity against VREF that was administered to the cohort. After multivariate analysis, linezolid treatment (HR, 0.08; 95%CI, 0.02 – 0.27) and presence of acute kidney injury at the onset of bacteremia (HR, 4.01; 95%CI, 1.62 – 9.94) were independently associated with the main outcome. Conclusion: Presentation with acute kidney injury and lack of treatment with an effective antibiotic poses risk for mortality in patients with VREF bacteremia.