Background: Our innate immunesystem protects us from infections but, since its methods is not all specific for microorganisms, may also induce collateral damage. Severe physical injury often proved deadly throughout evolution. Such injuries may induce massive collateral damage. Nowadays we can initiate advanced critical care for affected patients and save them from imminent trauma-related death. We are therefore faced with the fact that the collateral damage from the immune system may pose a major threat to the patient, the pathophysiology of which is not amenable to direct medical treatment and which leaves us with only passive supportive measures. In this thesis we investigated the role of leucocytes under such circumstances. Our main aim was to understand better the role of leucocytes in the development of increased vascular permeability after burns and trauma. More specifically we investigated the impact of an injury on the function of leucocytes such as the dynamic change of certain cell-surface receptors on the leucocytes and in their numbers and immature forms. We wanted to find out if the increased pulmonary vascular permeability after a burn could be mediated through heparin binding protein (HBP) released from granuloctes, and whether HBP could be used as a biomarker for respiratory failure after trauma. We also wanted to confirm the possible role of histamine as a mediator of the systemic increase in vascular permeability after burns. Methods: The dynamic change of cell-surface receptors was measured by flow-acquired cytometer scanning (FACS) on blood samples taken after burns. The concentrations of HBP after a burn and mechanical trauma were analysed in plasma. Pulmonary vascular permeability after a burn was assessed using transpulmonary thermodilution. The histamine turnover after a burn was assessed with high performance liquid chromatography (HPLC) for concentrations of histamine and methylhistamine in urine. Results: We confirmed earlier investigations showing altered expression of receptors on leucocytes after a burn, receptors intimately associated with leucocyte functions (study I). In a pilot study of 10 patients we measured plasma concentrations of HBP and found them to be increased soon after a burn (study II). This finding was not confirmed in a larger, more extensive and specific study of 20 patients. We did, however, find an association between alterations in the number of leucocytes soon after a burn and pulmonary vascular permeability, indicating that they had a role in this process (study III). In another study of trauma (non burn) we found an association between the concentration of HBP in early plasma-samples after injury and the development of ARDS, indicating that granulocytes and HBP have a role in its aetiology (study IV). We found a small increase in urinary histamine and normal urinary methylhistamine concentrations but had anticipated a distinct increase followed by a decrease after reading the current papers on the subject. This indicates that the role of histamine as a mediator of increased vascular permeability after burns may have been exaggerated (study V). Conclusions: We conclude that leucocytes are affected by burns and trauma, and it is likely that they contribute to the development of respiratory failure and acute respiratory distress syndrome (ARDS). HBP is a candidate biomarker for the early detection of ARDS after trauma, and the white blood count (WBC) is a useful biomarker for the detection of decreased oxygenation soon after a burn.

Un endothélium vasculaire rétinien quiescent est essentiel dans l’approvisionnement et le maintien de l’homéostasie tissulaire afin d’assurer la fonction visuelle. L’hyperglycémie chronique dans le diabète peut mener à des complications reliées à plusieurs changements structuraux et fonctionnels de l’endothélium. Ces changements se manifestent souvent par des vaisseaux instables et hyperperméables, résultant en un tissu rétinien inadéquatement perfusé. Ces altérations sont rencontrées dans la pathophysiologie de l’œdème maculaire diabétique (OMD) qui affecte plus du quart des diabétiques. L’inhibition du facteur de perméabilité vasculaire VEGF-A a révolutionné le traitement de l’OMD, mais est aussi associée à des effets secondaires non négligeables reliés à leur non-spécificité et à une compréhension incomplète des mécanismes régulant la perméabilité vasculaire. Un ciblage spécifique de l’endothélium permettant la récupération de la quiescence et la stabilité physiologique réduisant l’hyperperméabilité pourrait fournir un nouvel outil thérapeutique. La BMP9 (Bone morphogenetic protein 9), qui est mise en circulation par le foie, est connue comme facteur de quiescence et de stabilité vasculaire ainsi que pour son effet sur l’homéostasie du glucose. Ces aspects étant peu documentés dans un contexte diabétique, nous avons évalué les capacités de la BMP9 sur la stabilisation de l’endothélium rétinien et ses effets paracrines/autocrines sur la gluconéogenèse hépatique. Nous avons démontré que la signalisation canonique de la BMP9/Smad1,5,9 via son récepteur spécifique à l’endothélium Alk1, était déficiente dans un modèle murin de diabète, ce qui exacerbe l’hyperperméabilité endothéliale rétinienne. À l’inverse, la surexpression de la BMP9 par un modèle murin de livraison adénovirale récupère la perméabilité physiologique, associée principalement à un renforcement des jonctions interendothéliales en limitant l’action du VEGF. De plus, nous avons trouvé que la BMP9 améliore le contrôle glycémique chez les souris diabétiques par l’inhibition de la gluconéogenèse hépatique, via la voie non-canonique Alk3/FOXO1. Fondamentalement, ce travail met en évidence les mécanismes régissant la perméabilité endothéliale dans un contexte diabétique, fournissant une alternative thérapeutique contre l’OMD. La régulation de la perméabilité rétinienne par la BMP9 s’effectue à plusieurs niveaux, indirectement par le contrôle glycémique, et directement par la solidification jonctionnelle de la barrière endothéliale rétinienne, réhabilitant ainsi la quiescence et la stabilité de l'endothélium physiologique. / A quiescent retinal vascular endothelium is essential for the supply and maintenance of tissue homeostasis to ensure proper visual function. Chronic hyperglycemia in diabetes can lead to multiple complications related to several structural and functional changes in the endothelium, characterized by unstable and hyperpermeable vessels resulting in an inadequately perfused retinal tissue. These alterations are encountered in the pathophysiology of diabetic macular edema (DME), which affects more than a quarter of diabetics. Inhibition of the vascular permeability factor VEGF-A has revolutionized the treatments of DME but is associated with non-negligible side effects related to their non-specific action combined with an incomplete understanding of the mechanisms regulating vascular permeability. Specific endothelial targeting aiming to recover quiescence and reducing hyperpermeability could provide new therapeutic tools for the treatment or prevention of DME. BMP9 (Bone morphogenetic protein 9), which is produced by the liver, is known as a vascular quiescence and stability factor as well as for its effects on glucose homeostasis. Since these aspects are poorly documented in a diabetic context, we investigated BMP9’s capabilities on endothelium stabilization and its paracrine/autocrine effects on hepatic gluconeogenesis. In our studies, we found that the canonical BMP9/Smad1,5,9 signaling, via its physiological Alk1 endothelium-specific receptor, was deficient in a murine model of diabetes, which exacerbates retinal endothelial hyperpermeability. In contrast, adenoviral overexpression of BMP9 recovers physiological permeability, which was primarily associated with the enhancement of interendothelial junctions by limiting the action of VEGF. In addition, we found that BMP9 improves glycemic control in diabetic mice by inhibition of hepatic gluconeogenesis via the non-canonical ALK3/FOXO1 pathway. Fundamentally, this work highlights new insights of the mechanisms governing endothelial permeability in a diabetic context, providing a therapeutic alternative against DME. Regulation of retinal permeability by BMP9 occurs on several levels, indirectly, through glycemic control, and directly through the junctional solidification of the hyperglycemic retinal endothelial barrier, thus rehabilitating the quiescence and stability of the physiological endothelium.

La rétinopathie diabétique est associée à plusieurs changements pathologiques du lit vasculaire rétinien, incluant l’ouverture de la barrière hémato-rétinienne, l’inflammation vasculaire et la modification du débit sanguin. Récemment, il a été proposé que le récepteur B1 des kinines, qui est surexprimé dans la rétine diabétique, puisse être impliqué dans le développement de ces altérations vasculaires. Ainsi, cette thèse présente les effets de traitements pharmacologiques avec des antagonistes du récepteur B1 sur la perfusion rétinienne, la perméabilité vasculaire, l’infiltration des leucocytes (leucostasie), l’expression de médiateurs de l’inflammation et la production d’anion superoxyde dans la rétine du rat rendu diabétique avec la streptozotocine (STZ). Les résultats obtenus montrent que l’application oculaire (10 µl d’une solution à 1%, deux fois par jour pendant 7 jours) de LF22-0542, un antagoniste hydrosoluble du récepteur B1, bloque significativement l’hyperperméabilité vasculaire, la leucostasie, le stress oxydatif et l’expression génique de médiateurs de l’inflammation (B1R, iNOS, COX-2, VEGF-R2, IL-1β et HIF-1α) dans la rétine chez le rat à 2 semaines de diabète. L’administration orale (3 mg/kg) d’un antagoniste non-peptidique et sélectif pour le récepteur B1, le SSR240612, entraîne une diminution du débit sanguin rétinien 4 jours après l’induction du diabète mais n’a aucun effet sur la réduction de la perfusion rétinienne à 6 semaines. Le récepteur B1 joue donc un rôle protecteur au tout début du diabète en assurant le maintien d’un débit sanguin normal dans la rétine; un effet qui n’est toutefois pas maintenu pendant la progression du diabète. Ces données présentent ainsi la dualité du récepteur B1 avec des effets à la fois protecteurs et délétères. Elles suggèrent aussi un rôle important pour le récepteur B1 dans l’inflammation rétinienne et le développement des altérations vasculaires. Le récepteur B1 pourrait donc représenter une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la rétinopathie diabétique. / Diabetic retinopathy is associated with retinal vascular changes, including blood retinal barrier breakdown, vascular inflammation and blood flow alterations. It has been proposed that kinin B1 receptor, which is upregulated in the diabetic retina, could be involved in the development of these pathological features of diabetic retinopathy. In a rat model of diabetes induced by Streptozotocin (STZ), the effects of kinin B1 receptor antagonists on retinal perfusion, vascular permeability, leukostasis, gene expression of inflammatory mediators and production of superoxide anion in the retina were evaluated. The results show that in 2-week diabetic rats, topical ocular application of the water soluble kinin B1 receptor antagonist LF22-0542 (10 µl of 1% solution, twice per day) for a 7-day period reverses vascular hyperpermeability, leukostasis, oxidative stress and gene expression of inflammatory mediators (B1R, iNOS, COX-2, VEGF-R2, IL-1β and HIF-1α) in the retina. Single oral administration (3 mg/kg) of SSR240612, a selective non-peptide B1 receptor antagonist, induces a decrease of retinal blood flow in 4-day diabetic rats but has no effect on retinal blood flow reduction present at 6 weeks of diabetes. Therefore, B1 receptor has a protective role in early diabetes by preserving a normal blood flow in the retina. These data suggest that B1 receptor exerts protective and adverse effects in the diabetic retina. They also support a key role for B1 receptor in retinal inflammation and the development of vascular alterations. B1 receptor could therefore represent a promising therapeutic target for the treatment of diabetic retinopathy.

L’angiogenèse et l’augmentation de la perméabilité vasculaire sont des éléments clés pour la croissance et la progression tumorale. Par conséquent, de nombreux efforts sont déployés à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation et le remodelage des vaisseaux sanguins de manière à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. De cette optique, les travaux de cette thèse se sont concentrés sur la protéine tyrosine phosphatase DEP-1, initialement identifiée comme un régulateur négatif de la prolifération et de la phosphorylation du VEGFR2 lorsque fortement exprimée dans les cellules endothéliales. Toutefois, en utilisant une approche d’ARNi, il a été démontré que via sa capacité à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529), DEP-1 était également un régulateur positif de l’activation de Src dans les cellules endothéliales stimulées au VEGF. Puisque Src joue un rôle central dans la promotion de l’angiogenèse et la perméabilité vasculaire, nous avons en plus démontré que DEP-1 était un promoteur de ces fonctions in vitro et que la tyrosine phosphorylation de sa queue C-terminale, permettant l’interaction et l’activation de Src, était requise. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent dans un premier temps à partir d’une souris Dep1 KO, dont le développement ne présente aucun phénotype apparent, que la perte de l’expression de DEP-1 se traduit en une inhibition de l’activation de Src et de l’un de ses substrats, la VE-Cadherine, en réponse au VEGF chez la souris adulte. Nos résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle primordial de DEP-1 dans l’induction de la perméabilité vasculaire et de la formation de capillaires in vivo. Conséquemment, la croissance tumorale et la formation de métastases aux poumons sont réduites due à une inhibition de leur vascularisation ce qui se traduit par une diminution de la prolifération et une augmentation de l’apoptose des cellules cancéreuses. De façon intéressante, l’expression élevée de DEP-1 dans les vaisseaux sanguins tumoraux de patientes atteintes du cancer du sein corrèle avec une vascularisation accrue de la tumeur. En plus du rôle de DEP-1 dans la réponse angiogénqiue à l’âge adulte, nos travaux ont également démontré le rôle important de DEP-1 lors de la vascularisation de la rétine, un modèle in vivo d’angiogenèse développementale. Dans ce contexte, DEP-1 inhibe la prolifération des cellules endothéliales et limite leur bourgeonnement et la complexification du réseau vasculaire rétinien en permettant l’expression adéquate du Dll4, un régulateur crucial de l’organisation de la vascularisation développementale. Cette expression du Dll4 découlerait de la stabilisation de la β-caténine par l’inactivation de la GSK3β, un régulateur important de la dégradation de la β-caténine, en réponse au VEGF selon la voie de signalisation VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β. Ainsi, ces travaux identifient DEP-1 comme un régulateur important de l’organisation vasculaire rétinienne. Les rôles positifs de DEP-1 dans les cellules endothéliales découlent principalement de sa capacité à lier et activer la kinase Src. En plus de contribuer à la réponse angiogénique, Src est également un oncogène bien caractérisé notamment pour sa contribution au programme invasif des cellules cancéreuses mammaires. Les travaux de cette thèse illustrent que DEP-1 est préférentiellement exprimée dans les cellules cancéreuses mammaires invasives et qu’il régule l’activation de Src, de voies de signalisation invasives et, par le fait même, de l’invasivité de ces cellules in vitro et in vivo. De façon intéressante, ces observations corrèlent avec des données cliniques où l’expression modérée de DEP-1 est associée à un mauvais pronostic de survie et de rechute. Ces résultats démontrent donc, pour la première fois, le rôle positif de DEP-1 dans l’activation de Src au niveau des cellules endothéliales et des cellules cancéreuses mammaires ce qui permet la régulation du bourgeonnement endothélial, de la perméabilité vasculaire, de l’angiogenèse normale et pathologique en plus de l’invasion tumorale. / Angiogenesis and increased vascular permeability are key component of tumor growth and progression. Consequently, numberous efforts are currently deployed to illucidate the molecular mecanisms contributing to the formation and remodelling of blood vessels in oder to identify new potential therapeutic targets. In that thought, the work of this thesis was focused on the protein tyrosine phosphatase DEP-1, initially identified as a negative regulator of proliferation and VEGFR2 phosphorylation when highly expressed in endothelial cells. However, using RNAi, it was shown that through its capacity to dephosphorylate the inhibitory tyrosine of Src (Y529), DEP-1 could also positively regulate Src activation in endothelial cells in response to VEGF. As Src is a central promoter of angiogenesis and vascular permeability, we showed that DEP-1 was a promoter of these vascular functions in vitro and that the tyrosine phosphorylation of its C-terminal tail, allowing interaction and activation of Src, was required. Interestingly, the catalytic inactivation of DEP-1 in mice resulted in increased proliferation in endothelial cells, but also in desorganization of vascular structures which contrast the absence of phenotype in DEP-1 complete knock-out mice (KO). The work of this thesis demonstrates for the first time that DEP-1 deletion causes inhibition of Src and one of its substrate, VE-Cadherin, activation in response to VEGF in Dep-1 KO mice, which develop normally. Our results show the crucial role of DEP-1 in VEGF-induced vascular permeability and capillary formation in vivo. Consequently, tumor growth and lung metastases formation were inhibited due to reduced tumor vascularisation causing reduced proliferation and increased apoptosis of tumor cells. Accordingly, high expression of DEP-1 in tumor-associated blood vessels of breast cancer patients correlates with greater tumor vascularisation. In addition to DEP-1 role in post-natal angiogenic response, our work also demonstrates the important role of DEP-1 during retinal vascularisation, an in vivo developmental angiogenesis model. In this context, DEP-1 inhibits proliferation of endothelial cells and limits their sprouting by allowing adequate β-catenin-dependant expression of Dll4, a Notch ligand regulating developmental vascularisation organisation. DEP-1 allows β-catenin stabilisation via inactivation of GSK3β, an important regulator of β-catenin degradation, in response to VEGF through VEGFR2-Src-PI3K-Akt-GSK3β signaling pathway. Thus, this work identifies DEP-1 as an important regulator of retinal vascular sprouting. The positive roles of DEP-1 in endothelial cells depend on it ability to bind and activate the kinase Src. In addition to its contribution to angiogenic response, Src is also a well-characterized oncogene notably for its contribution to invasive program of mammary cancer cells. This work illustrates that DEP-1 is preferentially expressed in invasive mammary cancer cells and that it regulates Src activation, pro-invasive signaling pathways and, consenquetly, cell invasiveness in vitro and in vivo. All these activities are dependant on DEP-1 catalytic activity and ability to bind Src. Interestingly, these results correlate with clinical data where moderate expression of DEP-1 is associated with poor pornostic of survival and relapse. Collectively, the results presented here demonstrate, for the first time, the crucial role of DEP-1 in Src activation in endothelial and breast cancer cells, leading to endothelial sprouting, vascular permeability, normal or pathological angiogenesis, and breast cancer invasiveness and metastases formation.

Les jonctions adhérentes (JA) sont nécessaires à l’élaboration d’une barrière vasculaire sélective dans laquelle la VE-cadhérine joue un rôle crucial. En effet, la VE-cadhérine est une molécule d’adhérence entrant dans la constitution des JA et présente spécifiquement au sein de l’endothélium. Lorsque la VE-cadhérine est exprimée à la surface des cellules endothéliales, l’intégrité de la barrière est préservée. En revanche, des modifications de la VE-cadhérine, comme par exemple sa phosphorylation, provoquent son internalisation, la dissociation des complexes adhésifs ou la désorganisation générale des jonctions endothéliales, défavorisant ainsi la sélectivité de la barrière. De manière générale, une perméabilité vasculaire élevée peut être observée au cours de l’activation de l’endothélium, telle que l’angiogenèse ou la réponse inflammatoire, en conditions physiologiques comme pathologiques. Par exemple, la phosphorylation de la VE-cadhérine provoquée par le facteur VEGF (vascular growth endothelial facteur) entraîne l’augmentation de la perméabilité vasculaire. En outre, une molécule pro-inflammatoire telle que l’interleukine-8 (IL-8) peut également provoquer la phosphorylation de la VE-cadhérine, aboutissant ainsi à l’augmentation de la perméabilité vasculaire. Tandis que les voies de signalisation régissant les effets pro-angiogéniques ou pro-inflammatoires du VEGF et de l’IL-8, respectivement, sont bien caractérisées, les mécanismes moléculaires sous-tendant spécifiquement l’augmentation de perméabilité endothéliale sont moins bien connus. Au cours de mon doctorat, je me suis donc attachée à examiner les interactions moléculaires entre la VE-cadhérine phosphorylée et la molécule d’échafaudage β-arrestine1, dans les cellules endothéliales humaines exposées au VEGF. J’ai également exploré la distribution de la VE-cadhérine dans les cellules endothéliales cérébrales dans un contexte tumoral, récapitulé par le sécrétome de cellules gliomateuses (GB). Mon travail a permis d’identifier la partie C-terminale (C-tail) de la β-arrestine1 qui comporte 43 acides aminés, comme une région interagissant directement avec la VE-cadhérine lorsqu’elle est phosphorylée sur le résidu S665. Cette liaison pourrait conduire alors à l’internalisation de la VE-cadhérine, lors de la stimulation par le VEGF. En outre, nous avons démontré le rôle inattendu du domaine C-tail de la β-arrestine1 dans la régulation négative de l’activité du promoteur de la VE-cadhérine. Ceci se traduit par une réduction des niveaux d’expression de la VE-cadhérine, contribuant ainsi à l’affaiblissement de la barrière endothéliale en réponse au VEGF. En outre, nous avons voulu évaluer l’effet des différents facteurs secrétés par le GB sur la perméabilité vasculaire. L’étude du sécrétome du GB a révélé une production abondante et majoritaire d’IL-8, qui provoque l’internalisation de la VE-cadhérine et la désorganisation des jonctions endothéliales. En plus de son action sur la perméabilité, l’IL-8 favorise la tubulogenèse des cellules endothéliales cérébrales. En conclusion, nous avons mis en évidence un rôle nouveau de la β-arrestine1 dans la régulation de la VE-cadhérine dans les cellules endothéliales humaines. Nous avons également démontré que la sécrétion d’IL-8 par le GB entraîne le remodelage des jonctions de la VE-cadhérine et conduit à une perte de la fonction de barrière des cellules endothéliales cérébrales. L’ensemble de nos résultats a donc permis d’améliorer nos connaissances des mécanismes moléculaires modulant la perméabilité endothéliale. / VE-cadherin is a major adhesion molecule composing endothelial adherens junctions (AJ), which ensure selectivity of the endothelial barrier. Stabilization of the VE-cadherin complex at the surface of endothelial cells plays a pivotal role in the maintenance of vascular homeostasis. Conversely, the disorganization or internalisation of VE-cadherin is a frequent consequence of VE-cadherin modifications (e.g phosphorylation), which promotes in turn vascular permeability. In general, vascular leakage can be observed in both physiological and pathological conditions. Indeed, VE-cadherin phosphorylation caused by pro-angiogenic and pro-permeability factors, among which vascular endothelial growth factor (VEGF) is the prototype, occurs during physiological angiogenesis, as well as tumour-associated angiogenesis. Besides, pro-inflammatory molecules, such as interleukin-8 (IL-8) can also participate in the phosphorylation of VE-cadherin and thereby promote vascular permeability. To best characterise VE-cadherin-mediated increase in vascular permeability under physiological VEGF challenge, we notably investigated the molecular interactions between serine (S665) phosphorylated VE-cadherin and the scaffolding molecule β-arrestin. We also studied the distribution of VE-cadherin in brain endothelial cells under pathological conditions, as provided by the secretome of glioblastoma (GB) brain tumour cells. My work allows the identification of a 43 amino-acid sequence within the C-terminus tail of β-arrestin1 (C-tail) that can directly bind to (S665) phosphorylated VE-cadherin and further triggers its internalisation upon VEGF stimulation. Moreover, we demonstrated the unexpected role of β-arrestin1 C-tail in the down-regulation of the VE-cadherin promoter activity, which results in reduction of VE-cadherin RNA and protein levels, thus contributing to the endothelial barrier properties. Furthermore, in order to evaluate the effects of tumour-secreted factors on the hyper-permeability associated with the tumour microenvironment, we explored the composition and function of the GB secretome on brain endothelial cells. We found that abundant secretion of IL-8 by GB cells causes VE-cadherin-mediated endothelial junction disorganization. Moreover, IL-8 promotes both brain endothelial cell permeability and tubulogenesis. In conclusion, we established a new role for β-arrestin1 in the control of VE-cadherin-based junctions in human endothelial cells. Likewise, we demonstrated that tumour cell-released IL-8 chemokine provokes VE-cadherin-dependent junction remodelling and thereby increases the permeability of human brain endothelial cells. Our results reinforce the central role of VE-cadherin in the modulation of the vascular barrier function in physiological and pathological conditions.

Les décès attribués à un choc septique à la suite d’une infection sévère augmentent chez les diabétiques et surviennent assez fréquemment dans les unités de soins intensifs. Le diabète sucré et le choc septique augmentent la production d’espèces réactives oxygénées et de cytokines pro-inflammatoires, lesquelles activent le facteur de transcription nucléaire Kappa B conduisant à l’induction du récepteur B1 (RB1) des kinines. Le diabète induit par la streptozotocine (STZ) augmente l’expression du RB1 dans divers tissus périphériques, le cerveau et la moelle épinière. Les lipopolysaccharides bactériens (LPS), souvent utilisés pour induire le choc septique, induisent aussi le RB1. L’objectif de ce travail vise à démontrer la contribution du RB1 des kinines dans l’exacerbation du choc septique pendant le diabète. Des rats Sprague-Dawley (225-250 gr) traités à la STZ (65 mg/kg, i.p.) ou le véhicule ont reçu quatre jours plus tard les LPS (2 mg/kg, i.v.) ou le véhicule en présence ou pas d’un antagoniste du RB1 (SSR240612, 10 mg/kg) administré par gavage. La température corporelle a été mesurée pendant 24h après le traitement. Le SSR240612 a aussi été administré à 9h AM et 9h PM et les rats sacrifiés à 9h AM le jour suivant après un jeûne de 16 h. Les effets de ces traitements ont été mesurés sur les taux plasmatiques d’insuline et de glucose, l’œdème et la perméabilité vasculaire (dans divers tissus avec la technique du Bleu d’Evans) ainsi que sur l’expression du RB1 (PCR en temps réel) dans le cœur et le rein. L’augmentation de la température corporelle après traitement au LPS chez les rats traités ou pas à la STZ a été bloquée par le SSR240612. L’antagoniste a normalisé l’hyperglycémie et amélioré la déficience en insuline chez les rats STZ. Le SSR240612 a inhibé l’œdème et réduit la perméabilité vasculaire dans les tissus des rats diabétiques traités ou pas avec les LPS. La surexpression du RB1 chez les rats traités au STZ et/ou LPS était renversée par le SSR240612. Cet antagoniste a prévenu la mortalité causée par les LPS et LPS plus STZ. Les effets anti-pyrétique, anti-inflammatoire et anti-diabétique du SSR240612 suggèrent que le RB1 puisse représenter une cible thérapeutique valable pour le traitement de la co-morbidité associée au choc septique dans le diabète. / Death attributed to septic shock following severe infection increases in diabetic patients and occurs quite frequently in intensive care units. Diabetes mellitus and septic shock increase the production of reactive oxygen species and pro-inflammatory cytokines leading to higher kinin B1 receptor (RB1) expression that is mediated by the activation of the transcriptional nuclear factor Kappa B. Streptozotocin (STZ)-induced diabetes increased the expression of RB1 in rat peripheral tissues, brain and spinal cord. Bacterial lipopolysaccharides (LPS) commonly used to induce septic shock in animal models, also induce RB1. Our objective is to study the contribution of kinin RB1 in the increased morbidity and mortality associated with the combination of these two diseases. Sprague-Dawley rats (225-250g) treated with STZ (65 mg/kg, ip) or vehicle received four days later LPS (2 mg/kg, iv) or vehicle in the presence or absence of the RB1 antagonist, SSR240612 (10 mg/kg), administered by gavage. Body temperature was monitored for 24h after treatment. In addition, SSR240612 was administered twice (9h AM and 9h PM) and rats were sacrificed the following morning at 9h AM after 16 h of fasting to measure the impact on plasma insulin and glucose, oedema and vascular permeability in various tissues (with the technique of Evans Blue) and on the expression of RB1 (real-time PCR) in heart and kidney. The increase in body temperature caused by treatment with LPS both in STZ-diabetic and non-diabetic rats was blocked by SSR240612. The antagonist normalized hyperglycaemia and improved insulin deficiency in STZ rats. SSR240612 inhibited oedema and reduced vascular permeability in all tissues from diabetic rats treated or not with LPS. The overexpression of RB1 induced by LPS and STZ was blocked by SSR240612. Pharmacological blockade of B1R with SSR240612 prevented the mortality induced by LPS and STZ plus LPS. Thus the anti-pyretic, anti-inflammatory and anti-diabetic effects of SSR240612 suggest that kinin RB1 is a promising therapeutic target for the treatment of co-morbidity associated with septic shock in diabetes.

La rétinopathie diabétique est associée à plusieurs changements pathologiques du lit vasculaire rétinien, incluant l’ouverture de la barrière hémato-rétinienne, l’inflammation vasculaire et la modification du débit sanguin. Récemment, il a été proposé que le récepteur B1 des kinines, qui est surexprimé dans la rétine diabétique, puisse être impliqué dans le développement de ces altérations vasculaires. Ainsi, cette thèse présente les effets de traitements pharmacologiques avec des antagonistes du récepteur B1 sur la perfusion rétinienne, la perméabilité vasculaire, l’infiltration des leucocytes (leucostasie), l’expression de médiateurs de l’inflammation et la production d’anion superoxyde dans la rétine du rat rendu diabétique avec la streptozotocine (STZ). Les résultats obtenus montrent que l’application oculaire (10 µl d’une solution à 1%, deux fois par jour pendant 7 jours) de LF22-0542, un antagoniste hydrosoluble du récepteur B1, bloque significativement l’hyperperméabilité vasculaire, la leucostasie, le stress oxydatif et l’expression génique de médiateurs de l’inflammation (B1R, iNOS, COX-2, VEGF-R2, IL-1β et HIF-1α) dans la rétine chez le rat à 2 semaines de diabète. L’administration orale (3 mg/kg) d’un antagoniste non-peptidique et sélectif pour le récepteur B1, le SSR240612, entraîne une diminution du débit sanguin rétinien 4 jours après l’induction du diabète mais n’a aucun effet sur la réduction de la perfusion rétinienne à 6 semaines. Le récepteur B1 joue donc un rôle protecteur au tout début du diabète en assurant le maintien d’un débit sanguin normal dans la rétine; un effet qui n’est toutefois pas maintenu pendant la progression du diabète. Ces données présentent ainsi la dualité du récepteur B1 avec des effets à la fois protecteurs et délétères. Elles suggèrent aussi un rôle important pour le récepteur B1 dans l’inflammation rétinienne et le développement des altérations vasculaires. Le récepteur B1 pourrait donc représenter une nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la rétinopathie diabétique. / Diabetic retinopathy is associated with retinal vascular changes, including blood retinal barrier breakdown, vascular inflammation and blood flow alterations. It has been proposed that kinin B1 receptor, which is upregulated in the diabetic retina, could be involved in the development of these pathological features of diabetic retinopathy. In a rat model of diabetes induced by Streptozotocin (STZ), the effects of kinin B1 receptor antagonists on retinal perfusion, vascular permeability, leukostasis, gene expression of inflammatory mediators and production of superoxide anion in the retina were evaluated. The results show that in 2-week diabetic rats, topical ocular application of the water soluble kinin B1 receptor antagonist LF22-0542 (10 µl of 1% solution, twice per day) for a 7-day period reverses vascular hyperpermeability, leukostasis, oxidative stress and gene expression of inflammatory mediators (B1R, iNOS, COX-2, VEGF-R2, IL-1β and HIF-1α) in the retina. Single oral administration (3 mg/kg) of SSR240612, a selective non-peptide B1 receptor antagonist, induces a decrease of retinal blood flow in 4-day diabetic rats but has no effect on retinal blood flow reduction present at 6 weeks of diabetes. Therefore, B1 receptor has a protective role in early diabetes by preserving a normal blood flow in the retina. These data suggest that B1 receptor exerts protective and adverse effects in the diabetic retina. They also support a key role for B1 receptor in retinal inflammation and the development of vascular alterations. B1 receptor could therefore represent a promising therapeutic target for the treatment of diabetic retinopathy.

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