170 f. / Submitted by Cynthia Nascimento (cyngabe@ufba.br) on 2013-02-27T13:14:01Z No. of bitstreams: 1 Paula Bacelar Leite.pdf: 1832443 bytes, checksum: 9905ca3e73155cecd6489273fc00880a (MD5) / Approved for entry into archive by Alda Lima da Silva(sivalda@ufba.br) on 2013-03-01T17:56:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Paula Bacelar Leite.pdf: 1832443 bytes, checksum: 9905ca3e73155cecd6489273fc00880a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-01T17:56:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula Bacelar Leite.pdf: 1832443 bytes, checksum: 9905ca3e73155cecd6489273fc00880a (MD5) / FAPESB / A partir de 1989, com o primeiro relato, na região cacaueira baiana do fungo Moniliophthora perniciosa, causador da doença vassoura-de-bruxa, iniciou-se nessa região um processo de empobrecimento provocado pela redução de até 100% da produção de cacau, em diversas propriedades rurais. A vassoura de bruxa representa uma das mais importantes doenças do cacaueiro por sua grande capacidade destrutiva e pela grande velocidade com a qual se espalha. A planta do cacau é uma espécie nativa da floresta tropical úmida americana, provavelmente originária das bacias do Amazonas e Orinoco. É uma árvore que desenvolve em clima quente e úmido numa faixa geográfica compreendida entre os paralelos 20ºN e 20ºS. Entre os esforços encontrados no controle da vassoura de bruxa destacam-se as pesquisas sobre novas variedades de cacau resistentes, produtivas e que originem matérias primas de qualidade industrial. O chocolate é o produto obtido a partir da mistura de derivados de cacau (Theobroma cacao L.), massa (ou pasta ou liquor) de cacau, cacau em pó e ou manteiga de cacau, com outros ingredientes, contendo, no mínimo, 25 % (g/100 g) de sólidos totais de cacau. A qualidade do chocolate é avaliada por meio de suas características químicas, físicas, físico-químicas e sensoriais. Com o objetivo de colaborar com o Programa Brasileiro de Melhoramento Genético foram caracterizadas amostras de cacau monitoradas durante o processo de fermentação e secagem das variedades resistentes à vassoura de bruxa denominadas SR162 e PH16 e uma amostra susceptível a doença denominado de cacau convencional. Foram processadas e caracterizadas as massa de cacau, manteiga de cacau e os chocolates quanto à composição físico-química e química, assim como a avaliação física através do estudo da estrutura dos chocolates e a avaliação sensorial através do teste de aceitação e análise descritiva quantitativa (ADQ®). Os resultados das análises físico-químicas realizadas mostraram que independente da resistência ou não à vassoura de bruxa as variedades estudadas apresentam características próprias. Entre as amostras dos materiais em estudo, não foram identificadas diferenças significativas nas análises de pontos de fusão e na composição de ácidos graxos. As análises colorimétricas mostraram que cada chocolate produzido possui uma cor específica, o que foi confirmado pelos provadores treinados na avaliação sensorial. No estudo das estruturas dos chocolates o menor conteúdo de gordura e o maior tamanho de partículas, encontrados na amostra da variedade PH16, levaram a um maior valor de tensão inicial e maior área de histerese. Para a viscosidade a variação da gordura e o tamanho das partículas não são interferentes. Na Análise Descritiva Quantitativa® realizada, as amostras de chocolates apresentaram diferenças significativas entre si (p<0,05), com referência aos termos descritores. No teste de aceitação os consumidores avaliaram os chocolates com notas que variaram de gostei muito a gostei moderadamente. Através das analises realizadas, verificou-se que as amostras de cacau resistentes à vassoura de bruxa, SR162 e PH16, e o cacau convencional apresentaram características particulares. / Universidade Federal da Bahia.Faculdade de Farmácia. Salvador-Ba, 2012.

Resumo: Vassoura-de-bruxa e podridão de Moniliophthora, causadas pelos fungos Crinipellis perniciosa e Moniliophthora roreri, respectivamente, são as doenças de maior impacto econômico da cultura do cacau e estão presentes na maioria dos países produtores do Continente Americano. Evidências biológicas e moleculares comprovam que estes fitopatógenos estão intimamente relacionados. O uso de resistência genética através de dones resistentes de cacaueiro, é a medida mais eficiente no controle destas doenças. O conhecimento sobre as populações destes fungos é importante na geração de informações para o programa de melhoramento genético do cacau visando resistência. Marcadores moleculares RAPO e SSR foram usados para analisar a estrutura genética de populações destes fitopatógenos. No geral, as populações do Brasil, Equador, Peru e Trinidad agruparam-se de acordo com o país de origem, apresentando maior variabilidade dentro e não entre países, com presença de subpopulações. A população do Brasil apresentou maior diversidade genotípica em comparação com as demais. A transferibilidade de pares de primers SSR de C. perniciosa para M. roreri foi satisfatório. Populações de M. roreri do Equador e Peru apresentaram alta diferenciação genética interpopulacional, sendo que a do Peru apresentou maior variabilidade. / Abstract: Witches' broom and fresty pod hot, caused by Crinipellis perniciosa and Moniliophthora roreri, are the most important disease of cacao in the American Continent. Biological and molecular data have shown that these pathogen are closely related. Resistance is the most efficient method to control these diseases. Therefore, information about the population structure of these cacao pathogen are important to support the breeding programo Molecular markers such as RAPD and SSR were used to analyzed the genetic structure of C. perniciosa and M. roreri frem the American Continent. Populations of C. perniciosa clustered according to their country of origin, with more variability within than between countries, revealing the presence of subpopulations. C. perniciosa Brazilian populations presented higher genotypic diversity than C. perniciosa from other countries. The transferability of C. perniciosa-SSR to M. roreri was positive. On the contrary, high interpopulation variability was observed between Ecuador and Peru, being M. roreri from Peru much more diverse than Ecuador. / Orientador: Carlos Ruggiero / Coorientador: Karina Peres Gramacho / Banca: João Carlos de Oliveira / Banca: Antonio de Goes / Banca: Maria Lúcia Carneiro Vieira / Banca: João Alexio Scarpare Filho / Doutor

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Júlio Cézar de Mattos Cascardo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:26:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AnaCristinaCaribedos_D.pdf: 6201793 bytes, checksum: ec32c93bb2e8f1111e029a6a82d77abd (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O fungo Moniliophthora perniciosa, agente causal da doença "vassoura-de-bruxa" (VB) do cacaueiro (Theobroma cacao L.) é responsável pela diminuição da produção de cacau no Brasil e em outras regiões da América do Sul e Central. Esse decréscimo está diretamente associado a graves problemas sociais e ambientais, particularmente nas regiões amazônica e Sul da Bahia. A interação cacau-M. perniciosa envolve mecanismos genéticos complexos e pouco estudados em nível molecular. Portanto, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia de silenciamento gênico por RNA de interferência (RNAi) em M. perniciosa, visando análises funcionais de genes relacionados à sua patogenicidade. RNAi é uma eficiente ferramenta para reprimir a expressão gênica experimentalmente, portanto, uma alternativa tecnológica muito promissora. Devido ao fato de RNAi ser um mecanismo pós-transcricional que promove o silenciamento de genes com alta especificidade e de modo sistêmico é considerado uma ferramenta versátil para o estudo de fungos filamentosos heterocarióticos. O trabalho foi conduzido em três etapas integradas: 1) estabelecimento e avaliação das condições adequadas para eletroporação e regeneração de protoplastos de M. perniciosa, como método alternativo para a transfecção de DNA e de dsRNAs nos experimentos de transformação e de silenciamento do fungo, respectivamente; 2) produção de uma linhagem transgênica de M. perniciosa que expresse o gene heterólogo gfp e o estabelecimento da metodologia de silenciamento por RNAi, usando o gene gfp como modelo; 3) silenciamento mediado por dsRNAs de dois genes endógenos de M. perniciosa, vinculados a detoxificação de ROS e a produção de corpos de frutificação. Os parâmetros que promoveram a maior freqüência de regeneração dos protoplastos eletroporados foram a aplicação de um pulso de 1.5 kV. Em relação à transformação de M. perniciosa, o gene repórter gfp foi estavelmente introduzido no genoma do fungo e posteriormente silenciado por transfecção de gfpdsRNA sintetizado in vitro, comprovando a operacionalidade do mecanismo de RNAi em M. perniciosa. Em adição, os genes endógenos MpPRX1 e MpHYD que codificam para peroxiredoxina e hidrofobina, respectivamente, foram silenciados, usando dsRNAs específicos e apresentaram níveis reduzidos de mRNAs que variaram de 18% a 98% quando comparados aos controles. O silenciamento dos genes gfp e MpPRX1 foi corroborado pela redução da fluorescência de GFP e da atividade da peroxidase, bem como da sobrevivência do micélio submetido a H2O2, respectivamente. O silenciamento de gfp e de MpPRX1 persistiu por aproximadamente quatro meses, indicando silenciamento sistêmico. O estabelecimento da técnica de silenciamento gênico por RNAi em M. perniciosa abre novos caminhos para explorar funcionalmente o genoma deste fitopatógeno, bem como o desenvolvimento de mecanismos que bloqueiem ou diminuam a ação deste / Abstract: The fungus Moniliophthora perniciosa, causal agent of cacao (Theobroma cacao L.) witches' broom (WB) disease, is responsible for the decrease in cacao production in Brazil and other regions of South and Central America. This decrease is directly associated to severe social and ecological problems, particularly in the Amazon and Southern Bahia regions. The cacao-M. perniciosa interaction involves complex genetic mechanisms little studied at the molecular level. Therefore, this study aimed to establish a methodology of gene silencing by RNA interference (RNAi) in M. perniciosa, aiming functional analyses of genes related to his pathogenicity. RNAi is a powerful tool to experimentally suppress or regulate gene expression, therefore, a very promising technological alternative. Because RNAi is a post-transcriptional event that promotes gene silencing with high specificity and in a systemic way, it is considered a versatile tool for the study of heterokaryotic fungi. The work was conducted in three integrated steps: 1) establishment and evaluation of appropriate conditions for electroporation and regeneration of M. perniciosa protoplasts, as an alternative method for transfection of transgenic DNA and dsRNAs in transformation and fungus silencing experiments, respectively; 2) production of a transgenic strain of M. perniciosa that expresses the heterologous gene gfp and the establishment of methodology for silencing by RNAi, using the gfp gene as a model; 3) silencing mediated by dsRNAs of two endogenous M. perniciosa genes linked to detoxification of ROS and the production of fruiting bodies. The parameters that promoted the highest frequency of regeneration of electroporated protoplasts were the application of one pulse of 1.5 kV. Regarding M. perniciosa transformation, the gfp reporter gene was stably inserted into the genome of the fungus and subsequently silenced by transfection of gfpdsRNA synthesized in vitro, demonstrating the operationality of the RNAi mechanism in M. perniciosa. In addition, the endogenous genes MpPRX1 and MpHYD, coding for peroxiredoxin and hydrophobin, respectively, were silenced using specific dsRNAs showing reduced levels of mRNAs ranging from 18% to 98% when compared to controls. Silencing of gfp and MpPRX1 was validated by experiments that showed correlation between reduced levels of GFP fluorescence and peroxidase activity, as well as survival of mycelium subjected to H2O2, respectively. The silencing of gfp and MpPRX1 persisted for approximately four months, indicating systemic silencing. The establishment of the gene silencing technique by RNAi in M. perniciosa opens new paths to functionally explore the genome of this pathogen and the development of mechanisms that block or decrease his action / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo A. Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:53:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cabrera_OdalysGarcia_D.pdf: 6336814 bytes, checksum: 10a8f8e8b80239f363cbb4eda5d2746e (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A doença Vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao) é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa e atualmente constitui um dos maiores problemas fitopatológicos do Brasil. Análises do genoma de M. perniciosa permitiram identificar três genes codificadores para proteínas indutoras de necrose e etileno (NEPs) descritas em oomicetos, bactérias e alguns fungos ascomicetos. Os genes codificadores das proteínas NEP de M. perniciosa (MpNEPs) parecem estar localizados no mesmo cromossomo e foram nomeados 1 e 2 (o terceiro gene está incompleto) segundo a descoberta no genoma (1) ou em uma biblioteca de cDNA de interação M. perniciosa-cacaueiro (2). Os genes codificadores para estas proteínas foram clonados, e expressos usando um sistema de expressão heterólogo em E. coli produzindo proteínas de fusão a cauda de histidinas. As proteínas recombinantes foram purificadas usando colunas de afinidade a metais. MpNEP1 e MpNEP2 apresentam alta similaridade em sua seqüência de aminoácidos e são capazes de induzir necrose e síntese de etileno tanto em folhas de tabaco quanto em cacau. Ambas as MpNEPs apresentam perfis de expressão diferencial nas fases de vida do fungo: MpNEP1 é expressa de forma similar nas fases biotrófica e saprofítica enquanto que MpNEP2 é mais expressa na fase biotrófica. Importantes diferenças no comportamento físico das proteínas foram detectadas: MpNEP1 se comporta como um agregado (dímero ou trímero) em solução e é sensível a tratamento térmico enquanto que MpNEP2 se comporta como monômero e mantém a atividade de necrose depois de submetida a altas temperaturas. Estas diferenças sugerem que estas proteínas podem ter funções complementares durante o desenvolvimento da doença. Esta é a primeira vez que se descreve a presença desta família de proteínas em fungos basidiomicetos e seu estudo pode ser de grande importância para a compreensão dos mecanismos da doença Vassoura-de-bruxa / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches¿ broom disease of Theobroma cacao, which constitutes one of the main phytopathological problems of Brazil. An analysis of the M. perniciosa draft genome led to the identification of three putative genes encoding Necrosis and Ethylene inducing Proteins, which have been described in oomycetes, bacteria, and some species of ascomycetous fungi. The NEP proteins of M. perniciosa (MpNEPs) are apparently located on the same chromosome and were named 1 and 2 according to their discovery in the genome (1) or in a cDNA library containing transcripts from the interaction M. perniciosa-cacao (2). The genes codifying MpNEPs were cloned and expressed using a heterologous expression system in E. coli producing recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide. MpNEPs were purified using nickel affinity columns. MpNEP1 and 2 have highly similar amino acid sequences and are able to induce necrosis and ethylene emission in both tobacco and cacao leaves. These MpNEPs showed different expression profiles according to the developmental stage of the fungus: MpNEP1 was expressed in a similar way in the biotrophic and saprotrophic mycelias, while MpNEP2 was preferentially expressed in the biotrophic phase. Furthermore, important differences were also detected in the physical properties of these two proteins. MpNEP1 in solution behaves as an oligomer (dimer or trimer) and is very sensitive to temperature. On the other hand, MpNEP2 in solution behaves as a monomer and is able of rapid renaturation after boiling, thus keeping its necrotic activity. These differences indicate that these highly similar NEPs may have complementary roles during disease development. This is the first report of NEP1-like proteins in basidiomycetes and their study will be of great importance in order to acquire a better understanding of the molecular mechanisms underlying Witches¿ broom disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Mauricio Costa Mondego / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T09:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_M.pdf: 9729318 bytes, checksum: 0c17aa7d5f8dfd63cbc8d23f9259fc83 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Moniliophthora perniciosa é um fitopatógeno de grande importância econômica no Brasil, em especial na região do sul da Bahia, por causar a doença do cacaueiro conhecida como Vassoura de Bruxa. Esse fungo possui um ciclo de vida hemibiotrófico, apresentando duas fases distintas: a primeira biotrófica/parasítica e a segunda saprotrófica/necrotrófica. O banco de dados gerados pelo projeto genoma Vassoura de Bruxa vem sendo estudado com o intuito de desvendar as vias metabólicas utilizadas pelo patógeno na colonização do cacaueiro. Curiosamente, foi verificada a expressão de um gene similar a taumatina pelo fungo. As taumatinas de plantas são expressas durante a resposta hipersensitiva (HR) em interações planta-patógeno, sendo classificadas como PR-5 (pathogenesis related protein). Taumatinas possuem atividade antifúngica e são capazes de clivar ß-glucanas. Uma nova função foi descrita para uma taumatina de trigo: a de inibição de xilanase. Recentemente, as taumatinas vêm sendo estudadas também em nematódeos, artrópodos e fungos. O trabalho aqui descrito visou à clonagem do gene de M. perniciosa similar a taumatinas MpTLP1 e a expressão da proteína recombinante MpTLP1, bem como o estudo da expressão desse gene durante o desenvolvimento de M. perniciosa. Análises de Northern blot mostram que esse gene é induzido quando o fungo é incubado com extrato de cacau e ácido salicílico. Dados de Real time PCR mostram que esse gene é mais expresso na fase biotrófica do fungo. Esses resultados sugerem a participação de MpTLP1 na interação planta-patógeno. MpTLP1 foi expressa em E.coli e renaturada a partir de corpos de inclusão. A proteína renaturada não apresentou atividades antifúngica e ß-glucanolítica. Esses resultados podem ser atribuídos a sua renaturação ineficiente, ou pelas suas diferenças estruturais com relação a outras TLPs com atividade antifúngica e ß-glucanolítica. Algumas características de MpTLP1 podem indicar que essa proteína possa ser um inibidor de xilanase ou de outras enzimas que clivam parede celular. / Abstract: Moniliophthora perniciosa is a phytopatogen that has economical importance in Brazil, particularly in the south of Bahia, because this fungus causes the disease in cacao known as Witches' Broom disease. This fungus is a hemibiotrofic pathogen that has two distinct stages: a biotrophic (or parasitic) and a necrotrophic (or saprotrophic). The database generated by the Witches' Broom genome project has been studied in order to unravel the metabolic pathways used by the pathogen during the colonization of cacao. Curiously, it was detected the expression of a gene similar to thaumatins in M. perniciosa. Plant thaumatins are expressed during hypersensitive responde (HR) in plant pathogen interactions, being classified as PR-5 (pathogenicity related protein class-5). Thaumatins have antifungal and ß-glucanolitic activities. Recently, a new wheat thaumatin-like protein was described as a xylanase inhibitor. Thaumatins from nematodes, arthropods and fungi have also been characterized. This work aimed the cloning of the M. perniciosa thaumatin like-gene MpTLP1, the expression of the recombinant protein MpTLP1, as well as at the characterization of its gene expression during the development of M. perniciosa. Northern blot analysis shows that MpTLP1 expression is induced when the fungus is incubated with cacao extract and salicylic acid. Real time-PCR data show that MpTLP1 is more expressed in the biotrophic stage of the fungus. These results suggest the participation of MpTLP1 in plant-pathogen interaction. MpTLP1 was expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The refolded protein did not have antifungal or ß- glucanolytic activity. These results can be attributed to an inefficient refolding or to structural differences in relation to other TLPs that have antifungal and ß- glucanolytic activity. Some MpTLP1 features may indicate that this protein inhibits xylanases or other enzymes that cleave cell walls. / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReisJunior_Osvaldo_M.pdf: 4891818 bytes, checksum: f9d97822f44db63385219e9c927eaf29 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As tecnologias de sequenciamento de segunda geração geram um grande número de sequências em um curto espaço de tempo e com baixo custo. O sequenciamento em larga escala de cDNA, conhecido como RNA-seq, tem permitido análises precisas de transcriptomas inteiros sem a necessidade de conhecimento prévio sobre sequências genômicas, conforme exigido pela tecnologia de microarranjos. No entanto, existem muitas discussões sobre os métodos utilizados para o alinhamento de reads, identificação de genes diferencialmente expressos e montagem de transcriptomas. Desde 2000, o Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), tem estudado a doença da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), que é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa. Recentemente, 54 bibliotecas RNA-seq da interação planta-patógeno foram sequenciadas pelo nosso grupo, a fim de ajudar na elucidação da complexa biologia da doença. Desta forma, este trabalho tem como objetivo gerar informações sobre o perfil de transcrição do M. perniciosa e do T. cacao durante a doença vassoura-de-bruxa. Os resultados estão divididos em três seções principais, sendo que na primeira apresentamos uma análise de alinhamento e expressão gênica nas condições e tecidos amostrados. Na segunda, analisamos o estágio inicial da doença, conhecido como vassoura-verde, onde através da análise de expressão diferencial identificamos genes relacionados aos mecanismos de interação entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa. Na ultima seção, desenvolvemos uma estratégia para identificar sequências de possíveis RNAs não codificantes longos (lncRNA) e aplicamos esta estratégia no fungo M. perniciosa. De uma maneira geral estes dados apresentam um importante avanço no estudo desta doença e poderão ser utilizados em trabalhos futuro / Abstract: Next-generation sequencing technologies generate large numbers of sequences in a short time and at low cost. The high-throughput sequencing of cDNA, known as RNA-seq, has allowed precise analyses of entire transcriptomes without the need of previous knowledge on genomic sequences, as required by microarrays. However, there are many discussions about the methods used for read alignment, identification of differentially expressed genes and assembly of transcriptomes. Since 2000, the Genomics and Expression Laboratory (LGE), has been studying the Witches' Broom Disease (WBD) of cacao (Theobroma cacao), which is caused by the basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa. Recently, 54 RNA-seq libraries of this plant-pathogen interaction were sequenced by our group in order to help in the elucidation of the complex biology of the disease. Thus, this work aims to generate information about the transcription profile of M. perniciosa and T. cacao during the Witches' Broom Disease (WBD). The results are divided into three main sections, the first is an analysis of alignment and gene expression under the conditions and sampled tissues. In the second section, we analyze the initial stage of the disease, known as green broom, where through differential expression analysis we could identify genes related to mechanisms of interaction between cacao and the fungus M. perniciosa. In the last section, we developed a strategy to identify possible sequences of long noncoding RNAs (lncRNA) and applied this strategy in the fungus M. perniciosa. In general these data present an important advance in the study of this disease and may be used in future work / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:53:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_D.pdf: 3383952 bytes, checksum: e4041edb080f1a645fcbd6eacdc51378 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cultura do cacau é de grande importância econômica em países produtores da semente e produtores de chocolate, e move um mercado que alcança hoje ao redor de U$ 50 bilhões. As doenças fúngicas são um fator importante na redução de produção de cacau. No Brasil, o principal responsável pela perda na produção é o basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença conhecida como vassoura de bruxa, que arrasou a produção brasileira na década de 90. A doença tem como característica a não elicitação de resposta hipersensitiva (HR), o que permite a colonização de tecidos vegetais pelo fungo. HR é uma resposta que desencadeia a indução da expressão de proteínas denominadas PRs (pahtogenesis related), que agem contra patógenos. Entre as PRs encontram-se as PR5, conhecidas como taumatinas. Análise do genoma de M. perniciosa resultou na anotação de 13 genes que codificam proteínas Taumatina- like (MpTLPs). Apesar de serem bem descritas como proteínas antifúngicas em plantas, estudos em fungos basidiomicetos apontam seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação cogumelos. M. perniciosa é a espécie de fungo com o maior número de TLPs descritos até o momento, tendo 6 deles organizados em clusters, indicando eventos de duplicação. Análise filogenética revelou uma maior quantidade de TLPs em basidiomicetos, quando comparado a ascomicetos, indicando sua participação na formação de cogumelos. No geral, MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, onde o galho seco está sujeito a infecção de fungos oportunistas, indicado a contribuição dessas proteínas no combate contra esses fungos, além de poder estar participando no desenvolvimento de sua parede para formação de basidiocarpo e na degradação da parede celular da planta. Além das MpTLPs, análise de transcriptoma revelou um total de 35 MpCSEPs (Proteínas Candidatas a Efetores de Patogenicidade Secretados pelo fungo) com valor de RPKM >50 foram identificadas em plantas de cacau infectadas. Esses genes são expressos preferencialmente na fase inicial da doença (Vassoura verde), onde encontramos o fungo ainda em fase biotrófica. Em geral, esses genes codificam proteínas pequenas e ricas em cisteínas que são características típicas de efetores de virulência (AVRs), podendo ser uma evidência de que esses genes codificam potenciais efetores. Após triagem, 16 desses genes foram escolhidos para a caracterização estrutural. Destes, sete foram clonados para expressão de proteína heteróloga, o que resultou ao final do estudo a cristalização de 2 proteínas (MpCSEP 5 e MpCSEP 14). Os cristais obtidos até o momento foram testados em linha de luz MX1 e MX2, mas não apresentou difração e os processos de refinamento dos cristais deverão ser continuados. As proteínas obtidas nesse estudo poderão ser utilizadas em testes enzimáticos em trabalhos futuros, para sua completa caracterização estrutural e funcional / Abstract: The cocoa cultivation have great economic importance in the seed and chocolate producing countries , moving a market that presently reaches around $50 billion. Fungal diseases are the major factor in reducing cocoa production. In Brazil, the main responsible for the production loss is the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, known as the etiological agent of witches' broom disease , which devastated the Brazilian production in the 90's disease. The disease is characterized by not eliciting a hypersensitive response (HR), which allows the plant tissue colonization by the fungus. HR is a response that triggers the induction of the expression proteins called PRs (pahtogenesis related), which act against pathogens. Among the PRs, PR5 are known as thaumatins. M. perniciosa genome analysis resulted in the annotation of 13 genes encoding proteins Thaumatin - like (MpTLPs). Despite being well described as antifungal proteins in plants, fungi basidiomycetes studies suggest its involvement in cellular remodeling during mushroom formation. M. perniciosa fungal is the species with the highest number of TLPs described so far, with 6 of them organized in clusters, indicating duplication events. Phylogenetic analysis revealed a greater number of TLPs in basidiomycetes when compared to ascomycetes, indicating their involvement in the formation of mushrooms. Overall, MpTLPs are transcribed during the dry broom disease, where the dead branch is subject to opportunistic fungal infection, indicating the contribution of these proteins in the fight against these fungi, and can be participating in the development of your wallpaper for training basidiocarp and in the cell wall degradation of the plant. Besides MpTLPs, transcriptome analysis revealed a total of 35 MpCSEPs (candidate secreted effectors of pathogenicity protein by the fungus) with RPKM value > 50 have been identified in infected cocoa plants. These genes are preferentially expressed in the early phase of the disease (Green Broom), where we found the fungus still in biotrophic phase. In general, these genes encode small and rich in cysteine that are typical characteristics of virulence effector (AVRs) proteins, which can be evidence that these genes encode potential effectors. After screening, 16 of these genes were chosen for structural characterization. Of these, seven were cloned for expression of heterologous protein, resulting at the end of the study the crystallization of 2 proteins (MpCSEP 5 and 14). The crystals obtained so far been tested in MX1 and MX2 light line, but showed no diffraction and processes of crystals refinement should continue. The proteins obtained in this study may be used in enzymatic assays in future work to its full structural and functional characterization / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:59:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fonseca_JosePedro_M.pdf: 497183 bytes, checksum: 992a81544cf97f11b6ecd399a3cf3172 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Transferência horizontal de genes (HGT) pode ser definida como a transmissão de genes entre diferentes grupos taxonômicos no qual o gene incorporado ao genoma do organismo receptor pode ser mantido ao longo de sucessivas gerações pelo sistema reprodutivo tradicional do receptor. HGT é reconhecida como uma das principais forças atuantes na evolução de genomas de procariotos, que têm significantes percentagens adquiridas por esse processo (1.5% a 14.5%).Em eucariotos, entretanto, o papel de HGT começou apenas recentemente a ser avaliado e geralmente é relacionado com algum cenário evolutivo específico como, por exemplo, a relação hospedeiro-patógeno. Espécies de fungos são consideradas especialmente suscetíveis a HGT por seu modo íntimo de associação com hospedeiros. Em vista disso, no presente projeto foi elaborado um protocolo para identificação de potenciais candidatos a HGT no genoma de Crinipellis perniciosa, o fungo causador da vassoura de bruxa nos cacauais. Primeiramente foi criado um banco de dados contendo todas as seqüências putativas de proteínas (ORFs) de fungos disponíveis no banco de dados do NCBI nr (03/2004). Uma montagem-rascunho de seqüências genômicas ¿shotgun¿ de C. perniciosa, num total de 17.000 contigs, foi então comparada, através de BLASTX, com esse banco de ORFs de fungos. Cerca de 5000 contigs de C. perniciosa que apresentaram similaridade com o banco de ORFs de fungos (e-value < e-5) foram eliminados, sendo considerados como contendo genes verticalmente transferidos. As demais 12.000 seqüências foram então comparadas por blastX contra nr, gerando um total de 357 ¿hits¿ com alta similaridade (e-value < e-5) com seqüências não encontradas dentro das seqüências de fungos até então depositadas.Estes 357 contigs foram então analisados pelo algoritmo BLASTP contra o NCBI-nr e destes 43 apresentaram alta similaridade com proteínas ou domínios conservados de organismos evolutivamente distantes a fungos: 16 apresentaram alta similaridade com plantas, 19 com bactérias e outros 09 com vertebrados/invertebrados. Entre os genes putativos mais interessantes destacam-se o gene ¿Thaumatin¿ (THN) e Transposase; cujas ORFs, à exceção de THN estão completas, não tem introns e apresentam sinais de endereçamento celular. Esses genes foram amplificados a partir do DNA genômico e cDNA da fase necrotrófica de C. perniciosa, confirmando assim sua presença no genoma do fungo, sendo inclusive validados através de sequenciamento. Entre os genes candidatos amplificados, Pollen e DAD não apresentaram uma amplificação consistente e análises através de BLASTN contra banco de dados de EST e do genoma do eucalipto indicaram uma possível contaminação. Um gene identificado neste trabalho cujo produto é biologicamente interessante é o gene ¿thaumatin¿ (THN), da família de genes PR-5 (¿pathogenesis-related¿), descrito como uma proteína antifúngica relacionada à patogênese e à resposta sistêmica a patógenos em plantas.Assim, o presente trabalho gerou uma lista de genes candidatos a terem a sua origem pela transferência horizontal e sua análise poderá permitir a compreensão de processos de interação patógeno hospedeiro / Abstract: Horizontal gene transfer (HGT) can be defined as the mobilization and transmission of DNA across species barriers other than through sexual transmission to the offspring (vertical descent). HGT has long been recognized as a major force affecting the evolution of prokaryotes as significant proportions of such genomes have been subjected to horizontal transfer (1.5% to 14.5%). The role of HGT in eukaryotes is still poorly demonstrated and only recently some individual cases have been reported, normally linked to some evolutive scenario such as host-pathogen interaction. It is said that fungal species are especially susceptible to HGT for their close associations with their hosts. This is especially the case for fungi with saprophytic mode of feeding that could somehow facilitate HGT. This is also the case in pathogens that share an intracellular environment with its host. We investigate here the possible role of HGT in the basidiomycete, saprophytic fungi C. perniciosa and its possible consequences to plant-pathogen interactions in the context of putative acquired HGT genes.Given the large number of sequences to examine and the expectation that only a few were horizontally transferred we created a stepwise approach based on genomic comparisons in order to reduce the number of HGT candidates through elimination of spurious HGT candidates.We first created a fungal database containing all fungal sequences available at NCBI at the time of the analysis and all fungal genomes available through the FTP site (NCBI). This fungal dataset was then compared to a draft assembly of C. perniciosa shotgun genomic sequences using BLASTX with an e-value cutoff higher than E>-5. This served to eliminate all sequences with high similarities to fungal sequences that are not considered as being subjected to HGT. Secondly, we made a second round of genomic comparison, this time against the NCBI-nr, containing all protein coding sequences and putative ORFs, through BLASTX with a cutoff BLAST e-value of e<-5. We managed to reduce our sequences from around 17.000 contigs to around 7.000 in the first round of screening and to only 357 contigs after the second round of genomic screening. Those 357 contigs were then examined for putative homologs using BLASTP against NCBI-nr and we selected 43 candidates of HGT showing high similarity to sequences of distantly related organisms, mainly plants and bacteria. We then moved on to perform Phylogenetic and Parametric analysis on those candidates to see if they confirmed HGT. Out of those 43 candidates we found a strong bias between plants and fungi, with 15 HGT candidates being proposed to have been transferred from plants to fungi. Out of those 15 plant candidates we found 6 transposons with high similarities to plants class 1 transposons, suggesting that transposons indeed might play a role in HGT. Two HGT candidates in our list (Transposase and THN) were successfully amplified through PCR and were sequenced. Further analysis suggested the presence of 6 contaminant sequences in the C. perniciosa genome from Eucalyptus through BLASTN scores against EST and eucalyptus databases including the putative genes for Pollen and DAD / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T10:59:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Formighieri_EduardoFernandes_D.pdf: 7946045 bytes, checksum: f2194ed5a131ce1c4510fba4a7bbea5f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O genoma mitocondrial (mtDNA) do fungo Moniliophthora perniciosa foi completamente seqüenciado e contém 109103 pb, com 31% de bases GC, porcentagem menor que a encontrada nas seqüências do genoma nuclear (47%). É o maior genoma mitocondrial de fungos descrito até o momento, e seu tamanho é conseqüência de grande espaço intergênico, que contém diversas ORFs com possibilidade de serem confirmadas como novos genes. Análises computacionais indicam a presença de variação no número de mtDNAs/célula nas diferentes bibliotecas, com tendência significativa de menor número de mtDNAs/célula no grupo de bibliotecas proveniente de culturas submetidas a repetidas repicagens. A maioria dos genes típicos (atp6, atp9, nad1-6, nad4L, cox1-3, cob, sendo a exceção o atp8), todos os rRNAS, tRNAS (foi encontrado pelo menos um para cada aminoácido) e genes das ORFs intrônicas estão orientados no sentido horário. Foram identificados também um gene rps3 e um grupo de ORFs com características semelhantes às dos genes típicos. Surpreendentemente o mtDNA apresenta uma região ocupada por uma estrutura de invertron característica de plasmídeos kalilo-like, integrado de maneira estável ao genoma em todas as variedades do biótipo C, e presente nos demais biótipos testados. Esta seqüência está disponível no GenBank através do número de acesso: AY376688. A outra linha de trabalho foi desenvolvida juntamente com outros bioinformatas do Laboratório de Genômica e Expressão. Foram desenvolvidas ferramentas de mineração e anotação de genes para projetos genoma, sendo os maiores destaques o Gene Projects, que permite mineração e anotação de genes durante o processo de seqüenciamento, e a nova interface de anotação, desenvolvida para otimizar a qualidade e a eficiência da anotação de genes / Abstract: The mitochondrial genome (mtDNA) of the fungus Moniliophthora perniciosa was completely sequenced and it contains 109103 bases pair, with 31% of bases GC, smaller percentage than found in the sequences of the nuclear genome (47%). It is the largest mitochondrial genome of fungus described to the moment, and its size is consequence of great intergenic space, with several ORFs who can be confirmed as new genes. Computational analyses show the presence of variation in the number of mtDNAs / cell in different libraries, with significant tendency of smaller mtDNAs / cell number in group of libraries originating from cultures undergoes to repeatedly reply. Most of the typical genes (atp6, atp9, nad1-6, nad4L, cox1-3, cob, being the exception the atp8), all of the rRNAS, tRNAS (it was found at least one for each amino acid) and genes of the intronic ORFs are guided in the hourly sense. Surprisingly the mtDNA presents one region occupied for a structure of invertron, characteristic of plasmids kalilo-like, integrated in stable way to the genome in all of the varieties of the biotype C, and present in other tested biotypes. This sequence is available in the GenBank through the accession number: AY376688. The other work line was developed together with other bioinformatics of the Genomic and Expression Laboratory. Data mining and annotation of genes tools were developed for projects genome, being the largest prominences the Gene Projects, that allows mining and annotation of genes during the sequencing process, and the new annotation interface, developed to optimize the quality and the efficiency of the annotation of genes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25Bitstream added on 2014-06-13T20:04:39Z : No. of bitstreams: 1 simoes_mlg_dr_rcla.pdf: 7383499 bytes, checksum: 3bdb988e95e0edaf3bc9450a229443f5 (MD5) / Diferentes isolados de Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum, e T. viride) e um isolado de T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum foram estudados para uso no biocontrole de quatro subgrupos genéticos de Moniliophthora perniciosa, designados como Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. A associação das características dos isolados de Trichoderma avaliados quanto à velocidade de crescimento micelial, germinação, produção de esporos e produtividade massal de esporos em arroz, além das suas capacidades de antibiose e micoparasitismo a cada subgrupo do patógeno, resultou na determinação do índice denominado Potencial para uso no biocontrole (%PCB) a cada subgrupo de M. perniciosa. Os %PCBs variaram, demonstrando haver variabilidade genética entre os isolados do antagonista quanto às características avaliadas, como também nos níveis de resistência do patógeno. T. harzianum 911 apresentou o melhor %PCB para todos os subgrupos de M. perniciosa, sendo o pior apresentado por T. reesei 1612. Mp1445 foi o subgrupo que apresentou a menor capacidade de supressão aos antagonistas, sendo a maior apresentada por Mp1916. T. harzianum 906 inibiu o crescimento de Mp1916 por metabólitos não voláteis e todos os isolados de Trichoderma avaliados inibiram todos os subgrupos do patógeno pela ação de metabólitos voláteis, variando, porém, os percentuais de inibição entre as espécies e entre isolados da mesma espécie. Mp1445 inibiu o crescimento de T. virens 2007 por metabólitos não voláteis, sendo comprovada, portanto, a possibilidade do patógeno inibir o antagonista. T. harzianum 911 apresentou capacidade de micoparasitismo em placa e em vassouras infectadas individualmente pelos subgrupos do patógeno, além de produzir as enzimas β-1,3-glucanase, quitinase, protease, FPase, CMCase e amilase, tanto em substratos específicos como em cultivos... / Different isolates of Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum and T. viride) and one isolate of T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum were studied for their usage in biocontrol of four genetic subgroups of Moniliophthora perniciosa named as Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. The association of the characteristics of the Trichoderma isolates evaluated regarding to velocity of mycelial growth, germination, spores production in Petri dish and mass production of spores in rice, besides their capacities of antibiosis and mycoparasitism to each subgroup of the pathogen, resulted in the determination of the index named Potential to be used in Biocontrol (%PCB) to each subgroup of M. perniciosa. The %PCBs varied, pointing out that there is a genetic variability among the antagonistic isolates regarding to the evaluated characteristics, as well as the levels of the pathogen resistance. T. harzianum 911 showed the best %PCB for all subgroups of M. perniciosa, being the worst presented by T. reesei 1612. Mp1445 was the subgroup that presented the lowest antagonistic suppression capacity, being the highest presented by Mp1916. T. harzianum 906 inhibited the growth of Mp1916 by non-volatile metabolites and all the evaluated isolates of Thrichoderma inhibited all the subgroups through volatile metabolites, varying, although, the percentages of inhibition among the species and among the isolates of the same species. Mp1445 inhibited the growth of T. virens 2007 by non-volatile metabolites, being proved, therefore, the possibility of the pathogen to inhibit the antagonist. T. harzianum 911 presented the mycoparasitism capacity in Petri dishes and in brooms infected indiviadually by the pathogen, besides the production of β-1,3-glucanase, chitinase, protease, FPase, CMCase and amilase, in both specific substrates and in cultivations with dried mycelia... (Complete abstract click electronic access below)