Orientador: Lucilene Delazari dos Santos / Resumo: O uso de animais de grande porte como sorodoadores tem se mostrado de grande importância para a produção do selante de fibrina do Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP). O objetivo deste trabalho foi certificar um plantel de bubalinos, realizar uma investigação sobre os potenciais candidatos à biomarcadores de brucelose em soro de búfalos e evidenciar o isolamento e a quantificação pioneira de exossomos (EVs) do soro de bubalinos com theileriose e babesiose. Realizaram-se os seguintes testes sorológicos: brucelose (BRU), leptospirose (LEP), febre aftosa (FMD), rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR), diarréia viral bovina (BVD), varíola bovina (Pox) e tuberculose, língua azul (BTV), estomatite vesicular (EV) - sorotipos cocal (COCV) e alagoano (VSAV), leucose bovina (BLV), neospora (NC), toxoplasmose (TX) e testes bioquímicos laboratoriais. Todas as amostras de soro foram submetidas ao diagnóstico sorológico para detecção de brucelose, diagnóstico de reação em cadeia da polimerase para detecção de theileriose e babesiose, cromatografia líquida de afinidade, isolamento de exossomos, digestão de proteínas em solução, análise de espectrometria de massa e ferramentas de bioinformátca. Observamos um enriquecimento de 90,5% de proteínas nos soros de búfalos após este protocolo de depleção. A análise MS/MS evidenciou que as principais diferenças no proteoma dos animais com brucelose. No que se refere ao exossosmos isolados e quantififcados neste trabalho, nossa met... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of large animals as sorbozers has been shown to be of great importance for the production of fibrin sealant from the Center for the Study of Venoms and Poisonous Animals (CEVAP). The objective of this work was to certify a flock of buffaloes, to conduct an investigation of the potential candidates for brucellosis biomarkers in buffalo serum and to evidence the isolation and the pioneer quantification of buffalo serum exosomes (EVs) with theileriose and babesiosis. The following serological tests were carried out: brucellosis (BRU), leptospirosis (LEP), foot-and-mouth disease (FMD), infectious bovine rhinotracheitis (IBR), bovine viral diarrhea (BVD), bovine pox (Pox) and tuberculosis, blue tongue (BTV), vesicular stomatitis (EV) - cocal (COCV) and alagoan (VSAV) serotypes, bovine leukosis (BLV), neospora (NC), toxoplasmosis (TX) and laboratory biochemical tests. All serum samples were submitted: 1) serological test; 2) Polymerase chain reaction; 3) Depletion; 4) Isolation of exosomes; 5) Mass spectrometry and 6) Analysis and interpretation of the data. The MS / MS analysis showed that the major differences in the proteome of animals with brucellosis. Regarding the isolated and quantified exosmos in this work, our methodology is strongly encouraged for the isolation and characterization of EVs in Apicomplexa infections in farm animals. We conclude that this study on different fronts such as management, infectious diseases and parasitic diseases can be used in small pro... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O sucesso no desenvolvimento de tumores não dependente somente de mutações, mas também é influenciado pelo microambiente do tumor; nele ocorre a interação entre as células tumorais e o estroma. Essa interação pode ser mediada por vesículas liberadas por essas células para o meio extracelular. Essas vesículas atuam na comunicação celular que pode influenciar a progressão tumoral. O objetivo deste estudo foi analisar as interações mediadas por vesículas entre células tumorais e fibroblastos normais. As células tumorais foram plaqueadas sobre a monocamada de fibroblastos e carregadas com diferentes corantes vitais. Nossos resultados evidenciaram a presença e a troca de vesículas entre as células em co-cultura. Vesículas isoladas mostraram tamanhos heterogêneos. Células tumorais possuem mais vesículas que as células normais. As vesículas são compostas pelas proteínas AHNAK e Anexinas. AHNAK foi detectada em vesículas trocadas e estava aumentada em tumores. AHNAK é molécula estrutural das vesículas extracelulares que pode influenciar a biologia dos tumores de mama. / The successful development of tumors is not only dependent on cell mutations, but also driven by the tissue microenvironment; relies on interaction of cells and their surrounding stroma. Some cell types release vesicular structures into the extracellular space that would be involved in cellular communication and tumor progression. The aim of this study was to analyze vesicle-mediated interactions between tumor cells and normal fibroblasts. Tumor cells were plated above fibroblasts monolayer and both loaded with different vital dyes. Our results evidenciated presence and exchange of vesicles between breast tumor cells and fibroblasts in co-culture. Vesicles isolated showed heterogeneous sizes. Tumor cell showed more vesicles than normal cells. These vesicles were composed of AHNAK and Annexins proteins. The protein AHNAK was detected in exchanged vesicles and was increased in tumors when compared to normal breast tissues. AHNAK could represent a vesicle structural molecule that would influence breast tumor biology.

O Melanoma é um tipo de neoplasia que se origina de melanócitos normalmente presentes na epiderme. Uma das características do melanoma é a capacidade de adquirir resistência a terapias. As células de melanoma podem aumentar a liberação de vesículas extracelulares (VEs) em resposta ao tratamento com quimioterápicos. A cisplatina (CDDP) e a temozolomida (TMZ) são drogas utilizadas para o tratamento de tumores. Ambas as drogas formam adutos no DNA, mas as vias de sinalização que deflagram a morte celular são distintas. O objetivo desse estudo é investigar a morte celular da linhagem B16-F10 na presença de VEs oriundas de células B16-F10 tratadas com cisplatina CDDP ou TMZ. Inicialmente as VEs oriundas de células de melanoma murino, B16-F10, tratadas com CDDP ou TMZ e seus controles, foram isoladas por ultracentrifugações sucessivas. Para os experimentos in vitro, as células foram tratadas com as drogas em combinação com as respectivas VEs. As amostras foram realizados avaliações de ciclo celular e de morte e ensaio clonogênico. Para os experimentos in vivo, as células B16-F10 foram pré-tratadas com VEs, e posteriormente, as células foram inoculadas via subcutânea em camundongos C57BL/6 e os tumores foram mensurados diariamente. Em nosso estudo concluimos que a metodologia do isolamento de VEs é eficiente. Além disso, observamos que o tratamento com CDDP ou TMZ aumenta a liberação de VEs por células tumorais. Apesar do resultado contraditorio, as VEs liberadas por células tumorais tratadas com quimioterápicos aumentam a capacidade de sobrevivência das células de melanoma in vitro. VEs oriundas de células de melanoma não participam inicialmente da sensibilização à morte de células tumorais causada pelas mesmas drogas, mas a longo prazo, as VEs oriundas de células tratadas com a TMZ podem conferir uma resposta celular de sobrevivência às células tumorais in vitro. In vivo, o resultado é inconclusivo, uma vez que para confirmar se as VEs fazem parte da adaptação tumoral conferindo fenômenos de sobrevivência celular in vivo, é necessário avaliar em outros modelos celulares e animais / Melanoma is a neoplasm derived from melanocytes normally present in the skin specifically in the epidermis. One of the malignancies of melanoma is the ability to acquire chemoresistance. Cisplatin (CDDP) and temozolomide (TMZ) are drugs used for the treatment of tumors. Both drugs can form alkylating adducts in DNA, however, the pathways that trigger cell death are distinct. Tumor cells, including melanoma, may increase the release of extracellular vesicles (EVs) in response to chemotherapeutic treatment. The aim of this study is to investigate the cell death phenomenon in B16-F10 cell line in presence of EVs derived from chemotherapeutic-treated B16-F10 cells. For in vitro experiments, the cells were treated with CDDP or TMZ in combination with EVs from chemotherapictreated samples. For in vivo experiments, B16-F10 cells were exposed to EVs and inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. The growth was measured daily. In this work, we established and characterized VEs released by melanoma cells treated with chemotherapics and we established chemotherapics treatments to isolate EVs for next EVs isolation. Our results showed that CDDP or TMZ treatment increase the release of EVs by tumor cells. The EVs released by melanoma cells after CDDP or TMZ treatment seem to increase the survival capacity of melanoma cells. Thus, we concluded that EVs derived from melanoma cells do not participate in the cell death sensitization induced by CDDP or TMZ. However, EVs derived from TMZ treated cells may offer a survival effect to tumor cells in vitro a long term. In vivo, The result is inconclusive since to confirm how VEs are part of the tumor adaptation conferring cellular survival phenomena in vivo, it is necessary to evaluate in other cellular and animal models

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: As vesículas extracelulares (VEs) são formações membranárias heterogêneas de tamanhos submicrométricos, que possuem funções específicas dependentes de sua biogênese. Os Concentrados de hemácias (CH) sofrem inúmeras alterações bioquímicas e morfológicas durante a estocagem comprometendo o meio intracelular e extracelular. O controle de qualidade das unidade de CH avalia essa lesão de estoque das hemácias principalmente a partir da determinação do grau de hemólise através da dosagem de hemoglobina livre. Não se sabe ao certo a quantidade de vesículas extracelulares que um CH pode gerar durante seu armazenamento mas muitos estudos relacionam as VEs com complicações pós-transfusionais. O objetivo deste estudo foi analisar o controle de qualidade de concentrados de hemácias sob o aspecto da identificação de vesículas extracelulares, correlacionando o grau de hemólise e a identificação de VEs em CH de hemácias em diferentes dias de conservação. Métodos: CH foram obtidos de 20 doadores saudáveis, refrigerados armazenados por 35 dias, e avaliados para o perfil de doação de sangue, grau de hemólise e dosagem de VEs por citometria de fluxo nos dias 5, 15, 25 e 35 de armazenamento. Resultados: Não houve diferença estatística significante entre o perfil da doação e as dosagens de grau de hemólise e VEs. O número total de VEs aumentou significativamente com o armazenamento assim como o grau de hemólise, observando maior correlação entre os métodos em D25 (p=0,0002) e D35 (p<0,0001). O tam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane formations of submicrometric sizes, which have specific functions depending on their biogenesis. Red blood cell (RBC) undergo numerous biochemical and morphological changes during storage age compromising the intracellular and extracellular environment. The quality control of these units evaluates this lesion RBCs inventory mainly from the haemolysis determination through the measurement of free haemoglobin. It is unclear how much EVs the RBCs can generate during its storage but many studies related the EVs with post-transfusion complications. The objective of this study was to analyze the RBCs quality control under the aspect of the identification of EVs, correlating the haemolysis and the identification of VEs on different days of conservation. Methods: RBC were obtained from 20 healthy donors, refrigerated and stored for 35 days, and evaluated for blood donation profile, haemolysis and EVs counting by flow cytometry on storage days 5, 15, 25 and 35. Results: There was no statistically significant difference between the donation profile and haemolysis percentual and EVs dosages. The total number of EVs increased significantly with storage as well as the haemolysis, observing a higher correlation between the methods in D25 (p = 0.0002) and D35 (p <0.0001). The size of the VEs was evaluated by the fluorescence intensity that demonstrated VEs < 3μm. The haemolysis proved to be an unreliable parameter, since even in th... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

As células que compõem o tumor podem interagir entre si, através da liberação e incorporação de vesículas extracelulares, muitas vezes contribuindo para a progressão tumoral. Dessa maneira, o presente trabalho teve como objetivo observar se as vesículas extracelulares , como as microvesículas e os exossomas liberados pelas células cancerosas em condições de estresse celular, após quimioterapia e indução de hipóxia conferem alguma vantagem adaptativa às células tumorais. Nossos resultados mostram que vesículas liberadas por células de melanoma humano em hipóxia ou normóxia apresentam tamanho médio característico de exossomos e microvesículas e não modulam os processos de proliferação, morte e migração celular. As vesículas liberadas pelas células após tratamento com o quimioterápico temozolamida também apresentam tamanho característico de exossomos e microvesículas; em adição, o tratamento com a temozolamida induziu um aumento na secreção dessas vesículas pelas células de melanoma. A incubação das células tumorais com vesículas oriundas da terapêutica com a temozolamida aumentou a proliferação celular, conferindo vantagem proliferativa às células de melanoma humano / Tumor cells can interact with each other by releasing and incorporating extracellular vesicles, contributing to tumor progression. Therefore, the aim of this study was to evaluate if extracellular vesicles, such as microvesicles and exossomes, released by cancer cells under cell stress conditions like chemotherapy and hypoxia, induce an adaptive advantage to tumor cells. Our results show that vesicles shed by human melanoma cells under hypoxia, or normoxia exhibit the characteristic size of exossomes and microvesicles and do not modulate cell proliferation, death or migration. The vesicles released by melanoma cells after temozolomide treatment also showed the average size of exossomes and microvesicles; moreover, temozolomide treatment induced an increase in extracellular vesicles shedding by tumor cells. Incubation of tumor cells with vesicles released under temozolamide therapeutics caused an increase in cell proliferation, providing a proliferative advantage to human melanoma cells

O sucesso no desenvolvimento de tumores não dependente somente de mutações, mas também é influenciado pelo microambiente do tumor; nele ocorre a interação entre as células tumorais e o estroma. Essa interação pode ser mediada por vesículas liberadas por essas células para o meio extracelular. Essas vesículas atuam na comunicação celular que pode influenciar a progressão tumoral. O objetivo deste estudo foi analisar as interações mediadas por vesículas entre células tumorais e fibroblastos normais. As células tumorais foram plaqueadas sobre a monocamada de fibroblastos e carregadas com diferentes corantes vitais. Nossos resultados evidenciaram a presença e a troca de vesículas entre as células em co-cultura. Vesículas isoladas mostraram tamanhos heterogêneos. Células tumorais possuem mais vesículas que as células normais. As vesículas são compostas pelas proteínas AHNAK e Anexinas. AHNAK foi detectada em vesículas trocadas e estava aumentada em tumores. AHNAK é molécula estrutural das vesículas extracelulares que pode influenciar a biologia dos tumores de mama. / The successful development of tumors is not only dependent on cell mutations, but also driven by the tissue microenvironment; relies on interaction of cells and their surrounding stroma. Some cell types release vesicular structures into the extracellular space that would be involved in cellular communication and tumor progression. The aim of this study was to analyze vesicle-mediated interactions between tumor cells and normal fibroblasts. Tumor cells were plated above fibroblasts monolayer and both loaded with different vital dyes. Our results evidenciated presence and exchange of vesicles between breast tumor cells and fibroblasts in co-culture. Vesicles isolated showed heterogeneous sizes. Tumor cell showed more vesicles than normal cells. These vesicles were composed of AHNAK and Annexins proteins. The protein AHNAK was detected in exchanged vesicles and was increased in tumors when compared to normal breast tissues. AHNAK could represent a vesicle structural molecule that would influence breast tumor biology.

[ES] El consumo de altas cantidades de etanol durante en un corto período de tiempo, conocido también como consumo en atracón, causa importantes alteraciones en el sistema nervioso central del adolescente, activando la respuesta innata inflamatoria, que puede causar muerte neuronal y alteraciones a nivel estructural y de la conducta. Esta respuesta se produce mediante la activación de los receptores de membrana Toll-like, y específicamente por los receptores TLR4, localizados en células gliales. Cuando dicho receptor se une a su ligando y dimeriza, desencadena una cascada de señalización que finaliza con la translocación al núcleo del factor de transcripción NF-κB, donde se promueve la síntesis y liberación de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias al medio extracelular. Entre los mecanismos que podrían participar en la amplificación de la respuesta neuroinflamatoria se encontrarían un tipo de vesículas extracelulares (VEs), denominadas exosomas. Los exosomas son micropartículas de 30-150 nm de tamaño con un contenido de carácter bioactivo, formado por proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, y que cumplen un papel importante en la comunicación intercelular. Por tanto, la hipótesis que planteamos en esta tesis doctoral es que las VEs ejercen un papel en el mantenimiento y propagación de la neuroinflamación causada por el consumo de alcohol en forma de atracón. Utilizando VEs de cultivos primarios de astrocitos demostramos que el etanol induce una mayor secreción de VEs y altera los niveles de determinadas proteínas y microARNs (miARNs) asociados con la neuroinflamacion. Además, demostramos que cuando las neuronas corticales en cultivo se incuban con VEs procedentes de los astrocitos WT tratados con etanol, se inducen marcadores inflamatorios en las neuronas y presentan mayores niveles de apoptosis. Durante el proceso de biogénesis exosomal, se ha demostrado la participación de una familia de enzimas, llamadas esfingomielinasas, que estarían relacionadas con la biogénesis y secreción de las VEs. Estudios previos de este laboratorio han demostrado que el etanol es capaz de activar las esfingomielinasas, aunque el mecanismo por el cual esto ocurre se desconoce. En este proyecto de tesis proponemos a las membranas asociadas a mitocondrias (MAM) como mecanismo regulador de la secreción de VEs mediada por esfingomielinasas. Mediante el análisis de la actividad de transferencia de fosfolípidos, marcador de actividad de MAM, observamos que el etanol, tanto a nivel tisular como en cultivo, es capaz de activar MAM. Además, demostramos que, inhibiendo la actividad tanto de MAM como de las esfingomielinasas, se revierte el aumento en secreción de VEs causado por el tratamiento con etanol. Estos resultados sugieren que el etanol promueve una mayor liberación de VEs mediante la activación de las enzimas esfingomielinasas a través de MAM. Además, puesto que las VEs tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica (BBB) y tener estabilidad en la circulación, se han considerado como posibles candidatos a biomarcadores de situaciones patológicas. Uno de los elementos presentes en las VEs, que se ha utilizado recientemente como biomarcador en diversos estudios, son los miARNs, moléculas de ARN no codificante de cadena corta implicados en la regulación génica. Se ha descrito que, en pacientes con enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson u otras, se detectan patrones de expresión diferencial de miARNs en las VEs circulantes, en comparación con pacientes control. En este estudio demostramos que el etanol es capaz de alterar los perfiles de miARNs relacionados con la inflamación presentes en VEs circulantes de jóvenes con intoxicación etílica aguda (IEA). Estos efectos presentan diferencias de género, siendo las mujeres/hembras más vulnerables a los efectos del alcohol, ya que la expresión de marcadores inflamatorios en cerebro y en VEs circulantes son más elevadas en mujeres/hembras que en hombres/machos. Estos resultados ponen de manifiesto que las VEs circulantes y sus perfiles de miARNs son posibles candidatos a biomarcadores de la neuroinflamación asociadas con el abuso de alcohol. / [CA] El consum d'elevades quantitats d'alcohol durant un curt període de temps, conegut també com a consum en afartament, causa importants alteracions en el sistema nerviós central de l'adolescent, activant la resposta innata inflamatòria, que pot causar mort neuronal i alteracions a nivell estructural i de conducta. Aquesta resposta es produeix mitjançant l'activació dels receptors de membrana Toll-like, i específicament pels receptors TLR4, localitzats en cèl·lules glials. Quan aquest receptor s'uneix al seu lligant i dimeritza, desencadena una cascada de senyalització que finalitza amb la translocació al nucli del factor de transcripció NF-κB, on es promou la síntesi i alliberament de citoquines i quimioquines pro-inflamatòries al medi extracel·lular. Dins dels mecanismes que podrien participar en l'amplificació de la resposta neuroinflamatòria es trobarien un tipus de vesícules extracel·lulars (VEs), denominades exosomes. Els exosomes són micropartícules de 30-150 nm de grandària amb un contingut de caràcter bioactiu, format per proteïnes, lípids i àcids nucleics, i que compleixen un paper important en la comunicació intercel·lular. Per tant, la hipòtesi que plantegem en aquesta tesi doctoral és que les VEs exerceixen un paper en el manteniment i propagació de la neuroinflamació causada pel consum d'alcohol en forma d'afartament. Utilitzant VEs de cultius primaris d'astròcits demostràrem que l'etanol indueix una major secreció de VEs i una alteració dels nivells de determinades proteïnes i microARNs (miARNs) associats amb la neuroinflamació. A més a més, també observàrem que quan les neurones corticals en cultiu s'incubaben amb VEs procedents dels astròcits WT tractats amb etanol, s'induïen marcadors inflamatoris en les neurones i aquestes presentaven majors nivells d'apoptosi. Durant el procés de biogènesi exosomal, s'ha demostrat la participació d'una família d'enzims, anomenats esfingomielinases, que estarien relacionats amb la biogènesi i secreció de les VEs. Estudis previs d'aquest laboratori han demostrat que l'etanol és capaç d'activar les esfingomielinases, encara que el mecanisme pel qual això passa es desconeix. En aquest projecte de tesi proposem a les membranes associades a mitocòndries (MAM), juntament amb les esfingomielinases com el mecanisme regulador de la secreció de VEs induïda pel consum d'alcohol. Mitjançant l'anàlisi de l'activitat de transferència de fosfolípids, marcador d'activitat de MAM, observàrem que l'etanol, tant a nivell tissular com en cultiu, era capaç d'activar MAM. A més, demostràrem que inhibint l'activitat tant de MAM com de les esfingomielinases, revertiem l'augment en la secreció de VEs causat pel tractament amb etanol. Aquests resultats suggereixen, que l'etanol promou una major alliberament de VEs mitjançant l'activació dels enzims esfingomielinases a través de MAM. A més, ja que les VEs tenen la capacitat de creuar la barrera hematoencefàlica (BBB) i ser estables en circulació, s'han considerat bons candidats a biomarcadors de situacions patològiques. Un dels elements presents en les VEs que s'ha utilitzat recentment com a biomarcador en diversos estudis, són els miARNs, molècules d'ARN no codificant de cadena curta implicats en la regulació gènica. S'ha descrit que, en pacients amb malalties neurodegeneratives, com l'Alzheimer o Parkinson, es detecten patrons d'expressió diferencial de miARNs a les VEs circulants, en comparació amb pacients control. A aquest estudi demostrem que l'etanol és capaç d'alterar els perfils de miARNs relacionats amb la inflamació presents en VEs circulants de joves amb intoxicació etílica aguda (IEA). Aquests efectes presenten diferències de gènere, sent les dones / noies més vulnerables als efectes de l'alcohol, ja que l'expressió de marcadors inflamatoris en cervell i en VEs circulants són més elevades en noies que en nois. / [EN] Heavy alcohol intake during a short period of time, also known as binge drinking, has been proved to produce negative effects on the individual's central nervous system by activating an inflammatory response that can lead to neuronal death and structural and behavioral alterations. This response is produced by glial cells, the main component of the neuroimmune system, through the activation of TLR4, a transmembrane receptor of the TLR family. When TLR4 binds to its ligand and dimerizes, it triggers a signaling cascade that ends up with the translocation of NF-κB to the nucleus, acting as a transcription factor, where it promotes the synthesis and release of pro-inflammatory cytokines and chemokines to the extracellular milieu. Among the mechanisms responsible for the transmission and amplification of this neuroinflammatory response, one candidate could be a kind of extracellular vesicles (VEs) called exosomes. Exosomes are microparticles of 30-150 nm in size, with a bioactive content, composed mostly by proteins, lipids and nucleic acids, which play an important role in intercellular communication. Therefore, the hypothesis of this thesis is that VEs play an important role in the transmission of the neuroinflammatory response caused by ethanol binge drinking. Using VEs from primary cultures of astrocytes, we show that ethanol is able to induce a higher secretion of VEs and alters their composition of inflammatory related protein and microRNAs (miARNs). Furthermore, incubation of these VEs in primary cultures of neurons lead to the development of inflammatory protein and gene markers, and higher apoptosis levels. Exosomal release has been shown to be partly regulated by a family of enzymes called sphingomyelinases, since inhibition of these enzymes resulted in a reduction of secreted VEs. Previous studies from this laboratory have shown that ethanol is able to activate sphingomyelinases, but the mechanism involved in the process is currently unknown. We propose membrane-associated mitochondria (MAM), along with sphingomyelinases, as the responsible for the increased VEs release after ethanol intake. We show that ethanol is capable of increasing phospholipid transfer activity, a marker of MAM activity. Moreover, MAM and sphingomyelinase inhibition resulted in depleted VEs secretion. These results suggest that ethanol promotes increased release of VEs by activating sphingomyelinase enzymes through MAM. VEs display certain biological characteristics, like the ability to cross the blood-brain barrier (BBB) or their high stability in serum, which make them good candidates for biomarkers of pathological situations. One of the elements present in VEs that has recently been used as a biomarker in various studies are miARNs, which are short-chain non-coding RNA molecules involved in gene regulation. It has been described that differential expression patterns of miARNs in circulating VEs can be detected in patients with neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's, Parkinson's or others, when compared to healthy patients. In this study we demonstrate that ethanol is able to alter the inflammatory-related miARNs expression patterns in circulating VEs of young people with acute alcohol intoxication (IEA). Notably, the alterations in miARNs are dependent on the patient's gender, being women/females more affected by alcohol than men/males, since women/females showed lower presence of anti-inflammatory miARNs and a higher expression of inflammatory markers in brain tissue than men/males. / Ibáñez Cabanes, F. (2021). Papel de las vesículas extracelulares en la propagación y mantenimiento de la neuroinflamación inducida por el consumo de alcohol en la adolescencia [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/174214

Em pacientes submetidos à diálise peritoneal (DP), alterações morfofuncionais da membrana peritoneal (MP) ocorrem de forma progressiva ao longo dos anos. Estas alterações caracterizam-se, morfologicamente, por perda da camada mesotelial, inflamação, neoangiogênese e fibrose peritoneal (FP) e, funcionalmente, pela queda na ultrafiltração. Tais alterações implicam diretamente em perda da eficiência dessa terapia renal substitutiva. Até o momento, não existe tratamento específico capaz de prevenir ou reverter esta situação. As células tronco mesenquimais (CTm) têm mostrado efeitos terapêuticos benéficos em doenças associadas à fibrose. A participação das CTm no reparo tecidual está principalmente relacionada à sua atividade parácrina, através da liberação de fatores solúveis e vesículas extracelulares (VE). As VE liberadas são importantes na intercomunicação célula-célula e possivelmente contribuem para o efeito terapêutico das CTm ao entregar seu conteúdo (mRNAs, miRNAs, proteínas) para as células alvo. Assim, o objetivo central do presente estudo foi comparar o possível efeito terapêutico das CTm de tecido adiposo (CTmTA) e de VE derivadas de CTmTA na prevenção da FP experimental em ratos. A FP foi induzida em ratos Wistar machos através de injeções intraperitoneais (IP) de gluconato de clorexidina (GC) a 0,1%, em dias alternados, por um período de 30 dias. As CTmTA utilizadas foram obtidas de tecido adiposo gonadal de rato Wistar, cultivadas e expandidas até a 4ª passagem e caracterizadas de acordo com a sua capacidade de aderência ao plástico, presença de marcadores de superfície e pela diferenciação celular in vitro. As VE derivadas de CTmTA foram isoladas por ultracentrifugação. Os protocolos de isolamento por ultracentrifugação e caracterização por microscopia eletrônica, rastreamento de nanopartículas e quantificação das proteínas totais das VE foram padronizados e estabelecidos no laboratório. Os tratamentos com 2x106 CTmTA ou com 30 ug VE foram administrados por injeções de IP. Os animais do estudo foram divididos em 4 grupos: Grupo Controle (n = 8), animais que receberam apenas injeções IP de solução fisiológica; Grupo FP (n = 9), animais que receberam injeções IP de GC para indução da FP e foram tratados com solução fisiológica; Grupo FP + CTmTA (n = 8), animais que receberam injeções IP de GC para indução da PF e foram tratados com 2x106 CTmTA, no 3º e 10º dias, via IP, e Grupo FP + VE (n = 8), animais que receberam injeções IP de GC para indução da FP e foram tratados com 30 ug de VE, IP no 3º e 10º dias, via IP. Após 30 dias da indução de FP, os animais foram submetidos ao teste de função peritoneal e, em seguida, à eutanásia para coleta de amostras de tecido do peritôneo. As amostras do peritôneo parietal foram direcionadas para análises histológicas, imunohistoquímicas, de imunofluorescência e biologia molecular. No Grupo FP, como esperado, houve um aumento significativo da espessura da MP. Os tratamentos com CTmTA e VE preveniram o espessamento da MP, mantendo a espessura similar à do Grupo Controle. Os tratamentos com CTmTA e VE bloquearam o aumento do número de miofibroblastos, da expressão de fibronectina e de fatores envolvidos na FP (TGF-beta e FSP-1), observados nos animais do Grupo FP. Além disso, a expressão gênica de Smad3, que está associada à ativação de genes pró-fibróticos, estava aumentada no Grupo FP e foi reduzida nos grupos tratados. Por outro lado, a expressão gênica de Smad7, um gene associado à contrarregulação do TGF-beta, estava reduzida no Grupo FP e foi aumentada nos grupos que receberam tratamento. Os tratamentos com CTmTA e VE também apresentaram efeitos anti-inflamatórios, reduzindo o número de macrófagos e de linfócitos na MP e diminuindo a expressão do TNF-alfa, uma citocina pró-inflamatória, quando comparados ao Grupo FP. Com relação a análise funcional, o grupo tratado com VE apresentou melhora na capacidade de ultrafiltração. No entanto, os tratamentos com CTmTA e VE não alteraram o transporte de glicose pela MP em relação ao Grupo FP. Outro aspecto dos efeitos dos tratamentos CTmTA e VE diz respeito à neoangiogênese na MP, importante fator relacionado a capacidade de ultrafiltração. Apesar dos grupos tratados com CTmTA e VE apresentarem diminuição significativa da expressão de VEGF na MP, não foi constatada diferença na densidade capilar na MP destes grupos, em relação ao Grupo FP. Em conclusão, no modelo experimental de FP, os tratamentos com CTmTA e VE apresentaram efeito anti-inflamatório e foram igualmente eficientes no bloqueio do processo de FP. O tratamento com VE mostrou melhor capacidade de preservação da função peritoneal, com aumento da capacidade de ultrafiltração. Portanto, os tratamentos com CTmTA ou com VE derivadas de CTmTA apresentam potencial terapêutico e constituem uma nova abordagem, ainda pouco explorada, na prevenção do desenvolvimento da FP associada à DP / In patients undergoing peritoneal dialysis (PD), morphofunctional changes of the peritoneal membrane (PM) occur progressively over the years. These modifications are morphologically characterized by loss of the mesothelial layer, inflammation, neoangiogenesis and peritoneal fibrosis (PF), and functionally, by the reduction in ultrafiltration (UF). Moreover, these changes directly imply in failure of treatment. Currently, there is no clinical alternative to prevent or reverse this situation. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have shown beneficial therapeutic effects in diseases associated with fibrosis. The participation of MSC in tissue repair is related to their paracrine activity, through the release of soluble factors and extracellular vesicles (EV). The EV released are important to cell-to-cell communication and the possibility to contribute to the therapeutic effect of MSC, by delivering their content (mRNAs, miRNAs, proteins) to the target cells. Therefore, the aim of this study was to compare the possible therapeutic effect of MSC versus EV derived from MSC for prevention of experimental PF fibrosis in rats. PF was induced in male Wistar rats by intraperitoneal (IP) injections of 0.1% chlorhexidine gluconate (CG) on alternate days, for a period of 30 days. The MSC used were obtained from Wistar rats gonadal adipose tissue (ASC), cultured and expanded to the 4th passage and characterized according to their ability to adhere to plastic, presence of membranes markers and by cell differentiation in vitro. EV derived from ASC were isolated by ultracentrifugation. The protocols of ultracentrifugation and characterization by electron microscopy, nanoparticle tracking and quantification of total proteins from EV were standardized and established in the laboratory. Both treatments using ASC (2x106 cells) or EV (30 ug) were administered via IP injections. The animals were divided into four groups: Control group (n = 8), animals that received only IP injections of physiological solution; PF group (n = 9), animals that received IP injections of CG to induce PF and were treated with physiological solution; PF+ASC group (n = 8), animals that received IP injections of CG for induction of PF and were treated with 2x106 ASC, at the 3rd and 10th day, by IP delivery; PF+EV group (n = 8), animals that received IP injections of CG for induction of PF and were treated with 30 ug of EV at the 3rd and 10th day, by IP delivery. After 30 days of PF induction, the animals were submitted to the peritoneal function test and then, to euthanasia to collect tissue samples from the peritoneum. The samples were analyzed by histology immunohistochemistry, immunofluorescence, and also by molecular biology. In the FP group, there was a significant increase in the thickness of the PM. Both treatments with ASC or EV prevented increase in PM thickness. Importantly, ASC and EV treatments blocked the increased number of myofibroblast, fibronectin expression and the factors involved in PF (TGF-beta and FSP-1) observed in the PF group. In addition, the Smad3 gene expression, which is associated with activation of pro-fibrotic genes, was increased in the PF group and decreased in the treatments groups. Conversely, the gene expression of Smad7, a gene associated with TGF-beta against regulation, was decreased in the PF group and increased in the animals that received the treatment. ASC and EV injections also showed anti-inflammatory effects, reducing the infiltration of macrophages and lymphocytes into the PM and decreasing the expression of TNF-alpha, a proinflammatory cytokine. The treatments with ASC and EV did not alter the glucose transport by the PM in relation to the PF group, but promoting an increase of the UF capacity. Only the EV treated group showed an increase in UF capacity. Another aspect of the effects of ASC and EV treatments concerns to neoangiogenesis in the PM, an important factor related to the UF capacity. Although the treated groups showed a significant decrease of the VEGF expression in the PM, no difference in the capillary density was observed in relation of PF group. In conclusion, in the experimental model of FP, treatement with ASC or EV showed anti- inflammatory effects and were equally efficient in blocking the PF process. However, the treatment with EV showed a better capacity of preservation of the peritoneal function, with increased capacity of UF. Therefore, the use of ASC and EV potentially represents a new therapeutic approach in preventing the development of PF associated with PD

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.