Das Verständnis der Mechanismen, nach denen biologische Systeme ablaufen, ist ein wichtiger Fokus der aktuellen Strukturbiologie. Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) ist eine geeignete Technik, um solche Ziele anzustreben sowie Struktur und Dynamik von Biomolekülen zu erforschen, um komplementäre Informationen zum Verständnis von Proteinfunktionalität zu erhalten. Rasante Fortschritte sind vor nicht langer Zeit auf dem Gebiet biologischer Festkörper-NMR (ssNMR) erzielt worden, was zu vollständiger Strukturaufklärung zahlreicher Peptide und kleiner Proteine, der Beschreibung von Protein-Komplexbildung sowie der der dynamischen Eigenschaften kleiner Proteine geführt hat. Festkörper-NMR ist die Methode der Wahl bei struktureller und dynamischer Charakterisierung von Membranproteinen und aggregierten amyloidogenen Systemen, die schwer löslich und kaum mit Lösungs-NMR oder Röntgenkristallographie zugänglich sind. Moderne Festkörper-NMR ist noch immer limitiert, was Auflösung und Empfindlichkeit betrifft, und macht weitere Entwicklungen auf den Gebieten der Probenpräparation und des Pulssequenz-Designs erforderlich. In meiner Arbeit untersuche ich die potenzielle Verwendung von Deuterierung in der Protein Festkörper-NMR zur Erhöhung von Empfindlichkeit und Auflösung in 15N-1H Korrelationsexperimenten. Der erzielte Fortschritt auf diesen Gebieten erlaubt die Verfolgung von Proteinrückgratbewegungen mit hoher Genauigkeit, die vorher nicht verfügbar war. Wir zeigen zum ersten Mal, dass TROSY Experimente für Festkörper-NMR gewinnbringend sind. Außerdem wurde eine Pulssequenz für 13C-13C J Kopplung zur Erhöhung der Auflösung in der Kohlenstoff-Dimension entwickelt. / Understanding the mechanisms how biological systems work is an important objective of current structural biology. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a well suited technique to approach these goals and to study structure and dynamics of biomolecules in order to obtain complimentary information for understanding functionality of proteins. Recently, rapid progress has been made in the field of biological solid state NMR (ssNMR), which resulted in complete structure elucidation of several peptides and small proteins, the characterization of protein complex formation and the characterization of dynamic properties of small proteins. Solid state NMR is the method of choice for structural and dynamic characterization of membrane proteins and aggregated amyloidogenic systems, which are poorly soluble and can not be easily studied by solution state NMR and X-ray spectroscopy. Modern solid state NMR is still limited in resolution and sensitivity, and requires developments in sample preparation and pulse sequence design. In my thesis, I study the potential use of deuteration in protein solid state NMR for sensitivity, as well as for resolution enhancement in 15N-1H correlation experiments. Achieved progress in these fields allows to monitor backbone motion with high accuracy, which has not been available before. We show for the first time that TROSY type experiments can be beneficial for solid state NMR. In addition, a pulse sequence for 13C-13C J decoupling was developed to increase resolution in the carbon dimension.

Wir haben DNA-basierte Hybridisierungssonden zur erzwungenen Interkalation (sogenannte FIT-Sonden) entwickelt. Diese beruhen auf dem Ersatz einer natürlichen Nukleobase durch einen umgebungssensitiven Farbstoff. Die einzelsträngigen Sonden zeigen ein geringes Fluoreszenzsignal, da die Rotation um die zentrale Methinbrücke den angeregten Zustand effizient entvölkert. Durch Hybridisierung mit komplementären Zielsequenzen wird der Farbstoff in den Basenstapel gezwungen, wodurch die Rotation eingeschränkt wird und verstärkt Fluoreszenz auftritt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Sonden optimiert, um maximale Fluoreszenzanstiege und maximale Helligkeit zu erzielen. Wir konnten zeigen, dass der Einbau von Locked Nucleic Acid (LNA) gleichzeitigt die Helligkeit und die Stabilität gegenüber Nukleaseverdau vergrößert. Solche LNA-verstärkten FIT-Sonden konnten in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Anne Ephrussi (EMBL-Heidelberg) wurden solche Sonden erfolgreich in der Lebendzell-Bildgebung von Oskar mRNA in Oozyten von Drosophila Melanogaster eingesetzt. Die kombinierte Verwendung von Thiazolorange und einem zweiten, terminal angebrachten Cy7-Reporter ermöglichte durch Ratiometrische Messungen die Quantifizierung von Sonden und Ziel RNA durch waschfreien Fluoreszenz in-situ Hybridisierung. Wir konnten die Farbauswahl für FIT-Sonden erweitern und etablierten Chinolinblau als den höchst-responsiven Farbstoff in DNA-FIT-Sonden, welcher bis zu 195-fache Fluoreszenzintensivierung zeigte. Die Verwendung von cyan- (Thiazolgelb), grün- (Thiazolorange) und rot-emittierende (Chinolinblau) FIT-Sonden ermöglichte die simultane Detektion drei verschiedener RNA-Sequenzen. Dieselben Farbkanäle wurden ebenfalls zur Entwicklung von Wiederholungseinheiten für FIT-Sonden verwendet. Durch die Expression transgener RNA und die benachbarter Hybridisierung zahlreicher Sonden sollten die Mehrfarbdetektion in lebenden Zellen mit sehr geringer Nachweisgrenze gelingen. / We developed oligonucleotide hybridization probes based on forced intercalation (FIT). FIT probes contain asymmetric cyanine dyes of the thiazole orange family as nucleobase surrogates as an internal label. The thiazole orange is dark in the unbound, single stranded state, due to rapid depletion of the chromophores excited state by torsional twisting. Upon hybridization with target nucleic acids, the reporter is forced into the base stack, resulting in restriction of intramolecular rotation which is accompanied by a dramatic increase in quantum yield. The probes have been optimized for highest fluorescence response and maximum brightness upon hybridization with complementary nucleic acids. We discovered that locked nucleic acids (LNA) increase both, the nuclease resistance in living cells and the brightness. FIT-probes were applied in real-time PCR and RNA localization studies in fixed tissue and in living cells. Together with our collaborator Anne Ephrussi we demonstrated that carefully chosen probe sequences disrupted RNA secondary structure and thereby altered the motility of oskar ribonucleotide-particles in living oocytes of Drosophila melanogaster. The combined use of fluorogenic base surrogates and a second, terminally attached, independent reporter allowed the rapid intracellular RNA-quantification by means of wash-free fluorescence in-situ hybridization. We expanded the color repertoire of FIT probes by screening multiple chromophores and discovered quinoline blue as the most responsive chromophore with up to 195-fold fluorescence enhancement. The combined use of cyan- (thiazole yellow), green- (thiazole orange) and red-emissive (quinoline blue) FIT probes allowed the simultaneous detection of multiple RNAs of interest. The same color channels could be used for the development of artificial repeat tags for FIT-probes that will enable live-cell multiplexing by FIT-probes with transgenic RNAs.

Die Epithelien vielzelliger Organismen bilden eine funktionelle Grenzschicht, die für die Homöostase innerhalb und für den spezifischen Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten verantwortlich ist. Der interzelluläre Spalt zwischen Epithelzellen wird durch tight junctions verschlossen, die eine selektive Permeabilitätsbarriere bilden. Da viele Krankheiten auf eine Dysfunktion der Barriere zurückzuführen sind, ist eine genaue Kenntnis der molekularen Zusammensetzung der tight junctions aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse. In dieser Arbeit wurden Anreicherungsstrategien entwickelt, die eine Proteomanalyse der tight junction-Proteine erlauben. Der Fokus wurde dabei auf die Claudine und Tricellulin gelegt, die als transmembranale Proteine das molekulare Rückgrat der tight junctions bilden. Durch Affinitätsreinigung gelang erstmals eine Anreicherung verschiedener Claudine, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden. Die metabolische Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen (SILAC) erlaubte die quantitative Diskriminierung von Proteinen, die unspezifisch an das Matrixmaterial banden. Von den potentiellen Interaktionspartnern der Claudine wurden Integrin-a3, SUMO-1 und Sphingosinkinase 2 ausgewählt, um deren Interaktion mit Claudinen weiter zu verifizieren. Es wurden keine Hinweise auf Wechselwirkungen zwischen Claudinen und Integrin-a3 sowie SUMO-1 gefunden, während die Interaktion von Claudinen mit Sphingosinkinase 2 weder bestätigt noch ausgeschlossen werden konnte. Ferner wurde eine Affinitätsreinigung durchgeführt, um Interaktionspartner von Tricellulin anzureichern. Durch die quantitative massenspektrometrische Analyse wurde ausschließlich Claudin-4 nicht aber Claudin-3 und 7 als potentieller, spezifischer Interaktionspartner von Tricellulin identifiziert. Es wurde aber gezeigt, dass die Kombination aus Affinitätsreinigung und quantitativer Massenspektrometrie einen wertvollen Beitrag zur Entschlüsselung von Protein-Komplexen leisten kann. / Epithelia function as specialized barriers that separate different compartments within multicellular organisms and regulate the specific exchange of substances between them. The intercellular space between adjacent epithelial cells is sealed by tight junctions forming a permeability barrier. Dysregulation of the barrier occurs in a variety of diseases. Hence, a deeper knowledge is required of the molecular composition of tight junctions, in particular with respect to pharmacological applications. In the present study, new enrichment strategies have been established that allow the proteomic analysis of tight junction proteins. Special emphasis was placed on claudins and tricellulin as these transmembrane proteins constitute the molecular backbone of the tight junctions. For the first time, using an affinity purification, the enrichment of several claudins was accomplished that were identified by mass spectrometry. The metabolic labeling of proteins with stable isotopes (SILAC) allowed the quantitative discrimination of proteins that bound unspecifically to the matrix. Integrin-a3, SUMO 1 and sphingosin kinase 2 were chosen for further verifications from the proteins considered to potentially interact with claudins. While there was no evidence for an association of claudins with integrin-a3 and SUMO-1, an interaction of claudins with sphingosin kinase 2 could be neither confirmed nor disproved. Furthermore, an affinity purification was performed in order to enrich interaction partners of tricellulin. Claudin-4 was identified as a specific, potential interaction partner of tricellulin by quantitative mass spectrometric analysis whereas claudin 3 and -7 were determined to be enriched unspecifically. The present study demonstrates that a combination of affinity purification and quantitative mass spectrometry can substantially contribute to the elucidation of protein complexes.

Das Ziel dieser Arbeit war es einen geeigneten internen Standard für die linksventrikuläre mRNA-Quantifizierung bei kardialer Hypertrophie und Herzinsuffizienz in der Ratte zu finden. Die mRNA-Expression von GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin and Porphobilinogen-Desaminase (PBGD) wurde vier Wochen nach Induktion von Hypertrophie (kleiner aortokavaler Shunt) und Herzinsuffizienz (großer aortokavaler Shunt bzw. Myokardinfarkt) mit Hilfe des Ribonuklease Protektion Assay (RPA) und der TaqMan PCR bestimmt. Die linksventrikuläre ANP-mRNA-Expression war in allen untersuchten Modellen unabhängig von der angewendeten Detektionsmethode erhöht. Die mRNA-Expression der Housekeeping Gene mit Hilfe des RPA bestimmt, war in allen untersuchten Modellen im Vergleich zu den Kontrollen unverändert (GAPDH: kleiner Shunt: 105.1+-7.4, großer Shunt: 105.2+-6.8, MI: 88.4+-3.7; 18SrRNA: kleiner Shunt: 110.7+-8.2, großer Shunt: 104.4+-8.9, MI: 107.5+-12.0; Cyclophilin: kleiner Shunt: 96.4+-7.9, großer Shunt: 112.9+-4.9, MI: 95.7+-13.8; PBGD: kleiner Shunt: 81.9+-6.3, großer Shunt: 83.7+-4.7, MI: 79.8+-9.7; % Kontrolle). In der sehr sensitiven TaqMan PCR zeigte sich eine veränderte mRNA-Expression von GAPDH, PBGD und Cyclophilin, lediglich 18S wurde unverändert exprimiert (GAPDH: kleiner Shunt: 114.5+-18.7, großer Shunt: 133.6+-19.1, MI: 64.2+-6.2, p / The purpose of this study was to identify an appropriate left ventricular mRNA as internal standard in gene expression analysis in cardiac hypertrophy and heart failure in the rat. Expression levels of GAPDH, 18SrRNA, Cyclophilin and porphobilinogen desaminase (PBGD) were measured four weeks after induction of either cardiac hypertrophy (small aortocaval shunt) or heart failure (large aortocaval shunt or myocardial infarction) using Ribonuclease protection assay (RPA) and TaqMan PCR. The left ventricular expression of ANP mRNA was increased in all these experimental models independently of the used method. Using RPA the mRNA expression of all studied housekeeping genes was unchanged in all experimental models compared to controls (GAPDH: small shunt: 105.1+-7.4, large shunt: 105.2+-6.8, MI: 88.4+-3.7; 18SrRNA: small shunt: 110.7+-8.2, large shunt: 104.4+-8.9, MI: 107.5+-12.0; Cyclophilin: small shunt: 96.4+-7.9, large shunt: 112.9+-4.9, MI: 95.7+-13.8; PBGD: small shunt: 81.9+-6.3, large shunt: 83.7+-4.7, MI: 79.8+-9.7; % control). Using the TaqMan PCR as a much more sensitive method only 18SrRNA levels were unchanged whereas GAPDH, PBGD and Cyclophilin mRNA expression was regulated (GAPDH: small shunt: 114.5+-18.7, large shunt: 133.6+-19.1, MI: 64.2+-6.2, p

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Frage nach Eignung der Technik, des Aufwands, der Schulung und der Vor- und Nachteile eines Einsatzes der Telepathologie in der Schnellschnitt-Diagnostik zu analysieren. Weltweit wurden verschiedene Telepathologiesysteme entwickelt, die zum Teil für den Schnellschnitt verwendet werden können. Auch an der Charité entstanden mit dem 1.ATM-System, 2.dem TPS-System und 3.dem TELEMIC-System, drei technisch völlig unterschiedliche Systeme. Diese Systeme wurden anhand einer retrospektiven Studie hinsichtlich ihrer Einsatzfähigkeit in der telepathologische Schnellschnitt-Diagnostik untersucht. Um die Systeme untereinander vergleichen zu können, wurden 124 histologische Schnellschnittpräparate aus dem Jahr 1999 herausgesucht (ausschließlich Brustgewebe), die von vier erfahrenen Pathologen mit jedem System erneut bearbeitet wurden. Qualitativ wurden mit dem ATM- und dem TPS-System gleichwertige Ergebnisse wie in der konventionellen Schnellschnitt-Diagnostik erreicht. Das TELEMIC-System war qualitativ aufgrund der hohen Rate von Rückweisungen den anderen Systemen und dem konventionellen Schnellschnitt deutlich unterlegen. Bei den Diagnosezeiten zeigte sich eine leichte Unterlegenheit des TPS-Systems gegenüber dem konventionellen Schnellschnitt. Da es jedoch insbesondere als Möglichkeit der Ferndiagnose eingesetzt wird, fallen die bei der konventionellen Schnellschnitt-Diagnostik nötigen Transportzeiten durch einen Kurier weg. Das ATM-System und das TELEMIC-System sind auch ohne Zurechnung der Transportzeiten zeitlich zum konventionellen Schnellschnitt vergleichbare Systeme. / Target of the available work is it, the question about suitability of the technique, the expenditure, to analyze the training and the pro and cons of an application of the Telepathologie on fresh frozen diagnostics. World-wide different Systems for telepathology were developed, which can be used partially for the fresh frozen diagnostics. At the Charité were developed three technically completely different systems: 1.ATM-System, 2.TPS system and 3.TELEMIC system, These systems were examined on the basis a retrospective study regarding their serviceability on telepathologische fresh frozen diagnostics. In order to be able to compare the systems among themselves, 124 histological fresh frozen preparations were picked out from the year 1999 (excluding chest tissues), which were again processed by four experienced pathologists with each system. Qualitatively with ATM and TPS system equivalent results as on were achieved conventional fresh frozen diagnostics. The TELEMIC system was qualitatively inferior for the other systems and the conventional fresh frozen diagnostics due to the high rate of rejections. With the diagnostic times an easy inferiority of the TPS system showed up in relation to the conventional fresh frozen diagnostics. Since it is used however in particular as possibility of the remote diagnostics, the feed times necessary with the conventional fresh frozen diagnostics are omitted by a courier. The ATM system and the TELEMIC system are also without addition of the feed times temporally to the conventional fresh frozen diagnostics comparable systems.

Um das Langzeitüberleben eines Kreuzbandtransplantates nach Ersatz des VKB zu gewährleisten muß das Transplantat revaskularisiert werden. Trotz zahlreicher Studien zu diesem Thema gibt es noch immer eine kontroverse Diskussion bezüglich der Revaskularisierung von Kreuzbandtransplantaten. Ziel der vorliegenden Studie war es die endoligamentäre mikrokapilläre Revaskularisierung eines freien Sehnentransplantates mit Hilfe immunhistochemischer Färbetechnik darzustellen und ihren Verlauf über die Zeit zu dokumentieren. Darüber hinaus sollten die im Rahmen des Remodelingprozesses nach vorderem Kreuzbandersatz ablaufenden Ab- und Aufbauprozesse der Extrazellulärmatrix des Transplantates weiter aufgeklärt werden. Bei der Heilung des medialen Kollateralband des Kniegelenkes wurden kontraktile fibroblastische Zellen entdeckt, die eine mögliche Rolle bei der Wiederherstellung der Matrixhomöostase spielen. Nach Entdeckung dieses Zelltyps im intakten vorderen Kreuzbandes wurde gemutmaßt, Myofibroblasten könnten eine entscheidende Rolle bei der Entstehung der Kollagentertiärstruktur spielen. In der vorliegenden Studie sollte aufgeklärt werden, ob Myofibroblasten im intakten ovinen vorderen Kreuzband und seinem freien Sehnentransplantat nach VKB-Ersatz während des Remodelings wieder auftaucht. 36 ausgewachsene Merinoschafe erhielten einen vorderen Kreuzbandersatz mittels ipsilateralem Flexorsehnentransplantat. Nach je 6, 9, 12, 24, 52 und 104 Wochen wurden 6 Tiere getötet und das mittlere Drittel des Kreuzbandtransplantates histologisch aufgearbeitet. Neben konventionellen Färbungen zur Auswertung von Gesamtzellzahl und Crimpstruktur wurden immunhistochemische Färbungen mit anti-v. Willebrandt Factor (Factor VIII) zum Nachweis von Endothelzellen der Gefäßwand und anti-alpha-smooth-muscle Aktin zum Nachweis von Myofibroblasten durchgeführt. In Querschnittpräparaten, je in 3 Zonen (subsynovial, intermediär und zentral) unterteilt, wurden Gefäßanschnitte ausgezählt. In Längsschnittpräparaten wurden Myofibroblasten nachgewiesen. Die Auswertungen wurden mit Hilfe eines digitalen Bildanalysesystems vorgenommen. Die Untersuchungen zur Revaskularisierung zeigten von peripher nach zentral über die Zeit einwachsende Kapillaren. Die größte Dichte an Gefäßanschnitten wurde nach 6 Wochen gefunden, der Gefäßstatus des nativen VKB wurde nach 24 Wochen erreicht. Myofibroblasten konnten sowohl im intakten VKB als auch im Flexorsehnentransplantat vor Implantation nachgewiesen werden. Weiterhin konnten Myofibroblasten erstmalig auch im remodelierenden Bandgewebe bereits nach 6 Wochen innerhalb neu gebildeter Kollagenfasern identifiziert werden. Die vorliegende Studie konnte damit erstmalig die Kinetik der endoligamentären Revaskularisierung auf kapillärer Ebene darstellen. Im vorliegenden Modell war die Revaskularisierung wesentlich früher abgeschlossen als zuvor beschrieben. Myofibroblasten stellen einen regulären Bestandteil sowohl des nativen als auch des remodelierenden VKB dar. Dabei könnten diese Zellen eine wichtige Rolle bei der Wiedererlangung der Gewebehomöostase durch die Ausbildung der Kollagentertiärstruktur spielen. Die Präsenz dieser Zellen während der frühen Remodellingphase läßt weiterhin vermuten, daß alpha smooth muscle Actin exprimierende Zellen in der frühsten Phase der Bildung von Kollagenfibrillen mitbeteiligt sind. / After replacement of the anterior cruciate ligament with a free tendon autograft, the substitute initially is avascular and without a synovial surface. To ensure long-term survival, the graft must become revascularised. Despite numerous studies on the topic, there still is controversial discussion regarding revascularisation. The first aim of the current study was to investigate the endoligamentous microcapillary revascularisation of the free tendon graft after anterior cruciate ligament replacement with time. Furthermore degeneration and reformation of the extracellular matrix during remodeling of the anterior cruciate ligament graft was to elucidate. Contractile fibroblastic cells expressing the alpha-smooth muscle actin isoform, so called myofibroblasts, have been identified to play a possible role during the healing of the medial collateral ligament by means of restoring the tissue s in situ strain via extracellular matrix contraction. Recently, these cells have also been identified to be a normal part of the human anterior cruciate ligament. It has been hypothesised that myofibroblasts play a role in wrinkling of the extracellular matrix. Therefore the second aim of the current study was to identify myofibroblasts in the intact ovine anterior cruciate ligament and their reoccurrence in a free autologous tendon graft during remodeling after anterior cruciate ligament reconstruction. Thirty-six mature sheep had an anterior cruciate ligament reconstruction with an ipsilateral flexor tendon split graft. Besides conventional staining to analyse total cell density and collagen crimp, midsubstance tissue samples were immunostained for von Willebrandt factor (Factor VIII) to detect the endothelial cells of capillaries and for a-smooth muscle actin to identify myofibroblasts. For vessel detection cross sections of the samples were determined in three zones (subsynovial, intermediate, and center of the graft). Myofibroblast distribution was analysed in longitudinal sections. Evaluation was performed at 6, 9, 12, 24, 52, and 104 weeks by means of histomorphometry using a digital imaging analysis system. The observations showed that capillary vessels, which originate from the synovial envelope, invaded the avascular graft tissue from the surface toward the center zone. The highest level of vascular density was found after 6 weeks, reaching the vascular status of the native anterior cruciate ligament after 24 weeks. Myofibroblasts were identified in the intact ovine anterior cruciate ligament as well as in the flexor tendon graft prior to implantation. During remodeling first myofibroblasts were found at 6 weeks within newly formed fibre bundles. At 24, 52, and 104 weeks myofibroblast distribution and cell density was similar to that of the intact ovine anterior cruciate ligament. The current study has shown, for the first time, the kinetics of an endoligamentous revascularisation of a free tendon graft at the capillary level. In the current model, the process of revascularisation terminated earlier than previously described. Furthermore the current study has shown that alpha-smooth muscle actin containing fibroblastic cells are a regular part of the intact as well as the remodeled anterior cruciate ligament. There is evidence, that myofibroblasts may be involved in maintaining tissue homeostasis in the mature ligament e.g. by means of crimp formation. The presence of these cells during the early remodeling may further indicate that alpha-smooth muscle actin containing fibroblastic cells are involved in the earliest stages of fibre bundle formation.

In dieser Arbeit wird das Konzept der Scopes und auf großskalige metabolische Netzwerke angewendet. Scopes beschreiben die Synthesekapazität eines Netzwerkes, wenn dieses mit bestimmten Ausgangsstoffen versorgt wird. Dabei werden für definierte Ausgangsstoffe alle durch das Netzwerk synthetisierbaren Stoffe berechnet. In dieser Arbeit wird insbesondere das Referenznetzwerk der KEGG-Datenbank untersucht, welches Reaktionen unabhängig von ihrem Vorkommen in unterschiedlichen Organismen enthält. Es werden die Synthesekapazitäten systematisch für alle Einzelstoffe und für einige Stoffkombinationen errechnet und untersucht. Der Effekt von Kofaktoren wird analysiert. Desweiteren ist es möglich, Kombinationen von Ausgangsstoffen zu finden, aus denen wichtige Metabolite der Zelle produziert werden können. Somit kann der Nährstoffbedarf einer Zelle abgeschätzt werden. Im zweiten Teil wird eine Hierarchie der Scopes basierend auf Inklusionsrelationen zwischen diesen erstellt. Diese Hierarchie kann mit der chemischen Komposition der enthaltenen Stoffe, also mit deren chemischen Bausteinen, den Elementen oder Gruppen, in Verbindung gebracht werden. Dabei erhalten Scopes mit sehr häufigen Bausteinkombinationen eine hervorgehobene Rolle in der Hierarchie. Die Scopehierarchie kann mit der Autotrophie des Netzwerkes in Zusammenhang gebracht werden. Der dritte Teil beschäftigt sich mit möglichen Änderungen in der Topologie des Netzwerkes und deren Auswirkungen auf die Scopes. Es stellt sich heraus, dass die Synthesekapazitäten sich im allgemeinen sehr robust gegenüber solchen Veränderungen verhalten. Die Methodik ist im übrigen auch geeignet um Lücken im biochemischen Wissen aufzuspühren und dadurch die Kenntnisse über den Metabolismus zu erweitern. Außerdem zeigen die getätigten Analysen evolutionäre Ziele hinter der Konstruktion metabolischer Netzwerke auf. / In this work, the concept of scopes is introduced and applied to large scale metabolic networks. The scopes represent functional measures, describing the synthesizing capacity of a metabolic network if supplied with a predefined set of resources. For a given set of initial metabolites, the seed, all possible products are determined using the stoichiometric information of the network. Specifically, the organism independent KEGG reference network is analyzed. The first part of this work describes possible applications of the scopes, including the determination of the synthesizing capacities of different compounds and sets of compounds, the study of the effect of cofactors on the capacities of metabolic networks or the identification of possible nutrient sets required for the maintenance of a cell. In the second part, the scopes of different seed compounds are systematically analyzed and put in relation to one another. A hierarchy is generated representing the inclusion relations of the scopes. Interestingly, this hierarchy reflects the chemical composition, i.e. the chemical elements or chemical groups of the contained compounds. Scopes containing frequently used chemical elements or groups are represented by high degree nodes in this hierarchy. A subhierarchy of these characteristic scopes is described and brought in relation to the autotrophy of the network. In the third part, the effect of modifications in the topology of metabolic networks is analyzed. It turns out that the scopes are generally robust against the deletion of single and even multiple reactions. Also, the influence of limitations in the metabolic knowledge on the results is discussed and possibilities for improvements are indicated. The performed analyses reveal evolutionary objectives behind the construction of metabolic networks. In particular, hypotheses about design, autotrophy or robustness of metabolic networks can be inferred.

Systembiologie strebt danach, biologische Netzwerke dynamisch zu modellieren. Zwei Erfordernisse sind zuhierfür erfüllen. Erstens müssen die Interaktionsnetzwerke bekannt sein. Zweitens muss die Dynamik einerjeden Interaktion aufgedeckt werden. Die Dynamik von Interaktionen werden durch Ratengleichungen beschrieben unter Verwendung von Kinetiken. Diese Kinetiken beschreiben den Interaktionsmechanismus. Für jede einzelne Interaktion des Netzwerkes sind die Parameter durch das Experiment zu bestimmt. Für enzymkatalysierte Reaktionen zum Beispiel werden Messungen durchgeführt, in welchen der Verbrauch des Substrates aufgezeichnet wird. Für viele Enzyme jedoch sind weder der Mechanismus geschweige denn die Parameter bekannt. Und vorhandene Daten sind gewöhnlich von mangelhafter Qualität. Nach einer Einführung in die kinetische Modellierung metabolischer Netzwerke betrachten wir ein veröffentlichtes künstliches genetisches Netzwerk, das entweder einem stationären Zustand zustrebt oder in Abhängigkeit eines kritschen Parameters in einen dauerhaften Schwingungszustand übergeht. Dieser kritsche Parameter ist der Hillkoeffizient in der Wechselwirkung zwischen einem Gen und dem anderen. Für verschiedene Parameterwahlen untersuchen wir, bei welchemWert des Hillkoeffizienten eine Bifurkation auftritt. Auf diese Weise ermitteln wir die Verteilung des kritschen Parameters, der nicht analytisch berechnet werden kann. Wir fahren dann fort und untersuchen nützliche Datenquellen für die Parametrisierung von kinetischen Modellen metabolischer Netzwerke und sammelnsie in einer elektronischen Ressource, um sie auf elektronischem Wege zugänglich und nutzbar zu machen. Dies erfordert, Standardreferenzen zu wählen für die Benennung der Komponenten biologischer Netzwerke. Schließlich beschreiben wir einen Arbeitsablauf, während desselben die Datenbank verwendet wird zur Parametrisierung von kinetischen Modellen metabolischer Netzwerke. / Systems biology seeks to model biological networks dynamically. Two requirements need to be fulfilled for this to be possible. First, the interaction networks need to be known. Second, the dynamics of the interactions have to be revealed. Dynamics of interactions are described by rate laws using kinetics. These kinetics describe the interaction mechanism. For each single interaction occurring in a biological networkparameters have to specified. They have to be measured by experiments. For enzyme catalysed reactions, for example, the parameters are measured by enzyme assays tracking the consumption of substrate. For many enzymes parameters and kinetic mechanism are not known. And existing data for parameters generally are ofpoor quality. After introducing kinetic modelling of metabolic networks we consider a published artificial genetic network that can either tend to a steady state or exhibit sustained oscillations depending on a critical parameter. This critical parameter is the Hill coefficient in the interaction from one gene with the other. For different parameter settings we examine at what value of the Hill coefficient a bifurcation occurs. At this point the network begins to oscillate. We thus assess the distribution of the critical values, a property that cannot be calculated analytically. We then go on to consider useful data sources for parmetrisation of kinetic models of metabolic networks and collect them in an electronical resource to make them electronically accessible and usable. This requires choosing standard references for the designation of components of biological networks. Finally we describe a workflow in which this data resource is used for automatic parametrisation of kinetic models of metabolic networks.

Stochastische Effekte können einen großen Einfluss auf die Funktionsweise von biochemischen Netzwerken haben. Vor allem Signalwege, z.B. Calciumsignaltransduktion, sind anfällig gegenüber zufälligen Schwankungen. Daher stellt sich die wichtige Frage, wie dadurch der Informationstransfer in diesen Systemen beeinträchtigt wird. Zunächst werden eine Reihe von stochastischen Simulationsmethoden diskutiert und systematisch klassifiziert. Dies dient als methodische Grundlage der ganzen Dissertation. Der Schwerpunkt liegt hier auf approximativen und hybriden Ansätzen, einschließlich der Hybridmethode des Softwaresystems Copasi, deren Implementierung Teil dieser Arbeit war. Die Dynamik biochemischer Systeme zeigt in den meisten Fällen einen Übergang von stochastischem zu deterministischem Verhalten mit steigender Partikelzahl. Dieser Übergang wird für Calciumsignaltransduktion und andere Systeme untersucht. Es zeigt sich, dass das Auftreten stochastischer Effekte stark von der Sensitivität des Systems abhängt. Ein Maß dafür ist die Divergenz. Systeme mit hoher Divergenz zeigen noch mit hohen Teilchenzahlen stochastische Effekte und umgekehrt. Schließlich wird der Einfluss von zufälligen Fluktuationen auf die Leistungsfähigkeit von Signalpfaden erforscht. Dazu werden simulierte sowie experimentell gemessene Calcium-Zeitreihen stochastisch an die Aktivierung eines Zielenzyms gekoppelt. Das Schätzen des informationstheoretischen Maßes Transferentropie unter unterschiedlichen zellulären Bedingungen dient zur Abschätzung des Informationstransfers. Dieser nimmt mit steigender Partikelzahl zu, ist jedoch sehr abhängig von der momentanen Dynamik (z.B. spikende, burstende oder irreguläre Oszillationen). Die hier entwickelten Methoden, wie der Gebrauch der Divergenz als Indikator für den stoch./det. Übergang oder die stochastische Kopplung und informationstheoretische Analyse mittels Transferentropie, sind wertvolle Werkzeuge für die Analyse von biochemischen Systemen. / Stochastic effects in biochemical networks can affect the functioning of these systems significantly. Signaling pathways, such as calcium signal transduction, are particularly prone to random fluctuations. Thus, an important question is how this influences the information transfer in these pathways. First, a comprehensive overview and systematic classification of stochastic simulation methods is given as methodical basis for the thesis. Here, the focus is on approximate and hybrid approaches. Also, the hybrid solver in the software system Copasi is described whose implementation was part of this PhD work. Then, in most cases, the dynamic behavior of biochemical systems shows a transition from stochastic to deterministic behavior with increasing particle numbers. This transition is studied in calcium signaling as well as other test systems. It turns out that the onset of stochastic effects is very dependent on the sensitivity of the specific system quantified by its divergence. Systems with high divergence show stochastic effects even with high particle numbers and vice versa. Finally, the influence of noise on the performance of signaling pathways is investigated. Simulated and experimentally measured calcium time series are stochastically coupled to an intracellular target enzyme activation process. Then, the information transfer under different cellular conditions is estimated with the information-theoretic quantity transfer entropy. The amount of information that can be transferred increases with rising particle numbers. However, this increase is very dependent on the current dynamical mode of the system, such as spiking, bursting or irregular oscillations. The methods developed in this thesis, such as the use of the divergence as an indicator for the transition from stochastic to deterministic behavior or the stochastic coupling and information-theoretic analysis using transfer entropy, are valuable tools for the analysis of biochemical systems.

In dieser Arbeit wurde die Methode der breitbandigen fs-zeitaufgelösten Fluoreszenzaufkonversionsspektroskopie (FLUPS) weiterentwickelt und vollständig theoretisch beschrieben, was anhand des Vergleichs von vorhergesagten und experimentell bestimmten photometrischen Korrekturfunktionen gezeigt werden konnte. Die Methode wurde verwendet, um lokale Fluoreszenzspektren von solvatochromen Sonden in der Nähe bestimmter Matrizes in wässrigen Lösungen zu messen. Aus der Dynamik der Stokes-Verschiebung konnte die Solvatations- bzw. Umgebungsdynamik bestimmt werden. Es wurden mittlere Solvatationszeiten τsolv von 0.57±0.06 für reines Wasser, 2.8±0.2 ps für DNA, 480±30 ps für Phospholipid-Kopfgruppen, 0.71±0.03 ps für ein Peptid (α-Helix) und 0.76±0.03 ps für eine t-Butyl-Gruppe erhalten. Hervorzuheben sind dabei die überraschend schnelle Relaxation nahe des Peptids und die sehr langsame Dynamik nahe der Lipid-Kopfgruppen, welche über 5 Größenordnungen der Zeit beobachtet wurde. Um den Einfluss einer hydrophoben Gruppe auf die Solvatationsdynamik erstmals zu aufzuzeigen, wurden präzise Messungen bei verschiedenen Temperaturen vor-genommen. Zuordnungen dieser Dynamiken zu molekularen Prozessen konnten durch Vergleiche zu MD-Simulationen durchgeführt werden. / The method of broadband fs time-resolved fluorescence upconversion spectroscopy (FLUPS) was further developed and completely theoretically described in this work. This was shown by comparing predicted and measured photometric correction functions. This method was used to obtain local fluorescence spectra of solvatochromic dyes near certain matrices in aqueous solution. From the dynamics of the Stokes-Shift the solvation or environmental dynamics respectively were obtained. Average solvation times τsolv of 0.57±0.06 for bulk water, 2.8±0.2 ps for DNA, 480±30 ps for phospholipid head groups, 0.71±0.03 ps for a peptide (α-helix) and 0.76±0.03 ps for a t-butyl group were obtained. Emphasized are the surprisingly fast dynamics near the peptide and the slow dynamics of the lipid head group region. The latter was observed over 5 orders of magnitude in time. To distinguish the influence a hydrophobic group for the first time, precise measurements at different temperatures were performed. Molecular processes were assigned to the obtained dynamics by comparisons to MD studies.