Heute kennt man weit über 100 klinische Erkrankungen, bei denen Sauerstoffradikale am pathogenetischen Mechanismus beteiligt sind. Sauerstoffradikalbildung wird als Initiator oder Promotor des Alterungsprozesses, der Arteriosklerose, der postischemischen Organschäden, des Diabetes mellitus oder verschiedener neurologischer sowie dermatologischer Erkrankungen diskutiert. Besonderes Interesse gilt hierbei den Superoxidradikalen (O2-.), da ihre Bildung den Initialschritt des oxidativen Stresses, nämlich die Übertragung eines Elektrons auf das Sauerstoffmolekül, darstellt. Obwohl für den Nachweis der Superoxidradikalbildung eine Vielzahl verschiedener Methoden angewendet wird, gibt es zunehmend quantitative und qualitative Widersprüche bezüglich O2-. -Radikale in biologischen Systemen. Dies ist auf die mangelnde Vergleichbarkeit der unterschiedlichen Nachweismethoden zurückzuführen. Die vorliegende Untersuchung wurde zur Überprüfung der Eignung in der Praxis angewandter Superoxid-Nachweismethoden wie Photometrie (Cytochrom c , Epinephrin, Nitrotetrazolium blau), Chemilumineszenz (Luminol, Lucigenin) und ESR-Spintrapping (DMPO, DEPMPO) für biologische Fragestellungen unternommen. Als biologische O2-.-Quellen wurden submitochondriale Partikeln, Mitochondrien und polymorphkernige Neutrophile untersucht. Es wurde gezeigt, daß bei Anwendung eines standardisierten O2-. -generierenden Enzymsystems (Xanthin/Xantinoxidase) je nach Methode Wiederfidungsraten erhalten werden, die weniger bis sehr stark von den realen O2-. -Bildungsraten abweichen. Der Nachweis der Superoxidbildung über die Chemilumineszenz des Luminols und des Lucigenins hat gezeigt, daß die Intensität des ausgestrahlten Lichtes nicht nur durch die Bildungsrate der O2-.-Radikale bestimmt wird, sondern auch durch unspezifische Wechselwirkungen der Nachweissysteme mit den zu untersuchenden Objekten. Da vielen Nachweismethoden die Oxidation oder Reduktion der jeweiligen Nachweissubstanz durch Superoxidradikale zugrundeliegt, können die Nachweisreaktionen auch durch andere reduzierende oder oxidierende biologische Komponenten in Gang gesetzt werden. Eine Überprüfung der Selektivität einer Nachweismethode durch die Zugabe des O2-.-eliminierenden Enzyms SOD ist nicht immer möglich, da Superoxidradikale oft auch als Zwischenprodukte der Nachweisreaktionen auftreten und/oder SOD nicht immer den Zugang zur O2-.-Bildungsquelle hat. Spintrapping der Superoxidradikale mit DEPMPO kann hingegen als sicherer Beweis der Superoxidbildung betrachtet werden. Für einen quantitativen Nachweis der Superoxidradikale mittels Spintrapping sind jedoch Kenntnisse über die Stabilität des Spinadduktes in jedem konkreten System erforderlich. Ein mathematisches Modell für die Berechnung der Superoxidbildung in verschiedenen Nachweisystemen wurde erarbeitet. / Imbalanced production of oxygen-centered radicals is generally considered to play a major role in the pathogenesis of a great number of clinical diseases. Metabolic disorders and other derangements of homeostasis affect O2-salvage in a way which may trigger O2- radical formation. Inversely, if O2- radicals are formed in excess, a great variety of functional and structural alterations are expected to occur. It follows that an evaluation of the ranking of O2- radicals in the pathophysiological cascade of the various diseases requires reliable methods allowing identification of the respective reactive oxygen species (ROS), localization of the generation site and the analysis of the conditions required for O2- radical formation. Superoxide radicals (O2-.) are of major interest in this respect as this univalent reduction product is the starting molecule of all ROS possibly occurring in biological systems. Controversial reports on the existence, the sites and formation conditions of O2-.-radicals in the tissue may be due to the application of inadequate methods. The aim of this study was therefore to critically evaluate current O2-.-detection methods for their suitability and comparability. O2-.-radical release from xanthine/xanthine oxidase was assessed and used as a standardized O2-.-source. Spectrophotometric (cytochrom c, epinephrin, nitroblue tetrazolium), chemiluminescence (luminol, lucigenin) and ESR-spin trapping (DMPO, DEPMPO) detection methods were exposed to this O2-.-radical generating system and analyzed with respect to their selectivity and quantitative yield. In a second step the influence of the biological O2-.-generating systems such as submitochondrial particles, mitochondria and polymorphnuclear neutrophils on the available detection methods was tested. The results revealed great variations between the detection methods used both with respect to their selectivity for O2-.-registration and the quantitative analysis of the rates formed. All conventional O2-.-detection methods were found to be directly affected by the biological systems studied, spin trapping with DEPMPO being the most reliable method for qualitative O2-.-detection. Quantitative O2-.-detection requires knowledge about the stability of the respective adduct. A mathematical model for the calculation of O2-.-formation rate in various detection systems is worked out.

Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine bedeutende Rolle in der Regulation des Blutdruckes, es ist ein starker Vasodilatator. Mäuse mit genetisch inaktivierter endothelialer Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS-/-) haben einen Bluthochdruck. Mäuse mit fehlender neuronaler NO-Produktion (nNOS-/-) zeigen einen erniedrigten Blutdruck in Narkose. Im Gegensatz dazu konnte in der Literatur eine Hemmung der Katecholaminfreisetzung durch neuronal gebildetes NO gezeigt werden. Es war deshalb das Ziel dieser Studie, die Kreislaufparameter von eNOS-/- und nNOS-/- Mäusen im wachen Zustand in Ruhe und unter Stress zu untersuchen. Außerdem wurde untersucht, ob nNOS die Expression des Schlüsselenzyms der Katecholaminsynthese, Tyrosinhydroxylase (TH), hemmt und die hämodynamische Antwort auf Stress abschwächt. Acht nNOS-/-, neun eNOS-/- und neun Wildtypkontrollmäuse (WT) erhielten einen Femoralarterienkatheter. Blutdruck und Herzfrequenz sowie die Körperkerntemperatur wurden 24h nach der Operation unter wachen Bedingungen in Ruhe und bei Erhöhung der Umgebungstemperatur aufgezeichnet. Die Tyrosinhydroxylase-mRNA-Expression und -Proteingehalt der Nebennieren wurden mittles RT-PCR und Western Blot bestimmt. In Ruhe zeigten eNOS-/- und nNOS-/- Mäuse einen signifikant erhöhten mittleren und diastolischen Blutdruck im Vergleich zu Wildtypkontrollen. Während des Hitzestresses war der initiale Blutdruckabfall bei den eNOS-/- Mäusen signifikant vermindert. Der stressinduzierte Anstieg von Blutdruck und Herzfrequenz war deutlich verstärkt bei nNOS-/- Mäusen im Vergleich zu WT und eNOS-/- Mäusen. Die TH-mRNA-Expression war zehnfach erhöht bei nNOS-/- Mäusen im Vergleich zu WT. Auch der Proteingehalt der Nebennieren war dreifach erhöht in nNOS-/- im Vergleich zu WT. Diese Ergebnisse zeigen, dass endothelial gebildetes NO hauptsächlich an der thermoregulatorischen Vasodilatation der Hautgefäße beteiligt ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass neuronal gebildetes NO die TH-Expression hemmt und die sympathisch vermittelte Stressantwort vermindert. / Nitric oxide (NO) plays an important role in the circulatory regulation, it is a very potent vasodilator. Mice deficient of a functional endothelial NO synthase (eNOS-/-) exhibit hypertension. Mice lacking a functional neuronal NO production (nNOS-/-) were observed to be hypotensive under anaesthesia. In contrast, evidence from the literature suggests an inhibition of catecholamine release by NO derived from nNOS. Therefore it was the aim of this thesis to evaluate the circulatory parameters in eNOS-/- and nNOS-/- under conscious conditions at rest and in reponse to stress. Additionally, it was tested if nNOS inhibits the expression of the key enzyme of the catecholamine synthesis, tyrosine hydroxylase, and thereby reduces the hemodynamic responses to stressful stimuli. Eight nNOS-/-, nine eNOS-/-, and nine wild type controls (WT) were chronically instrumented with femoral artery catheters. 24h after surgery,resting blood pressure and heart rate were measured and then mice were exposed to an elevated ambient temperature. Arterial blood pressure together with heart rate and core temperature were recorded in conscious animals. Tyrosine hydroxylase mRNA expression and protein content in the adrenal gland were measured by RT-PCR and western blotting, respectively. At rest, eNOS-/- and nNOS-/- exhibited a significantly elevated mean and diastolic blood pressure compared to WT. During heat stress, the initial decrease in blood pressure seen in WT and nNOS-/- was significantly blunted in eNOS-/-. The stress-induced acceleration of heart rate and increase in blood pressure were much stronger in nNOS-/- compared to WT and eNOS-/- . TH mRNA expression was ten times larger in nNOS-/- than in WT. Correspondingly, protein content in the adrenal gland was increased threefold in nNOS-/- compared to WT. The results of this thesis indicate that endothelial derived NO predominantly mediates the thermoregulatory vasodilatation. Furthermore, it shows that neuronally derived NO inhibits TH expression and, therefore, limits the sympathetically-mediated responses to stressful stimuli, such as heat stress.

Selenoproteine spielen eine wichtige Rolle in der antioxidativen Abwehr und bei Immunreaktionen. Der Selen(Se)metabolismus wird von Hepatozyten gesteuert, die das Se-Transportprotein Selenoprotein P (SEPP) synthetisieren und sezernieren. SEPP nimmt bei kritischen Erkrankungen, z. B. Sepsis ab und führt zu niedrigen Se-Spiegeln. Sepsis triggert die übermäßige Produktion von proinflammatorischen Zytokinen. Aminoglykosid-Antibiotika (AG), die oft bei schwerer Sepsis eingesetzt werden, induzieren Fehlinterpretationen der mRNA inklusive des Stoppcodons UGA welches für die Selenoprotein-Biosynthese notwendig ist. Es wurden daher die molekularen Wechselwirkungen zwischen den Zytokinen IL-6, IL-1b und TNFa, AG und dem Se-Status mit der Biosynthese in Leberzelllinien untersucht. IL-6 führte zu einer starken Reduktion der SEPP-mRNA und einer dosisabhängigen Reduktion von SEPP. Parallel dazu reduzierte IL-6 das Transkriptlevel, die Proteinexpression und die Enzymaktivität der Typ-I-Dejodase (DIO1). Auf die Expression der antioxidativ-wirkenden Glutathionperoxidasen (GPX) wirkte IL-6 isozymspezifisch; während die Transkriptkonzentrationen von GPX2 anstiegen und die von GPX4 abnahmen, blieb GPX1 unbeeinflusst. Die IL-6-abhängigen Effekte bestätigten sich auch in Reportergenassays von SEPP-, DIO1-, GPX2- und GPX4-Promotorkonstrukten. Um die Wirkungen von AG auf die Selenoprotein-Translation besser zu verstehen, wurden die SECIS-Elemente von GPX1-, GPX4- und SEPP-Transkripten in ein Reportersystem kloniert und auf eine Regulation durch AG und Se analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der korrekte Se-Einbau vom Se-Status, von der AG-Konzentration und dem spezifischen SECIS-Element abhängig ist. Auf transkriptionaler und translationaler Ebene führten AG zu stark erhöhten SEPP-Spiegeln, während die Expression und Enzymaktivität von GPX und DIO1 nur in geringerem Ausmaß beeinflusst wurden. Eine Analyse der Se-Beladung zeigte, dass der Se-Gehalt von SEPP stark durch AG reduziert und vom Se-Status abhängig war. / Selenoproteins play important roles in antioxidant defence and immunoregulation. Selenium (Se) metabolism is controlled by hepatocytes synthesizing and secreting the Se-transporter selenoprotein P (SEPP) declining in critical illness, e.g., sepsis. Sepsis triggers excessive production of pro-inflammatory cytokines. Aminoglycoside (AG) antibiotics applied in sepsis in induce mRNA misinterpretation including the stop codon UGA required during selenoproteins biosynthesis. The molecular interplay between the cytokines IL-6, IL-1b and TNFa, AG and Se-status on selenoprotein expression was investigated in hepatic-derived cell lines. IL-6 strongly reduced the level of SEPP mRNA and secreted SEPP in a dose-dependent manner. Likewise, expression of selenoenzyme type 1 deiodinase (DIO1) declined at the transcript, protein and enzyme activity level. The effects of IL-6 on the expression of antioxidative-acting glutathione peroxidases (GPX) were isozyme-specific; while transcript level of GPX2 increased and those of GPX4 decreased, GPX1 remained unaffected. IL-6-dependent effects were reflected in reporter gene experiments of selenoprotein promoter constructs. Characterising the effects of AG on selenoprotein translation, the SECIS-elements of GPX1, GPX4 and SEPP transcripts were cloned into a reporter system and analysed for their response to AG and Se. The results indicate that the correct co-translational Se-insertion depends on the Se-status, AG concentration and the specific SECIS-element. At both transcriptional and translational levels, SEPP levels were strongly increased in response to AG, whereas the expression and enzyme activity of GPX and DIO1 were affected to a lower degree. Analysis Se-status indicate that the Se-content of SEPP was strongly reduced by AG and depends on Se-status.

Zellen enthalten zahlreiche Enzyme, deren Reaktionen von molekularem Sauerstoff abhängen. Oft sind deren aktive Zentren tief im inneren des Proteins verborgen, was die Frage nach spezifischen Zugangskanälen, die den Sauerstoff gezielt zum Ort der Katalyse leiten, aufwirft. In der vorliegenden Arbeit wird dies am Beispiel der 12/15-Lipoxygenase, als ein typisches Beipiel Sauerstoff verbrauchender Enzyme, untersucht. Die Sauerstoffverteilung innerhalb des Proteins wurde bestimmt und mögliche Routen für den Sauerstoffzugang definiert. Zu diesem Zweck wurden theoretische Untersuchungen eng mit Experimenten verzahnt. Zuerst wurden Molekulardynamik Simulationen des Proteins in Lösung durchgeführt. Aus den Trajektorien konnte die dreidimensionale Verteilung der Freien Enthalpie für Sauerstoff berechnet werden. Die Analyse der günstigsten Pfade in dieser Energielandschaft führte zur Identifikation von vier Sauerstoffkanälen im Protein. Alle Kanäle verbinden die Proteinoberfläche mit einem Gebiet hoher Sauerstoffaffinität am aktiven Zentrum. Diese Region liegt bezüglich des Substrats gegenüber dem Eisenzentrum, wodurch eine strukturelle Erklärung für die Reaktionsspezifität des Enzyms gegeben ist. Der katalytisch bedeutsamste Weg des Sauerstoffs kann durch L367F Austauschmutation blockiert werden, was zu einer stark erhöhten Michaelis-Konstante für Sauerstoff führt. Diese experimentell nachgewiesene Blockade konnte, mit Hilfe entsprechender Molekulardynamik Simulationen, durch eine Umordnung eines Wasserstoffbrücken-Netzwerks von Wassermolekülen innerhalb des Protein im Detail erklärt werden. Die Ergebnisse ermöglichen den Schluss, dass die Hauptroute für Sauerstoff zum aktiven Zentrum des Enzyms einem Kanal folgt, der aus vorübergehend verbundenen Hohlräumen besteht. Hierbei unterliegt das Öffnen und Schließen des Kanals der Dynamik der Proteinseitenketten. / Cells contain numerous enzymes utilizing molecular oxygen for their reactions. Often, their active sites are buried deeply inside the protein which raises the question whether there are specific access channels guiding oxygen to the site of catalysis. In the present thesis this question is investigated choosing 12/15-lipoxygenase as a typical example for such oxygen dependent enzymes. The oxygen distribution within the protein was determined and potential routes for oxygen access were defined. For this purpose an integrated strategy of structural modeling, molecular dynamics simulations, site directed mutagenesis, and kinetic measurements has been applied. First, molecular dynamics simulations of the protein in solution were performed. From the trajectories, the 3-dimensional free-energy distribution for oxygen could be computed. Analyzing energetically favorable paths in the free-energy map led to identification of four oxygen channels in the protein. All channels connect the protein surface with a zone of high oxygen affinity at the active site. This region is localized opposite to the non-heme iron providing a structural explanation for the reaction specificity of this lipoxygenase isoform. The catalytically most relevant path can be obstructed by L367F exchange which leads to a strongly increased Michaelis constant for oxygen. This experimetally proven blocking mechanism can, by virtue of molecular dynamics studies, be explained in detail through a reordering of the hydrogen bonding network of water molecules. As a conclusion, the results provide strong evidence that the main route for oxygen access to the active site of the enzyme follows a channel formed by transiently interconnected cavities whereby the opening and closure is governed by sidechain dynamics.