Intrazelluläre Protein- und RNA-Lokalisation ist ein lebenswichtiger molekularer Mechanismus. Ihm unterliegen sowohl die äußere Gestaltung der Zellform, Zellagilität, zelluläre Differenzierung sowie die intra- sowie interzelluläre Kommunikation. Diverse Krankheiten werden mit Fehlfunktionen des intrazellulären Molekültransportes assoziiert und es existieren unzählige Beispiele für bekannte Wege des intrazellulären Protein- und RNA-Transportes. Allerdings ist die globale Komposition lokaler Protein- und RNA-Reservoirs bisher kaum wissenschaftlich erforscht worden. In dieser Studie beschreibe ich die Protein- sowie RNA-Kompositionen subzellulärer Fraktionen zweier neuronaler Zelltypen. Die Neuriten und Somata von Neuroblastoma-Zellen (N1E-115) und Ascl1 induzierten Neuronen (beides Mauszellen) wurden mechanisch voneinander separiert und mittels RNA-Sequenzierung und Massenspektrometrie auf ihre Bestandteile untersucht. Die Verteilung von mRNAs korreliert signifikant mit der Verteilung der entsprechenden Proteine in Ascl1-iNs während in der Neuroblastoma Zelllinie N1E-115 kein solcher Trend nachgewiesen werden konnte. Der Vergleich zu Datensätzen von anderen Zellsystemen und Methoden zeigt, dass das lokale Proteom sowie das lokale Transkriptome und Translatome stark Zelltyp spezifisch ist. Um den Einfluss lokaler Proteinbiosynthese auf die Komposition subzellulärer Proteinpools zu erheben, habe ich die Lokalisation neu synthetisierter Proteine untersucht. Es scheint, als sei die RNA-Lokalisation und lokale Translation von hoher Relevanz für die Protein-Lokalisation in diesen stark polarisierten Zellsystemen. Des Weiteren stelle ich eine Methode vor, um de novo „zip codes“ in diesen neuronalen Zellsystemen zu identifizieren. Diese könnte ein elementar wichtiger Schritt sein, um Fehlfunktionen im interzellulären Molekültransport zu verstehen. / Intracellular protein and RNA localization is one of the mayor players in the formation of cell shape, enabling cell agility, cellular differentiation and cell signaling. Various diseases are associated with malfunctions of intracellular molecule transport. There are many known pathways of how and why proteins and RNAs are transported within the cell and where they are located, though there is not much known about the global distribution of proteins and RNAs within the cell. In this study I apply a subcellular fractionation method coupled to multiple omics approaches to investigate the global distribution of mRNAs, noncoding RNAs and proteins in neuronal cells. Neurites and soma from mouse neuroblastoma cells (N1E-115) as well as from Ascl1 induced neurons (Ascl1-iNs) were isolated and the composition of the spatial proteome and transcriptome was examined. The localization of mRNAs correlates significantly with the localization of their corresponding protein products in Ascl1-iNs whereas it does not in the mouse neuroblastoma cell line N1E-115. Comparing these datasets with recently published data of other cell lines and methods it is clear, that the local proteome, transcriptome and translatome of neuronal cells is highly cell type specific. To investigate how spatial protein pools are established I analyzed local pools of newly synthesized proteins revealing that many proteins are synthesized on the spot. RNA localization therefore plays a crucial role in generating local protein pools in these highly polarized cell systems. Additionally, I propose a method to identify on a global scale de novo “zip codes” in these cell systems which would be a great step towards understanding malfunctions in molecule transport.

Mitglieder der CCC1 like Proteinfamilie sind Metalltransportproteine und Homologe zum vakuolären Eisen- und Mangantransporter CCC1 aus S. cerevisiae. VIT1-Homologe als CCC1-like Proteine pflanzlicher Herkunft können eine Anwendung in der Eisen-Biofortifikation finden. Bei der Überexprimierung von TaVIT2 in Weizen wurde von der 4 fachen Erhöhung des Eisen- und Mangangehalts im Mehl berichtet (Connorton et al., 2017). Die Überexprimierung von OsVIT1 oder OsVIT2 in Reis hat zur Erhöhung sowohl vom Eisengehalt als auch von Zink- und Mangangehältern geführt (Zhang et al., 2012). In dieser Arbeit wurden 6 CCC1-like Proteine aus A. thaliana bezüglich ihrer Substratspezifität untersucht. VIT1 und fünf VIT-Like Proteine (VTLs) wurden an ihren N- und C Termini modifiziert und im Hefekomplementationsverfahren auf ihre Fähigkeit Eisen, Mangan oder Zink zu transportieren untersucht. Ein einfacher Algorithmus zur Modifizierung von Membranproteinen durch Entfernung mehrerer AS-Reste vom N- bzw. vom C-Terminus ist beschrieben. Es sollte untersucht werden, ob diese Modifizierung einen Einfluss auf die Hefekomplementation hat. Native und modifizierte VTLs wurden mittels GFP-Fusion in den Zelllokalisierungsstudien untersucht. Es sollte festgestellt werden, ob Modifikationen die Zelllokalisierung beeinflussen. Eine Lokalisierung an der Vakuolenmembran wurde für VIT1, VTL1-4 und für einige modifizierte VTL4-Konstrukte nachgewiesen. Dagegen zeigte das VTL5-Konstrukt vorwiegend eine Plasmamembranlokalisierung. Die Entfernung von 21 AS vom N Terminus von VTL4 bzw. von 23 AS vom N-Terminus von VIT1 hatten keinen Effekt auf die Komplementation der Δccc1 Mutante. Dagegen zeigten die entsprechenden Konstrukte keine Komplementation der Δpmr1 Mutante. Es wurden modifizierte Konstrukte von AtVIT1 und AtVTL4 gefunden, die nicht in der Lage waren Mangan und Zink zu transportieren und dadurch für Eisen spezifisch gewesen wären. Diese wären gute Kandidaten für eine eisenselektive Biofortifikation. / CCC1 like protein family are metal transport proteins with high homology to the S. cerevisiae vacuolar iron and manganese transporter CCC1. The plant members of this family such as VIT1-homologue might find an application in iron biofortification of crops. An almost 4-fold increase in the iron content in flour of TaVIT2 overexpressing wheat was demonstrated (Connorton et al., 2017), but the overexpressing plants showed a significant increase in manganese content as well. OsVIT1 or OsVIT2 overexpressing in rice (Zhang et al., 2012) lead to increased iron, zinc and manganese. In this thesis six member of A. thaliana CCC1-like proteins were investigated for their substrate specificity. VIT1 itself and five other VIT1-like proteins (called VTLs) were modified at their N- and C-termini and investigated for iron, manganese and zinc transport capacity via a yeast complementation assay. A simple algorithm to modify membrane proteins by removing AA rests from their N- and / or C-terminal regions is presented, and the effects of these modifications on the functionality of the modified protein by the yeast complementation test are reported. The cell localization of native and modified VTLs was studied using fusion to GFP to determine if modifications would alter the subcellular localization in yeast. VTL1-4 as well as VIT1 were localized to the vacuolar membrane of yeast cell. VTL5 was predominantly localized to the plasma membrane of the yeast cell. Some modified VTL4 constructs could still be localised to the vacuolar membrane. Removal of 21 AA from the N-terminus of AtVTL4 as well as removal of 23 AA from the N-terminus of AtVIT1 didn't affect the complementation of the Δccc1 mutant. In contrast no complementation of Δpmr1 mutant was seen with the same constructs. Certain modified forms of AtVIT1 and AtVTL4 were unable to transport either manganese or zinc. We propose that they might be iron-specific, and thus would be candidates for a selective iron biofortification.

Die Aktivierung des NF-kB Vorläuferproteins p100 und p105 erfolgt durch eine proteasomale Trunkierung, um die aktiven p52 und p50 zu erzeugen. Zur Erforschung wurde eine Massenspektrometrie-basierende Proteomik-Strategie entwickelt, die mit der gezielten Reaktionsüberwachungstechnik plus einer Isotopenmarkierung verwendet wurde. In einem endogenen murinen embryonalen Fibroblasten-System konnte gezeigt werden, dass beide Vorläufer zu den jeweiligen Produkten in einer parallelen und sich einander bedingenden Weise in Reaktion auf einen Lymphotoxin-β-Rezeptor-Agonisten verarbeitet werden. Unsere SRM-SILAC- Methode erlaubte die Unterscheidung von Prä-Stimulationsprotein-Populationen aus Proteinen, die de novo nach der Stimulation synthetisiert wurden, und zeigte eine Tendenz für ältere Vorläufermoleküle, sich einer Degradation zu unterziehen, während die de novo-Moleküle auf die Produkte verarbeitet wurden. Die langsame und anhaltende Kinetik, die ein typisches Merkmal des nicht-kanonischen NF-κB- Weges ist. Darüber hinaus, konnten wir beobachten, dass die hydrolytische Aktivität der AAA ATPase VCP / p97 in der Bildung von de novo p52 und p50 eine Rolle spielt. Durch ein MS-basiertes Screening für strahlungsinduzierte Protein-Interaktoren eines weiteren NF-κB-Players, der die regulatorische Untereinheit des IKK-Komplexes IKKγ / NEMO bildet, konnte der Enhancer von mRNA Decapping 4 (EDC4) entdeckt werden. Durch die zusätzliche Untersuchung der E3-Ligase, Parkin, konnte eine Verbindung mit dem NF-κB-Weg durch eine lineare Ubiquitinierung hergestellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Parkin ist Hauptkomponenten des linearen Ubiquitin-Ketten-Assemblierungskomplexes (LUBAC). Die Proteomanalyse im Proteinkinase A (PKA) -Signalisierungsweg konnte zwei neuartige Regulationsformen identifizieren: K63-verknüpfte Polyubiquitinierung die katalytische Untereinheit von PKA, PKAC in Richtung eines lysosomalen pathways führt, und auch durch einen Pseudosubstrat-Hemmungsmechanismus. / Activation of the NF-κB precursor protein p100 and p105 by a specific proteasomal truncation to yield the active products p52 and p50 is a distinct feature of the non- canonical pathway but the mechanism governing it remains elusive. A novel mass spectrometry-based proteomics strategy was developed, using the targeted selected reaction monitoring technique in conjunction with stable isotope labeling for both absolute quantitation of proteins and to mark precursor protein populations relative to the application of the lymphotoxin β stimulation. In an endogenous murine embryonic fibroblast system, we have shown that both precursors are processed to the respective products in a parallel and interdependent manner in response to a lymphotoxin β receptor agonist. Our Dynamic SRM-SILAC method allowed distinction of pre-stimulation protein populations from proteins synthesized de novo post- stimulation, and revealed a tendency for older precursor molecules to undergo degradation while the de novo molecules went on to be processed to the products, accounting for the slow and persistent kinetics that are a hallmark of the non- canonical NF-κB pathway. In addition, the hydrolytic activity of the AAA ATPase VCP/p97 was implicated in the generation of de novo p52 and p50. An MS-based proteomics screen for specific, radiation-induced protein interactors of another key NF-κB player, the regulatory subunit of the IKK complex, IKKγ/NEMO, turned up the Enhancer of mRNA Decapping 4 (EDC4). This unexpected finding has expanded the known role of NF-κB regulation of protein levels beyond transcription into mRNA stability. Separate investigations into the ubiquitin E3 ligase, parkin, connected it to the NF-κB pathway through a linear ubiquitination it helps catalyze on IKKγ/NEMO. Proteomic analysis of polyubiquitin in the protein kinase A (PKA) signalling pathway helped to identify two novel modes of regulation: a lysosomal degradation pathway; as well as a pseudosubstrate inhibition mechanism.

The aim of this thesis is to analyse the personal pronoun “we” in a political debate using Conversation Analysis as research method. More specifically, the thesis aims to identify and analyse how the speakers of a political debate use “we” to express different referential domains in terms of group affiliation. Consequently, to support the thesis’s aim, the following research questions have been devised: What different categories of “we” can be found in the debate? How and when are these different categories used to manifest group affiliation and what do they accomplish?

Thesis advisor: Bonnie Jefferson / In 1984, a group of famous British musicians came together to form the megagroup called Band Aid and released the holiday song “Do They Know It‟s Christmas?” to increase public awareness of the Ethiopian famine. A few months later, American musicians under the name United Support of Artists for Africa (U.S.A. for Africa) released the song “We Are the World” to raise money for these famine victims. Both songs were immensely popular and together created a new rhetorical form, the international musical philanthropy genre. Over twenty-five years after the release of these two songs, Sudanese recording artist Emmanuel Jal released his own song “We Want Peace” to raise public awareness for the Southern Sudanese vote for independence. This study examines the creation of the international musical philanthropy genre by analyzing and comparing the songs “Do They Know It‟s Christmas?” and “We Are the World”. This analysis also discusses the implications of the international musical philanthropy genre. After examining the effects of this new genre, this analysis then examines how the new song “We Want Peace” challenges and expands the international musical philanthropy genre. / Thesis (BA) — Boston College, 2011. / Submitted to: Boston College. College of Arts and Sciences. / Discipline: Communication Honors Program. / Discipline: Communication.

Der Eintritt löslicher oder membranständiger Proteine in den Sekretionsweg beginnt mit dem Transport der Proteine durch die Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER). Die Translokationspore wird durch den heterotrimeren Sec61-Komplex gebildet. Homologe Membranproteine der alpha- und gamma-Untereinheit dieses Komplexes sind bislang in allen daraufhin untersuchten prokaryotischen und eukaryotischen Organismen gefunden worden. Es handelt sich somit um einen entwicklungsgeschichtlich hoch konservierten Mechanismus des Proteintransports durch Membranen. Zahlreiche Untersuchungen in den letzten Jahren haben uns mittlerweile ein komplexes Bild des Translokationsgeschehens vermittelt. Die vorliegende Arbeit beleuchtet einen völlig neuen Aspekt der Proteintranslokation: Es zeigt sich, daß Gene, die für Komponenten des Sec61-Komplexes kodieren, in sehr unterschiedlichen eukaryotischen Organismen unabhängig voneinander dupliziert wurden und sich im folgenden nebeneinander weiterentwickelten. Die Untersuchung dieser sog. paralogen Gene und ihrer Genprodukte zum einen in Säugerzellen und zum anderen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist Gegenstand der Arbeit. In Säugerzellen finden sich zwei sehr ähnliche SEC61a-Gene (knapp 80% Identität auf Nukleinsäureebene, etwa 94% auf Aminosäureebene), deren Expression in verschiedenen Organen und Embryonalstadien der Maus analysiert wurde. In allen bislang getesteten Geweben wurden beide Gene exprimiert. Deutliche Unterschiede zeigten sich allerdings in der Stärke der Expression: Während die Expressionshöhe des bereits bekannten SEC61a-I-Gens relativ konstant war, variierte die des paralogen SEC61a-II-Gens zwischen den einzelnen Organen. Der selektive Vorteil zweier paraloger SEC61a-Gene für den Säugerorganismus liegt somit möglicherweise in der unterschiedlichen Regulierbarkeit ihrer Expression. In Saccharomyces cerevisiae finden sich paraloge Proteine und dafür kodierende Gene sowohl für die alpha-Untereinheit Sec61p als auch für die beta-Untereinheit Sbh1p des heterotrimeren Sec61p-Komplexes. Der Grad der Identität liegt mit 32% zwischen Sec61p und Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) allerdings erheblich niedriger als in Säugerzellen. Sbh1p und Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) sind zu etwa 50% identisch. Für die gamma-Untereinheit Sss1p wurde kein paraloges Protein gefunden. Es konnte gezeigt werden, daß die beiden, hier neu beschriebenen Proteine Ssh1p und Sbh2p zusammen mit Sss1p einen eigenständigen, heterotrimeren Komplex, den Ssh1p-Komplex, bilden, der ebenfalls in der ER-Membran lokalisiert ist und eine Funktion beim Proteintransport durch diese Membran hat. Im Gegensatz zu SEC61 ist SSH1 nicht essentiell, wenn auch das Ssh1p für normale Wachstumsraten erforderlich ist. Die Deletion des SBH2-Gens zeigt keinen Phänotyp, was allerdings für die des SBH1-Gens ebenfalls gilt. Erst das Fehlen beider Proteine führt zu einem temperatur-abhängigen Wachstumsphänotyp und zu Defekten in der Translokation. Der entscheidende Unterschied zwischen dem Sec61p- und dem Ssh1p-Komplex scheint darin zu bestehen, daß der Sec61p-Komplex modulartig einsetzbar ist: als trimerer Komplex bei der kotranslationalen Translokation und im heptameren Sec-Komplex beim posttranslationalen Proteintransport. Demgegenüber deuten die Untersuchungen des Ssh1p-Komplexes darauf hin, daß dieser nicht mit dem tetrameren Sec62p-Sec63p-Komplex zum heptameren Sec-Komplex assoziieren kann. Vielmehr läßt er sich in Assoziation mit membrangebundenen Ribosomen nachweisen, was auf eine ausschließliche Funktion des Ssh1p-Komplexes bei der kotranslationalen Translokation schließen läßt. / Soluble or membrane proteins entering the secretory pathway are first translocated across the endoplasmic reticulum (ER) membrane. The proteins move through a channel formed by the heterotrimeric Sec61-complex. Homologues of the alpha- and gamma-subunit of this complex have been found in a wide variety of procaryotic and eucaryotic organisms indicating an evolutionary highly conserved mechanism for translocating proteins across membranes. Several recent investigations contributed to a complex understanding of this process. The work presented here sheds light on a completely new aspect of protein translocation across the ER-membrane: Interestingly genes coding for components of the Sec61-complex are found to have been duplicated independently in diverse eucaryotic organisms giving rise to so called paralogous genes (= intraspecies homologues) co-evolving after duplication. These paralogous genes and their gene products in mammalian cells as well as in the yeast Saccharomyces cerevisiae have been analyzed in detail. Mammalian cells possess two very similar SEC61a-genes (about 80% identity on nucleic acid level, about 94% on protein level). Their expression has been analyzed for several murine organs and embryonic stages. All tissues tested so far showed expression of both genes though the level of expression differed significantly: whereas expression of the already known SEC61a-I-gene seemed to be more or less constant across different tested organs, expression levels of the paralogous SEC61a-II-gene were not. Consequently the ability to differentially regulate the expression of the two paralogous SEC61a-genes may be of selective advantage for the mammalian organism. In the yeast Saccharomyces cerevisiae paralogous proteins of the alpha-subunit Sec61p as well as for the beta-subunit Sbh1p of the heterotrimeric Sec61p-complex can be found. The paralogous alpha-subunits Sec61p and Ssh1p (Sec sixty-one homolog 1) are less well conserved (32% identity) than the mammalian paralogues. Sbh1p and Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog 2) are 50% identical. No paralogous protein was found for the gamma-subunit Sss1p. Instead, it could be shown that the new proteins Ssh1p and Sbh2p together with Sss1p are found in a heterotrimeric complex, the Ssh1p-complex, which like the Sec61p-complex localizes to the ER-membrane and has a function in translocating proteins across this membrane. In contrast to Sec61p Ssh1p is not essential for cell viability but it is required for normal growth rates. Sbh1p and Sbh2p individually are also not essential, but cells lacking both proteins are impaired in their growth at elevated temperatures and show translocation defekts in vivo as well as in vitro. The most intriguing difference between the Sec61p-and the Ssh1p-complex might be that the Sec61p-complex has a role in both co- and post-translational translocation pathways, as a separate entity and as part of the heptameris Sec-complex, respectively. However, there was no evidence for the Ssh1p-complex being part of an heptameric complex together with the tetrameric Sec62p-Sec63p-complex, but association of the trimeric Ssh1p-complex with membrane-bound ribosomes could be shown, making it likely that the Ssh1p-complex functions exclusively in the co-translational pathway of protein transport.

Volumeninduzierte Chloridströme wurden bereits in einer Reihe von Zelltypen charakterisiert. In dieser Arbeit wurde die Modulation volumenaktivierte Chloridströme ICl,Vol und der Signalweg zu ihrer Aktivierung untersucht. In Endothelzellen aus der Pulmonalarterie des Rindes (CPAE) wurden der Membranstrom unter Anwendung der 'patch clamp' - Technik und simultan dazu die Konzentration des freien intrazellulären Kalziums [Ca2+]i gemessen. Bisher wurde davon ausgegangen, daß die Aktivierung von ICl,Vol kalziumunabhängig erfolgt. In dieser Arbeit wurde ICl,Vol unter Pufferung des [Ca2+]i mit BAPTA und EGTA gemessen. Es konnte gezeigt werden, daß freies intrazelluläres Kalzium in Konzentrationen niedriger als 50 nM zur Stromaktivierung notwendig ist. Bei einer höheren Konzentration verliert der Strom jedoch seine Kalziumabhängigkeit. Chromoglycinsäure (CL) blockiert ICl,Vol in Endothelzellen. Dieser Effekt ist jedoch im Vergleich zu dem klassischen Chloridkanalblocker NPPB geringer (Ki=15mM) und sehr langsam (im Mittel 100 s). Damit sind die blockierenden Eigenschaften auch geringer ausgeprägt als z.B. auf ICl,Vol und Hemmung der Serotoninsekretion in Mastzellen. Weiterhin war die Rolle von durch Proteinphosphorylierung modulierten intrazellulären Signalwegen bei der Aktivierung von ICl,Vol Gegenstand von Experimenten. Weder die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) durch direkte Applikation des Phorbolesters PMA noch deren Ab - Regulation durch 24-stündige Inkubation mit PMA hatten Einfluß auf die Aktivierung von ICl,Vol. Auch Wortmannin, ein Inhibitor sowohl der MAP - Kinasen (und damit des Tyrosinkinase - assoziierten Rezeptor - Signalweges) als auch der PI3 - Kinase, zeigte keinen Effekt auf ICl,Vol. Der Aktivator der MAP - Kinasen und der fokalen Adhaesionskinase p125FAK, die Substanz Lysophosphatsäure (LPA), zeigte weder einen Effekt auf ICl,Vol, noch konnte damit ein Chloridstrom induziert werden. Die Induktion von HSP durch Applizierung von thermischem und chemischem Streß unter Inkubation bei bis zu 45 °C über 60 min und Einwirkung von 0,3 mM Natriumarsenit zeigte keinerlei Einfluß auf ICl,Vol. Es konnte auch keine Aktivierung eines Chloridstromes beobachtet werden. Zur Untersuchung des Aktivierungsmechanismus von ICl,Vol dienten Experimente unter gleichzeitiger Messung von ICl,Vol, Membrankapazität (CM) und (jedoch zeitlich unabhängig voneinander) der Zellhöhe. Die Ergebnisse wurden an Hand dreier Modellvorstellungen zur Aktivierung von ICl,Vol diskutiert. Es bestand eine enge Korrelation zwischen Veränderungen der Zellhöhe und des aktivierten Stromes. Beide korrelieren jedoch nicht mit den Änderungen von CM. Dabei änderte sich CM bei einem Teil der Zellen praktisch nicht, d.h. geringer als 2% des Ausgangswertes vor Applikation hypotoner Lösung (n=17), bei den verbliebenen Teil zeigten sich deutliche Veränderungen von durchschnittlich 10,6 ± 0,9 % ( ± SEM, n=5). In letzterem Fall änderte sich jedoch immer zuerst ICl,Vol und dann CM. Nach Inhibierung des intrazellulären Vesikeltransports durch Brefeldin A war ICl,Vol ohne signifikante Änderungen auslösbar. Unter Cycloheximid, einem Blocker der Proteinsynthese auf Transkribtionssebene, wurden keine spezifischen Veränderungen von ICl,Vol beobachtet. Auf jeden Fall ist CM nicht der primäre Trigger für ICl,Vol. Die Aktivierung von volumeninduzierten Chloridströmen erfolgt nicht maßgeblich durch die Inkorporierung von Ionenkanal - Proteinen enthaltenden Membranvesikeln. / Volume-induced chlorid currents are characterised for many types of cells. I have investigated the modulation and activation of these currents. In cultered pulmonary artery endothelial cells (CPAE) patch clamp maesurements of membrane currents and simultaneous maesurements of free intracellular calcium ([Ca2+]i) were performed. Until now, activation of ICl,Vol was characterised as Calcium-independently. I maesured the current buffering [Ca2+]i with the Calcium chelators BAPTA and EGTA. It could be observed, that [Ca2+]i at concentrations less than 50 nM is required to activate ICl,Vol. At higher concentrations, there is no modulation by [Ca2+]i. Sodiumchromoglycate (CL) blocks ICl,Vol in endothelium cells. This effect is small (Ki=15mM) and slow (100 s) as compared of those of the classical chlorid channel blocker NPPB. Inhibitory effects of CL to ICl,Vol in endothelial cells are weaker than to ICl,Vol and to secretion of serotonin in mast cells. The role of intracellular phosphorylation signal pathways on activation of ICl,Vol was investigated. Neither activation of protein kinase C (PKC) throught direct application of the phorbol ester PMA nor down-regulation through preincubation with PMA had any effect on activation of ICl,Vol. Also Wortmannin, an inhibitor of MAP-kinases, failed to have significant effects on I

In multizellulären Organismen bilden Epithel- und Endothelzellen die äußere Begrenzung innerer und äußerer Körperoberflächen bzw. kleiden die Blutgefäße aus. So schaffen sie abgegrenzte Organkompartimente mit individuellen, der jeweiligen Funktion angepassten Bedingungen. Dazu muss die parazelluläre Diffusion von Stoffen eingeschränkt werden. Die Abdichtung des parazellulären Spalts erfolgt durch tight junctions (TJ). Claudine (Cld) bilden das strukturelle Rückgrat der TJ. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass einzelne Aminosäuren der zweiten extrazellulären Schleife (2. EZS) eines Claudins für die parazelluläre Dichtigkeit essentiell sind. Da endogene TJ-Stränge fast ausschließlich aus mindestens zwei verschiedenen Claudinen aufgebaut sind, wurde die Wirkung von Aminosäuresubstitutionen in der 2. EZS von Cld5 auf die parazelluläre Dichtigkeit in einer claudinheterogenen Umgebung analysiert. Dafür wurden verschiedene Cld5-Mutanten stabil in MDCK-II-Zellen exprimiert. Die Aminosäuresubstitutionen in der 2. EZS von Cld5 führten nicht nur zum Verlust der durch Cld5wt bedingten parazellulären Abdichtung, sondern darüber hinaus zu einer geringeren parazellulären Dichtigkeit im Vergleich zur Vektorkontrolle. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde mit einem Peptid, dessen Sequenz der C-terminalen Hälfte der 1. EZS von Cld1 entsprach (Cld153-81), eine reversible Öffnung der TJ von epithelialen Zelllinien erzielt. Mit dem N-terminal verkürzten Clostridium perfringens Enterotoxin-Fragment CPE194-319 wurde ebenfalls eine Reduktion der parazellulären Dichtigkeit von Epithelzellen erzielt. Insgesamt tragen die Untersuchungen dieser Arbeit zu einem besseren Verständnis der durch Claudine vermittelten Abdichtung des parazellulären Spalts bei. Darüber hinaus bieten Cld153-81 und CPE194-319 neue Perspektiven für eine gezielte therapeutische Öffnung der TJ, um beispielsweise die Wirkstoffzufuhr ins Gehirn zu verbessern. / Epithelial and endothelial cells form the external lining of outer and inner body surfaces and blood vessels of multicellular organisms. Thus, they create separate compartments each exhibiting an environment optimally adjusted to their respective function. To build up such compartments epithelial and endothelial cells have to restrict the paracellular diffusion of substances. The paracellular cleft is sealed by tight junctions (TJ). In electron microscopical images TJs appear as a network of intermembranous strands in the apical region of the lateral cell membrane of epithelial and endothelial cells. Claudins (Cld) form the structural backbone of TJs. The present study provided evidence for the first time that single amino acids of the second extracellular loop (ECL) of a claudin are essential for the paracellular tightness of epithelial cells. The effect of single amino acid substitutions of the second ECL of Cld5 were studied in cells expressing various other endogenous claudins except Cld5. Point mutants of Cld5 were stably expressed in MDCK-II cells. While the expression of Cld5wt caused increased paracellular tightness, this effect was completely abolished by the Cld5 point mutants. Furthermore, the mutants even decreased the paracellular permeation of certain substances compared with the vector control. Further findings of the present study demonstrated that a peptide corresponding to the C-terminal half of the first ECL of Cld1 is capable of opening the TJ in a reversible manner. Using an N-terminal fragment of clostridium perfringens enterotoxin (CPE194-319) a reduction of the paracellular tightness of epithelial cells was demonstrated. Taken together, the findings of the present study contribute to a better understanding of the sealing of the paracellular cleft by claudins. Furthermore, Cld153-81 und CPE194-319 open new perspectives for a targeted therapeutic opening of the TJs suited for enhancing the transport of active substances into diseased tissue.

Die Beschreibung genregulatorischer Ereignisse ist entscheidend um Zelldifferenzierung und -entwicklung zu verstehen. Dynamische Vernderungen der Chromatinstruktur, Histonmodifikationen und das Binden von Transkriptionsfaktoren an Enhancer und Promotoren, koennen mit Hilfe von genomweiten Hochdurchsatz-Sequenziertechniken wie ChIP-Seq, DNase-Seq, ATACSeqund RNA-Seq untersucht werden. In dieser Arbeit entwickele ich mehrere probabilistische Modelle fuer die Analyse von genomweiten Sequenzierungsdaten. Diese umfassen 1. einen Peak-Finder fuer ChIP-/DNase-/ATAC-Seq-Daten, der sich Replikate zunutze macht und praezise Peak-Weiten berechnet, 2. eine Pipeline um das Genom in hoher Aufloesung in eindeutige Klassen von Kombinationen von Histonmodifikationen zu segmentieren, 3. ein Bayes-Netzwerk-Modell welches multiple zeitlich aufgelste Histonmodifikations-ChIP-seq-Daten kombinatorisch clustert Klassen von regulatorischen Elementen zu identifizieren. Mit Hilfe dieser Modelle untersuchen wir die Promotorumgeben und zeigen einen Zusammenhang zwischen Chromatinstruktur und Promotordirektionalitaet. Darueber hinaus verwenden wir ein Modell zur direkten Reprogrammierung von Stammzellen in Motorneuronen durch die gezielte Expression von Transkriptionsfaktoren und analysieren die dadurch induzierten zeitlichen Vernderungen der Chromatinstruktur und Transkriptionsfaktorbindedynamik. Wir beobachten, dass Promotoren verschiedenen Chromatin-Dynamiken zur Aktivierung und Repression folgen, die mit den Chromatin-Dynamiken von Enhancer-Elementen korrelieren. Enhancer hingegen werden durch kooperatives Verhalten direkt induzierter Transkriptionsfaktoren und anderen Faktoren, die in den Stammzellen zu Beginn vorhanden waren oder im Verlaufe der Differenzierung aktiviert wurden, kontrolliert. Diese Arbeit zeigt wie wichtig Chromatin-Dynamik und ihre Beziehung zur Logik von Transkriptionsfaktoren ist, um die Veraenderungen der Genexpression zu verstehen. / Delineating transcription regulatory events is crucial to understand cell differentiation and development. Dynamic changes of chromatin structure, histone modifications and transcription factor binding to enhancers and promotors can be investigated with the aid of genome-wide high-throughput sequencing technologies such as ChIP-Seq, DNase-Seq, ATAC Seq and RNA Seq. In this thesis, I develop several probabilistic models for the analysis of genome-wide sequencing data. These include: 1. a peak finder for ChIP-Seq, DNase-Seq and ATAC Seq data, which exploits biological replicates and accurately demarcates peak widths, 2. a pipeline for high-resolution genome segmentation into unique classes of combinations of histone modifications and 3. a Bayesian network model that can co-cluster multiple time-course histone modification ChIP-Seq data sets into distinct classes of regulatory elements. With the aid of these models we investigate the promoter chromatin environment and show a link between chromatin state and transcription initiation directionality. In addition, we use a system for direct reprogramming of stem cells in motor neurons by the targeted expression of transcription factors to analyse changes in chromatin state and transcription factor dynamics during differentiation. We observe that promoters follow different chromatin dynamics for activation and repression that correlate with the chromatin dynamics of enhancer elements. Enhancers are controlled by cooperative behavior of directly induced transcription factors and other factors present in the stem cells initially, or activated in the course of differentiation. Overall, this work demonstrates the importance of understanding chromatin dynamics and their relationship to transcription factors logic in order to better explain changes in gene expression.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is an important crop in several regions of Brazil for having good agronomic performance in soils with low fertility and low water availability. Mathematical models adapted and tested in different environmental conditions are tools to describe the interactions between plant and environment. The objective of this study was to simulate the leaf number (LN) with two mathematical models, one that considers the linear effect and one that considers the nonlinear effect of air temperature on leaf appearance on the stems of cassava. Considering two versions in each model, one version uses the daily mean temperature (Tmean) and the other uses the daily minimum and maximum temperature (Tmm).The linear model is the model that uses the concept of phyllochron and nonlinear model is the Wang; Engel (WE) model. Model coefficients were estimated from a data set of accumulated number leaves, on the main stem and on the sympodial first and second order branching (HP, RS1 and RS2) of the variety of cassava "Fepagro RS 13", collected in experiments conducted on the field area, Crop Science Department, Federal University of Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil, in the growing seasons 2005/2006 and 2007/2008.The evaluation of the models was performed with independent data collected in the same location in the growing seasons 2006/2007, 2008/2009, 2009/2010 and 2010/2011, with different rainfall availability. The WE model provided the best estimate of leaf number in cassava, with a root mean square error (RMSE) of 3.2 and 3.5 leaves, compared with the phyllochron model with 3.7 and 4.4 leaves for LN general utilizing temperature versions Tmean and Tmm, respectively. Among the versions of the models, for simplicity the versions that uses Tmean can be used, but in warmer regions the version that uses the daily minimum and maximum temperature (Tmm) is suggested. / A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma cultura importante em várias regiões do Brasil, por ter desempenho agronômico satisfatório em solos com baixa fertilidade e baixa disponibilidade hídrica. Modelos matemáticos adaptados e testados em diferentes condições ambientais são ferramentas que permitem descrever as interações entre a planta e o ambiente. Neste estudo objetivou-se simular a emissão do número de folhas (NF) com dois modelos matemáticos, um que considera o efeito linear e outro que considera o efeito não linear da temperatura do ar sobre o aparecimento de folhas nas hastes da mandioca, considerando duas versões de cada modelo, uma versão com a temperatura média diária do ar (Tmed) e outra com a temperatura mínima e máxima do ar (Tmm). O modelo linear é o modelo que utiliza o conceito do filocrono e o não-linear é o modelo de Wang; Engel (WE). Para estimar os coeficientes dos modelos foi usado um conjunto de dados de número de folhas acumuladas, na haste principal e na ramificação simpodial de primeira e segunda ordem (HP, RS1 e RS2) da variedade de mandioca FEPAGRO RS 13 , coletados em experimentos conduzidos na área experimental do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Santa Maria, RS, nos anos agrícolas 2005/2006 e 2007/2008 (em duas datas de plantio). A avaliação dos modelos foi realizada com dados independentes coletados no mesmo local nos anos agrícolas de 2006/2007, 2008/2009, 2009/2010 e 2010/2011, os quais tiveram distintas disponibilidades de precipitação pluviométrica. O modelo de WE proporcionou melhor estimativa para o número de folhas em mandioca, com valor de raiz do quadrado médio do erro de 3,2 e 3,5 folhas, comparado com o modelo do filocrono com 3,7 e 4,4 folhas para NF geral usando as versões de temperatura Tmed e Tmm, respectivamente. Entre as versões dos dois modelos, por simplicidade pode-se usar a versão que usa a Tmed, mas em regiões mais quentes sugere-se usar a versão que usa a temperatura mínima e máxima diárias do ar (Tmm).