The paralogous multi-functional adaptor proteins YAP and TAZ are nuclear effectors of the Hippo pathway, a central regulator of developmental organ size control, tissue homeostasis and tumour suppression. YAP/TAZ target the TEAD transcription factor family to promote cell survival and inhibit apoptosis. TEAD proteins contain a DNAbinding domain and a YAP/TAZ interaction domain. PCR analysis of medaka fish TEAD cDNA revealed the presence of alternative TEAD splice-forms with variations at the C-terminus of the DNA-binding domain. Structural analysis indicated the YAPbinding domain of TEAD proteins is folded and globular. NMR spectroscopy showed that the TEAD binding domain of YAP does not contain secondary structure. YAP and TAZ both contain WW domains, which are small protein-protein interaction modules. Two YAP isoforms are known, YAP1 and YAP2 that contain one and two WW domains, respectively. To date, only a single WW isoform of TAZ has been described. PCR analysis of medaka TAZ cDNA identified both single WW and tandem WW isoforms of TAZ. NMR spectroscopy was used to characterise structural, conformational, and peptide binding features of the tandem WW domains from YAP and TAZ. The YAP WW2 solution structure confirms that the domain has the canonical anti-parallel β-sheet WW fold. WW1 of YAP and both WW domains of TAZ undergo conformational exchange. The region linking the two WW domains is flexible and allows interaction of both WW domains with peptides containing single and dual PPxY binding motifs. In addition to YAP and TAZ, tandem WW domains are also present in the core and upstream Hippo pathway proteins Salvador and Kibra. Both proteins contain one atypical WW domain; the tandem WW domains of these two proteins are unstable. Understanding structure and function of Hippo pathway components could contribute to drug development and will also contribute to knowledge of protein folding and interactions.

abstract: Cyanovirin-N (CVN) is a cyanobacterial lectin with potent anti-HIV activity, mediated by binding to the N-linked oligosaccharide moiety of the envelope protein gp120. CVN offers a scaffold to develop multivalent carbohydrate-binding proteins with tunable specificities and affinities. I present here biophysical calculations completed on a monomeric-stabilized mutant of cyanovirin-N, P51G-m4-CVN, in which domain A binding activity is abolished by four mutations; with comparisons made to CVN<super>mutDB</super>, in which domain B binding activity is abolished. Using Monte Carlo calculations and docking simulations, mutations in CVN<super>mutDB</super> were considered singularly, and the mutations E41A/G and T57A were found to impact the affinity towards dimannose the greatest. <super>15</super>N-labeled proteins were titrated with Man&#945;(1-2)Man&#945;, while following chemical shift perturbations in NMR spectra. The mutants, E41A/G and T57A, had a larger Kd than P51G-m4-CVN, matching the trends predicted by the calculations. We also observed that the N42A mutation affects the local fold of the binding pocket, thus removing all binding to dimannose. Characterization of the mutant N53S showed similar binding affinity to P51G-m4-CVN. Using biophysical calculations allows us to study future iterations of models to explore affinities and specificities. In order to further elucidate the role of multivalency, I report here a designed covalent dimer of CVN, Nested cyanovirin-N (Nested CVN), which has four binding sites. Nested CVN was found to have comparable binding affinity to gp120 and antiviral activity to wt CVN. These results demonstrate the ability to create a multivalent, covalent dimer that has comparable results to that of wt CVN. WW domains are small modules consisting of 32-40 amino acids that recognize proline-rich peptides and are found in many signaling pathways. We use WW domain sequences to explore protein folding by simulations using Zipping and Assembly Method. We identified five crucial contacts that enabled us to predict the folding of WW domain sequences based on those contacts. We then designed a folded WW domain peptide from an unfolded WW domain sequence by introducing native contacts at those critical positions. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Biochemistry 2014

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第18095号 / 理博第3973号 / 新制||理||1573(附属図書館) / 30953 / 京都大学大学院理学研究科化学専攻 / (主査)教授 三木 邦夫, 教授 杉山 弘, 教授 秋山 芳展 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

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LRP2/Megalin ist ein Rezeptor der LDL-Rezeptor Genfamilie mit essentieller Funktion in der Entwicklung des Zentralnervensystems. Der Rezeptor wird im Neuroepithel des Embryos exprimiert und steuert die Ausbildung der Vorderhirnstrukturen. In weiteren Untersuchungen an LRP2-defizienten Mäusen konnte ich zeigen, dass der Verlust der Expression des Rezeptors in adulten Tieren zu einer Beeinträchtigung der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen in der subventrikulären Zone (SVZ) des lateralen Ventrikels führt. Infolgedessen war die Anzahl der Neuroblasten reduziert, die zum olfaktorischen Bulbus wandern und dort zu Interneuronen differenzieren. Anhand immunhistologischer Untersuchungen konnte ich nachweisen, dass der Verlust von LRP2 zu einer verminderten Anzahl GFAP-positiver Zellen, die auch die neuronalen Stammzellen (Typ B Zellen) umfassen, führt. Weiterhin wiesen LRP2 Mutanten eine Reduktion in den Signalen für Nestin, DLX2, PSA-NCAM und DCX. Meine derzeitige Hypothese besagt daher, dass LRP2 ebenso wie im embryonalen Neuroepithel auch in der adulten neuronalen Stammzellnische eine Rolle bei der Regulation der BMP4 Signalwege spielt. Dies wird möglicherweise durch Endozytose-vermittelte Aufnahme mit anschließendem Abbau des Morphogens durch LRP2 vermittelt, wie es bereits in vitro gezeigt werden konnte. BMP4 hat im Wesentlichen eine anti-proliferative Wirkung. Eine exakt gesteuerte Regulation der Konzentration dieses Morphogens ist daher eine Vorraussetzung für ein Neurogenese-permissives Milieu in der adulten neurogenen Stammzellnische. Die Ergebnisse meiner Arbeit entschlüsseln eine neue Rolle von LRP2 in der adulten Neurogenese. Die Expression des Rezeptors im Ependym des lateralen Ventrikels ist essentiell für die Regulation der BMP Signalwege in der neurogenen Stammzellnische. / LRP2 (also know as megalin) is a member of the low-density lipoprotein receptor gene family that plays an important role in regulation of neurogenesis in the embryonic neural tube. During early forebrain development, LRP2 deficiency leads to an increase in bone morphogenetic protein 4 (Bmp4) expression and signalling in the dorsal neuroepithelium, and a loss of sonic hedgehog (Shh) expression in the ventral forebrain. In this thesis I demonstrate that LRP2 is expressed in ependymal cells of the lateral ventricles in the adult brain. Intriguingly, expression is restricted to the ependyma that faces the stem cell niche. Expression is not seen in ependyma elsewhere in the lateral ventricles or in the dentate gyrus, the second neurogenic zone of the adult mouse brain. I further show that lack of LRP2 expression in adult mice results in impaired proliferation of neural precursor cells in the SVZ resulting in a decreased number of neuroblasts reaching the olfactory bulb. Using immunohistological detection of marker proteins, absence of LRP2 was shown mainly to affect the GFAP-positive neuronal precursor cell population in the SVZ (B cells). Furthermore, Lrp2 mutant mice also showed a decrease in the signals for nestin, DLX2, PSA-NCAM and DCX. Reduced neurogenesis in the SVZ in LRP2-deficient mice coincides with a significant increase in BMP2/4 expression and enhanced activation of downstream mediators Phospho-SMAD1/5/8 and ID3 in the stem cell niche. My findings revealed a novel regulatory pathway whereby LRP2 down-regulates BMP signaling to modulate the instructive microenvironment of the SVZ and to enable adult neurogenesis to proceed. Thus, LRP2 plays a crucial role in regulating BMP-signaling levels in the adult SVZ, highlighting the unique role of ependymal cells in this stem cell niche. The underlying mechanism of LRP2 action in control of neurogenesis may thus be conserved between the embryonic and adult brain.

Die Haut ist eine oft übersehene Komponente des angeborenen Immunsystems der Mücken. Die Haut der Mücke bildet eine physische Barriere, die die mikrobielle Homöostase aufrechterhält, das Eindringen von Toxinen wie Insektiziden verhindert und das Austrocknen verhindert. Die am meisten untersuchten Akteure des Immunsystems von Stechmücken sind das Fettgewebe und die Blutzellen, aber die Hauttalg-Fabriken, die Oenozyten, werden in Studien nur selten berücksichtigt. Mückenpuppen haben aktiv funktionierende immunitätsbezogene Organe, einschließlich derjenigen, die Hautbarrieren produzieren. Ihre biologische Rolle in diesem Entwicklungsstadium ist kaum bekannt, aber der Übergang von der Puppen- zur Erwachsenenhaut und die Auffälligkeit der talgproduzierenden Zellen machen dieses Stadium zu einem vielversprechenden Entwicklungsstadium für die Untersuchung der Hautbildung. Mit Hilfe der Transkriptomanalyse beschreiben wir die Rolle der Blutzellen bei der Entwicklung des chitinösen Teils der Insektenhaut, die Beteiligung des Fettkörpers an der Immunität und bestätigen die Rolle der talgproduzierenden Zellen im Lipidstoffwechsel. Darüber hinaus beschreiben wir talgsezernierende Zellen als einen bedeutenden Wirkungsort des NF-kappaB-ähnlichen IMD-Rel2-Pathway, in dem der Transkriptionsfaktor Rel2 die Retinoid-Homöostase reguliert. Schließlich bestätigen wir eine 100 Jahre alte Beobachtung, wonach sebumsezernierende Zellen der Stechmücke ihren Zellinhalt in einem Netzwerk von Vesikeln absondern. Wir beschreiben extrazelluläres Chromatin als Fracht in diesem Vesikelnetzwerk und sein antimikrobielles Potenzial. / The skin is an often overlooked component of the mosquito's innate immune system. The mosquito skin provides a physical barrier that maintains microbial homeostasis, prevents the entry of toxins like insecticides, and avoids desiccation. The most studied players in the immune system of mosquitoes are the adipose tissue and blood cells, but studies rarely consider the skin sebum factories, oenocytes. Mosquito pupae have actively functional immunity-related organs, including those producing skin barriers. Their biological roles at this developmental stage are poorly understood, but the pupae-to-adult metamorphic skin transition and the conspicuity of sebum-secreting cells make it a promising developmental stage to study skin formation. We use transcriptomics to describe the role of blood cells in the development of the chitinous section of the insect skin, the involvement of the fat body in immunity, and confirm the lipid metabolism role of sebum-secreting cells. Furthermore, we describe sebum-secreting cells as a significant action site of the NF-kappaB-like IMD-Rel2 pathway where the transcription factor Rel2 regulates retinoid homeostasis. Finally, we confirm a 100-year-old observation of how mosquito sebum-secreting cells secrete their cellular contents in a network of vesicles. We describe extracellular chromatin as cargo inside this vesicle network and its antimicrobial potential.

Die Invasion von Leukozyten in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein wesentlicher Bestandteil bei der Pathogenese von Hirnverletzungen sowie akuten und chronischen Entzündungsvorgängen im Gehirn. Mikrogliazellen, die überwiegende Population immunkompetenter Zellen des ZNS, stellen die erste Verteidigungslinie im Hinblick auf Verletzungen und Erkrankungen des Gehirns dar. Im Rahmen vieler neurodegenerativer Erkrankungen wird die Zerstörung von Neuronen, aber auch die kollaterale Gewebsschädigung auf die Aktivierung der Mikrogliazellen zurückgeführt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig einen regulatorischen Aktivierungszustand der Mikroglia (CD40dimCD86dimIL-10high), der zur Induktion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen (Treg) führt. Die Stabilität und funktionelle Aktivität Mikroglia-induzierter Treg konnte sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. In vitro inhibierten sie die Proliferation antigen-spezifischer Effektorzellen, in vivo führte ein adoptiver Transfer der regulatorischen T-Zellen zur Abmilderung des Krankheitsverlaufes experimentell induzierter, autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE). Mikrogliazellen unterstützten sowohl die Proliferation bereits ausgebildeter regulatorischer T-Zellen als auch deren Differenzierung aus naiven T-Zellen. Die Induktion regulatorischer T-Zellen durch Mikroglia war Major Histocompatibility Complex (MHC)-II-abhängig und antigenspezifisch. Für Untersuchungen zur in vivo Relevanz wurden MHC-II-chimäre Mäuse generiert und eine Läsion im entorhinalen Kortex gesetzt. Fehlte MHC-II in ZNS-residenten Zellen, wurden weniger regulatorische T-Zellen pro Leukozyt in die lädierten Hemispheren rekrutiert. Zusammenfassend demonstrieren diese Ergebnisse das Modulationspotential von Mikrogliazellen auf die CD4+ T-Zellantwort. Die Mikroglia-induzierte Differenzierung und Proliferation von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen ist ein möglicher Mechanismus der Regulation von Entzündungsvorgängen im ZNS durch Mikrogliazellen. / The invasion of leukocytes into the central nervous system (CNS) is a key event in the pathogenesis of CNS injury and acute or chronic inflammatory neurological diseases. However, regulatory mechanisms of local innate immune responses that limit CNS inflammation are only poorly understood. Microglia are the predominant innate immune cells of the brain and present the first line of defence in CNS injury or disease. In the context of neurodegenerative disease, microglia activation accounts for collateral tissue damage and neurodestruction. This thesis for the first time describes a regulatory microglia phenotype (MHCII+CD40dimCD86dimIL-10high) that induced a strong Foxp3+ regulatory T cell (Treg) response. Microglia-induced Treg cells were stable and functionally active in vitro by inhibiting antigen-specific proliferation of effector T cells and in vivo, by attenuating experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) disease course after adoptive transfer. The data also suggested that regulatory microglia can mediate both, proliferation of Foxp3+ Treg cells and de novo differentiation from naive CD4+ T cells. Microglia-mediated Treg induction was proven to be MHCII and antigen-dependent. Using entorhinal cortex lesion (ECL) as a brain injury mouse model, diminished Foxp3+ Treg cell recruitment per infiltrated leukocyte in chimeric mice lacking MHCII specifically in the CNS was demonstrated, indicating in vivo relevance of antigen presentation by brain resident cells. Taken together, these findings demonstrate that microglial cells can directly modulate CD4+ T cell responses by regulating molecule levels for efficient antigen presentation and levels of secreted cytokines and chemokines. Microglia-mediated differentiation and proliferation of Foxp3+ Treg cells can be one of the mechanisms how microglia contribute to local immune homeostasis and limit CNS inflammation.

Diese aus drei verschiedenen Studien bestehende Arbeit trägt mittels Verknüpfung von Anatomie (Struktur) und Physiologie oder Verhalten (Funktion) zu einem besseren Verständnis von somatosensorischer Informationsverarbeitung bei. In der ersten Studie untersuchten wir wie das Nervensystem der Ratte sich an das kontinuierliche Nachwachsen und Ausfallen der Tasthaare anpasst. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Barrel-Kortex Neurone nach Auslenkung von sowohl jungen oder alten Tasthaaren ähnliche neuronale Antworten aufweisen. Wir konnten auch beobachten, dass junge und alte Tasthaare gemeinsam im Follikel innerviert werden und im Kortex nicht separat topologisch repräsentiert sind. Diese Ergebnisse könnten erklären wie die Stabilität von Wahrnehmung während fortlaufenden körperlich-sensorischen Veränderungen gewährleistet wird. In der zweiten Studie identifizierten wir Details der kortikalen Nasen Repräsentation und konnten zeigen, dass die Organisation von Schicht 4 im Somatosensorischen Kortex in Nagetieren konserviert ist. Wir fanden auch eine Kopplung von Nervenzellaktivität mit der Atmung, was für eine koordinierte Verarbeitung von Tastsinn und Atmung im Nasen-Somatosensorischen Kortex spricht. In der dritten Studie charakterisierten wir die kortikale Repräsentation der Schnauze im Hausschwein und konnten zeigen, dass dessen makroskopische, drei-dimensionale Erscheinung viele Details aufweist, die auch bei der tatsächlichen Schnauze zu finden sind. Ähnlich wie bei unseren histologischen Beobachtungen im Nasen- Somatosensorischen Kortex von Nagern konnten wir im Hausschwein Kortex eine Verjüngung von Schicht 4 der mutmaßlichen Repräsentation des Nasenlochs beobachten. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit i) einen potentiellen Mechanismus für Kontinuität der Wahrnehmung während körperlichen Veränderungen ii) Details der kortikalen Nasen-Repräsentation und dessen Verhältnis zur Atmung und iii) isomorphe Eigenschaften der kortikalen Schnauzen-Repräsentation im Hausschwein. / Topological mapping of body part representations in the brain have long been studied in neuroscience. In this thesis, three separate studies investigate such somatosensory representations by relating anatomy (structure) to physiology or behavior (function). In the first study we investigated whether and how the rat nervous system adapts to whiskers regrowth. We found that barrel cortex neurons displayed similar response properties to young and old whisker deflection and that both whiskers share their peripheral innervation in the same follicle. Our results further suggest that young and old whiskers do not form topologically distinct representations in the cortex. Such findings illuminate how perceptual stability is maintained despite the constant change of bodies and sensory structures. In the second study we identified the rodent nose somatosensory cortex and found that its tangential layer 4 organization is conserved across rodents. We also found significant respiration locked neural activity in the rat nose somatosensory cortex, suggesting coordinated processing of touch and respiration. In the third study we characterized the pig rostrum somatosensory cortex and found that its three-dimensional, gross organization matches the detailed structure of the actual rostrum appearance. We also found that layer 4 appears thinner in the putative nostril, similar to our results in the rodent nose somatosensory cortex. Collectively, our data i) reveal potential mechanisms for perceptual stability during bodily changes ii) identify the rodent nose somatosensory cortex and its relationship to respiration and iii) a striking isomorphism of the pig cortical rostrum representation with the pig snout.

Cette thèse présente le mesure des sections efficaces de production WW MS et la détermination des couplages triples (TGCs) correspondants en utilisant ces 4.7 ${rm fb}^{-1}$ de donnes 2011 de collision $pp$. Ces mesures permettent un test contraignant du secteur 'électrofaible non abélien $SU(2) times U(1)$ du Modèle Standard; donnent l'opportunité de sonder la nouvelle physique `a travers les couplages triples anormaux de bosons de jauge (aTGCs) qui seront observés dans la distribution des variables cinématiques des WW produits ou de leurs produits de désintégration finaux dans le secteur de haute 'énergie; et permettent d'avoir une bonne compréhension du bruit de fond irréductible dans la recherche du boson de Higgs dans le canal de d'esint'egration $H rightarrow W^{+}W^{-}$.Ce travail de th`ese donne un base solide pour les mesures `a venir de la production WW avec les $sim$25 ${rm fb}^{-1}$ de luminosité intègré de donnes a 8 TeV prévue pour la fin 2012, qui conduiront vers une amélioration de la précision et des limites plus strictes sur les aTGCs. / This thesis presents a measurement of the SM WW production cross section and the determination of the corresponding limits on anomalous triple gauge boson couplings (aTGCs), using the 2011 4.7 ${rm fb}^{-1}$ $pp$ collisions data at 7 TeV collected in 2011. The measurement allows for a stringent test of the non-Abelian $SU(2) times U(1)$ SM electroweak sector and probes new physics that could manifest itself through aTGCs that may alter the observed production cross section or kinematic distributions. This measurement also provides a good understanding of the irreducible background in searches for the Higgs boson through the $Hrightarrow W^{+}W^{-}$ decay channel.This thesis work has laid a solid foundation for further measurements of the WW production with the $sim$25 ${rm fb}^{-1}$ integrated luminosity 8 TeV recorded data expected by the end of 2012, which will further improve the precision and yield more stringent limits on the aTGCs.

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