Im Gehirn gemessene Extrazelluläre Feldpotentiale (EFPs) sind ein wichtiges Maß für neuronale Aktivität. In vielen Fällen ist der genaue physiologische Ursprung dieser Potentiale unbekannt oder umstritten. Der auditorische Hirnstamm der Schleiereule bietet eine ausgezeichnete Möglichkeit, die EFPs und ihren Ursprung zu untersuchen. Der Hirnstamm der Eule ist ideal, weil das Feldpotential in ihm sehr stark ist, weil die zugrundeliegende Anatomie wohl-untersucht ist, und weil das Potential sehr einfach durch auditorische Stimulation gesteuert werden kann. In dieser Arbeit präsentiere ich zwei Beispiele, in welchen ich mir die einzigartigen Eigenschaften der Schleiereule zunutze mache, um das EFP zu erforschen. Das erste Beispiel behandelt Axone, und ich zeige, dass neuronale Aktivität in Axonbündeln, welche eine charakteristische Endzone besitzen, ein starkes Dipolmoment erzeugen kann. Im zweiten Beispiel behandele ich Synapsen. Aus den EFPs der Synapsen konnte ich die Merkmale der synaptischen Kurzzeitplastizität extrahieren. Die Methoden und Erkenntnisse die ich entwickelt habe sind auf andere Organismen übertragbar und erweitern das Verständnis vom Einfluss unterschiedlicher anatomischer Strukturen auf das EFP. / Extracellular field potentials (EFPs) recorded in the brain are an important indicator of neural activity for neuroscientists. In many cases, their physiological basis is unknown or debated. The barn owl auditory brainstem provides an excellent opportunity to study these EFPs and their origins. The barn owl auditory brainstem is ideal because the field potentials are very large and very easily controlled by the auditory stimulus, and the underlying anatomy is well known. Here I present two examples of exploiting the unique properties of the EFP in the barn owl auditory brainstem. The first is concerned with axons, where I show that activity in axon bundles with characteristic termination zones generates strong dipole moments. The second example is concerned with synaptic currents, from which I was able to extract a signature of short-term plasticity. The methods and insights I developed are applicable to other organisms as well, and contribute to the general understanding of the roles different anatomical structures can play in the generation of EFPs.

Um zu verstehen, wie das Gehirn von Säugetieren funktioniert, untersuchen wir wie neuronale Aktivität einerseits zu Kognition beträgt und andererseits komplexe Verhaltensweisen ermöglicht. Im Fokus dieser Doktorarbeit stehen dabei zwei Regionen der Großhirnrinde der Ratte: der parahippocampale Cortex und der motorische Cortex. Im ersten Teil haben wir neuronale Schaltkreise im parahippocampalen Cortex und in den oberen Schichten des enthorhinalen Cortex untersucht, während Ratten ihre Umgebung räumlich erkunden. Diese beiden Regionen tragen wesentlich zum Orientierungssinn bei. Dabei haben wir herausgefunden, dass anatomische Identität und Einbindung in den Microschaltkreis einerseits räumliche neuronale Signale, wie zum Beispiel der Aktivität von grid cells, border cells und head-direction cells, bestimmen. Andererseits tragen diese beiden Eigenschaften auch zur temporalen Präzision neuronaler Signale bei, wie zum Beispiel in Form von spike bursts, theta Modulation und phase precession. Im zweiten Teil dieser Doktorarbeit untersuchen wir die Aktivität von Neuronen im Vibrissen Motorcortex während komplexer Bewegungsabläufe der Schnurrhaare, die dem natürlichen Repertoire der Ratte entstammen: eigeninitiierte Bewegungen in freier Luft, Berührung von Artgenossen zur sozialen Interaktion und das Abtasten von Objekten. Dabei haben wir herausgefunden, dass neuronale Aktivität im Motorcortex während der Bewegung der Schnurrhaare unterdrückt ist, dass elektrische Microstimulation zum Rückzug der Schnurrhaare führt und, dass pharmakologische Blockade Bewegung der Schnurrhaare fördert. Um diese überraschende Beobachtung in einen breiteren Kontext zu integrieren, endet dieser Teil mit einer Bewertung der Literatur zu der bewegungsunterdrückenden Wirkung von Motorcortex Aktivität bei Nagetieren, Primaten und Menschen. / In order to understand how the mammalian brain works, we must investigate how neural activity contributes to cognition and generates complex behavioral output. In this thesis I present work, which focuses on two regions of the cerebral cortex of rats: parahippocampal cortex and motor cortex. In the first part of the thesis we investigate neural circuits in the parasubiculum and the superficial medial enthorhinal cortex, two structures that play a key role in spatial cognition. Briefly, we find that the in these regions, anatomical identity and microcircuit embedding is a major determinant of both spatial discharge patterns (such as the discharge patterns of grid cells, border cells and head-direction cells) and temporal coding features (such as spike bursts, theta-modulation and phase precession). In the second part of the thesis we investigate the activity of neurons in vibrissa motor cortex during complex motor behaviors, which play a vital role in rat ecology: self-initiated bouts of exploratory whisking in air, whisking to touch conspecifics during social interactions and whisking to palpate objects. Briefly, we find that neural activity decreases during whisking behaviors, that microstimulation leads to whisker retraction and that pharmacological blockade increases whisker movement. Thus, our observations collectively suggest that a primary role of vibrissa motor cortex activity is to suppress whisking behaviors. The second part of the thesis concludes with a literature review of motor suppressive effects of motor cortical activity across rodents, primates and humans to put this unexpected finding in a broader context.

Diese Dissertation befasst sich mit dem Einfluss von Resonanz und Synchronisation auf die Präzision und die Zuverlässigkeit von Rezeptorneuronen. Präzision von individuellen Neuronen an der Peripherie eines Nervensystems, beispielsweise in sensorischen Neuronen, ist äusserst wichtig für höhere Stufen der Verarbeitung. Verschiedene Formen von Resonanz können dazu führen, dass sich die Präzision eines Neurons erhöht. Hier wird neuronale Timing-Resonanz untersucht: diese kommt vor, wenn ein Neuron für Signale mit Frequenzen um seine Resonanzfrequenz - seiner Feuerrate - Aktionspotentiale (Spikes) mit höherer Präzision produziert, als für andere Frequenzen. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Experimenten an auditorischen Rezeptorneuronen der Heuschrecke Locusta migratoria werden Spike-Antworten gewonnen, welche mit verschiedenen Zuverlässigkeitsmassen auf ihre Präzision untersucht werden. Verschiedene auditorische Stimulus-Typen und Stimulus-Parameter werden verwendet, um Kopplungsverhältnisse zwischen der Stimulusfrequenz und der Spike-Antwort und deren Einfluss auf Spike-Zeiten-Zuverlässigkeit, Phasen-Kopplung und Spike-Jitter zu untersuchen. Dabei werden durch Variation der Stimulusamplitude sogenannte Arnold-Zungen sichtbar. Der deutlichste Effekt ist für Stimulusfrequenzen in der Nähe der mittleren Feuerrate zu sehen, wo die Breite der Arnold-Zunge ansteigt, wenn die Stimulusamplitude erhöht wird und erhöhte Werte für die Zuverlässigkeitsmasse vorhanden sind. / This thesis deals with the effect of resonance and synchronisation on the precision and reliability of receptor neurons. Precision of individual neurons at the periphery of a nervous system, for example sensory neurons, is very important for later stages of processing. Different forms of resonance lead to an increase of precision in a neuron. Here, we examine neuronal timing resonance: a neuron produces action potentials (spikes) with greater precision around its resonance frequency - its firing rate - than at other frequencies. By using electrophysiological experiments on auditory receptor neurons of the locust Locusta migratoria, spike responses are generated whose precision is investigated using different reliability measures. Different types of auditory stimuli and stimulus parameters are used to examine locking of the spike response to the frequency of the stimulus, and the influence this locking has on spike time reliability, phase coupling and spike jitter. By varying the stimulus amplitude, so-called Arnold tongues become visible. The most prominent effect is seen for stimulus frequencies around the average firing rate, where the width of the Arnold tongue and the values of the reliability measures increases for increasing stimulus amplitudes.

PixD (Slr1694) ist ein Photorezeptor, der den sensors of blue light using FAD (BLUF) Proteinen zugeordnet wurde. Die Übertragung des Stimulus auf das Apoprotein erfolgt in dieser Proteinfamilie über eine Neuordnung des Wasserstoffbrückennetzwerkes um den Kofaktor, in das die strikt konservierten Reste Tyrosin-8 (Y8), Glutamin-50 (Q50) und möglicherweise das semi-konservierte Tryptophan-91 (W91) involviert sind. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Hinweise auf die Wasserstoffbrückenkonfiguration der Flavinbindetasche in Dunkel- und Lichtzustand zu erhalten, um eine bessere Vorstellung von der Stabilisierung des Lichtzustandes zu bekommen und mögliche Wege der Signaltransduktion an die Proteinoberfläche einzugrenzen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich lichtaktivierte Interaktionsänderungen zwischen Apoprotein und Chromophor auf die Neubildung einer Wasserstoffbrücke zum Flavin C4-Carbonyl beschränken. In Übereinstimmung zu früheren Analysen liegt das Q50 im Dunkelzustand in seiner Amid-Form vor. Sein Seitenkettencarbonyl ist im Lichtzustand vermutlich zu Y8 ausgerichtet, wobei Hinweise auf eine Amid-Imidsäure-Tautomerisierung des Glutamins in PixD gefunden wurden. Eine selektive Isotopenmarkierung des Tryptophan-91 zeigte Anzeichen für eine Verlängerung des β5-Stranges, die wahrscheinlich ein zentrales Element der Signalweiterleitung an die Proteinoberfläche darstellt. Möglicherweise erstreckt sich das Wasserstoffbrückennetzwerk dabei bis in die über dem beta5-Strang liegende alpha-Helix. Wird es gestört, scheint das Proteininnere für Imidazol zugänglich gemacht zu werden, wo es die Aktivierungsenergie für die Rückkehr in den Dunkelzustand beeinflusst. Auch Substitutionen des H73 im gegenüberliegenden Eckstrang des beta-Faltblattes beeinflussten die Geschwindigkeit der Dunkelrelaxation von PixD. Sie veränderten die IR-Absorption gegenüber dem Wildtyp jedoch nicht und unterstützen die Theorie einer Protonenleitung über das benachbarte H72. / The photoreceptor PixD (Slr1694) belongs to the sensors of blue light using FAD (BLUF) protein family. These photoreceptors propagate the signal by a rearrangement of hydrogen bonds surrounding the cofactor, involving the highly conserved residues tyrosine-8 (Y8), glutamine 50 (Q50) and perhaps the semi-conserved tryptophan-91 (W91). One aim of the presented work was to gain a deeper insight into the hydrogen bond configuration of the flavin binding pocket in the light and dark state conformations. Thereby, knowledge of the stabilization mechanisms for the light state and the signal propagation to the protein surface could be acquired. The results indicate a restriction of light induced changes in hydrogen bonding of the flavin to its C4 carbonyl. In agreement with former studies, the Q50 forms the amide isomer in the dark state. Its side chain carbonyl group most likely points towards Y8 in the active protein. Besides, the results support an amide-imidic acid-tautomerization of Q50 in PixD. A selective isotope labeling of the tryptophan-91 localized at the beginning of an edge strand of the beta sheet indicates an elongation of the secondary structure that may represent a central element of the signal propagation to the protein surface. The secondary structure is possibly connected with an alpha helix located above the beta5 strand by hydrogen bonds. A disturbance of this interaction probably allows the base catalyst imidazole to enter the protein core. Substitutions of H73 in the opposing edge beta strand changed the rate of the PixD dark relaxation as well. However, they had no visible effect on the infrared absorbance compared to the wild type and hence support a putative involvement of the neighbouring H72 in proton transfer reactions.

In der synaptischen Vesikelmembran adulter Neuronen bildet Synaptobrevin mit Synaptophysin den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex. Der Komplex wird im Gegensatz zum SNARE-Komplex nicht in embryonalen Membranen gebildet, sondern erst während der neuronalen Entwicklung hochreguliert. Dabei erfährt Synaptophysin wahrscheinlich eine posttranslationale Modifizierung, die durch einen niedermolekularen Faktor bewirkt wird. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex spielt eine entscheidende Rolle innerhalb der Präsynapse bei der Bereitstellung von Synaptobrevin zur Bindung seiner SNARE-Partner an der Plasmamembran. Im Zustand erhöhter exozytotischer Aktivität der Synapse beschleunigt der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex die Rekrutierung von Synaptobrevin für eine erneute Bildung des SNARE-Komplexes und ermöglicht damit schnelle Exozytose-Endozytose-Zyklen bei erhöhter präsynaptischer Stimulation. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex und der SNARE-Komplex schließen sich gegenseitig aus. Synaptische Membranen sind aus Lipiden und Proteinen aufgebaut, welche miteinander in Wechselwirkungen stehen. Innerhalb der Membranen formieren sich Subdomänen wie Lipid Rafts die durch eine besondere Lipidzusammensetzung stabilisiert werden und mit speziellen Proteinen bevorzugt assoziieren. Durch die spezielle Organisation des Membranaufbaus können die Prozesse der Endozytose und der Exozytose zum Teil reguliert werden. Synaptische Vesikel, die zu den kleinsten Zellorganellen zählen, zeigen einen besonders hohen membranären Cholesterolgehalt. Synaptophysin ist ein integrales Membranprotein synaptischer Vesikel und konnte zusätzlich als spezifisch cholesterolbindendes Protein identifiziert werden. Durch die Assoziation mit cholesterolreichen Nanodomänen der synaptischen Vesikelmembran könnten die Funktionen von Synaptophysin bei der Membranstabilisation und im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex der synaptischen Vesikelmembran beeinflusst werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nach Cholesterolverminderung der Membranen von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen mittels Filipin und Methyl-ß-cyclodextrin Synaptophysin in dem Detergens Triton X-100 unlöslicher wird. Die Cholesterolverminderung der Membranen von Neuronen aus Rattengehirngewebe und Hippokampuskulturen mittels Methyl-ß-cyclodextrin und Lovastatin führte weiterhin zu einer verminderten Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes in der synaptischen Vesikelmembran. Somit scheint die Cholesterolassoziation von Synaptophysin und damit die Organisation der synaptischen Vesikelproteine innerhalb von Membrandomänen entscheidend an der Regulation der Proteininteraktionen im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex beteiligt zu sein. Zusätzlich trägt Synaptophysin durch seine Cholesterolbindung wahrscheinlich zur Stabilisierung des hohen Krümmungsgrades der Membran der synaptischen Vesikel bei. Die Auswirkungen des verminderten Cholesterolgehaltes auf Synaptophysin und den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex konnten auch bei homozygoten Mausmutanten für die Niemann-Pick Krankheit nachgewiesen werden. Der Cholesterolgehalt synaptischer Vesikel ist also für die Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes entscheidend und beeinflusst direkt die synaptische Effizienz. / Synaptobrevin interacts with synaptophysin in membranes of adult small synaptic vesicles and forms the synaptophysin/synaptobrevin complex. In contrast to the SNARE complex the synaptophysin/synaptobrevin complex only occurs in adult rat brain but is absent in embryonic brain. Changes in the binding properties of synaptophysin are probably induced by a factor of low molecular weight and correlate with posttranslational modifications of the protein. The synaptophysin/synaptobrevin complex plays an important role within the presynaptic terminal promoting synaptobrevin to bind its SNARE partners at the plasma membrane. In times of increased synaptic activity at the synapse the synaptophysin/synaptobrevin complex accelerates the recruitment of synaptobrevin to form new SNARE complexes and allows for fast exocytotic/endocytotic cycles. The synaptophysin/synaptobrevin complex and the SNARE complex are mutually exclusive. Major constituents of synaptic membranes are lipids and proteins which are subjected to continuous interactions. Within the membrane form specialized environments known as lipid rafts that are stabilized through tightly packed lipids and proteins that associate preferentially with these domains. The characteristic organisation of membrane structures is crucial for regulating the process of endocytosis and exocytosis. Synaptic vesicles are among the smallest cell organelles and are especially enriched in cholesterol. The integral membrane protein synaptophysin in addition was identified as a major specifically cholesterol-binding protein. Lateral association with cholesterol enriched subunits of the synaptic vesicle membrane may contribute to mediate the functions of synaptophysin in stabilising membrane structures and may in part regulate synaptophysin/synaptobrevin complex formation. Here we show that depletion of the cholesterol content of CHOp38 cell and PC12 cell membranes by Filipin and Methyl-ß-cyclodextrin significantly changes the solubility of synaptophysin in non-ionic detergents like Triton X-100. After cholesterol depletion of adult rat brain and primary cultures of mouse hippocampus by Methyl-ß-cyclodextrin and the HMGCoA-reductase inhibitor Lovastatin the synaptophysin/synaptobrevin complex was seen to be downregulated. Thus, the synaptophysin/synaptobrevin interaction critically depends on high cholesterol content of the synaptic vesicle membrane. Thereby, synaptophysin likely contributes to stabilise the high membrane curvature of synaptic vesicles. The effects of cholesterol depletion on functional properties of synaptophysin and the synaptophysin/synaptobrevin complex could also be shown on homozygous littermates of the mouse model of Niemann-Pick type C disease. Our investigation indicates that the cholesterol content of synaptic vesicles appears to be important for the fusion of the synaptophysin/synaptobrevin complex and directly affects synaptic efficiency.

Die Struktur des Knochenmaterials wird während des gesamten Lebens durch dynamische Prozessen verändert. Diese sind der Umbauprozess, bei dem existierendes Material entfernt und durch neues, vorerst weiches ersetzt wird. In dieses weiche Material wird im sog. Mineralisierungsprozess Mineral eingelagert und somit die Steifigkeit erhöht. Diese zwei Prozesse führen zu einem heterogenen Knochenmaterial. Das komplexe Zusammenspiel kann durch Knochenkrankheiten beeinflusst werden und zu einem mechanischen Versagen des Materials führen. Wie viel Einfluss dabei allein dem Umbauprozess und dem Mineralisierungsprozess zuzuschreiben sind, konnte bislang nicht geklärt werden. An diese Fragestellungen wird in der vorliegenden Dissertation mit physikalischen und numerischen Methoden herangegangen. Das heterogene Material ist das Ergebnis des Mineralisierungs- und Umbauprozesses und wird abkürzend BMDD (für bone mineralization density distribution) genannt, die für alle gesunden Menschen gleich ist und bei Knochenkrankheiten davon abweicht. Mittels Modellierung wird eine Störung in der Mineralisierung simuliert, die zu Verschiebungen in der BMDD führt. Diese Verschiebungen können verglichen werden mit einem veränderten Umbauprozess. Der unterschiedliche Einfluss der beiden Prozesse liegt im zeitlichen Verlauf. Die Mineralisierungskinetik im Knochen konnte durch die neuartige Auswertung von 3D in vivo micro-CT-Bildern von Mäusen erstmals quantifiziert werden. Die Auswertung bestätigte, die schnellere Mineralisierung im neugeformten und die langsamere in bereits vorhandenem Knochen. Wie der Umbauprozess im kompakten Knochen gesteuert sein kann, wurde mittels Anordnungsmechanismen der Osteone beschrieben. Für einen solchen Knochenbaustein war es verboten innerhalb einer definierten Zone eines anderen Bausteins gebildet zu werden. Diese Zone ließ sich am besten durch einen normalverteilten Radius, mit einer dazugehörigen Variabilität beschreiben. / The structure of the bone material is continuously changed during the life by dynamic processes. These are the remodeling process during which the existing material is replaced by new, initially soft material. In this soft material mineral is incorporated during the so called mineralization process, thus increasing the stiffness. These two processes lead to a heterogeneous bone material. Their interplay can be perturbed by bone diseases, which can lead to material failure. It remains unclear to which degree each of these two processes contributes during diseases. Yet, while the remodeling process is known to be mechanically controlled, it is unclear how mechanical stimuli affect the mineralization process. The heterogeneous mineral distribution in trabecular bone is the result of the complex interplay between the mineralization and the remodeling process and is called bone mineralization density distribution (BMDD). The BMDD is similar for all healthy adult humans. A deviation from this healthy distribution is indicative of bone diseases. With a mathematical model the influence of changed mineralization kinetics on the BMDD is investigated and compared to a remodeling change. The different influences lie in the time development. With a novel 3D analysis of in vivo micro-CT of the vertebra in a mouse tail the mineralization kinetics could be quantified for the first time. It could be e.g. shown that the bone is demineralized before it is completely resorbed. An algorithm was developed to understand how the remodeling process can be regulated. The arrangement of the building blocks could be described when such a block could only be placed within a defined zone of another building block. This zone could be best quantified when its radius was normally distributed with a corresponding standard deviation.

LRP2/Megalin ist ein Rezeptor der LDL-Rezeptor Genfamilie mit essentieller Funktion in der Entwicklung des Zentralnervensystems. Der Rezeptor wird im Neuroepithel des Embryos exprimiert und steuert die Ausbildung der Vorderhirnstrukturen. In weiteren Untersuchungen an LRP2-defizienten Mäusen konnte ich zeigen, dass der Verlust der Expression des Rezeptors in adulten Tieren zu einer Beeinträchtigung der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen in der subventrikulären Zone (SVZ) des lateralen Ventrikels führt. Infolgedessen war die Anzahl der Neuroblasten reduziert, die zum olfaktorischen Bulbus wandern und dort zu Interneuronen differenzieren. Anhand immunhistologischer Untersuchungen konnte ich nachweisen, dass der Verlust von LRP2 zu einer verminderten Anzahl GFAP-positiver Zellen, die auch die neuronalen Stammzellen (Typ B Zellen) umfassen, führt. Weiterhin wiesen LRP2 Mutanten eine Reduktion in den Signalen für Nestin, DLX2, PSA-NCAM und DCX. Meine derzeitige Hypothese besagt daher, dass LRP2 ebenso wie im embryonalen Neuroepithel auch in der adulten neuronalen Stammzellnische eine Rolle bei der Regulation der BMP4 Signalwege spielt. Dies wird möglicherweise durch Endozytose-vermittelte Aufnahme mit anschließendem Abbau des Morphogens durch LRP2 vermittelt, wie es bereits in vitro gezeigt werden konnte. BMP4 hat im Wesentlichen eine anti-proliferative Wirkung. Eine exakt gesteuerte Regulation der Konzentration dieses Morphogens ist daher eine Vorraussetzung für ein Neurogenese-permissives Milieu in der adulten neurogenen Stammzellnische. Die Ergebnisse meiner Arbeit entschlüsseln eine neue Rolle von LRP2 in der adulten Neurogenese. Die Expression des Rezeptors im Ependym des lateralen Ventrikels ist essentiell für die Regulation der BMP Signalwege in der neurogenen Stammzellnische. / LRP2 (also know as megalin) is a member of the low-density lipoprotein receptor gene family that plays an important role in regulation of neurogenesis in the embryonic neural tube. During early forebrain development, LRP2 deficiency leads to an increase in bone morphogenetic protein 4 (Bmp4) expression and signalling in the dorsal neuroepithelium, and a loss of sonic hedgehog (Shh) expression in the ventral forebrain. In this thesis I demonstrate that LRP2 is expressed in ependymal cells of the lateral ventricles in the adult brain. Intriguingly, expression is restricted to the ependyma that faces the stem cell niche. Expression is not seen in ependyma elsewhere in the lateral ventricles or in the dentate gyrus, the second neurogenic zone of the adult mouse brain. I further show that lack of LRP2 expression in adult mice results in impaired proliferation of neural precursor cells in the SVZ resulting in a decreased number of neuroblasts reaching the olfactory bulb. Using immunohistological detection of marker proteins, absence of LRP2 was shown mainly to affect the GFAP-positive neuronal precursor cell population in the SVZ (B cells). Furthermore, Lrp2 mutant mice also showed a decrease in the signals for nestin, DLX2, PSA-NCAM and DCX. Reduced neurogenesis in the SVZ in LRP2-deficient mice coincides with a significant increase in BMP2/4 expression and enhanced activation of downstream mediators Phospho-SMAD1/5/8 and ID3 in the stem cell niche. My findings revealed a novel regulatory pathway whereby LRP2 down-regulates BMP signaling to modulate the instructive microenvironment of the SVZ and to enable adult neurogenesis to proceed. Thus, LRP2 plays a crucial role in regulating BMP-signaling levels in the adult SVZ, highlighting the unique role of ependymal cells in this stem cell niche. The underlying mechanism of LRP2 action in control of neurogenesis may thus be conserved between the embryonic and adult brain.

Zusammenfassung in PDF Zielstellung: Der biologische Botenstoff N ist von signifikanter Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des Herz-Kreislauf-Systems. Pathologische Bedingungen sind oft auf eine veränderte Verfügbarkeit von N zurückzuführen. Das Verständnis der Regulierung der N-Bildung durch Endothelzellen (EC) und die nachfolgende N-Chemie im gesunden und kranken Organismus ist deshalb essentiell, jedoch längst nicht vollständig. Das Ziel dieser Dissertation war aus diesem Grund Untersuchungen zum Schutz von N vor der Wechselwirkung mit S (durch SOD-mimetische Nitroxide), sowie zum Effekt des Membranpotentials (Em) und des Zellwachstums (Proliferation) auf die Aktivität der endothelialen N Synthase (eNOS) an Kulturen von Atrium-Endothelzellen des Rindes (BAtEC). Methoden: Zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von N wurde die ozon-vermittelte N-Chemolumineszenz (N-CL) evaluiert, modifiziert und an verschiedene in vitro Systeme angepaßt. Die N-CL wurde auf Grundlage des durch SOD hemmbaren Abbaus von N durch S als ein neuartiger Ansatz zur Bestimmung physiologisch niedriger Konzentrationen an S vorgeschlagen. Ergebnisse: Die Nitroxide -hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl und 3-ethoxycar-bonyl-proxyl erhöhten die N-Konzentration durch ihre SOD-mimetische Wirkung in Modellsystemen von 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) und Kulturen von BAtEC. Mittels ESR-Spin-Trap Untersuchungen an Lösungen von SIN-1 wurde die Bildung von H-Addukten durch Dismutierung von S bestätigt, Peroxynitrit wurde als Quelle ausgeschlossen. Modulierung des Em (durch Veränderung der extrazellulären K + -Konzentration) beeinflußte die endotheliale N-Freisetzung; Hyperpolarisierung erhöhte, Depolarisierung verminderte die N Produktion. Inhibierung der elektrogenen Na + -K + ATPase induzierte synchrone Oszillationen der endothelialen N-Freisetzung. Die systematische Untersuchung zu EC-Wachstum/Proliferation zeigte keine Änderung der N-Produktion (in Gegenwart von SOD). Jedoch war die Menge von verfügbarem N (in der Abwesenheit von SOD) niedrig in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Die Expression der eNOS erhöhte sich mit der Kultivierungsdauer und erreichte ein Maximum bei Konfluenz. Die relative eNOS-Aktivität (N, 2-, und L-citrulline-Produktion pro eNOS-Protein) war am größten in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Schlußfolgerungen: Die Wechselwirkung mit S ist kritisch für die Halbwertszeit von N. Aus der durch diese Studie gezeigten Erhöhung von N in biologischen und chemischen Modellsystemen kann geschlußfolgert werden, daß Nitroxide unter Bedingungen einer S-bedingten Verminderung von verfügbarem N pharmakologische Wirksamkeit besitzen könn-ten. Untersuchungen ergaben den Nachweis zur Em-abhängigen Modulierung der endothelialen N-Freisetzung. Dies liefert eine Erklärung für die Em-bedingten Veränderungen des Gefäßto-nus, nachgewiesen während physiologischer Zellstimulierung, aber auch unter pathologischen Bedingungen. Untersuchungen zu EC-Wachstum/Proliferation lieferten den Beweis für die Ver-minderung von verfügbarem N in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC durch endogen gebildetes S. Die Expremierung von eNOS war proliferationsabhängig. Die spezifische eNOS-Aktivität war in proliferierenden BAtEC erhöht (wahrscheinlich durch post-translationale Verän-derungen) und in ruhenden BAtEC erniedrigt (wahrscheinlich durch Substrat- oder Kofaktormangel). / abstract in pdf Objective: The biological messenger n is of significant importance for the functionality of the cardiovascular system. Pathological conditions are often attributed to an altered availability of n. The understanding of the regulation of n formation by endothelial cells (EC) and the concomitant chemistry of n in health and disease is therefore essential but far from being complete. The objective of this dissertation was therefore to study in culture systems of bovine atrial endothelial cells (BAtEC) the protection of n from the interaction with S by SOD-mimetic nitroxides, and the effect of the membrane potential (Em) and cell growth/proliferation on the activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Methods: For the sensitive and specific detection of n, the ozone-mediated n chemiluminescence (n-CL) was evaluated, modified and adapted to various in vitro systems. Due to the SOD-inhibitable degradation of n by S , the n-CL was proposed as a novel approach to quantify the physiological low levels of S . Results: The nitroxides 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl, and 3-ethoxycarbonyl-proxyl increased the n concentration by their SOD-mimetic action in a model system of 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) and cultures of BAtEC. EPR spin trapping in SIN-1 solution revealed the formation of H adducts due to dismutation of S and not via decomposition of peroxynitrite. Changes in Em (by alteration of the extracellular K + concentration) affected the endothelial n release; membrane hyperpolarization increased, membrane depolarization decreased the n production. Inhibition of the electrogenic Na + -K + ATPase induced synchronous oscillations in endothelial n liberation. The systematic investigations on EC growth/proliferation showed no change in total n production (in the presence of SOD). However, the bioavailable n (in the absence of SOD) was low in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Expression of eNOS increased with culture duration with a maximum at confluence. Relative eNOS activity (n, 2, and L-citrulline production per eNOS protein) was highest in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Conclusions: The interaction of S is critical for the half-life of n. With the increase of n in biological and chemical model systems shown by this study, nitroxides might exert pharmacological potential under conditions of S -mediated diminution of bioavailable n. Experimental evidence was shown for the Em-dependent modulation of endothelial n formation. It supports an explanation for the Em-mediated changes of vascular tone, as demonstrated for physiological cell stimulation but also under pathological conditions. Investigations on the EC growth/proliferation provided evidence that BAtEC-derived S decreases bioavailable n in preconfluent, highly proliferating BAtEC, whereas expression of eNOS is proliferation-dependent. The specific eNOS activity is upregulated in proliferating BAtEC (probably via post-translational modifications) and down-regulated in quiescent BAtEC (probably via substrate or cofactor limitations).

Phagozyten entfernen apoptotische Zellen während der Entwicklung und beseitigen Pathogene im Immunsystem. Die zugrundeliegenden molekularen und zellulären Mechanismen, insbesondere die Unterschiede zwischen Makrophagen und nicht-professionellen Phagozyten wie Gliazellen, sind weitestgehend unklar. Wir haben neuartige Zellkultur-basierte Assays entwickelt, um 86 Kandidatengene zu testen, die wir aus der Literatur sowie unserem Expressions-Profiling in embryonalen Gliazellen von Drosophila melanogaster zusammengestellt haben. Die Genfunktion wurde durch RNAi herabgesenkt und die Phagozytoseeffizienz wurde mittels FACS untersucht; um die funktionelle Spezifität der Gene zu messen, haben wir nicht nur apoptotische Zellen, sondern auch Bakterien und Beads als „Essen“ angeboten. Mit Hilfe von Null-Mutanten und transgenem RNAi wurden die Ergebnis in vivo validiert. Um die Phagozytose apoptotischer Zellen testen, haben wir untersucht, wie Makrophagen und Gliazellen tote Zellen während der Embryonalentwicklung entfernen, während zur Untersuchung der bakteriellen Phagozytoze adulte Fliegen mit Bakterien infiziert wurden. Unser Screen liefert einen Querschnitt durch die verschiedenen Schritte der Phagozytose. In Bezug auf die Erkennung apoptotischer Zellen finden wir sowohl bekannte als auch neue Akteure für Makrophagen und Gliazellen. Außerdem zeigen wir, dass Vesikeltransport für die Phagozytose apoptotischer Zellen erforderlich ist. Überraschenderweise werden Rezeptoren zur Bakterienerkennung auch für apoptotische Zellen benötigt. Umgekehrt sind Apoptose- Rezeptoren auch für bakterielle Phagozytose notwendig, wodurch eine grundlegende Kreuz-Spezifität zutage tritt. Unsere Arbeit liefert die erste systematische und vergleichende Analyse der verschiedenen Phagozytosearten. Durch die Identifizierung vieler neuer Faktoren legt diese Arbeit den Grundstein für ein mechanistisches Verständnis der Phagozytose von apoptotischen Zellen und Bakterien durch Makrophagen und Gliazellen. / Phagocytes remove apoptotic cells during development and eliminate pathogens in the immune system. The underlying molecular and cellular mechanisms, particularly the differences between macrophages and non-professional phagocytes like glia, are not well understood. We used novel cell-based assays to screen phagocytic function of candidate genes assembled from literature and our genome-wide transcription profiling of Drosophila melanogaster embryonic glia. Gene function was knocked-down by RNAi and phagocytic efficiency assessed by flow cytometry; to explore functional specificity, we offered not only bacteria, but also apoptotic cells and beads as ''food''. To validate results in vivo, we analysed glial clearance of apoptotic neurons in embryonic development and immune clearance of bacteria in adult flies using both genetic mutants and transgenic RNAi. Our screen provides a cross section of the different steps of phagocytosis from recognition to engulfment and phagosomal degradation. For the recognition of apoptotic cells, we confirm the involvement of known factors, such as the chaperone Calreticulin and PS-binding Annexin, and identify new players, such as NIMA for macrophage and Megalin for glial corpse clearance. We find components associated with vesicular trafficking including the v-SNARE Synaptobrevin and the cytochrome Cyp4g15 to be required for corpse clearance. Unexpectedly, receptors known for bacterial recognition, such as PGRP-LC and TEP2, are also strongly required for apoptotic clearance. Conversely, receptors previously implicated in apoptotic cell recognition are also required in bacterial clearance (SIMU, Draper), revealing cross-specificity of the system. Our work represents the first systematic and comparative assessment of the molecular repertoire of different types of phagocytosis, and, with the identification of many new players, lays the groundwork for a mechanistic dissection of bacterial and corpse clearance by glia and macrophages.

Mikrogliazellen stellen die professionellen Phagozyten des zentralen Nervensystems dar und sind maßgeblich bei der Entfernung apoptotischer Neurone aus dem Gewebe beteiligt. Die Erkennungsmechanismen, die zu einer Erkennung und Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen führen, sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Kokulturmodells die Erkennungsmechanismen zwischen primären Mikrogliazellen und apoptotischen Kleinhirnneuronen untersucht. Der apoptotische Zelltod, charakterisiert durch Schrumpfung und Fragmentation der Neuron, durch Kondensation des Chromatins, durch Fragmentation der DNA und durch Präsentation von Phosphatidylserin auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran, wurde in den Kleinhirnneuronen durch eine Behandlung mit 100 µM S-Nitrosocystein induziert. Es konnte gezeigt werden, daß apoptotische Neurone keine löslichen Substanzen sekretierten, die chemotaktisch auf Mikrogliazellen wirken. Dies zeigt, daß die Erkennung apoptotischer Neurone über Zell-Zell-Kontakte erfolgt. Zur Untersuchung der beteiligten Erkennungsmechanismen wurden Mikrogliazellen zwei Stunden nach der Induktion des apoptotischen Zelltods zu den Neuronen gegeben und für sechs Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von Liganden kultiviert, die mögliche Rezeptoren zur Erkennung von apoptotischen Neuronen inhibieren. Die Bindung/Phagozytose der apoptotischen Kleinhirnneurone durch Mikrogliazellen wurde mit einer kombinierten DAPI/Propidiumjodid (für apoptotische/nekrotische Zellen) und einer Lektin Färbung (für Mikrogliazellen) durch Auszählung bestimmt. Die Aufnahme apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen wurde durch Galaktose und N-Acetylglukosamin reduziert, was auf eine Erkennung apoptotischer Zellen durch Lektine hindeutet. Weiterhin weist der inhibitorische Effekt von RGDS-Peptiden auf die Bindung/Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen auf eine Erkennung durch ein Vitronektinrezeptor hin. Da Mikrogliazellen spezifisch Lipidvesikel, die mit Phosphatidylserin angereichert waren, binden und O-Phospho-L-Serin die Aufnahme von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen deutlich inhibierte, erfolgte die Erkennung apoptotischer Neurone hauptsächlich durch einen Phosphatidylserin Rezeptor. Die Expression des PS-Rezeptors auf Mikrogliazellen ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikrogliazellen in vitro. Die Bindung von PS ist mit einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in der Mikrogliazelle verbunden und führt nicht zu einer sekretorischen Aktivierung der Mikrogliazelle. Da Astrozyten ebenfalls einen PS-Rezeptor exprimieren, könnten sie als semiprofessionelle Phagozyten ebenfalls eine Bedeutung bei der Aufnahme apoptotischer Neurone einnehmen. Diese Ergebnisse zeigen, daß apoptotische Neurone ein komplexes Oberflächenmuster exprimieren, welches durch unterschiedliche Rezeptorsysteme der Mikrogliazelle erkannt werden kann. Die Erkennung von PS auf apoptotischen Neuronen durch Mikroglia scheint bei diesen untersuchten Rezeptorsystemen die wichtigste Rolle zu spielen. / Microglia are the professional phagocytes of the central nervous system and play a crucial role in removal of apoptotic neurons out offrom the tissue. The recognition mechanisms leading to the recognition and phagocytosis of these apoptotic neurons by microglia are not yet characterized. Here IIn the present work established a co-culture model was established to examine the receptor systems involved in the recognition of apoptotic cerebellar neurons by primary microglia. Treatment with 100 µM S-nitrosocysteine induced apoptosis of cerebellar neurons as indicated by condensation and fragmentation of the neurons, condensation of the chromatin, fragmentation of the DNA and phosphatidylserine exposure to the exoplasmic leaflet of the plasma membrane. It was shown that apoptotic neurons do not release soluble signals that serve to attract microglia. Consequently, contact-dependent interaction between the microglial cell and the apoptotic neuron is required for recognition. For the examination of the receptor systems involved in recognition, microglial cells were added to neurons 2 h after induction of apoptosis induction and co-cultured for 6 h in the presence of ligands that inhibit recognition by binding to their respective receptors. Binding/phagocytosis was determined after combined DAPI/propidium iodide (for apoptotic/necrotic neurons) and lectin staining (for microglia). Uptake of neurons was reduced by galactose or N-acetylglucosamine, suggesting that recognition involves lectins. Furthermore, the inhibition of microglial binding/uptake of apoptotic neurons by RGDS peptide suggesteds a rolethe involvement of a microglial vitronectin receptor. The selective Binding of phosphatidylserine-enriched lipid vesicles on microglial cells and the strong interference of O-phospho-L-serine with the uptake of apoptotic neurons was indicative of an important role for the phosphatidylserine receptor (PS-receptor)As microglia selectively bind lipid vesicles enriches in phosphatidylserine and O-phospho-L-serine interfered in a strong way with the uptake of apoptotic neurons, the recognition of apoptotic neurons is manly dependent on a phosphatidylserine receptor. The expression of the PS-receptor is independent of the activation state of the microglial cell in vitro. The bindigbinding of PS induces an elevation of the intracellular calcium concentration in the microglia but doesid not induce an activationsectretion of (Liste der getesteten Zytokine einsetzen) of the microglial cell in an secretory way. Because of the expression of a PS-receptor, Astrocytes could also play a role in the uptake of apoptotic neurons as semiprofessional phagocytes. In summaryCollectively, these results suggest that apoptotic neurons generate a complex surface signal recognized by different receptor systems on microglia. The recognition of PS on the surface of apoptotic neurons by microglial cells seems to play a major role in the recognition of these apoptotic neuronscells..