Sharp wave-ripple Komplexe (SWRs) sind kurze Ereignisse von kohärenter Netzwerkaktivität im Hippocampus. SWRs spielen eine wichtige Rolle bei der Konsolidierung von expliziten Gedächtnisinhalten, die Mechanismen sind aber bis heute ungeklärt. Pyramidenzellen (PYR) und Parvalbumin-positive Korbzellen (PV+BCs) feuern während SWRs besonders häufig, wohingegen sie außerhalb beinahe inaktiv sind. SWRs treten spontan auf, und können durch Stimulation von PYR und PV+ Zellen hervorgerufen werden. Um die Rolle von PV+ Zellen in SWR Generierung zu klären, untersuche ich wie das Zusammenspiel von exzitatorischen Neuronen (PYR) und zwei Klassen von Interneuronen (PV+BCs und derzeit unbekannte Anti-SWR-Zellen) die Entstehung und die Häufigkeit von SWRs beeinflusst. Erstens entwickle ich ein Netzwerk aus feuernden Neuronen, das spontane Übergänge vom Anti-SWR-Zustand zum SWR-Zustand zeigt. Die Aktivität von PV+BCs, die die Aktivität von PYR disinhibieren, dominiert den SWR-Zustand. SWRs können hervorgerufen werden durch Stimulation von PYR oder PV+BCs, und durch Inaktivierung von Anti-SWR-Zellen. Durch Kurzzeitdepression der synaptischen Verbindung von PV+BCs zu Anti-SWR-Zellen wird die Dauer der SWRs reguliert. Die Koexistenz von Anti-SWR- und SWR-Zuständen bei konstanten Stärken der synaptischen Depression erlaubt die Untersuchung der Bistabilität des Netzwerks. Durch eine Mean-field-Näherung können Voraussetzungen für bistabile Netzwerkaktivität analytisch hergeleitet werden. Das Modell prognostiziert die Existenz von Anti-SWR-Zellen. Im letzten Teil dieser Arbeit zeige ich erste experimentelle Ergebnisse, die die Existenz von CA3-Interneuronen belegen, die anti-moduliert sind bezüglich SWRs. Durch die Untersuchung der Rolle von Interneuronen hinsichtlich der Generierung von SWRs trägt diese Arbeit zu einem tieferen Verständnis der neuronalen Schaltkreise im Hippocampus bei, die essentiell für den Erwerb und die Konsolidierung expliziter Gedächtnisinhalte sind. / Sharp wave-ripple complexes (SWRs) are events of coordinated network activity originating in the hippocampus. SWRs are thought to mediate the consolidation of explicit memories, but the mechanisms underlying their occurrence remain obscure. Pyramidal cells (PYR) and parvalbumin-positive basket cells (PV+BCs) preferentially fire during SWRs and are almost silent outside. SWRs emerge spontaneously or by activating PYR or PV+ cells. To understand how the activation of PV+ interneurons can result in an increase of PYR firing, I explore how the interaction of excitatory neurons (PYR) and two groups of interneurons (PV+BCs and a class of anti-SWR cells) contributes to the initiation, termination, and incidence of SWRs. First, I show that a biophysically constrained network of spiking neurons can exhibit spontaneous transitions from a non-SWR state to a SWR state, in which active PV+BCs disinhibit PYR by suppressing anti-SWR cells. SWR events can be triggered by activating PYR or PV+BCs, or inactivating anti-SWR cells. Short-term synaptic depression at the PV+BCs-to-anti-SWR cells connections regulates the termination of SWR events. The coexistence of states for intermediate values of the depression allows to study the network behavior in terms of bistability. To this end, I consider a mean-field approximation of the spiking network, where conditions for the emergence of a bistable configuration are derived analytically. This allows to unveil the mechanisms regulating the existence of bistable disinhibitory networks. The model predicts the existence of a class of anti-SWR cells. In the last part of this work, I show the first experimental evidence for CA3 interneurons anti-modulated with respect to SWRs, and discuss their involvement in the SWR generation process. Overall, the results of this thesis elucidate the role of interneurons in SWR generation and broaden our understanding of the microcircuits supporting the dynamics of memory-related networks.

The peptidyl prolyl cis/trans isomerase, PPIase, has been the focus of numerous studies in the field of cell cycle regulation since proline-directed phosphorylation is an essential signaling mechanism that might arrest cancer proliferation. Pin1 is the first phosphorylation-dependent PPIase enzyme to be discovered. The Pin1 regulatory mechanism, acting on other mitotic proteins in vivo and in vitro, remains largely unknown. For the study of Pin1 function, two types of assays were used to identity ligands for Pin1: (1) The Enzyme-Linked Enzyme Binding Assay (ELEBA) for the identification of WW domain ligands, (2) a catalytic assay to identified inhibitors of Pin1 catalytic activity. The ELEBA offers a selective approach for detecting ligands that bind to the Pin1 WW domain from chemical libraries. By using the ELEBA, a pSer-Pro peptidomimetic library of 315 ligands was screened, identifying three promising ligands cis-D2, O2, and M18. Competitive Kd values for cis-D2, O2, and M18 were determined to be 263 ± 6.4, 206 ± 3.4, and 130 ± 3.0μM, respectively. Furthermore, we screened the pSer-Pro peptidomimetic library using a Pin1 discontinuous-catalytic assay to identify inhibitors of Pin1. Ligands D20 and K7 were identified to decrease more than 90% of the Pin1 catalytic activity. To investigate the nature of the Pin1 interaction with c-Myc, we synthesized and characterized four peptides corresponding to the c-Myc sequence. These peptides were used in NMR isomerization studies of Pin1 by our collaborator Dr. Jeffry Peng (University of Notre Dame). Preliminary work shows that Pin1 binds and isomerizes the Ac–LLPpTPPLSPS–NH₂ peptide at the cMyc pThr58 position. Finally, we measured a secondary kinetic isotope effect (2º KIE) to study the Pin1 catalytic mechanism of proline isomerization. The ratio of kH/kD for unlabeled and [d₃]Ser-labeled substrate gave a SKIE value of 1.34 ± 0.01. The normal 2º KIE value indicates that carbonyl-serine hybridization is not changing from sp² to sp³. This result supports substrate analogue inhibitor studies, and previous solvent and SKIE results on Pin1, that suggest a twisted amide mechanism assisted by a transient hydrogen bond in the transition state. / Ph. D.

Le boson de Higgs dans le mode de désintégration WW* est observé avec un excès d'événements sur le bruit de fond de 6,1 écarts-types dans l'état final avec dilepton, alors que l’importance du signal attendu pour le boson de Higgs du modèle standard est de 5,8 écarts-types. Une indication pour la production du processus en fusion de bosons vecteurs (VBF) est également obtenue avec une importance de 3,2 écarts-types. Les résultats sont obtenus à partir d'un échantillon de données en collisions proton-proton enregistrées par le détecteur ATLAS au LHC, qui correspond à une luminosité intégrée de 4,5fb-1 à √s = 7 TeV et 20,3fb-1 à √s = 8 TeV. Tous les canaux de saveur leptonique (ee/μμ et eμ/μe)) sont analysés, y compris de différentes catégories en multiplicité de jets (nj = 0, 1,≥ 2). Les canaux ayant différentes saveurs leptoniques eμ/μe ont la meilleure sensibilité au signal. Les catégories à basse multiplicité de jet sont contribuées principalement par la production du processus en fusion de gluon-gluon (ggF), tandis que la catégorie à haute multiplicité est plus sensible à la production VBF. Les bruits de fond dans différents canaux et catégories varient et leurs contributions sont obtenues dans la plupart de cas à partir des données avec des régions de contrôle ou validation. Les bruits de fond dominants sont les productions WW et le quark top. Dans les canaux ayant la même saveur leptonique, la contribution Drell-Yan est aussi une autre source importante. Pour le boson de Higgs à 125,36GeV, le rapport du signal mesuré sur celui du modèle standard est de 1,09+0,16-0,15 (stat.) +0,17-0,14 (syst.). Les rapports correspondants pour les productions ggF et VBF sont de 1,02±0, 19 (stat.) +0,22-0,18 (syst.) et 1,27+0,44-0,40 (stat.) +0,30-0,21 (syst.), respectivement. La section efficace totale mesurée à √s = 8 TeV est de σ(gg → H → WW∗) =8TeV est de σ(gg → H → WW∗) et σ(VBFH → WW∗) = 0,51+0,17−0,15 (stat.)+0,13−0,08 (syst.) pb. La section efficace fiducielle est aussi mesurée pour la production ggF dans l'était final exclusif avec zéro ou un seul jet. En plus des couplages, d'autres propriétés du boson de Higgs, notamment le nombre quantique de spin et la largeur totale de désintégration, sont également étudiées en utilisant les données de 8TeV et les canaux ayant différentes saveurs leptoniques seulement. L'étude du spin est basée sur un échantillon de données dominé par les événements sous le pic de résonance en utilisant les catégories de jet nj ≤ 1. L'hypothèse sur le spin-parité JCP = 0++ du modèle standard est comparée à d'autres hypothèses. Les données sont compatibles avec le modèle standard et les limites sont placées sur des hypothèses alternatives de spin. Les événements dans la queue hors pic de résonance à haute masse dans la catégorie inclusive de jet sont ensuite utilisés pour mesurer les couplages du boson de Higgs hors de sa couche de masse et pour imposer une contrainte sur la limite supérieure de la largeur totale du boson de Higgs, lorsque certaines hypothèses sont faites / The Higgs boson decays to WW* is observed based on an excess of events over background of 6.1 standard deviations in the dilepton final state including all flavour channels (ee/μμ and eμ/μe) and jet multiplicity categories (nj = 0, 1,≥ 2), where theStandard Model expectation is 5.8 standard deviations. Evidence for thevector-boson fusion (VBF) production process is also obtained with a significance of3.2 standard deviations. The different favour channels eμ/μe have the best expected signal sensitivity. The low jet multiplicity categories are dominantly contributed by the gluon-gluon fusion (ggF) production process whereas the large jet multiplicity category has the best sensitivity to the VBF production process. The results are obtained from proton-proton collision data recorded by the ATLAS detector at the LHC, corresponding to 4.5fb-1 at √s = 7TeV and 20.3fb-1 at √s = 8TeV. The background contribution in each channel and jet multiplicity category varies and is determined mostly with data-driven techniques with dedicated control or validation regions. The dominant background processes are the continuum WW and top quark productions. In the same flavour channels (ee/μμ), the Drell-Yan process is another important background source. For a Higgs boson mass of 125.36GeV, the ratio of the measured value to the expected value of the total production cross section times branching ratio fraction is 1.09+0.16-0.15 (stat.) +0.17-0.14 (syst.). The corresponding ratios for the gluon fusion and vector-boson fusion production modes are 1.02 ± 0.19 (stat.)+0.22−0.18 (syst.) and 1.27+0.44-0.40 (stat.) +0.30-0.21 (syst.), respectively. At √s = 8TeV, the total production cross section is measured to beσ(gg → H → WW∗) = 4.6±0.9 (stat.)+0.8−0.7 (syst.) pb σ(VBFH → WW∗) = 0.51+0.17−0.15 (stat.)+0.13−0.08 (syst.) pb. The fiducial cross section is determined for the gluon-fusion process in exclusive final states with zero and one associated jet. In addition to the on-shell couplings, other properties of the Higgs boson, namely the spin quantum number and the total decay width, are also studied using the 8TeV data and the different flavour channels only. The spin study is based on the on-shell dominated event sample using the nj ≤ 1 jet categories. The Standard Model spin-parity JCP = 0++ hypothesis is compared with alternative hypotheses. The data are found to be consistent with the Standard Model and limits are placed on alternative spin hypotheses.The off-shell events in the high mass tail from the inclusive jet category are then used to measure the off-shell couplings and impose a constraint on the upper limit of the total width of the Higgs boson indirectly, when certain assumptions are made.

Une recherche de résonance neutre et lourde X est effectuée dans le canal X→WW→eνμν en utilisant les données en collision pp correspondant à une luminosité intégrée d'environ 36,1 fb⁻¹, prises à une énergie dans le centre-de-masse de 13 TeV par le détecteur ATLAS au LHC. La résonance peut être soit un boson de Higgs scalaire lourd soit d'autres résonances lourdes aux spins différents. Deux scénarios de largeur sont étudiés pour un boson de Higgs lourd dans les modes de fusion gluon-gluon et de fusion vecteur-boson; une largeur soit étroite soit grande. Plusieurs hypothèses sont utilisées pour rechercher d'autres résonances, comme le modèle avec deux doublets de Higgs, le modèle de Georgi-Machacek, le modèle avec un triplet vectoriel en mode d'annihilation quark-antiquark, le modèle de Randall-Sundrum avec un graviton de spin 2 correspondant à un paramètre d'échelle de courbure de 1 ou 0,5 et un signal de spin 2 dans le mode de fusion vecteur-boson. Trois catégories d'événements indépendantes sont définies dans l'analyse : une catégorie inclusive où les espaces de phase en fusion vecteur boson sont exclus et deux autres catégories qui sont optimisées pour les signaux produits en mode de fusion vecteur-boson avec un jet ou au moins deux jets. Aucun excès significatif d'événements au-delà de la prédiction du bruit de fond du Modèle Standard ne se trouve dans la gamme de masse comprise entre 200 GeV et 5 TeV. Les limites supérieures sont obtenues sur le produit de la section efficace de la production de la résonance et du rapport de branchement X→WW. Pour les signaux de bosons de Higgs lourds, les valeurs supérieures à 6,4 pb et 1,3 pb à mH = 200 GeV et supérieures à 0,008 pb et 0,005 pb à 4 TeV sont exclues à un niveau de confiance de 95% pour la fusion gluon-gluon et la fusion vecteur-boson, respectivement. Pour les signaux prédits par le modèle avec un triplet vectoriel, les valeurs de masse inférieures à 1,3 TeV sont exclues. De la même manière, pour les signaux prédits par le modèle de Randall­ Sundrum, les valeurs de masse inférieures à 1,1 TeV et 850 GeV sont exclues pour le paramètre d'échelle de courbure de 1 et 0.5, respectivement. / A search for a heavy neutral resonance X is performed in the X→WW→eνμν decay channel using pp collision data corresponding to an integrated luminosity of 36.1 fb⁻¹, collected at a centre-of-mass energy of 13 TeV by the ATLAS detector at the Large Hadron Collider. The resonance can be either a heavy scalar Higgs boson or other heavy resonances with different spins. Two scenarios are considered for the heavy Higgs boson hypotheses with different decay widths in both the gluon-gluon fusion and the vector­ boson fusion production modes, namely a narrow-width approximation and a large width assumption. Several hypotheses are used for the interpretation to search for other resonances, like two Higgs doublet models, Georgi-Machacek model, heavy vector triplet model in the quark-antiquark annihilation mode, a bulk Randall-Sundrum graviton model with a spin-2 Graviton with a curvature scale parameter of either 1 or 0.5 and a spin-2 signal in the vector-boson fusion mode. Three orthogonal event categories are defined in the analysis: two vector-boson fusion categories which are optimised for the signals produced in the vector-boson fusion mode with one jet or at least two jets and one quasi-inclusive gluon-gluon fusion category where the vector boson fusion phase spaces defined by the two vector-boson fusion categories are excluded. No significant excess of events beyond the Standard Model background prediction is found in the mass range between 200 GeV and up to 5 TeV. Upper limits are set on the product of the production cross section of the resonance and the X→WW branching fraction. For heavy Higgs boson signals, values above 6.4 pb and 1.3 pb at 200 GeV and above 0.008 pb and 0.005 pb at 4 TeV are excluded at 95% confidence level for the gluon-gluon fusion and the vector-boson fusion production modes, respectively. For signals predicted by the heavy vector triplet model, mass values below 1.3 TeV are excluded. Similarly, for signals predicted by the bulk Randall-Sundrum graviton model, mass values below 1.1 TeV and 850 GeV are excluded for the curvature scale parameter of 1 and 0.5, respectively.

Der Hippokampus spielt eine wichtige Rolle bei der Erfassung, Festigung und dem Wiederabrufen von Gedächtnisinhalten. Diese Prozesse werden von Oszillationen begleitet, die synchronisierte neuronale Aktivität wiederspiegeln. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf ‘ripples’, eine schnell schwingende Netzwerkaktivität, die an der Festigung von Gedächtnisinhalten beteiligt ist. Das Subikulum ist eine der Hauptausgangsstationen des Hippokampus und überträgt Informationen zu Zielregionen außerhalb dieser Region. Um dies besser zu verstehen, habe ich hier die Eigenschaften von subikulären Pyramidenzellen und deren Regulierung während ripples untersucht. Es zeigte sich, dass eine Untergruppe von Zellen, burst (in Salven) feuernde Zellen, ihre Aktivität erhöht, während eine zweite Untergruppe, regulär feuerende Zellen, ihre Aktivitaet während ripples vermindert. Ferner ist bei regulär feuernden Zellen das Verhältnis zwischen Inhibition und Exzitation höher als bei burst feuernden Zellen. Zusammen mit Erkenntnissen aus früheren Studien lassen diese Ergebnisse vermuten, dass Information während ripples hauptsächlich zu Zielregionen der burst feuernden Zellen geleitet wird. Neben Pyramidenzellen beherbergt der Hippokampus auch eine Vielzahl verschiedener Interneurone. Im zweiten Teil dieser Arbeit habe ich O-LM Interneurone der hippokampalen Region CA1 untersucht. Diese spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Eingängen aus dem entorhinalen Kortex. Wir konnten zeigen, dass die exzitatorische Übertragung auf O-LM Interneurone durch Serotonin, einem von den Raphe-Kernen ausgeschütteten Neuromodulator, vermindert wird. Dies geschieht durch einen präsynaptischen Mechanismus, der wahrscheinlich eine Verminderung des Kalziumeinstroms in präsynaptische Endigungen umfasst. Eine Verminderung der Aktivität von O-LM Interneuronen durch Serotonin könnte die synaptische Übertragung von Signalen aus dem entorhinalen Kortex auf CA1 Pyramidenzelldendriten erleichtern. / The hippocampus plays an important role in the acquisition, consolidation and retrieval of memory. These processes are accompanied by hippocampal oscillations, which reflect synchronized neuronal activity. The first part of this thesis focuses on ripples, a fast oscillatory activity which is involved in memory consolidation. The subiculum as one of the main output areas of the hippocampus is ideally suited to mediate information transfer to extrahippocampal targets. Here I investigated the properties of subicular pyramidal cells and their modulation during ripples. I found that a subset of subicular pyramidal cells increases its firing rate during ripples whereas another subset decreases its firing rate. Furthermore I was able to identify a correlate between modulation and cell subtype: burst firing cells increased their firing rate, and regular firing cells decreased their firing rate. We could further show that regular firing cells receive a higher ratio of inhibition to excitation as compared to burst firing cells. Together with earlier work, these results suggest that information transferred during ripples is likely to be routed preferentially to target regions of the burst firing subtype. Besides pyramidal cells, the hippocampus hosts a variety of interneuron types. The second part of this thesis focuses on GABAergic O-LM interneurons of hippocampal area CA1, which play an important role in controlling input from the entorhinal cortex. We could show that excitatory transmission from local pyramidal cells onto O-LM interneurons is decreased by serotonin, a neuromodulator released from the midbrain raphe nuclei. This modulation is mediated by a presynaptic mechanism and is likely to involve a decrease in calcium influx into presynaptic terminals. We conclude that serotonin, by decreasing O-LM output, might release fibers from entorhinal cortex impinging onto CA1 pyramidal cell dendrites from inhibition.

Der primäre somatosensorische Kortex (S1) besteht aus sechs Schichten (L1L6).Die koordinierte Aktivität dieser sechs Schichten kortikaler Neurone ist entscheidend für die sensorische Wahrnehmung und die Steuerung willkürlichen Verhaltens. Es ist jedoch noch wenig über die synaptischen Mechanismen bekannt, die die Verarbeitung zwischen den kortikalen Schichten bei sich aktiv verhaltenden Tieren bestimmen. Ich habe einfache und doppelte in vivoGanzzellableitungen im VorderpfotenAreal von S1 in der Maus gemacht, und gezeigt, dass Pyramidalzellen in L2/3 und L5 während einer Bewegung der Vorderpfote Unterschiede in ihren intrinsischen Eigenschaften und der Dynamik ihrer Membranpotenziale zeigen. Doppelableitungen haben gezeigt, dass sensorisch und motorisch ausgelöste synaptische Eingänge zwischen den Zellschichten weitgehend korreliert waren, niederfrequente unterschwellige Potenzialschwankungen und spontane Aktionspotenziale jedoch einen schichtspezifischen Zeitverlauf zeigten. Auf einer längeren Zeitskala beobachteten wir, dass spontane Bewegungen der Vorderpfote eine Dekorrelation unterschwelliger Aktivität zwischen den Schichten auslösten. Des Weiteren zeigten L5Pyramidalzellen durch ihre Aktivität sensorisch ausgelöste und spontane Bewegungen der Vorderpfote stärker an, als L2/3Neurone. Insgesamt deuten meine Daten darauf hin, dass Unterschiede zwischen den Zellschichten beim Timing von Aktionspotenzialen, bei der unterschwelligen Synchronisierung und bei den mittleren Feuerraten sowohl von der Quelle des zu Grunde liegenden synaptischen Eingangs als auch vom resultierenden Verhalten abhängen. Außerdem konnte ich zeigen, dass Neurone im VorderpfotenAreal von S1 auf leichte Kältereizung der Vorderpfote antworten, und dass diese Antwort vom Ionenkanal transient receptor potential cation channel subfamily M member 8 (TRPM8) in primären sensorischen afferenten Neuronen vermittelt wird. / The primary somatosensory cortex (SI) is composed of six layers (L1L6). The coordination of neural activities across six layers of cortical neurons is essential for reliable sensory perception and the control of voluntary behavior. However, the synaptic neural mechanisms governing translaminar cortical processing in behaving animals are still unknown. I made in vivo single and dual whole cell recordings in mouse forepaw SI, my work revealed that L2/3 and L5 pyramidal neurons have distinct intrinsic properties and membrane potential dynamics during forepaw behavior. Dual recordings showed that sensory and movement evoked synaptic inputs were closely correlated across layers, but low frequency subthreshold fluctuations and spontaneous action potentials exhibited a laminar specific temporal profile. At longer time scales, my data showed that spontaneous forepaw movement evoked a decorrelation of subthreshold activity across layers. Furthermore, L5 pyramidal neurons signaled sensory evoked and spontaneous forepaw movements more strangely than L2/3 neurons. Overall, my work suggests that laminar differences in the timing of action potential firing, subthreshold synchrony and mean firing rates are dependent both on the origin of the underlying synaptic input and the behavioral outcome of the event. In addition, I identified that forepaw SI neurons respond to mild cooling stimulation of the forepaw and that this response is mediated by the Transient receptor potential cation channel subfamily M member 8 (TRPM8) in primary sensory afferent neurons.

Die Wanderung von Leukozyten aus dem Gefäßlumen läuft in einer Kaskade ab, die durch verschiedene Adhäsionsmoleküle vermittelt wird. Dabei wird der erste Kontakt der Leukozyten mit dem Endothel durch die Interaktion von L­Selektin mit seinen endothelialen Sialomucinliganden eingeleitet. Neben seiner Adhäsionsfunktion kann L­Selektin intrazelluläre Signalwege aktivieren und wird, induziert durch intrazelluläre Signale, an seinen cytoplasmatischen Serinresten durch Proteinkinase C (PKC) phosphoryliert. Über die Regulation dieser Serinphosphorylierung von L-Selektin ist nur wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der cytoplasmatischen Interaktion von L-Selektin mit dem Proteinphosphatase 2A-Inhibitor PhapII und die Identifizierung noch unbekannter Interaktionspartner der cytoplasmatischen Domäne von L­Selektin. Es konnte gezeigt werden, dass das basische Duplett Lys-365/Arg-366 der cytoplasmatischen Domäne von L-Selektin essentiell für die Bindung von PhapII ist, die über den sauren C­Terminus von PhapII vermittelt wird. In einem Malachitgrün-basierten Phosphataseassay konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatischen Serinreste von L­Selektin durch Protein Phosphatase 2A (PP2A) dephosphoryliert werden. Ferner konnte in Jurkat-Zelllysaten PP2A als ein direkter Interaktionspartner von nicht phosphoryliertem LScyto identifiziert werden. Die Dephosphorylierung von LScyto konnte durch PhapII verhindert werden, was auf eine Regulation der Serinphosphorylierung durch PKC, PP2A und PhapII hindeutet. Mit dem Ziel, die Interaktion von PhapII mit L-Selektin durch Co-Kristallisation zu untersuchen, wurde PhapII rekombinant exprimiert und gereinigt. Mittels chromatographischer Verfahren konnte PhapII als ein Protein mit intrinsischer Unordnung in seiner Sekundärstruktur beschrieben werden. Die Deletion des sauren C-Terminus bzw. die Mutation an Serin-9 von PhapII zeigten einen Einfluss auf die Konformation von PhapII zu einer kompakteren Proteinstruktur hin. / Migration of leukocytes from the lumen occurs in a cascade mediated by different members of adhesion molecules. The first contact of leukocytes to endothelium is initiated by the interaction of L­selectin to its endothelial sialomucin ligands. Besides its role in cell adhesion, L­selectin can induce a set of intracellular signaling pathways and can be a target of serine phosphorylation by protein kinase C (PKC) induced by intracellular signals. But little information on regulation of this serine phosphorylation of L-selectin and therefore regulation of intracellular protein interactions is known. The aim of this thesis was to analyze the cytoplasmic interaction of L-selectin with the inhibitor of protein phosphatise 2A PhapII and searching for other unknown interaction partners of the cytoplasmic domain of L-selectin. Results show that the basic doublet Lys-365/Arg-366 of the cytoplasmic domain of L­selectin (Lscyto) is essential for binding to PhapII which is mediated by the acidic C­terminal tail of PhapII. Using malachite green based assay to detect free phosphate, cytoplasmic serine residues of L­selectin were dephosphorylated by protein phosphatase 2A (PP2A). In addition, it was possible to identify PP2A as a direct interaction partner of the non-phosphorylated domain of L­selectin in Jurkat T cell lysates. The dephosphorylation of Lscyto was prevented by PhapII and points the regulation of serine phosphorylation by PKC, PP2A and PhapII. For analysis of the interaction of PhapII with L-selectin by co-crystallography, PhapII was recombinantly expressed and purified. Using chromatographic techniques PhapII was observed to be a protein with an intrinsic disorder in its secondary structure. Deletion of the acidic C-terminus and in particular mutation of Serine-9 showed an effect on the conformation of PhapII to a globular and compact protein structure.

Zentralnervöse Lernvorgänge hängen wesentlich von der Plastizität der synaptischen Übertragung ab. Synapsen verändern ihre Effizienz sowohl durch Änderungen in der Freisetzungswahrscheinlichkeit von Neurotransmittern als auch durch Variabilität der postsynaptischen Rezeptorausstattung. Darüberhinaus gibt es seit einiger Zeit Hinweise, dass auch die Konzentration des Neurotransmitters in synaptischen Terminalen variieren kann und dadurch die Freisetzungswahrscheinlichkeit von Vesikeln verändert wird. Um den Zusammenhang zwischen der Füllung synaptischer Vesikel und ihrer Dynamik im Vesikelzyklus besser zu verstehen, habe ich zunächst ein Computermodell entwickelt. Ich habe gefunden, dass nur eine Modifikation des Nachschubs von Vesikeln aus der Reservepopulation in die Population unmittelbar freisetzbarer Vesikel die experimentell gemessene Abhängigkeit der Freisetzungswahrscheinlichkeit von der präsynaptischen Transmitterkonzentration reproduzieren kann, nicht jedoch ein direkter Effekt auf die Freisetzungsrate. Einer der im Modell simulierten Mechanismen für den beobachteten Effekt des vesikulären Füllungszustandes auf die Vesikelfreisetzung besteht in einer Rückwirkung des freigesetzten Transmitters auf ionotrope Autorezeptoren. Diesen Mechanismus habe ich anschliessend an GABAergen Synapsen in der CA3-Region des Hippocampus untersucht. Tatsächlich habe ich durch patch-clamp Messungen herausgefunden, dass sowohl die Antwortwahrscheinlichkeit auf extrazelluläre Stimulation als auch die Frequenz von spontanen Vesikelfreisetzungen nach Applikation des GABAA Rezeptor-Agonisten Muscimol signifikant verringert ist. Diese Befunde weisen darauf hin, dass GABA seine eigene Freisetzung über ionotrope Autorezeptoren hemmt. Direkte Messungen der Vesikelfreisetzungen sind an GABAergen Synapsen nur durch bildgebende Verfahren möglich. Mit Hilfe von Zwei-Photonen Mikroskopie ist es mir erstmalig gelungen, im Hirnschnitt die spontane Fusion von Vesikeln zu untersuchen. Diese Methode könnte für eine Reihe von Fragestellungen relevant sein. Dabei hat sich gezeigt, dass nach Applikation von Muscimol die spontane Abnahme der Fluoreszenz vorher angefärbter synaptischer Vesikel ausschliesslich in perisomatischen (überwiegend GABAergen) synaptischen Boutons signifikant verringert ist. Zusammenfassend habe ich bei der experimentellen Prüfung von Vorhersagen eines Computermodells durch patch-clamp Untersuchungen und durch eine neue Methode mit funktioneller Bildgebung Hinweise auf funktionelle präsynaptische GABAA Rezeptoren an GABAergen Terminalen der CA3-Region des Hippocampus gefunden, die eine negative Rückwirkung auf die Freisetzung von Vesikeln ausüben. / Learning processes depend on synaptic plasticity. Synaptic efficacy depends both on the probability of transmitter release and on the variability of postsynaptic receptors. Furthermore, recent data suggest that the transmitter concentration in presynaptic terminals may be an additional variable influencing the release probability of synaptic vesicles. To better understand the relationship between vesicular filling and vesicular dynamics, I first developed a computer model. I found that only a modification of the replenishment of the readily releasable pool from a reserve pool reproduces the experimentally observed dependence of vesicular release on the presynaptic transmitter concentration, but not a direct effect on the release rate. One of the simulated mechanisms consists in a feedback of released transmitter on ionotropic autoreceptors. I investigated this mechanism in the CA3 region of the hippocampus. Indeed, using patch-clamp recordings I observed that application of the GABAA receptor agonist muscimol decreases significantly the response probability to extracellular stimulation as well as the frequency of spontaneous transmitter release. These results suggest that GABA inhibits its own release via ionotropic autoreceptors. Direct measurements of GABAergic vesicular release are only possible by imaging techniques. Using two-photon microscopy, I was (to my knowledge) the first one to investigate spontaneous vesicle fusion in brain slices. This method could be relevant to a variety of topics. I found out that application of muscimol leads to a significant decrease of fusion-associated fluorescence decay in perisomatic (mostly GABAergic) synaptic boutons. Taken together, I used patch-clamp recordings and a new application of two-photon microscopy to verify predictions of a computer model. The results suggest a negative feedback of GABA release via presynaptic GABAA receptors in the CA3 region of the hippocampus.

Synapsen sind die spezialisierten subzellulären Kontaktstellen im Gehirn, die die Kommunikation zwischen einzelnen Nervenzellen, den Neuronen, auf elektrischem oder chemischem Weg ermöglichen. Anatomisch und physiologisch sind Synapsen jedoch erstaunlich divers, unter anderem abhängig von der untersuchten Hirnregion, der Identität der prä- und postsynaptischen Neurone, den präsynaptisch ausgeschütteten Neurotransmittern und postsynaptischen Rezeptorsystemen. Generell kann die Effektivität oder Stärke synaptischer Übertragung durch unterschiedliche Mechanismen beeinflusst werden. Hier werden nun Mechanismen, Ausprägung und funktionelle Relevanz von Neuromodulation, Kurzzeit- und Langzeit-Plastizität der Stärke der synaptischen Übertragung an der hippokampalen Moosfaser-Synapse erarbeitet. Die vorgestellten Daten konnten mit Hilfe von in vitro experimentellen Ansätzen an der hippokampalen Formation von Mäusen gewonnen werden und durch Analysen und Simulationen aus dem Bereich der theoretischen Biologie bestätigt und erweitert werden. / Chemical synapses are key elements for the communication between nerve cells. This communication can be regulated on various time scales and through different mechanisms affecting synaptic transmission. Amongst these are slow and long-lasting adjustments by endogenous neuromodulators, instantaneous and reversible activity-dependent regulation by short-term plasticity and persistent activity-dependent changes by long-term plasticity. Within this thesis, we have investigated several aspects of modulation of synaptic transmission and its functional relevance at the example of the hippocampal mossy fiber synapse. The presented results were acquired through electrophysiological and microfluorometric experiments at the hippocampal formation of mice and could be verified and substantiated through theoretical analyses, simulations and computational modelling.

Es konnte ein neuer Cluster von insgesamt sieben T-Zell-Rezeptor delta-Rekombinationselementen (deltaRec2.1-2.7), welcher sich innerhalb des TCRD-Gens, 2,6-5,2 kb strangabwärts des variablen Gensegments Vdelta2, befindet. Gezeigt wurde, dass diese isolierten recombination signal sequences sowohl mit Ddelta3- als auch mit Jdelta1-Segmenten des TCRD-Gens und pseudo joining-Gensegmenten des TCRA-Gens rearrangiert werden. Rearrangements, die deltaRec2-Elemente enthielten, wurden in allen zehn Proben peripherer Leukozyten gesunder Spender gefunden, obwohl sie hundertfach seltener sind als klassische deltaRec-Rearrangements. Die absolute Frequenz der deltaRec2-Rearrangements in PB-T-Zellen war, verglichen mit der in Thymozyten, niedriger, was nahe legt, dass sie während der T-Zell-Entwicklung deletiert werden. Am auffälligsten war das Verschwinden von deltaRec2-Ddelta3-Umlagerungen, deren Häufigkeit in PB-T-Zellen elffach niedriger als in Thymozyten war. Die überwiegende Mehrheit der deltaRec2-Jdelta1-Rearrangements enthielt das Ddelta3-Element an der Verknüpfungsstelle. Dies bedeutet, dass sie sich aus deltaRec2-Ddelta3-Rearrangements entwickelt haben könnten. Im Gegensatz dazu steht, dass die Mehrheit der deltaRec2-pseudoJalpha–Umlagerungen kein Ddelta3-Segment enthielt, was vermutlich daher rührt, dass sie direkte Rearrangements darstellen. Die Umlagerungen deltaRec2-Jdelta1 und deltaRec2-pseudoJalpha scheinen T-Zell-spezifisch zu sein, deltaRec2-Ddelta3-Rearrangements hingegen wurden auch in B-Lymphozyten und NK-Zellen in geringer Zahl nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass deltaRec2-Rearrangements wahrscheinlich vorübergehende Schritte des Rekombinationsprozesses des TCRAD-Lokus sind und durch nachfolgende Valpha-Jalpha-Rearrangements deletiert werden können. Ähnlich wie die klassischen deltaRec-Umlagerungen, spielen vermutlich auch deltaRec2-Rearrangements eine Rolle auf dem Wege der Differenzierung von T-Lymphozyten hin zur reifen TCRalpha/beta-Zelle. Somit könnten die hier erstmals beschriebenen weiteren Rekombinationselemente in der MRD-Diagnostik maligner lymphatischer Erkrankungen die bisher genutzten Rearrangements ergänzen und ebenso als Verlaufsmarker genutzt werden. / A new cluster of 7 T-cell receptor delta recombining elements (deltaRec2.1-2.7) located within the T-cell receptor delta (TCRD) gene, 2.6-5.2 kb downstream from the variable region (Vdelta2) gene segment could be identified. The deltaRec2 elements are isolated recombination signal sequences to rearrange with the Ddelta3, Jdelta1 segments of the TCRD gene as well as with the pseudo joining segment of the TCRA gene. Rearrangements involving the deltaRec2 elements were found in all peripheral blood (PB) samples from 10 healthy individuals, although their frequency was about 100-fold lower than classical deltaRec rearrangements. Compared with thymocytes, the total frequency of deltaRec2 rearrangements was lower in PB T-cells, suggesting that they are deleted during T-cell development. The decrease in frequency of the deltaRec2-Ddelta3 rearrangements was most prominent: 11 times lower in PB T lymphocytes than in thymocytes. Since the deltaRec2-Jdelta1 rearrangements contained the Ddelta3 segment in the junctional region, it could be assumed that they are derived from the deltaRec2-Ddelta3 rearrangements. In contrast, the majority of deltaRec2-pseudoJalpha rearrangements did not contain the Ddelta3 segment, indicating that they are single step rearrangements. The deltaRec2-Jdelta1 and deltaRec2-pseudoJalpha rearrangements seem to be T-lineage specific, but the deltaRec2-Ddelta3 rearrangements were also found at very low frequencies in B-lymphocytes and NK-cells. The results suggest that deltaRec2 rearrangements are transient steps in the recombinatorial process of the TCRAD locus and are probably deleted by subsequent Valpha-Jalpha rearrangements. Similarly to the classical deltaRec rearrangements, also the deltaRec2 rearrangements most likely play a role in T-cell differentiation towards the TCRalpha/beta cell. These recombination elements could also complete the rearrangements used so far as marker in diagnosis of minimal residual disease of malignant lymphatic diseases.