Die heterogene Gruppe der Myopathien kann sowohl die Funktion des Muskels beeinflussen, als auch andere Organsysteme. Erworbenen Muskelerkrankungen sind theoretisch behandelbar, jedoch stehen zumeist nur sehr unspezifische Behandlungsoptionen zur Verfügung, während für vererbte Formen bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten bekannt sind. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Muskelerkrankungen untersucht. Gemeinsam ist ihnen ein jeweils charakteristischer Einstrom von Entzündungszellen, wobei die Zusammensetzung des Zellinfiltrates (z.B. Lymphozyten oder Makrophagen) bei den verschieden Erkrankungen unterschiedlich war. Weiterhin unterscheidet sich das zugrunde liegende Zytokinmilieu für die einzelnen untersuchten Entitäten. Daher war es Ziel der Arbeit, die genauen Interaktionen zwischen den Immunzellen zu untersuchen, sowie die charakteristischen Phänomene der Erkrankungen (Hypoxie, Entzündung und Fibrose). Nekrotisierende Myopathien können sowohl durch eine immun-vermittelte Genese, als auch durch Kontakt mit toxischen Substanzen ausgelöst werden und beide Subgruppen können klar durch morphologische Kriterien, als auch durch spezielle Immunaspekte unterschieden werden. Makrophagen waren hier die vorherrschende Zellpopulation und im gesamten Muskel verteilt. Patienten mit Dermatomyositis dagegen zeigten ein typisches perifaszikuläres Atrophiemuster und hypoxische Effekte, wobei beide Phänomene deutlich ausgeprägter bei juvenilen, als bei adulten Patienten vorkamen. Erbliche Myopathien (z.B. Muskeldystrophie Duchenne) können ebenfalls entzündliche Infiltrate aufweisen und die Entwicklung von Fibrose in der Skelettmuskulatur ist dabei ein Hauptkriterium der Muskelfaserdegeneration. Ein neu entwickelter computer-basierter Algorithmus wurde genutzt, um diese Entwicklung zu quantifizieren. Die Menge an Bindegewebe steigt mit dem Alter der Patienten, während bei älteren Patienten außerdem ein fettgewebiger Umbau ein wichtiger Aspekt der Pathologie war. / The heterogeneous group of myopathies can affect the skeletal muscle or other organ systems and comprise a huge number of different entities. Acquired myopathies are potentially treatable, but there are often only unspecific treatment options, while there is no causative cure for inherited forms of myopathies. In this work, three different entities were analyzed, which all share common aspects of the immune response, but also feature distinct immunological aspects as well. They have an inflammatory part in common, which is mainly regulated by influx of immune cells. However, the composition of these cellular infiltrates (e.g. lymphocytes or macrophages) was varying between the diseases. In addition, the respective cytokine milieu was highly specific in the examined entities. Thus, the aim of the study was to precisely examine interactions between immune cells, and analyze characteristic pathological phenomena (hypoxia, inflammation and fibrosis). Necrotizing myopathies have an immune-mediated background or showed a toxic aetiology and both sub-groups can be distinguished by their morphological characteristics and certain immune aspects. Here macrophages are the predominant cell population and are spread throughout the muscle. Analyses of patients suffering from dermatomyositis showed a typical perifascicular pattern of atrophy, as well as effects of hypoxia and the described features are in general more pronounced in juvenile dermatomyositis than in the adult form. Inherited myopathies (e.g. Duchenne muscular dystrophy) harbor significant inflammatory infiltrates as well and development of fibrosis was a major feature of skeletal muscle degeneration. A computer-based algorithm was used to quantify fibrosis. The amount of connective tissue increased with the age of patients, while at late stage of disease fatty transformation was an additional important issue.

Bei der Wundheilung und fibrosierenden Prozessen sowie bei der Urtikaria ist eine Mastzellvermehrung bekannt. Mastzellen (MZ) üben bei der Urtikaria eine Schlüsselfunktion aus und scheinen auch zum Bindegewebsumbau beizutragen. In humanem Narbengewebe (5-369 Tage alt) wurden MZ-Zahlen und MZ-Subpopulationen mittels Enzym- und Immunhistochemie im Vergleich zu normaler Haut untersucht. Außerdem wurden in Gewebsextrakten Aktivität und mRNA-Expression der MZ-Proteasen und in vitro ihre mitogene Wirkung auf Fibroblasten und Keratinozyten bestimmt. Zur Klärung von Mechanismen, die zur MZ-Vermehrung beitragen könnten, analysierten wir die Expression von MZ-Chemoattraktoren und MZ-Wachstumsfaktoren sowie ihrer Rezeptoren in humanem Narbengewebe (a), läsionaler und nicht-läsionaler Urtikariahaut (b) und in normaler Haut (c): SCF, c-Kit, NGF-R TrkA, NGF-R p75, GM-CSF, GM-CSF-R (a, b, c); NGF, TGF-(, TGF-(-R I, TGF-(-R II (a,c) mittels Immunhistochemie (a, b, c) und RT-PCR (a, c). Zusätzlich wurde die Expression der proentzündlichen Zytokine IL-3, -8, TNF-( untersucht (b, c). Tryptase und Chymase enthaltende MZ waren in Narben gegenüber normaler Haut signifikant vermindert ebenso wie Chymaseaktivität und -mRNA-Expression in Narbengewebsextrakten. Die Anzahl Tryptase-haltiger MZ war unverändert, obwohl Tryptaseaktivität und -mRNA in Narben vermehrt waren. Beide Proteasen erhöhten in vitro die mitogene Antwort von Fibroblasten, jedoch nicht von Keratinozyten. c-Kit+-MZ fanden sich in der mittleren und tiefen Dermis von Narben signifikant vermehrt. SCF, TGF-(, TGF-(-R I und II, NGF-R p75 und TrkA zeigten sich sowohl immunhistochemisch als auch in der RT-PCR in Narbengewebe hochreguliert im Vergleich zu normaler Haut, wohingegen NGF, GM-CSF und GM-CSF-R nur schwach exprimiert waren ohne Unterschied zwischen beiden Geweben. Mittels FACS-Analyse wurde erstmalig die Expression von TGF-(-R I und II auf isolierten Haut-MZ nachgewiesen. Im Gegensatz zu diesen Befunden waren in Urtikariagewebe SCF- und NGF-R p75-exprimierende Zellen vermindert im Vergleich zu normaler Haut. Die Zahl von c-Kit+-, NGF-R TrkA+-, GM-CSF+- und GM-CSF-R+ -Zellen zeigte sich unverändert. Hingegen war die Expression von IL-3 und TNF-( auf Endothelzellen in läsionaler und nicht-läsionaler Urtikariahaut signifikant hochreguliert. Die dargestellten Ergebnisse mit signifikanter Verminderung von Chymase- und Tryptase-haltigen MZ in humanem kutanen Narbengewebe sprechen für MZ-Degranulation nach Trauma. Nachfolgend findet sich in Narbengewebe eine Chymase--, Avidin--, Tryptase+-, c-Kit+-MZ-Subpopulation, am ehesten Folge einer Einwanderung und Proliferation von unreifen MZ oder MZ-Vorläufern, die von den vermehrt exprimierten Wachstumsfaktoren SCF und TGF-(, eventuell auch von NGF über seine vermehrt exprimierten Rezeptoren, induziert werden könnten. Neben NGF und TGF-( scheint auch SCF eine Rolle bei der Wundheilung zu spielen. Bei entzündlichen Hautkrankheiten unterschiedlicher Prägung wie Wundheilung und Urtikaria liegen offenbar verschiedenartige Regulationsmuster der MZ-Proliferation und -Differenzierung vor. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass bei Trauma Feedbackmechanismen über Wachstumsfaktoren wie SCF, TGF-( und NGF und ihre Rezeptoren auf MZ ablaufen, bei der Urtikaria unter Mitberücksichtigung bereits bekannter Daten aus der Literatur vorzugsweise über eine Interaktion von Mast- und Endothelzellen. / In wound healing and fibrosing processes as well as in urticaria an increase of mast cells (MC) has been observed. MC are key-players in urticaria, and might also contribute to tissue repair. In human cutaneous scar tissue (5-369 days old) and normal skin MC dynamics and MC subtypes were analysed by enzyme- and immunohistochemistry. Moreover, the activity of the MC proteases in extracts of both tissues and their in vitro effect on the mitogenesis of fibroblasts and keratinocytes were assessed. To elucidate mechanisms involved in mast cell accumulation, expression of MC chemotaxins, MC growth factors and their receptors was evaluated comparing cutaneous scar tissue (a), lesional and non-lesional skin of urticaria (b) and normal skin (c): SCF, c-Kit, NGF-R TrkA, NGF-R p75, GM-CSF, GM-CSF-R (a, b, c); NGF, TGF-(, TGF-(-R I, TGF-(-R II (a,c) by immunohistochemistry (a, b, c) and by RT-PCR (a, c). Additionally, expression of proinflammatory cytokines (IL-3, -8, TNF-() was studied (b, c). Tryptase and chymase containing MC were markedly decreased in scars as well as chymase activity and mRNA expression, whereas overall numbers of tryptase containing MC did not differ from those in normal skin, although tryptase activity and mRNA expression were increased in scar extracts. Both proteases induced a dose-dependent mitogenic response in 3T3-fibroblasts, but not in HaCaT-keratinocytes. Numbers of c-Kit+ MC were significantly increased in the mid and lower dermis of scars. Furthermore, SCF, TGF-(, its receptors I and II, the NGF-R p75 and TrkA were shown to be upregulated in scars both by immunohistochemistry and by RT-PCR, while NGF, GM-CSF and the GM-CSF-R were only weakly expressed without differences between scar and normal tissue. In addition, expression of TGF-(-R I and II could be shown on isolated human skin MC by FACS-analysis. In contrast to these findings, SCF- and NGF-R p75-expressing cells in urticaria tissue were downregulated compared to normal skin. Numbers of c-Kit+, NGF-R TrkA+, GM-CSF+ and GM-CSF-R+ cells remained unchanged. However, IL-3 and TNF-( expression was upregulated on endothelial cells in lesional and non-lesional skin of urticaria. These data show that numbers of resident MCTC are very low in human cutaneous scars suggesting massive mediator release from these cells after wounding. Instead, scar tissue is populated by a chymase-, avidin-, tryptase+, c-Kit+ MC subpopulation that is reflecting most probably an immigration and / or proliferation of immature MC and their precursors which might be promoted by SCF and TGF-beta, possibly also NGF via its receptors. Next to TGF-( and NGF, also SCF seems to play a role in wound healing. Our findings suggest different regulation patterns of MC increase in inflammatory conditions of the skin. After wounding, feedback mechanisms via growth factors (SCF, TGF-(, possibly NGF) and their receptors on MC could be operative, while in urticaria in accordance with data from the literature interactions between MC and endothelial cells appear to be essential.

Die Pathogenese der Hypertonie und der Arteriosklerose sind multifaktorieller Prozesse, welche die Interaktion von genetischen und Umweltfaktoren involviert. Die molekularen Mechanismen an den Gefäßen sind ähnlich, jedoch nicht im Detail verstanden. Bei beiden Gefäßerkrankungen ist das Endothel der zentrale Angriffspunkt, der zu einer chronischen Entzündungsreaktion führt, ist. Der Transkriptionsfaktor NF-kappaB ist der Hauptschalter bei der Aktivierung der Gene, die zu der Aktivierung von Leukozyten und zu der Entwicklung der Entzündungsreaktion führen. Die hier aufgezeigten Untersuchungen befassen sich mit dieser Problematik und sind in 4 Teilprojekte gegliedert. Teilprojekt 1 befasst sich mit der physiologischen Funktion von Bcl-3, einem Mitglied der IkappaBalpha Familie. Da über die Funktion von Bcl-3 wenig bekannt ist, sollte mit Hilfe des Yeast-Two-Hybrid Systems neue Interaktionspartner identifiziert werden. Insgesamt würden fünf Proteine identifiziert, die alle binäre Komplexe in vitro (Co-Immunopräzipitation und GST-puldown) und im Yeast-Two-Hybrid bilden. Wir konnten zeigen, dass Bcl-3 mit den Ankyrin Repeats zur gleichen Zeit mit (mindestens) zwei Proteinen interagieren kann. Die endogene Aktivität von p50/Bcl-3 Komplexe wird durch die Transfektion der Interaktionspartner gesteigert. Den größten Effekt hat dabei Jab1. In transienten Transfektionen modulieren Jab1, Tip60, Bard1 und Pirin modulieren die Transkriptionsaktivität von Bcl-3 in verschiedenen Zellinien und mit verschiedenen Reporterkonstrukten. Den stärksten aktivierenden Effekt auf p50/Bcl-3 übt Tip60 aus. Tip60, Jab1 und Pirin können ebenfalls in vivo mit Bcl-3 co-immunoprezipitiert werden, wenn beide Proteine transient transfiziert werden. Auf Grund dieser Ergebnisse spekulieren wir, dass Bcl-3 eine Adapterfunktion ausübt, die NF-kappaB p50/p52 mit anderen Transkriptionsfaktoren (NF-1, c-jun, thyroid rezeptor, HIV-Tat) bzw. basalen Transkriptionsfaktoren (Histonacetylasen, RNA Polymerasen) verbindet. Teilprojekt 2 hat sich mit neuen Risikofaktoren für die koronare Herzerkrankung beschafft. Es gibt Hinweise, dass ein infektiöses Agens neben etablierten Risikofaktoren ursächlich an der Pathogenese und Progredienz der Arteriosklerose beteiligt ist. Unter den möglichen Erregern haben Untersuchungen der letzten Jahre gezeigt, dass Chlamydia pneumoniae das infektiöse Agens sein könnte. Infektion mit C. pneumoniae führte zu einer Aktivierung von pro-koagulatorischen Faktoren (Tissue Faktor und PAI-1) und Zytokinen (Interleukin 6). vermehrt expremiert werden. Wir konnten zudem eine vermehrte membranständige Expression von Rho-A und Rac-1 nachweisen, welche durch Statine gehemmt wurde. Zudem zeigte sich eine vermehrte Sauerstoffradikalfreisetzung nach Infektion mit C.pneumoniae. Die untersuchten Faktoren werden durch den Transkriptionsfaktor NF-kappaB reguliert, der ebenfalls nach Infektion induziert wurde. IkappaBalpha wurde degradiert. Alle Prozesse wurden durch Zugabe von Statinen reduziert. Wir zeigen einen möglichen molekularen Mechanismus auf, wie durch eine C. pneumoniae Infektion das lokale Milieu in der arteriosklerotischen Plaque derart verändert wird, dass Prozesse gefördert werden, die zu einer instabilen Koronarsituation führen können. Ziel des Teilprojekts 3 war es, neue molekulare Mechanismen bei der Pathogenese Angiotensin II-vermittelter Endorganschäden herauszufinden. Wir haben dazu ein transgenes Tiermodell (dTGR) untersucht, welches das humane Renin- und Angiotensinogen-Gen überexprimiert und 3 bis 5-fach erhöhte Ang II-Spiegel aufweist. Ang II stimulierte die Transkriptionsfaktoren NF-kappaB und AP-1, sowie von ihnen regulierte pro-entzündliche Proteine. Wir sind der Hypothese nachgegangen, ob Entzündungsreaktionen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese spielen könnten. Sowohl anti-entzündliche Inhibitoren, wie Aspirin in hoher Dosierung, die die Aktivierung von NF-kappaB verhindern, verringerten die Organschäden. Pleiotrope Eigenschaften des HMG-CoA-Reduktase-Hemmers Cerivastatin verminderten, cholesterinunabhängig, die Organschädigung. Auch hier ist der zu Grunde liegende Mechanismus eine Hemmung der Ang II induzeirten Entzündungsreaktion. Teilprojekt IV befasst sich mit der Präeklampsie, einer schwangerschaftsspezifischen Erkrankung, die durch das erstmalige Auftreten von arterieller Hypertonie und Proteinurie nach der 20. Schwangerschaftswoche charakterisiert ist. Die Präeklampsie ist unverändert eine der häufigsten Ursachen für mütterliche und kindliche Morbidität und Mortalität. Wir haben festgestellt, dass Schwangere mit Präeklampsie spezifische, agonistische Antikörper gegen den Angiontensin-II-AT1-Rezeptor (AT1-AA) entwickeln. Dieser Autoantikörper ist gegen die zweite extrazelluläre Schleife des AT1-Rezeptors gerichtet. Wir konnten zeigen, dass AT1-AA eine Aktivierung von NF-kappaB und AP-1 bewirken. Zudem konnten wir nachweisen, das vermehrt reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induziert werden und dass dieser Prozess über die NADPH-Oxidase vermittelt ist. Auch konnten wir zeigen, dass die Expression der NADPH oxidase durch den AT1-AA induziert wird. Präeklamptische Plazenten weisen eine stärkere Produktion von ROS und eine vermehrte Expression der NADPH oxidase auf als gesunde Kontrollplazenten. Die Autoantikörper könnten einen wesentlichen endothelialen Schädigungsmechanismus bei Präeklampsie darstellen. Die konsekutive Aktivierung von NF-kappaB und AP-1 eine wichtige, mögliche Ursache, dass eine chronische vaskuläre Entzündungsreaktion iniitiert und unterhalten wird. / Atheroscleosis and hypertension are considered to be a complex process involving the interaction of genetic and environmental factors and the interplay between several cell types. Besides established risk factors for atherosclerosis and hypertension induced vascular pathology, chronic inflammation is regarded as a key event in the pathogenesis. The transcription factor family NF-kappaB is a key regulator of abroad rage of genes involved in inflammatory processes, proliferation and apoptosis. Aim of the investigations is to identify molecular mechanisms in vascular biology in order to understand pathophysiological vascular processes. The investigations are divided into 4 projects In project 1 we tried to identify the physiological role of the proto-oncoprotein Bcl-3, which is a member of the IkappaB family,. To gain insight into specific nuclear functions of Bcl-3 we have isolated proteins that interact with its ankyrin repeat domain. Using the yeast two-hybrid-system we identified four novel binding partners of Bcl-3 in addition to NF-kappaB p50 and p52, previously known to associate with Bcl-3. The novel Bcl-3 interactors Jab1, Pirin, Tip60 and Bard1 are nuclear proteins which also bind to other transcription factors including c-Jun, nuclear factor I (NFI), HIV-1 Tat or the tumor suppressor and PolII holoenzyme component Brca1, respectively. Bcl-3, p50, and either Bard1, Tip60 or Pirin are sequestered into quarternary complexes on NF-kappaB DNA binding sites, whereas Jab1 enhances p50-Bcl-3-DNA complex formation. Furthermore, the histone acetylase Tip60 enhances Bcl-3-p50 activated transcription through an NF-kappaB binding site, indicating that quarternary complexes containing Bcl-3 interactors modulate NF-kappaB driven gene expression. These data implicate Bcl-3 as an adaptor between NF-kappaB p50/p52 and other transcription regulators and suggest that its gene activation function may at least in part be due to recruitment of the Tip60 histone actetylase. Project 2 concentrated on investigating novel mechanism in arteriosclerosis. Recent reports link C. pneumoniae infection of arteriosclerotic lesions to the precipitation of acute coronary syndromes, which also feature tissue factor and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) overexpression. We investigated whether or not C. pneumoniae can induce thrombogenicity by upregulation of procoagulant proteins. Human vascular endothelial and smooth muscle cells were infected with a strain of C. pneumoniae isolated from an arteriosclerotic coronary artery. Tissue factor, PAI-1, and interleukin-6 expression was increased in infected cells. Western blotting We could show, that C.pneumoniae infection resulted in increased cell membrane-associated RhoA and Rac1, implying increased prenylation of these proteins. This effect was blocked by statin but circumvented by mevalonate. Cytochrome C assays showed that infected VSMCs produced increased reactive oxygen species that was blocked by statin. Infection increased nuclear transcription factor-kappaB expression in VSMCs that was dose-dependently suppressed by statin. Infected VSMCs produced and released RANTES and MCP-1. Statin dose-dependently blocked this production both at the mRNA and protein levels. These data provide evidence that C. pneumoniae infection can induce procoagulant protein and proinflammatory cytokine expression. This cellular response is accompanied by activation of NF-kappaB. Our results demonstrate how C. pneumoniae infection may initiate acute coronary syndromes. In project 3 we investigated molecular mechanism in Angiotensin II induced endorgan cardiovascular endorgan damage. Therefore we established a double transgenic rat (dTGR) model, in which rats transgenic for the humanangiotensinogen and renin genes are crossed. We show evidence that Ang II stimulates NF-kappaB and AP-1, which are involved with initiating chemokine and cytokine expression, leading to the above cascade in this model. Various pharmacological, such as the endothlin-1 receptor blocker bosentan, the immunosuppressant cyclosporin, the NF-kappaB inhibitor PDTC, the aldosteron antagonist spironolactone all ameliorated the ANG II-induced end-organ damage. However, all inhibitors were able to reduce NF-kappaB activation and inflammation. Stain also reduced cholesterol-independent the cardiovascular endorgan damage in dTGR. The pleiotrophic effects of statins reduced NF-kappaB and AP-1 activity, indicating that the local Angiotensin II induced inflammatory reaction is the key event in initiating the endorgan damage. Project 4 is focused on preeclampsia. Preeclampsia occurs after the 20th week of gestation and features hypertension and an increased peripheral vascular resistance; the mechanisms are unknown. The is a major cause of maternal and fetal morbidity We recently described autoantibodies (AT1-AA) directed at the AT1 receptor in the serum of preeclamptic patients, whose placentas are commonly infarcted and express tissue factor (TF). We proved AT1-AA specificity by coimmunoprecipitating the AT1 receptor with AT1-AA but not with nonspecific IgG. Angiotensin (Ang) II and AT1-AA both activated extracellular signal-related kinase, AP-1, and the TF promoter transfected VSMC and Chinese hamster ovary cells, but only when the AP-1 binding site was present. We then demonstrated TF expression in VSMC exposed to either Ang II or AT1-AA. All these effects were blocked by losartan. Nonspecific IgG or IgG from nonpreeclamptic pregnant women had a negligible effect. AT1-AA increased ROS production and the NADPH oxidase components, p22, p47, and p67 phox in Western blotting. AT1-AA activated NF-kappaB. IkappaBalpha expression was reduced in response to AT1-AA. The p22, p47, and p67 phox expression in placentas from preeclamptic patients was increased, compared with normal placentas. Furthermore, NF-kappaB was activated in placentas from preeclamptic women. We conclude that AT1-AA and Ang II both stimulate the AT1 receptor and initiate a signaling cascade resulting in TF expression. NADPH oxidase is potentially an important source of ROS that may upregulate NF-kappaB in preeclampsia These results show an action of AT1-AA on human cells that could contribute to the pathogenesis of preeclampsia. We suggest that AT1-AA through activation of NADPH oxidase could contribute to ROS production and inflammatory responses in preeclampsia.

Worauf schon die Literatur hinweist, kann mit dieser Studie bestätigt werden: Eine langfristige metabolische Kontrolle stellt einen essentiellen Faktor in der adäquaten Betreuung von GDM Patientinnen dar. Dies wird nicht nur durch eine IGT bei einem Drittel der Probandinnen, sondern auch durch durchschnittlich höhere Insulin- und Kortisolspiegel 5,5 Jahre nach der Erkrankung bestätigt. Die Objektivierung einer psychiatrischen Beeinträchtigung oder Einschränkung neuropsychologischer Funktionen aufgrund einer persistierenden Hyperglykämie konnte nicht eindeutig bestätigt werden. In Gedächtnistests sowie im subjektiven psychischen und somatischen Befinden konnten nur tendenzielle Unterschiede gemessen werden. Dies gilt auch in Abhängigkeit von der metabolischen Kontrolle unabängig eines zu Grunde liegenden Gestationsdiabetes. Auch wenn die Studie keine kognitive Beeinträchtigung nachweisen konnte, sind Störungen durch langfristige metabolische Dysfunktionen nicht auszuschliessen. Bei der Durchführung weiterer derartiger Studien sind unbedingt die von uns einbezogenen Stoffwechselparameter (Kortisol, Insulin und Glukose) mit Einfluss auf die Kognition einzubeziehen. Ein regelmässiges Follow-Up der Schwangeren mit Gestationsdiabetes sollte in jedem Fall erfolgen, um einen postpartalen Typ-2-Diabetes mellitus rechtzeitig zu erkennen und therapieren zu können. / This study can confirm the importance of long term metabolic control in GDM Patients as the existing literature is already pointing out. It is an essential aspect in the adequate support of patients with gestational diabetes. It is shown not only by an impaired glucose tolerance in one third of GDM Patients but also by insuline and glucagon levels above average 5.5 Years after the concerning pregnancy. The objectification of psychiatric impairment or impairment in neuropsychological functions due to persistent hyperglycaemia could not be proved clearly. In memory tests as in psychological or somatic findings we could only measure tendencies without significant differences. This counts also for the metabolic control itself without the existence of preceding gestational diabetes. Even though there were no cognitive impairments proven, we could not exclude any disturbances due to long term metabolic dysfunction. With the execution of future studies, metabolic parameter that we used (Insulin, Glucagone, Glucose) should be included as influencing parameter to cognitive functions. A Follow Up in GDM Patients should be performed regularly in any case, not only to exclude the development of a possible diabetes mellitus.

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In Europa stellt die Multiple Sklerose (MS) die häufigste neuroimmunologische Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) dar. Relevante Daten zum Krankheitsverlauf der MS wurden durch Untersuchungen im Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelits (EAE) gewonnen. Nach gegenwärtigem Kenntnisstand wandern autoreaktive T-Zellen vom T-Helfer-1 (Th-1) Typ in das ZNS ein und lösen eine gegen Bestandteile der Markscheide gerichtete Entzündung aus. Diese Zellen exprimieren große Mengen des für sie typischen Zytokin Interferon-gamma (IFN-gamma), was in zahlreichen Zelltypen die Expression des Tryptophan degradierenden Enzyms Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) induziert. Seit 1998 ist bekannt, dass die Inhibition der IDO zu einer durch T-Zellen vermittelten Abstoßung allogener Feten führt. Diese immunregulatorische Funktion von IDO konnte auf den schnellen Abbau der essentiellen Aminosäure Tryptophan und der im folgenden Abbauweg synthetisierten T-Zell-toxischen Metabolite zurückgeführt werden. Da im entzündeten ZNS-Gewebe während der MS und der EAE das IDO induzierende Zytokin IFN-gamma ebenfalls exprimiert wird, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden in wie weit die IDO an der Immunregulation des ZNS unter autoimmuner Neuroinflammation während EAE, beteiligt ist. Mittels HPLC konnte gezeigt werden, dass die relative IDO Aktivität im ZNS während der akuten und der Erholungsphase der Erkrankung signifikant gesteigert ist. Erfolgte ab dem Ausbruch der Erkrankung die systemische Inhibition der IDO Aktivität mit dem spezifischen IDO-Inhibitor 1-Methyl-Tryptophan, so führte dies zu einem signifikant schwereren Krankheitsverlauf im Vergleich zu Kontrolltieren. Mittels Immunzytochemie wurde gezeigt, dass aktivierte Mikroglia IDO im entzündeten ZNS und in Zellkultur nach IFN-gamma Stimulation exprimieren. Aufgrund von RT-PCR Analysen weiterer Enzyme des Kynureninweges konnte dessen Regulation während EAE nachgewiesen werden Entlang dieses Stoffwechselweges werden T-zell-toxische Tryptophanmetabolite gebildet die an der Eliminierung autoreaktiver T-Zellen im ZNS während der Erholungsphase der EAE beteiligt sein könnten und somit die aktivierten Th1 Zellen im ZNS einen antiinflammatorischen Rückkopplungsmechanismus auslösen. / Multiple sclerosis (MS) is the most widespread neuroimmunological disease of the central nervous system (CNS) in Europe. By applying the animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), important insights into the disease course of MS have been gained. At present it is accepted that at the onset of the disease myelin-reactive T helper type 1 (Th1) cells infiltrate the CNS and induce autoimmune neuroinflammation. Activated Th1 cells express high amounts of the cytokine interferon-gamma (IFN-gamma). This pro-inflammatory signaling molecule is known to induce the expression of the tryptophan-degrading enzyme Indolmaine 2,3- Dioxygenase (IDO) in several cell types. Since 1998 it is known that inhibition of IDO induces the T cell-mediated rejection of allogeneic concepti in mice. The mechanism of this immunregulatory function of IDO was shown to be due to the degradation of the essential amino acid tryptophan and the subsequent synthesis of T cell toxic metabolites. Since the IDO-inducing cytokine IFN-gamma is also expressed within inflamed CNS tissue during MS and EAE, the present work investigated the role of IDO in immunregulation of the CNS during autoimmune neuroinflammation in the EAE model. A significant increase in relative IDO activity within the CNS during the acute and remission phases of EAE was identified by HPLC analysis. Systemic inhibition of IDO activity by the specific IDO inhibitor 1-methyl-tryptophan reduced the remission and exacerbated the progression of the disease in comparison to control animals. Activated microglia were identified by immunocytochemistry as IDO-expressing cells within the acute inflamed CNS and in cell culture after IFN-gamma stimulation. Enzymes following IDO in the kynurenine pathway were shown by RT-PCR to be up-regulated in the disease course. The analyzed enzymes are known to produce T cell toxic tryptophan metabolites and might therefore be involved in the elimination of autoreactive T cells from CNS tissue. In conclusion, the presented data support the view that autoreactive Th1 cells in the CNS induce a self-limiting negative feedback mechanism which limits the spread of inflammation, thereby reducing bystander damage in the CNS.

Bei der adaptiven Immunantwort wird ein breites Repertoire an Effektor-T-Zellen gebildet, das sich durch spezifische und vielfältige funktionelle Fähigkeiten auszeichnet. Neben der Aktivierung der Immunantwort werden Mechanismen benötigt, die Immunantworten regulieren und abschalten können, um unerwünschte Immunreaktion zu verhindern. Die Arbeit befasst sich mit der Rolle von CD152 (CTLA-4), einem Homolog zu CD28, bei der Begrenzung von T-Zellantworten. Die Inhibition der Proliferationsbegrenzung der T-Zellen durch CD152 war ursprünglich auf eine späte Abschaltung der T-Zellproliferation zurückgeführt worden. Wir konnten zeigen, dass CD152 bereits die T-Zellaktivierung abschalten kann und somit die Aktivierungsschwelle der T-Zelle heraufsetzt. Wir konnten auch zeigen, dass CD152 die frühe T-Zellproliferation auf zwei Ebenen inhibiert: Durch die Transkriptionsinitiierung des autologen, Proliferation-induzierenden Zytokins IL-2 und durch die Expression von G1-Kinasen, die für das voranschreiten des Zellzyklus unerläßlich sind. Bisher war es nicht möglich, individuelle, CD152-oberflächen-exprimierende T-Zellen zu detektieren. Um die Expression von CD152 auf der Oberfläche von T-Zellen zu analysieren, haben wir eine sensitive Färbemethode für Oberflächen-exprimiertes CD152 etabliert. Wir konnten damit zeigen, dass während einer antigen-spezifischen Stimulation Zellmembran-gebundenes CD152 lediglich auf einer Subpopulation von aktivierten Zellen (CD152+ T-Zellen) exprimiert wird. Isolierte, aktivierte CD152+ T-Zellen waren im Gegensatz zu aktivierten CD152- T-Zellen bei Restimulation in ihrer Proliferation inhibiert. Dies zeigt auch, dass CD152 in der Lage ist, bereits aktivierte T-Zellen zu inhibieren. Die heterogene Expression von CD152 auf der Oberfläche lässt vermuten, dass die CD152 exprimierenden Zellen, wenn sie ein CD152-Signal bekommen, eine andere Zelldifferenzierung einschlagen als Zellen ohne CD152. Wiederholte oder chronische Aktivierung von Th-Zellen führt zu einer Form von Apoptose, dem Aktivierungs-induzierter Zelltod, gegen den Th2-Zellen resistent sind. Aktivierte Th2-Zellen exprimieren, im Gegensatz zu Th1-Zellen, häufiger CD152 auf ihrer Oberfläche. Wir konnten zeigen, dass CD152-Kreuzvernetzung von aktivierten T-Zellen direkt Resistenz gegen Apoptose vermittelt. Dies geschieht, indem ein Signaltransduktionsmolekül, die PI3´Kinase, aktiviert wird. Dies führt zur Inaktivierung von Apoptose-unterstützenden Molekülen (Phosphorylierung von FKHRL1 und Herunterregulation von FasL) und zur Induktion des Apoptose-verhindernden Moleküls Bcl-2. Vermeidung von Apoptose ist eine zentrale Voraussetzung zur Induktion von Gedächtniszellen. CD152 exprimierende Zellen wären somit gute Kandidaten, um zu Gedächtniszellen zu differenzieren. Um die Rolle von CD152 bei der späten T-Zelldifferenzierung in vivo untersuchen zu können, wurde das CD152 Gen konditionell in der Maus mutagenisiert. / During adaptive immune responses a broad repertoire of effector T-cells is generated, characterized by diverse functional capabilities. Besides activation of the immune response other mechanisms are needed in order to regulate and terminate responses, thus preventing unwanted immune reactions. Here I focus on the role of CD152 (CTLA-4), a homologue of CD28, in the limitation of T-cell responses. Inhibition of T-cell-proliferation by CD152 was originally attributed to a late regulation of the T-cell proliferation. We now show that CD152 is already able to prevent the activation of T-cells and to set the threshold for their activation. We also show that CD152 inhibits T-cell activation in two ways: It inhibits the induction of the growth-factor IL-2 and it inhibits the expression of G1-kinases mandatory for the progression of the cell cycle. Until now, it has not been possible to detect individual T-cells expressing CD152 at their surface. To analyze the expression of CD152 at the surface of individual cells, we developed a sensitive staining method. Using this technique we could show that antigen-specific stimulation of T-cells leads to the expression of surface-bound CD152 only on a fraction of the activated T-cells. Isolated, activated CD152+ T-cells were inhibited in their proliferation whereas CD152- T cells were not. This also shows that CD152 is indeed able to inhibit already activated T-cells. The heterogenous expression of CD152 at the cell surface of already activated T-cells also suggests that CD152+ T-cells will differentiate differently compared to CD152-T-cells. Repeated or chronic activation of Th-cells leads to one form of apoptosis, activation-induced cell death (AICD), against which Th2-cells are resistant. Activated Th2-cells express surface CD152 at higher frequencies than Th1-cells. We show here, that CD152-crosslinking of activated T-cells directly induces resistance against AICD by a mechanism requiring PI3´kinase. This leads to the inactivation of pro-apoptotic molecules (phosphorylation of FKHRL1 and downregulation of FasL). It also leads to the induction of the survival molecule Bcl-2. Prevention of apoptosis is a central prerequisite for the generation of memory cells. Therefore, surface CD152+ T-cells might be good candidates to differentiate into memory cells. To investigate the role of CD152 during the differentiation of T-cells in vivo, the CD152 gene was conditional mutagenese of the CD152 gene was generated.

Wenige Studien haben erste Hinweise darauf geliefert, dass die insektivore Fledermausart Mops condylurus ein natürliches Reservoir von Ebolaviren sein könnte. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden weitere Hinweise gesucht, um die Bedeutung dieser Fledermausart als Reservoirwirt für Ebolaviren besser beurteilen zu können. Dafür wurden die Expressionslevel des Membranproteins Niemann-Pick C1 (NPC1), welches essentiell für den Eintritt von Ebolaviren in ihre Wirtszellen ist, in vitro durch konfokale Mikroskopie und Durchflusszytometrie charakterisiert. In dieser Arbeit generierte Primärzellkulturen aus 12 verschiedenen Organen von M. condylurus zeigten für die meisten Primärzellen deutlich niedrigere Expressionslevel als Kontrollzellen von Mensch, Affe oder einer europäischen Fledermaus. Die untersuchte Replikationskinetik von Ebola virus (EBOV) zeigte in allen Primärzellen von M. condylurus niedrigere Replikationsraten, die meistens mit den niedrigen NPC1 Rezeptor-Expressionsleveln korrelierten. Geringere Mengen von NPC1 könnten in vivo zur Virusreplikation auf niedrigerem Niveau beitragen. Desweiteren zeigten alle Primärzellen von M. condylurus eine hohe Toleranz gegenüber EBOV ohne Zelltot. Eine beobachtete Persistenz in Lungenprimärzellen könnte die intrinsische Fähigkeit widerspiegeln, dass Ebolaviren auch in vivo in dieser Fledermausart persistieren könnten. Mit den geringeren NPC1-Rezeptor-Expressionsleveln, der geringeren Virusreplikation, der hohen Toleranz gegenüber EBOV und der Etablierung von persistenten Infektionen in Primärzellen von M. condylurus wurden in vitro zusätzliche Hinweise gewonnen, die die Wahrscheinlichkeit dieser Fledermausspezies als ein mögliches natürliches Reservoir von Ebolaviren erhöht. Ergebnisse von zusätzlichen Temperaturversuchen lassen vermuten, dass die Heterothermie der Fledermäuse einen Schlüsselfaktor für die Toleranz von Ebolaviren in vivo darstellen und darüber hinaus an der Balance zwischen Viruskontrolle und Virusvermehrung beteiligt sein könnte. / Few studies provide first evidence that Mops condylurus, an insectivorous microbat, could be a natural reservoir for ebolaviruses. The aim of this thesis was to investigate indicators to determine the potential role of this bat species in the ecology of ebolaviruses. Therefore, the expression levels of the membrane protein Niemann-Pick C1 (NPC1), essential for the entry of ebolaviruses into their host cells, were characterized in vitro by confocal microscopy and flow cytometry. Our generated primary cell cultures from 12 different organs from M. condylurus showed significantly lower expression levels in most primary cells compared to control cells from human, monkey or a European bat. In most cases, lower Ebola virus (EBOV) replication rates in primary cells from M. condylurus, determined by RT-qPCR, correlated to lower NPC1 receptor expression levels. Low NPC1 receptor expression levels may contribute to decreased virus replication rates also in vivo. Additionally, all primary cells were highly tolerant to EBOV infections without cell death. The observed establishment of persistent EBOV infections in lung primary cells from M. condylurus may reflect the intrinsic ability to persist in vivo in this bat species. With lower NPC1 receptor expression levels, lower virus replication rates, high tolerance to EBOV infections and establishment of persistent infections in primary cells from M. condylurus, the in vitro experiments provided further evidence that this bat species is a potential reservoir of ebolaviruses. Results from additional temperature experiments suggest, that heterothermy of M. condylurus could be a key factor for tolerance to EBOV infections in vivo and be involved in balancing the level of virus replication.

Die Auswirkung der systemischen Applikation von 100µg/kg/KG rekombinantem speziesspezifischem Wachstumshormon (GH) über 26 Tage auf den Knochenumbau des Yucatan-Minischweins wurde an Wirbelkörpern, Beckenkämmen und Rippen histomorphometrisch untersucht. Der Einfluss der Distraktionsosteogenese auf die Mineralappositionsrate wurde ermittelt. 24 Tiere wurden an der linken Tibia osteotomiert, ein Fixateur externe wurde zur Distraktionsosteogenese von 2mm/d angelegt. 12 Tiere erhielten Wachstumshormon, 12 Placebo. Eine polychrome Fluoreszenzmarkierung wurde i.v. appliziert. Post mortem wurden Schnitte und Dünnschliffe der genannten Knochen angefertigt. Mittels Bildanalysesystem erfolgte die histomorphometrische Auswertung anhand der Parameter Knochendichte, Porosität, Trabekeldicke, Trabekelumbauparameter und Mineralappositionsrate (MAR). Signifikante Veränderungen durch Wachstumshormongabe konnten gezeigt werden. Unterschiede zwischen den Lokalisationen traten auf. So war die Knochendichte der GH-Tiere an Wirbelkörpern und Rippen signifikant geringer als in der Placebogruppe, kein signifikanter Unterschied zeigte sich am Beckenkamm. An allen 3 Lokalisationen war in der Wachstumshormongruppe eine signifikant erhöhte kortikale Porosität zu finden. Nur am Wirbelkörper waren die trabekuläre Knochendichte und die Trabekeldicke bei den GH-Tieren signifikant geringer als bei den Kontrolltieren. Die Knochenresorption war in der GH-Gruppe am Beckenkamm signifikant erhöht. Die Formation war bei den GH-Tieren sowohl iliakal als auch vertebral signifikant erhöht. Insgesamt ergab sich damit ein signifikant verminderter Anteil an ruhender Oberfläche bei den GH-Tieren. In ihrer Ausprägung waren diese Parameter zwischen Wirbel und Beckenkamm signifikant verschieden. Die MAR war in der GH-Gruppe signifikant höher als in der Placebogruppe, außerdem war sie während der Distraktionsphase signifikant höher als während der Konsolidierungsphase. Vergleicht man die Parameter mit Angaben aus der Literatur, kann bestätigt werden, dass die hier verwendeten Messmethoden geeignet sind, und dass das Yucatan-Minischwein ein geeignetes Modell zur Klärung von Fragestellungen der Knochenbiologie auch im Hinblick auf den Vergleich zum Menschen darstellt. / The effect of systemic application of 100 µg/kg recombinant species specific growth hormone (GH) on the bone remodelling of 24 Yucatan mini pigs for a duration of 26 days was evaluated on vertebral body, iliac crest, and rib. The influence of distraction osteogenesis on the mineral apposition rate (MAR) was examined. 24 animals were osteotomized at the left tibia and treated with an external fixator for distraction osteogenesis of 2 mm/d. 12 of them received GH, the others placebo. A sequential polychrome fluorescent labelling was applied. After sacrifice thin and ground sections were manufactured. Using an image analysis system, a histomorphometrical evaluation was performed by means of bone density, porosity, trabecular thickness, trabecular remodelling parameters, and mineral apposition rate (MAR). Significant changes after GH application were visible. Differences between the locations were found. The bone density of vertebrae and ribs of the treatment group was significantly lower than that of the placebo group, whereas no difference was seen in the iliac crest biopsies. All 3 locations showed a significantly higher cortical porosity in the GH group. The trabecular bone density and the trabecular thickness were significantly decreased only in the vertebral bodies of the treatment group. The bone resorption was significantly elevated in the iliac crests of the GH group. The bone formation was increased in the iliac crest as well as in the vertebrae of the GH treated animals. Therefore, the resting surface was significantly decreased in the GH group. The extent of these effects was significantly different between iliac crest and vertebral body. The MAR was significantly higher in the GH group and during distraction osteogenesis. Compared to results of other study groups these parameters validate the methods of measurement and show that the Yucatan mini pig is a suitable model for research concerning bone biology, especially concerning the comparison with human parameters.

Zusätzlich zu seiner Funktion innerhalb des Gerinnungssystems vermittelt Thrombin inflammatorische Reaktionen. Mastzellen (MZ) sind durch die Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren wie Maus-Mastzell Proteasen (MCPTs mouse mast cell proteases auch als mMCPs bekannt), Zytokinen und Chemokinen. charakterisiert. Da Thrombinrezeptoren, auch als Proteinase-aktivierbare Rezeptoren (PAR) bekannt, von MZ exprimiert werden, wurde untersucht ob eine MZ-Aktivierung über die Thrombin/PAR Interaktion bei einer dermalen Entzündung eine Rolle spielt. Die intrakutane Injektion von Thrombin in die Ohren von C57BL/6 Kit+/+ Mäusen löste eine sofortige kutane Entzündung, einhergehend mit einer starken Ohrschwellung, aus. Im Vergleich dazu war diese Schwellung in MZ-defizienten C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen deutlich stärker, was darauf hindeutet, dass MZ anti-inflammatorisch wirken. Die lokale Rekonstitution von C57BL/6 KitW-sh/W-sh Mäusen mit knochenmarksgenerierten MZ normalisierte diesen Effekt. Die quantitative histomorphometrische Untersuchung der MZ bestätigte zusätzlich eine starke Degranulation der MZ nach Thrombininjektion nach. PCR-Analysen der MZ wiesen die Expression aller bekannten Thrombin-Rezeptoren. Die Stimulation mit verschiedenen Konzentrationen von Thrombin oder PAR-agonistischen Peptiden führte zu einer dosis-abhängigen Degranulation der MZ, was nahe legt, dass die Degranulation der MZ für die Limitierung der thrombin-induzierten Entzündung nötig ist. Gestützt wird die Hypothese durch die Tatsache, dass Zellkulturüberstand von degranulierten MZ zu einer Inaktivierung der Thrombinaktivität führt. Des Weiteren führte die Injektion von Thrombin in die Ohren von MCTP4-defizienten Mäusen zu einer deutlich erhöhten Ohrschwellung im Vergleich zur korrespondierenden Wildtyp-Maus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass die sofortige thrombin-induzierte Entzündungsreaktion durch kutane MZ kontrolliert wird. Dieser Mechanismus wird teilweise durch MCPT4 vermittelt. / In addition to its function in the coagulation system, thrombin mediates inflammatory reactions. Mast cells (MCs) are characterized by releasing inflammatory mediators like mouse mast cell proteases (MCPTs, also designated mMCPs), cytokines, and chemokines, upon activation. Since thrombin-receptors, also known as Proteinase-activated receptors (PAR), are expressed by MCs, it was questioned whether MC activation via the thrombin/PAR axis plays a role in skin inflammation. Intracutaneous injection of thrombin in ears of C57BL/6 Kit+/+ mice induced immediate inflammatory skin reactions associated with a distinct ear swelling. This swelling was more pronounced in MC-deficient C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice, indicating that MCs are anti-inflammatory, local reconstitution of C57BL/6 KitW-sh/W-sh mice with C57BL/6 Kit+/+ bone marrow-derived MCs normalized this effect. Additionally thrombin injection resulted in a strong degranulation of MCs assessed by quantitative histomorphometry. PCR analysis of MCs displayed expression of all known thrombin receptors. Stimulation with thrombin or PAR agonistic peptides resulted in a dose-dependent degranulation of MC, suggesting MC degranulation could be necessary for the limitation of thrombin-induced inflammatory responses. Supporting this hypothesis, supernatant from degranulated MCs inactivated thrombin activity. Furthermore, injection of thrombin in ears of C57BL/6 MCPT4-deficient mice, resulted in markedly increased ear swelling compared to the corresponding wild type mice. Together our results suggest that thrombin-induced immediate inflammatory skin reactions are controlled by cutaneous MCs, a mechanism partly mediated via MCPT4.