Neutrophile Granulozyten produzieren „Neutrophil Extracellular Traps“ (NETs), ein mit antimikrobiellen Molekülen bestücktes Netzwerk aus Chromatinfasern, das während eines Zelltodprogramms namens „NETosis“ von den sterbenden Neutrophilen ausgestoßen wird. Ihre netzartige Struktur erlaubt es ihnen, eine weitere Verbreitung des Infektionserregers zu verhindern; zudem erzeugen sie eine hohe lokale Konzentration an toxischen Molekülen, die Mikroorganismen töten können. Unter normalen Bedingungen werden NETs von Nukleasen zerkleinert und anschließend von Makrophagen entfernt. Wenn dieser Aufräummechanismus gestört ist, aktivieren NETs das Immunsystem und führen zur Produktion von Autoantikörpern oder entzündungsfördernden Zytokinen. NETs werden mit einer wachsenden Liste von inflammatorischen und Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Wie genau dabei NETs durch das Immunsystem erkannt werden, ist noch nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass NETs durch den zytosolischen DNA Sensor „cyclic GMP-AMP synthase“ (cGAS) detektiert werden können und dass dadurch die Expression von Typ I Interferonen (TIIFN) induziert wird. Zu Beginn demonstriere ich, dass NETs durch rekombinantes cGAS erkannt werden und dass mit isolierten NETs stimulierte Immunzellen cGAS-abhängig TIIFN produzieren. Des Weiteren zeige ich, dass Neutrophile, die NETosis begehen, in Nachbarzellen ebenfalls cGAS-anhängig TIIFN induzieren können. Abschließend konnte ich diese Ergebnisse in einem in vivo Mausmodel für systemische NET-Produktion bestätigen. Die vorliegende Arbeit zeigt einen Mechanismus, wie NETs durch das Immunsystem erkannt werden und dadurch sowohl zur Entstehung als auch zur Progression von Krankheiten beitragen kann. Sie ermöglicht dementsprechend die Entwicklung neuer Interventionsstrategien, welche zur Heilung oder Linderung einer Vielzahl von Erkrankungen beitragen können. / The first line of cellular defense of the immune system are neutrophils. They are the most abundant white blood cell, which exert an array of antimicrobial effector functions. Neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), a composite of chromatin and antimicrobial molecules, into the extracellular space during a form of regulated cell death called NETosis. Their net-like structure prevent further dissemination of the invader and establishes a high local concentration of toxic molecules that mediate pathogen killing. NETs provide a platform for undesired immune activation and contribute to the production of autoantibodies and pro-inflammatory cytokines. NETs are implicated in a growing list of inflammatory and autoimmune diseases, but the exact mechanism how NETs are recognized by the immune system is not fully understood. In this study, I demonstrate that the cytosolic DNA sensor cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) senses NETs and induces the production of type I interferons (TIIFN). I first showed that NETs are recognized by recombinant cGAS and that cells treated with isolated NETs produce TIIFN in a cGAS dependent mechanism. Secondly, I demonstrate that neutrophils undergoing NETosis are taken up by neighboring immune cells and induce cGAS-dependent TIIFN expression. Lastly, I confirmed our in vitro results in a mouse model of systemic NET induction. Wildtype mice injected with Concanavalin A significantly upregulate the expression of interferon stimulated genes, while cGAS-/- mice and Cybb-/- mice, which are incapable of producing NETs, fail to induce this response.

Tinnitus, die Wahrnehmung eines Phantomgeräuschs, geht in den meisten Fällen mit Hörverlust einher. Es ist jedoch unbekannt, wie Hörverlust zu Tinnitus führen könnte. In Tierversuchen wurde gezeigt, dass Verhaltensanzeichen für Tinnitus nach Hörverlust mit erhöhten spontanen Feuerraten von Neuronen im zentralen auditorischen System korreliert sind. Zunächst untersuchen wir ob sich bei lärmbedingtem Hörverlust die Audiogramme von Patienten mit und ohne Tinnitus unterscheiden. Im Vergleich zu Patienten ohne Tinnitus haben Tinnituspatienten im Mittel weniger Hörverlust, einen steileren Abfall des Audiogramms, und die Audiogrammkante befindet sich bei höheren Frequenzen. Mit einem theoretischen Modell zeigen wir, wie tinnitusartige Hyperaktivität durch eine Stabilisierung der mittleren Feuerrate von Neuronen im zentralen Hörsystem mittels homöostatischer Plastizität entstehen kann: verringerte Aktivität von Hörnervfasern nach Hörverlust wird kompensiert durch eine Erhöhung der neuronalen Verstärkung. Dies stabilisiert die mittlere Rate, kann jedoch zu einer Erhöhung der spontanen Feuerraten führen, die dann von Art und Stärke der cochlearen Schädigung abhängen. Wir testen das Modell, indem wir es auf die Audiogramme von Patienten mit tonalem Tinnitus und Lärmschwerhörigkeit anwenden. Für jedes Audiogramm sagen wir mit dem Modell Veränderungen in der Spontanaktivität von auditorischen Neuronen vorher. Das resultierende Hyperaktivitätsmuster hat typischerweise eine deutliche Spitze, die mit einem steilen Abfall des Audiogramms einhergeht. Wenn solch eine Spitze als Grundlage für einen tonalen Tinnitus interpretiert wird, dann sagt das Modell Tinnitusfrequenzen nahe den empfundenen Tinnitustonhöhen vorher. Unser Modell stellt also eine plausible Hypothese, wie Hörverlust zu Tinnitus führen könnte, dar. Basierend auf dem Modell zeigen wir außerdem wie Hyperaktivität und somit eventuell auch Tinnitus, durch zusätzliche akustische Stimulation reduziert werden könnte. / Tinnitus is a phantom auditory sensation that is associated with hearing loss, but how hearing loss can lead to tinnitus has remained unclear. In animals, hearing loss through cochlear damage can lead to behavioral signs of tinnitus and can increase the spontaneous firing rates of central auditory neurons. To study the relation between hearing loss and tinnitus, we first analyze audiometric differences between patients with hearing loss and tinnitus and patients with hearing loss but without tinnitus. We find that tinnitus patients have on average less hearing loss, a steeper slope of the audiogram, and the audiogram edge is located at higher frequencies compared to patients without tinnitus. We then derive a computational model that demonstrates how tinnitus-related hyperactivity could arise as a consequence of a stabilization of the mean firing rates of central auditory neurons through homeostatic plasticity: decreased auditory nerve activity after hearing loss is counteracted through an increase of the neuronal response gain. This restores the mean rate, but can also lead to increased spontaneous firing rates, which depend on the type and degree of cochlear damage. Finally, we test the ability of our model to predict tinnitus pitch by applying it to audiograms from patients with noise-induced hearing loss and tone-like tinnitus. Given an audiogram, the model is used to predict changes in the spontaneous firing rates of central auditory neurons. The resulting hyperactivity pattern typically exhibits a distinct peak that is associated with a steep drop in the audiogram. If such a peak is interpreted as the basis for a tone-like tinnitus sensation, the model predicts a tinnitus frequency that is close to the patient''s tinnitus pitch. Thus, our model presents a plausible hypothesis of how hearing loss could lead to tinnitus. Based on this model, we also show how hyperactivity, and possibly also tinnitus, could be alleviated through additional acoustic stimulation.

Die prospektive Studie untersuchte den Verlauf von Hochrisikoschwangerschaften mit zwischen 24/0 und 34/0 Schwangerschaftswochen erstmals diagnostiziertem ARED-Flow in der Arteria umbilicalis hinsichtlich ihres fetal outcome im Vergleich zu einer nach Gestationsalter gematchten Kontrollgruppe. Während der Studiendauer von 1995-1999 wurden 60 Feten aus Einlingsschwangerschaften mit ARED-Flow in der Umbilikalarterie in die Beobachtung einbezogen. Feten mit Malformationen und Chromosomenanomalien wurden ausgeschlossen. Die Beobachtung erfolgte mit wiederholten Doppler-Messungen der arteriellen und venösen Gefäße, mit CTG und mütterlichen Parametern. Eine Entbindung wurde eingeleitet, wenn sich entweder die fetalen Parameter verschlechterten (68%), wie ein Reverse Flow im Ductus venosus oder späte Dezelerationen im CTG oder eine mütterliche Indikation gegeben war (28%), wie das Auftreten einer Präeklampsie. Gemäß Protokoll wurden 50% der Feten mit ARED-Flow 6 Tage nach Erstdiagnose entbunden. Bei mütterlicher Indikation war dies bereits nach 4 Tagen, bei fetaler Indikation nach 7 Tagen der Fall. Im Ergebnis zeigte sich eine Mortalität von 38% mit 23 Verstorbenen (16 intrauteriner Fruchttod und 7 postnataler Tod), die meisten intrauterinen Fruchttode (14) traten bei einem Schwangerschaftsalter unter 29/0 SSW auf. 44 Feten wurden lebend geboren. Die lebendgeborenen Feten wurden in drei Gruppen A, B und C nach dem bei der Entbindung erreichten Schwangerschaftsalter eingeteilt. Zwischen 24/0 und 28/6 SSW (Gruppe A) betrug die Mortalität 36%, zwischen 29/0 und 31/6 SSW (Gruppe B) 10% und ab 32/0 SSW (Gruppe C) 8%. Signifikante Unterschiede zwischen den drei Gruppen zeigten sich bezüglich des Auftretens von periventrikulärer Leukomalazie (nur A: 36%), von neurologischen Auffälligkeiten (A: 73%, B: 45%, C: 8%), von Atemnotsyndrom (A: 100%, B: 35%, C: 8%) und hinsichtlich der Apgar-Werte nach 5 und 10 Minuten. Die 44 lebendgeborenen Feten mit ARED-Flow wurden einer nach Schwangerschaftswochen gematchten Kontrollgruppe normgewichtiger Frühgeborener gegenübergestellt. Zwischen den Feten mit ARED-Flow und der Kontrollgruppe konnten verschiedene signifikante Unterschiede festgestellt werden: In der ARED-Gruppe fanden sich niedrigere pH-Werte (p=0,001), ein geringeres Geburtsgewicht (p=0.0001), häufigeres Auftreten von bronchopulmonaler Dysplasie (p=0.002) und von Darmkomplikationen (p=0.01). Weitere beobachtete Parameter, wie z.B. peri- und intraventrikuläre Hämorrhagien, neurologische Auffälligkeiten, waren nicht signifikant verschieden. Allerdings war das Risiko postnatal zu versterben in der ARED-Gruppe 8-fach erhöht. Es ergibt sich der Rückschluss, dass die Diagnose ARED-Flow eine Gruppe ernsthaft hypotropher hypoxämischer Feten umschreibt, die eine hohe Mortalitäts- und Morbiditätsrate aufweist. Die Mortalität ist tendenziell bei niedrigem Schwangerschaftsalter bei der Entbindung (vor 29/0 SSW), bei extrem niedrigem Geburtsgewicht (unterhalb der 3. Perzentile), bei Vorliegen von spät auftretenden Dopplerveränderungen (wie Reverse Flow in der Arteria umbilicalis oder pathologischem venösen Doppler) erhöht. Obwohl die Inzidenz peri- und intraventrikulärer Hämorrhagien (16%) und neurologischer Defizite (40%) hoch war, erwies sich dieser Unterschied gegenüber den Frühgeborenen der Kontrollgruppe als nicht signifikant. Es kann angenommen werden, dass eine Verlängerung der Schwangerschaft unter venöser Dopplerkontrolle das fetal outcome verbessert. / The study examined prospectively the progression of high-risk pregnancies in cases of ARED flow in the Arteria umbilicalis detected between 24/0 and 34/0 weeks gestation in respect of their fetal outcome compared with a gestational age-matched control group. During the 1995-99 study period, 60 fetuses from singleton pregnancies with ARED flow in the umbilical artery were included in the study. Fetuses with malformations and anoiploidy were excluded. Surveillance was performed by repeated Doppler measurements of arterial and venous vessels, CTG and maternal parameters. Delivery was induced when either fetal parameters deteriorated (68%), as in the case of reverse flow in the Ductus venosus or late decelerations in CTG, or when maternal indication (28%) was given, as when pre-eclampsia occurred. Following our protocol, 50% of fetuses with ARED flow were delivered 6 days after the first diagnosis. In the event of maternal indication, this took place after 4 days, with fetal indication after 7 days. The results showed a mortality rate of 38% with 23 deaths (16 intrauterine and 7 postnatal). The majority of intrauterine deaths (14) occurred under 29/0 weeks of term. 44 fetuses were born live. The fetuses born live were divided into Groups A, B and C in line with gestational age on delivery. Mortality between 24/0 and 28/6 weeks pregnancy (Group A) was 36%, between 29/0 and 31/6 weeks (Group B) 10%, and 8% from 32/0 weeks onward (Group C). Significant variations between the three groups was indicated in the incidence of periventricular leukomalacia (only A:36%), neurological development (A:73%, B:45%, C:8%), respiratory syndrome (A:100%, B:35%, C:8%), and in relation to the Apgar values after 5 and 10 minutes. The 44 fetuses with ARED flow born live were compared with a control group of preterm neonates of average weight and similar gestational age. Various significant differences could be shown between ARED flow fetuses and the control group: the ARED group showed lower pH values (p=0.001), lower birth weight (p=0.0001), and a higher incidence of broncho-pulmonal dysplasia (p=0.002) and of intestinal complications (p=0.01). Other observed parameters such as peri- and intraventricular haemorrhage and neurological development were not significantly different. Nevertheless, the risk of postnatal death was 8 times higher in the ARED group. It has to be concluded that diagnosis of ARED flow encompasses a group of severely hypotrophic, acidemic fetuses showing high rates of mortality and morbidity. Mortality tends to increase in the case of low gestational age on delivery (up to 29/0 weeks), in cases of extremely low birth weight (less than 3%), and in incidences of late Doppler changes (such as reverse flow in the umbilical artery or pathological venous Doppler). Although the incidence of peri- and intraventricular haemorrhages (16%) and neurological defects (40%) was high, compared with the neonates of the control group it was insignificant; It can be assumed that prolongation of pregnancy using venous Doppler improves the fetal outcome.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Frage nach Eignung der Technik, des Aufwands, der Schulung und der Vor- und Nachteile eines Einsatzes der Telepathologie in der Schnellschnitt-Diagnostik zu analysieren. Weltweit wurden verschiedene Telepathologiesysteme entwickelt, die zum Teil für den Schnellschnitt verwendet werden können. Auch an der Charité entstanden mit dem 1.ATM-System, 2.dem TPS-System und 3.dem TELEMIC-System, drei technisch völlig unterschiedliche Systeme. Diese Systeme wurden anhand einer retrospektiven Studie hinsichtlich ihrer Einsatzfähigkeit in der telepathologische Schnellschnitt-Diagnostik untersucht. Um die Systeme untereinander vergleichen zu können, wurden 124 histologische Schnellschnittpräparate aus dem Jahr 1999 herausgesucht (ausschließlich Brustgewebe), die von vier erfahrenen Pathologen mit jedem System erneut bearbeitet wurden. Qualitativ wurden mit dem ATM- und dem TPS-System gleichwertige Ergebnisse wie in der konventionellen Schnellschnitt-Diagnostik erreicht. Das TELEMIC-System war qualitativ aufgrund der hohen Rate von Rückweisungen den anderen Systemen und dem konventionellen Schnellschnitt deutlich unterlegen. Bei den Diagnosezeiten zeigte sich eine leichte Unterlegenheit des TPS-Systems gegenüber dem konventionellen Schnellschnitt. Da es jedoch insbesondere als Möglichkeit der Ferndiagnose eingesetzt wird, fallen die bei der konventionellen Schnellschnitt-Diagnostik nötigen Transportzeiten durch einen Kurier weg. Das ATM-System und das TELEMIC-System sind auch ohne Zurechnung der Transportzeiten zeitlich zum konventionellen Schnellschnitt vergleichbare Systeme. / Target of the available work is it, the question about suitability of the technique, the expenditure, to analyze the training and the pro and cons of an application of the Telepathologie on fresh frozen diagnostics. World-wide different Systems for telepathology were developed, which can be used partially for the fresh frozen diagnostics. At the Charité were developed three technically completely different systems: 1.ATM-System, 2.TPS system and 3.TELEMIC system, These systems were examined on the basis a retrospective study regarding their serviceability on telepathologische fresh frozen diagnostics. In order to be able to compare the systems among themselves, 124 histological fresh frozen preparations were picked out from the year 1999 (excluding chest tissues), which were again processed by four experienced pathologists with each system. Qualitatively with ATM and TPS system equivalent results as on were achieved conventional fresh frozen diagnostics. The TELEMIC system was qualitatively inferior for the other systems and the conventional fresh frozen diagnostics due to the high rate of rejections. With the diagnostic times an easy inferiority of the TPS system showed up in relation to the conventional fresh frozen diagnostics. Since it is used however in particular as possibility of the remote diagnostics, the feed times necessary with the conventional fresh frozen diagnostics are omitted by a courier. The ATM system and the TELEMIC system are also without addition of the feed times temporally to the conventional fresh frozen diagnostics comparable systems.

Die systemische Autoimmunerkrankung Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) ist durch die Produktion von autoreaktiven Antikörpern charakterisiert. In wie weit veränderte B-Zellrezeptor (BZR) Signalwege oder Co-Rezeptoren in diesem Prozess involviert sind, ist noch nicht ausreichend im humanen SLE untersucht worden. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit eine detaillierte Analyse des inhibitorischen Co-Rezeptors CD22, der Kinase Syk und Akt in B-Zellen des peripheren Blutes von SLE Patienten durchgeführt. SLE Patienten zeigten eine Dysbalance in BZR abhängigen Signalwegen, welche eine B-Zellsubpopulationen unabhängige Reduktion der p-Syk/p-Akt Ratio versursacht. Diese Verschiebung könnte zu einer defekten negativen Selektion und somit zur Bildung von autoreaktiven Zellen führen, die wiederum durch Überlebensvorteile persistieren könnten. Zusätzlich wurde im peripheren Blut von SLE Patienten eine bislang nicht bekannte CD27 Syk++ B-Zellpopulation nachgewiesen. Diese wies, trotz des fehlenden Gedächtnismarkers CD27, Gedächtnismerkmale auf und könnte für die bekannte erhöhte Plasmazell-induktion in SLE Patienten verantwortlich sein. Somit konnte Syk als intrazellulärer Marker einer Gedächtnispopulation identifiziert werden. Des Weiterem stellt die Wiederherstellung der Balance von Syk- und Akt Phosphorylierung nach BZR Aktivierung einen erfolgsversprechenden Therapieansatz bei SLE Patienten dar, um die Entstehung und das Überleben von autoreaktiven B- und Plasmazellen besser kontrollieren zu können. / Systemic lupus erythematosus (SLE) is a severe systemic autoimmune disease in which loss of tolerance to nucleic acids results into the production of autoreactive antibodies (Ab) Therefore, B cells might play a key role in the pathogenesis of this disease. However, abnormalities of BCR associated co receptors and downstream kinases with potential implications in selection processes are rare for human SLE. Thus, a comprehensive analysis of the inhibitory BCR co-receptor CD22, the spleen tyrosine kinase (Syk) and the pro-survival serine kinase Akt has been undertaken to gain new insights into potential BCR signaling disturbances in this autoimmune disease. This data indicate that B cells from SLE patients display an intrinsically disturbed balance of BCR related signaling pathways, resulting in a B cell subset independent reduced p-Syk/p-Akt ratio. This may lead to a diminished BCR dependent negative selection and enhanced survival of SLE B cells, permitting the emergence of autoreactive B and plasma cells. Furthermore, SLE patients exhibit an increased frequency of a novel CD27-Syk++ B cell subset with memory features, enhanced tonic BCR signaling and the capacity to differentiate in auto-Ab secreting cells. The current study provides evidence that the use of intracellular markers, such as Syk, could permit a more precise delineation of CD27- memory B cell subsets in autoimmune diseases since the conventional used memory marker CD27 has some limitations. In addition, the balance between the BCR associated kinases Syk and Akt might be a promising therapeutic target to reduce the occurrence of autoreactive B and plasma cells.

Eine mangelhafte Produktion des Zytokins Interleukin-2 (IL-2), sowie Veränderungen in der Population der CD4+Foxp3+ regulatorischen T Zellen (Treg) wurden im Zusammenhang mit der Autoimmunkrankheit Systemischer Lupus erythematodes (SLE) beschrieben. Jedoch wurde ein möglicher kausaler Zusammenhang zwischen diesen beiden Auffälligkeiten und der Pathogenese des SLE bis jetzt nicht aufschlussreich untersucht. Durchflusszytometrische Analysen zeigten hier, dass der Anteil an Treg mit hoher Expression der IL-2 Rezeptoruntereinheit CD25, die mit funktioneller und metabolischer Treg Aktivität assoziiert wurde, in SLE Patienten erniedrigt ist. Außerdem ist das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen gestört. In vitro Experimente zeigten, dass eine defekte IL-2 Produktion der CD4+ T Zellen für die niedrige CD25 Expression der Treg von SLE Patienten verantwortlich ist, wohingegen Stimulation mit IL-2 in vitro die CD25 Expression der Treg wiederherstellt und auch das Überleben der Treg erhöht. Vor allem niedrige IL-2 Konzentrationen hatten einen selektiven Effekt auf die Treg Population, während andere Lymphozyten nur wenig beeinflusst wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine klinische Studie mit niedrig dosiertem IL-2 zur Behandlung von Patienten mit refraktärem SLE implementiert. Niedrig dosiertes IL-2 führte zu einer peripheren Expansion suppressiver Treg mit stark erhöhter CD25 Expression und verbesserte das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen. Diese Effekte wurden von einer klinischen Remission in drei der fünf mit IL-2 behandelten SLE Patienten begleitet. Zusammenfassend machen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des IL-2 Defizits für die Veränderungen in der Treg Population und die Pathogenese des SLE deutlich, und zeigen, dass niedrig dosiertes IL-2 einen sicheren und effizienten neuen Therapieansatz darstellt, der direkt in die Pathogenese des SLE eingreift. / A defective production of the cytokine Interleukin-2 (IL-2), as well as abnormalities in the population of CD4+Foxp3+ regulatory T cells (Treg), have been described in association with the autoimmune disease systemic lupus erythematosus (SLE). However, a possible causal relationship between these two features and SLE pathogenesis has not been adequately investigated so far. Here, flow-cytometric analyses showed that the proportion of Treg expressing high levels of the IL-2 receptor subunit CD25, which was associated with functional and metabolic Treg activity, is reduced in SLE patients. In addition, the homeostatic balance between Treg and conventional T cells is disturbed in SLE. In vitro experiments showed that a defective IL-2 production by CD4+ T cells accounts for the low CD25 expression in Treg from SLE patients. In contrast, in vitro stimulation with IL-2 restores CD25 expression in Treg and enhances their survival. Especially low IL-2 concentrations had a selective effect on the Treg population, while other lymphocytes were only marginally affected. Based on these results, a clinical trial with low-dose IL-2 was implemented for the treatment of patients with refractory SLE. Low-dose IL-2 treatment of SLE patients caused a selective peripheral expansion of suppressive Treg with strongly increased CD25 expression levels, and improved the homeostatic balance between Treg and conventional T cells. These effects were accompanied by clinical remission in three of the five SLE patients that were treated with low-dose IL-2 during the course of this study. In summary, this work demonstrates the impact of IL-2 deficiency for the Treg abnormalities and disease pathogenesis in SLE, and it proposes low-dose IL-2 as a safe and efficient novel therapeutic approach, which directly targets SLE pathogenesis.

Die Ätiologie von entzündlichen Pankreaserkrankungen, insbesondere bei den idiopathischen Pankreatitiden, ist weitgehend noch nicht verstanden. In der folgenden Arbeit sollen immunologische und molekularbiologische Aspekte zu Pankreaserkrankungen unter Berücksichtigung eigener Untersuchungen dargestellt werden. Zu Beginn unserer Arbeit haben wir untersucht inwieweit immunologische Veränderungen an der Entstehung einer chronischen Pankreatitis beteiligt sind. Wir fanden eine systemische Aktivierung des zellulären Immunsystems, ohne dass sich Unterschiede zwischen idiopathischer und alkoholtoxischer Pankreatitis ergaben. Im folgenden haben wir uns mit dem molekularbiologischen Hintergrund von entzündlichen und malignen Pankreaserkrankungen beschäftigt. Eine genetische Modellerkrankung ist die hereditäre Pankreatitis, deren genetische Ursache 1996 mit der Entdeckung zweier Mutationen im kationischen Trypsinogen entschlüsselt wurde. Mit der Identifizierung einer neuen Mutation im kationischen Trypsinogen und deren funktionellen Charakterisierung konnten wir hier zum weiteren Verständnis dieser Erkrankung beitragen. Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit dem genetischen Hintergrund bei Patienten mit idiopathischer Pankreatitis. Bei etwa 30% dieser Patienten fanden wir ein abnormales Allel im Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Gen und bei einzelnen Patienten einen Polymorphismus im Serine Proteasen Inhibitor (SPINK1) Gen. Das zunehmende Wissen um genetische Veränderungen und deren Folgen setzt auch eine kritische Auseinandersetzung mit ethischen und rechtlichen Fragen voraus. Daher wurden während einer internationalen Konsensus Konferenz Richtlinien zum Umgang mit diesen Fragen erarbeitet. Die Assoziation von UGT1A7*3 Polymorphismus, welches ein Phase II Protein mit niedriger katalytischer Entgiftungsaktivität im Xenobiotika Stoffwechsel kodiert, mit dem Auftreten von Pankreaserkrankungen war Gegenstand weiterer Untersuchungen. Hierzu untersuchten wir Patienten mit alkoholischer chronischer Pankreatitis, Patienten mit einer SPINK1 Mutation und gesunde Kontrollen. Darüberhinaus betrachteten wir ein Kollektiv von Patienten mit einem Pankreaskarzinom. Unsere Ergebnisse belegen einen synergistischen negativen Effekt von exogenen Risikofaktoren (Alkohol, Nikotin) und genetischer Prädisposition. Die Rolle des oxidativen Stresses in der Genese von Pankreaserkrankungen wird damit untermauert. Erste therapeutische Ansätze aus den gewonnenen Erkenntnisses haben wir in einer prospektiven Studie mit einer immunmodulierenden und antioxidativ wirksamen Glutaminsubstitution bei Patienten mit akuter Pankreatitis gezeigt. Die Glutaminsubstitution führte zu einem besseren Krankheitsverlauf. / The etiology of inflammatory and malignat pancreatic disease are poorly understood. This thesis will discuss our results of immunological and genetic investigations in patients with inflammatory and malignat pancreatic diseases. Especially the background of idiopathic pancreatitis will be discussed. We started our investigations with immunological investigations and demonstrated an evidence for a systemic activated cellular immune system in patients with chronic pancreatitis irrespectively of the aetiology of pancreatitis. Further studies deal with the genetic background of pancreatitis. The discovery of the association between a mutation of the cationic trypsinogen gene and the hereditary pancreatitis was a milestone in the modern pancreatology. We contribute to the understanding of this disease by detecting a new mutation (D22G). We were able to functional characterise this mutation. Mutation of the activation peptides (D22G, K23R) are related to an increased release of trypsin in hydrolisation studies in vitro. In addition, our further investigations confirmed and extended the knowledge of the role of mutation in the CFTR gene and the SPINK 1 gene in patients with 'idiopathic' pancreatitis. Cognisant of the ethical and clinical responsibilities guidelines for the genetic testing and managing of patients with genetic diseases of the pancreas were developed. The low detoxification activity UGT1A7*3 polymorphism has been identified as a novel risk factor of pancreatic inflammatory and malignant diseases defining the interaction of genetic predisposition and environmentally induced oxidative injury. Based on this data we conducted a prospective, randomised clinical trial on the supplementation with glutamine in patients with acute pancreatitis shedulded for total parenteral nutrition. The administration of glutamine, which has been shown to have an immune-modulating and antioxidative capacity, was associated with a favourable clinical course of the patiens receiving glutamine.

Übergewicht und Fettleibigkeit sind zu einem bedeutenden Gesundheitsproblem in den westlichen Industriestaaten geworden. In Untersuchungen an isolierten Blutgefäßen konnte gezeigt werden, dass das periadventitielle Fettgewebe einen antikontraktilen Effekt auf die Aorta der Ratte ausübt. Es konnte die Existenz eines transferablen antikontraktilen Faktors nachgewiesen werden, der Adventitium-Derived Relaxing Factor (ADRF) genannt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurden zelluläre Mechanismen der Freisetzung von ADRF aus dem periadventitiellen Fettgewebe der Aorta der Ratte untersucht. Die Freisetzung von ADRF ist ein kalziumabhängiger Prozess (EC50 ~ 4.7 mM). Durch den Einsatz von spezifischen Antagonisten der PKA (H-89, 9 muM) und Tyrosinkinase (Tyrphostin A25 10 muM, Genistein 10 muM) konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von ADRF vermutlich über die intrazellulären Signaltransduktionsmoleküle PKA und Tyrosinkinase reguliert wird. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Wirkung des periadventitiellen Fettgewebes auf Mesenterialarterien der Ratte untersucht. Applikation von Serotonin, Phenylephrin und Endothelin I resultierten in einer bis zu 75 % abgeschwächten kontraktilen Antwort der Gefäßringpräparationen (+)fat im Vergleich zu Gefäßringen (-)fat. Die Applikation von U46619 resultierte in keiner signifikant unterschiedlichen kontraktilen Antwort. Cromakalim (100 nM) relaxierte vollständig Serotonin-kontrahierte Gefäßringe (+)fat und (-)fat, aber konnte nicht U46619-kontrahierte Gefäßringe (+)fat und (-)fat relaxieren. Bei Applikation von Kaliumchloridlösung (60 mM) bestand zwischen Gefäßringen (+)fat und (-)fat keine Differenz der kontraktilen Antwort. Die Blocker glattmuskulärer KV-Kanäle 4-AP (2 mM) und 3,4-DAP (1 mM) konnten den antikontraktilen Effekt des perivaskulären Fettgewebes aufheben. Im Gegensatz dazu konnten Blocker von KATP-Kanälen (Glibenclamid, 3 muM), BK-Kanälen (Iberiotoxin, 100 nM), SK-Kanälen (Apamin, 1 muM), sowie unspezifische Kaliumkanalblocker (TEA, 1 mM; TPeA, 10 muM ) den antikontraktilen Effekt nicht aufheben. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass KV-Kanäle den antikontraktilen Effekt des perivaskulären Fettgewebes in der Mesenterialarterie der Ratte vermitteln. / Obesity has grown to become an eminent health problem for the western industrialized countries. Increased visceral adipose tissue in obesity is associated with adverse cardiovascular events and hypertension. Recently, studies on isolated rat aortic ring preparations have shown that periadventitial adipose tissue produces a vasorelaxing factor. This factor was named adipocyte derived relaxing factor, ADRF. Using isolated rat aortic rings and isometric contraction measurements, this work was able to show that ADRF release depends on extracellular [Ca2+] (EC50 ~ 4.7 mM). ADRF release is strongly inhibited by the protein tyrosine kinase inhibitors genistein and tyrphostin A25 (AG82). Protein kinase A inhibition by H89 also inhibited ADRF release while the protein kinase G inhibitor KT5823 had no effect. In the second part, the effect of visceral perivascular adipose tissue on mesenteric rings was examined. The contractile response to serotonin, phenylephrine, and endothelin I was markedly reduced in intact vessels compared to vessels without periadventitial fat. The contractile response to U46619 or depolarizing high K+ containing solutions (60 mM) was similar in vessels with and without periadventitial fat. The K+ channel opener cromakalim induced relaxation of vessels precontracted by serotonin but not by U46619 or high K+ containing solutions (60 mM), suggesting that K+ channels are involved. The anti-contractile effect was abolished by inhibition of delayed-rectifier K+ channels with 4-aminopyridine (2 mM). Blocking other K+ channels with glibenclamide (3 muM), apamin (1 muM), TEA (1 mM), TPeA (10 muM) did not restore the vascular response in intact vessels. These results suggest that visceral perivascular adipose tissue controls mesenteric arterial tone locally. It induces vasorelaxation by activating delayed-rectifier K+ channels in vascular smooth muscle cells.

Jedes Jahr treten weltweit über zehn Millionen Fälle von Tuberkulose (TB) auf. Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) schätzt, dass ein Drittel der Weltbevölkerung mit dem Erreger Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infiziert ist. Bei fünf bis zehn Prozent aller latent Infizierten bricht Tuberkulose im Laufe des Lebens aus. Dennoch sind bereits 100 Jahre seit der Entdeckung von Mtb vergangen, ohne dass die entscheidenden Faktoren für den unterschiedlichen Infektionsverlauf bekannt wären. In dieser Arbeit untersuche ich die unterschiedlichen Reaktionen auf eine Tuberkuloseinfektion in verschiedenen Wirten. In meinem ersten Ansatz habe ich öffentlich zugängliche Transkriptom-Datensätze von Tuberkulosepatienten und gesunden Probanden ausgewertet. Mit Hilfe der Gensatzanreicherungs-Analyse (eng. Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) habe ich die Transkriptionsprofile von Tuberkulosepatienten betrachtet. Das besondere Augenmerk lag hierbei auf der Interferon (IFN)-Signalkaskade, die für den Krankheitsverlauf von besonderer Bedeutung ist. In dieser Arbeit zeige ich zunächst, dass Patienten ohne eine IFN-Signatur in der untersuchten Kohorte vorkommen und widme mich im Anschluss der Frage, ob diese Patienten einen anderen Phänotypus haben als jene mit einer starken IFN-Antwort. Indem ich nur Patienten ohne IFN-Antwort betrachte, werden Mechanismen deutlich, die allen Patientengruppen gemein sind, aber vorher von der starken IFN-Signatur überlagert wurden. Ich belege in dieser Arbeit, dass eine starke IFN-Regulation auch mit einer ausgeprägten Lungenpathologie in Tuberkulosepatienten einhergeht. Passend hierzu weisen auch gesunde Probanden nach Verabreichung des Impfstoffs FLUAD® einen erhöhten Blutwert IFN-induzierter Zytokine auf. Mit Hilfe maschinellen Lernens konnte ich Transkriptomsignaturen der Patienten mit bzw. ohne IFN-Antwort identifizieren und vergleichen. Im zweiten Ansatz widme ich mich den unterschiedlichen Transkriptionsantworten auf Mtb-Infektionen in humanen Kohorten und zwei verschiedenen Mausmodellen. Der humanen und der murinen Immunantwort auf Infektionen unterliegen gravierende Unterschiede. Trotzdem sind einige Elemente des Immunsystems in beiden Arten konserviert. In dieser Arbeit präsentiere ich einen neuen Ansatz der Datenintegration, der die Identifizierung von übereinstimmenden und nicht übereinstimmenden Regulationselementen der Genexpression in heterogenen Datensätzen ermöglicht. Die Analyse basiert auf öffentlich zugänglichen sowie de-novo-generierten Datensätzen, zu denen ich durch wissenschaftliche Kollaborationen meiner Kollegen in der Abteilung Immunologie sowie der zentralen Einheit Microarray des Max-Planck-Instituts für Infektionsbiologie, Zugang erhalten habe. Des Weiteren liegt ein Schwerpunkt auf der vergleichenden Analyse humaner und muriner Transkriptionsantworten auf Tuberkulose in Vollblut und Makrophagen. Die erhaltenen Ergebnisse weisen auf einen signifikanten Unterschied in der Regulierung der angeborenen sowie der erworbenen Immunität in Mensch und Maus als Reaktion auf eine Mtb-Infektion hin. In dieser Arbeit charakterisiere ich die unterschiedliche Regulierung von T-Zell bezogenen Genen, die mit unterschiedlich ausgeprägten Phänotypen bei stark oder schwach TB-anfälligen Mausstämmen korrespondiert. Darüber hinaus habe ich den 21. Tag nach einer Tuberkuloseinfektion in Mäusen als Zeitpunkt ermittelt, der die Transkriptionsantworten in den untersuchten humanen Kohorten am besten widerspiegelt. Die angewandten Ansätze erleichtern die Auswahl des am besten geeigneten Tiermodells für die Erforschung der humanen Immunantwort auf eine ausgewählte Krankheit und liefern die Basis für ein besseres Verständnis der unterschiedlichen Krankheitsverläufe in Mtb-infizierten Patienten. / Over 10 million tuberculosis (TB) cases are being reported annually and the World Health Organization (WHO) estimates that up to the 1/3 of the world population is infected with Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Between 5 and 10% of the latently infected individuals develop TB during their lifetime. Yet, despite over 100 years of research since Mtb has been identified, we are not able to define all the factors which are responsible for the different infection outcomes in the hosts. In this thesis I investigate the variability in the response to TB presented by different hosts. In one approach, I collect publicly available transcriptomic datasets from TB patients and healthy donors. Using Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) I examine transcriptional profiles of individuals with TB. In particular, focus is brought to interferon (IFN) signaling which has been previously described as crucial for the disease outcome. I show that patients lacking IFN signature are present in the studied cohorts and investigate whether these patients present different phenotype than patients with strong regulation of IFN responses. Moreover, by focusing on patients lacking IFN response I try to unearth mechanisms present in all patient groups but dominated by the signal of IFN response. I show that strong regulation of IFN genes is related to severe pathology in the lungs of TB patients and that it is reflected by the levels of IFN-inducible cytokines in blood of healthy volunteers after vaccination with FLUAD® vaccine. Using Machine Learning (ML) methods, I identify and compare transcriptomic signatures of the patients presenting and lacking the IFN response. In the second approach I study the differences in the transcriptional responses to Mtb infection in human cohorts and two different mouse models. The immunity in infection, inflammation and malignancy differs markedly in man and mouse. Nevertheless, there are elements of immune system which have been conserved between the species. I propose a novel data integration approach which identifies concordant and discordant elements of gene expression regulation in heterologous datasets. The analysis is based on publicly available as well as novel experimental data acquired thanks to collaboration with my colleagues from the Department of Immunology and Microarray Core Facility of Max Planck Institute for Infection Biology (MPIIB). Additionally, I focus on the comparison of human and murine transcriptional responses to TB in whole blood (WB) and in macrophages. The results indicate profound differences between regulation of innate and adaptive immunity in man and mouse upon Mtb infection. I characterize differential regulation of T-cell related genes corresponding to the differences in phenotype between TB high and low susceptible mouse strains and identify the time point of 21 days p.i. of mice as best reflection of transcriptional responses in the studied human cohorts. The implemented approaches facilitate the choice of an appropriate animal model for studies of the human immune response to a particular disease and provide the basis for better understanding of differences in the outcomes of Mtb infection in individual hosts.

Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehender Vaskulatur, ist ein Prozeß, der sowohl unter physiologischen Bedingungen abläuft, wie bei der Embryonalentwicklung und der Wundheilung, als auch unter pathologischen Bedingungen, wie der diabetischen Retinopathie und dem Wachstum und der Metastasierung solider Tumoren. Chronische Entzündungen wie die Atherosklerose und die Rheumatoide Arthritis gehen ebenfalls mit angiogenetischen Prozessen einher. Die Angiogenese ist ein stark regulierter Vorgang, der Migration, Proliferation und Differenzierung der Endothelzellen erfordert. Die Fähigkeit zur Migration ist eine wichtige biologische Funktion der Endothelzellen. Das Ziel dieser Arbeit bestand daher in der Untersuchung der Einflüsse verschiedener Zytokine auf die Endothelzellmigration und in der Charakterisierung daran beteiligter Mechanismen der Signaltransduktion. Dabei erwies sch Leptin als ein potenter Stimulus der Endothelzellmigration. Die Migration endothelialer Zellen nach Stimulation mit chemotaktischen Faktoren wie Leptin und VEGF wird durch die Aktivierung der Proteinkinasen ERK-MAPK und Akt vermittelt, deren pharmakologische Inhibition eine signifikante Hemmung der Migration bewirkte. Die antidiabetischen Thiazolidinedione Troglitazone und Ciglitazone hemmten die Leptin-induzierte Endothelzellmigration durch die Inhibition der Proteinkinase Akt, hatten aber keinen Einfluß auf die Aktivierung der ERK-MAP-Kinase. Dieses Ergebnis zeigt, dass die ERK-MAP-Kinase und die Proteinkinase Akt zwei voneinander unabängige Wege der Signaltransduktion darstellen, deren jeweilige Aktivierung für die Migration von Endothelzellen erforderlich, aber nicht ausreichend ist. Die proinflammatorischen Mediatoren TNF alpha und CD40L hemmten die VEGF-induzierte Migration humaner Endothelzellen bei Inkubation der untersuchten Zellen über 24 h signifikant. Auch bei kurzzeitiger Stimulation über 5 h steigerte TNF alpha die Rate migrierter Endothelzellen nicht. Diese Beobachtung steht im Widerspruch zur angenommen Assoziation entzündlicher und angiogenetischer Prozesse. In der vorliegenden Arbeit wird zum ersten Mal gezeigt, dass Antidiabetika aus der Gruppe der PPAR gamma-Liganden die Endothelzellmigration direkt hemmen. Dies weist auf eine mögliche Erweiterung des therapeutischen Einsatzes der Thiazilodinedione bei Patienten mit NIDDM und sekundären Symptomen wie der diabetischen Retinopathie hin. / Angiogenesis, the formation of new blood vessels from the preexisting vasculature, is a process involved in physiologic conditions, such as embryonic development and woundhealing, as well as in pathologic conditions, such as diabetic retinopathy and growth and spreading of solid tumors. Chronic inflammation such as atherosclerosis and rheumatoid arthritis is also associated with angiogenic processes. Angiogenesis is a tightly regulated process that requires migration, proliferation and differentiation of endothelial cells. Cell migration is a very important biologic function of the endothelial cell. The aim of this study was therefore to investigate the impact of various cytokines on endothelial cell migration and to characterize the chemotactic signal transduction pathways involved in this process. Leptin, the product of the ob-gene, proved to be a potent stimulus of endothelial cell migration. The actvation of the protein kinases ERK-MAPK and Akt is critical for endothelial cell migration, and their pharmacological inhibition caused a significant down-regulation of the migratory response towards migration factors such as Leptin and VEGF. The antidiabetic thiazolidinediones Troglitazone and Ciglitazone inhibited the leptin-induced endothelial cell migration by interfering with the cytosolic protein kinase Akt. They did not exert any influence on the activation of the ERK-MAPK. These findings prove the existence of two different, independent ways of signal transduction involved in endothelial cell migration: The ERK-MAPK and the protein kinase Akt. The activation of either kinase is necessary, but not sufficient to induce a migratory response in human endothelial cells. The proinflammatory mediators TNF alpha and CD40L caused a significant inhibition of endothelial cell migration in response to VEGF, when they were added to the culture medium for 24 h. TNF alpha did not stimulate the migration of endothelial cells, even when administered during a comparable short period of 5 h. This observation is in contrast with the postulated association of inflammatory and angiogenic proceses. In conclusion, the results of this study show for the first time a direct inhibition of leptin-induced endothelial cell migration by antidiabetic drugs belonging to the PPAR gamma-ligand-family through their inhibitory effect on Akt. This possibly broadens the spectrum of therapeutic applications of the antidiabetic thiazolidinediones in patients suffering from NIDDM and secondary complications such as diabetic retinopathy.