Made available in DSpace on 2017-07-10T17:36:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_Diss_Emanuele_Guandalin_Dal_Maso.pdf: 848949 bytes, checksum: 41f0b72aa20a4da20bef91b1479c8adb (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The objective of this work, the control of common bacterial blight caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) with the use of hydroalcoholic extracts of tumeric, rosemary and Pycnoporus sanguineus. In vitro was made the agar diffusion test with discs of filter paper and the detection of Xap in seed lots of beans of producers from the western region of Parana. Under field condition bean (IAPAR-81) was sprayed at 14, 28 and 42 days after the emergency, with the extracts at a concentration of 150 mL.L-1. Antibiotic (22,5 mg L-1 oxytetracycline + 225 mg L-1 of streptomycin) and water were the control treatments. The treatments were applied three days before inoculation of the pathogen. The evaluations were performed every three days for calculation of the area under the disease progress curve (AUDPC). Also it was evaluated number of seeds per pod and mass of grains, in two seasons January-June (2013). In the greenhouse, in pots of 8 L (two plants per pot), were daily assessments within a period of 7 days using infrared gas (IRGA), always in medial region of the third and fourth pair of new leaves and fully exposed to solar radiation, for verification of (A, μmol CO2 m-2 s-1), (gs, mmol H2O m-2 s-1), (E mmol H2O m-2 s-1), (EUA, mol m-2 s-1) and (EIUA, mol m-2 s-1). It was also performed the treatments with hydroalcoholic extracts of tumeric and rosemary in concentrations of 100, 150 and 200 mL L-1 in the third leaf stage, and on the fourth day of evaluations was performed the inoculation of bacteria. In the third and fourth leaves, in order to verify the induction of systemic resistance of extracts. For the agar diffusion test it was found no antimicrobial effect. Seed analysis indicated the presence of Xap in the samples. In vivo, treatment of tumeric presented lower AUDPC and greater productivity. In greenhouse it was observed that rosemary 150 mL L-1 o improved in 47%, in average the efficiency of water use (USA) local and systemically / Objetivou-se com esse trabalho, o controle do crestamento bacteriano comum incitado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap) com o uso de extratos hidroalcoólicos de cúrcuma, alecrim e Pycnoporus sanguineus. In vitro realizou-se o teste de difusão em ágar com discos de papel filtro e a detecção da Xap em lotes de sementes de feijão de produtores da região oeste do Paraná. Em condições de campo, feijoeiro (IAPAR-81) foi pulverizado aos 14, 28 e 42 dias após a emergência, com os extratos na concentração de 150 mL L-1. Antibiótico (22,5 mg L-1oxitetraciclina + 225 mg L-1 de estreptomicina) e água foram as testemunhas. Os tratamentos foram aplicados três dias antes da inoculação do patógeno. As avaliações foram realizadas a cada três dias para cálculo da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD). Também avaliou-se número de sementes por vagem e massa dos grãos, em duas safras janeiro-junho (2013), Em casa de vegetação, cultivou-se duas plantas de feijão por vaso de 8 L, onde foram feitas avaliações diárias num período de 7 dias utilizando o aparelho de infravermelho de gás (IRGA), sempre na região mediana do terceiro e quarto pares de folhas novas e totalmente expostas a radiação solar, para verificação dos parâmetros (A, μmol CO2 m-2 s-1), (gs, mmol H2O m-2 s-1), (E mmol H2O m-2 s-1), (EUA, mol m-2 s-1) (EIUA, mol m-2 s-1). Também realizou-se os tratamentos com extratos hidroalcoólicos de cúrcuma e alecrim nas concentrações de 100, 150 e 200 mL L-1 na terceira folha trifoliolada, e no quarto dia das avaliações, foi realizada a inoculação da bactéria, com um corte na terceira e quarta folha trifoliolada, com o intuito de verificar a indução de resistência sistêmica dos extratos. Para o teste de difusão em ágar verificou-se que os extratos hidroalcoólicos não tiveram efeito antimicrobiano. A análise de sementes indicou a presença da Xap nas amostras. In vivo o tratamento com cúrcuma, apresentou menor AACPD e maior produtividade. Em casa de vegetação o tratamento com alecrim 150 mL -1 incrementou até 47% a eficiência de uso da agua, local e sistematicamente

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-15T13:58:20Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Laura Pereira Passos - 2016.pdf: 6140952 bytes, checksum: 715de51ee1d8b3b7ffd295f5d7121216 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-05-15T13:58:44Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Laura Pereira Passos - 2016.pdf: 6140952 bytes, checksum: 715de51ee1d8b3b7ffd295f5d7121216 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-15T13:58:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Ana Laura Pereira Passos - 2016.pdf: 6140952 bytes, checksum: 715de51ee1d8b3b7ffd295f5d7121216 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-04-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The common bean (Phaseolus vulgaris) is grown in Brazil in various locations, soil and climatic conditions. The diseases are among the leading causes of losses in productivity of this legume, and the common bacterial blight (CBB) is the most important bacterioses that affects the culture. The resistance of CBB in common bean is a complex quantitative trait that results from the interaction of several genes. Genetic maps are tools that optimize the search for loci associated with this type of feature, and the most commonly used molecular markers available for this type of study are the SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). In this sense, this study aimed to: (i) develop a robust genetic map for common bean using SNP markers and the RIL (Recombinant Inbreed Lines) mapping population derived from Ruda × AND 277; (ii) characterize this RIL population and their parents about the reaction to common bacterial blight in field and greenhouse; and (iii) identifying genomic regions (major genes and/or QTL) that control the bacterial blight in this population. We used 393 individuals of the Ruda × AND 277 RIL population, evaluated for reaction to CBB in two field trials in Ponta Grossa - PR, in the rain growing season of 2012 and 2014 and in an inoculation test at the greenhouse, in Santo Antônio de Goiás - GO. The population was genotyped with 5,398 SNP markers and mapping was performed using the R-OneMap and MapDisto programs. Statistical analyzes were performed in the Genes program, and the Scott-Knott method was used for averages groupingin R platform. The QTL analysis was conducted in QTLCartographer program. Using the chi-square test (1:1), 2,062 markers were selected for mapping. Three genetic maps with high strengt, saturation and resolution were built. Statistical analysis showed that there is genetic variability for the CBB resistance in the population of RILs. The QTL analysis identified 10 QTLs linked to resistance of CBB in the Ruda × AND 277 RIL mapping population, in the chromosomes PV01, PV02, Pv07, Pv09 and PV11, based on results from evaluations carried out in the field and greenhouse. The maps constructed for this population have high strength and resolution and may be used for future work on integrative mapping. The statistical analysis evidenced the quantitative character of resistance to CBB in common bean and showed that the parent Rudá has the CBB resistance alleles. It is expected that the markers linked to these QTLs identified can be used in future studies of marker assisted selection. / O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris) é cultivado no Brasil em vários locais e diversas condições edafoclimáticas. As doenças estão entre as principais causas de prejuízos na produtividade dessa leguminosa, sendo o crestamento bacteriano comum (CBC) a principal bacteriose que afeta essa cultura. A resistência ao CBC no feijoeiro-comum é uma característica complexa, quantitativa, que resulta da interação de vários genes. Os mapas Genéticos são ferramentas que otimizam a busca de locos associados a esse tipo de característica, e os marcadores moleculares mais utilizados disponíveis para esse tipo de estudo são os SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivos: (i) construir um mapa genético robusto para o feijoeiro-comum, utilizando marcadores SNP e a população de RILs (Recombinant Inbred Lines, ou linhagens endogâmicas recombinantes) derivada do cruzamento Rudá × AND 277; (ii) caracterizar esta população de RILs e seus genitores quanto à reação ao crestamento bacteriano comum, em campo e em casa de vegetação; e (iii) identificar regiões genômicas (genes de efeito principal e/ou QTLs) que controlam a reação ao crestamento bacteriano comum nesta população. Foram utilizados 393 indivíduos da população de RILs Rudá × AND 277, avaliados quanto à reação ao CBC em dois ensaios de campo em Ponta Grossa – PR, nas águas de 2012 e 2014, e em um ensaio de inoculação em casa de vegetação, em Santo Antônio de Goiás - GO. A população foi genotipada com 5.398 marcadores SNP e o mapeamento das RILs foi realizado utilizando os programas R-OneMap e MapDisto. As análises estatísticas foram realizadas no programa Genes, sendo o agrupamento de médias de Scott-knott realizado na plataforma R. A análise de QTL foi realizada no programa QTLCartographer. Por meio do teste de quiquadrado (1:1) foram selecionados 2.062 marcadores para o mapeamento. Foram construídos três mapas genéticos com elevada robustez, saturação e resolução. As análises estatísticas evidenciaram que há variabilidade genética para a característica de resistência ao CBC na população de RILs. A análise de QTL identificou 10 QTLs ligados à resistência ao CBC na população de RILs Rudá × AND 277 nos cromossomos Pv01, Pv02, Pv07, Pv09 e PV11 com base em dados obtidos a partir de avaliações em campo e casa de vegetação. Os mapas construídos para essa população apresentam elevada robustez e resolução e poderão ser utilizados para futuros trabalhos de mapeamento integrativo. As análises estatísticas evidenciaram o caráter quantitativo da resistência ao CBC em feijoeiro-comum e mostraram que o genitor Rudá possui alelos de resistência ao CBC. Espera-se que os marcadores ligados a esses QTLs identificados possam ser utilizados em futuros trabalhos de seleção assistida por marcadores.

Orientador: Suzete Aparecida Lanza Destéfano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T19:29:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goulart_MarcelaCristina_M.pdf: 1843141 bytes, checksum: 317126844277b642b5edc69d405b000b (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A soja é considerada uma das culturas mais importantes no Brasil, em função de seu alto valor sócio-econômico, determinado pelas inúmeras aplicações de seus produtos e subprodutos e consequente expressão no mercado interno e externo. No entanto, a cultura desta oleaginosa é frequentemente ameaçada com a ocorrência de um vasto número de doenças, que podem acarretar depreciação do produto, redução no rendimento e perdas econômicas para os produtores. Dentre as principais doenças bacterianas que afetam a cultura da soja, destacam-se a pústula bacteriana, causada por Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag); o crestamento bacteriano, causado por Pseudomonas savastanoi pv. glycines (Psg); e a murcha de Curtobacterium causada por Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), ocasionando perdas na produção de até 40%. A condição sanitária das sementes é extremamente importante se considerarmos que elas são veículos desses agentes fitopatogênicos que nelas podem se alojar e serem levados ao campo, provocando redução na germinação e vigor, e originando focos primários de infecção de doenças. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver nova metodologia de diagnóstico com o uso das técnicas moleculares que permitissem detectar e identificar a presença de Psg, Xag e Cff em sementes de soja por meio do desenvolvimento de primers espécie específicos. Os primers desenhados a partir de sequências da região espaçadora 16S-23S RNAr, mostraram-se altamente específicos e sensíveis. O par de primers Curto2f/p322anti gerou um fragmento de 675 pb e capacidade de detecção a partir de 0,01 ng de DNA genômico e aproximadamente 5x103 UFC/PCR; o par de primers Psgl/p322anti gerou um fragmento de 500 pb e o grau mínimo de sensibilidade foi de 1 pg de DNA genômico e cerca de 80 UFC/PCR; o par de primers Xanth2f/p322anti gerou um fragmento de 545 pb e capacidade de detecção a partir de 1 ng de DNA genômico e cerca de 700 UFC/PCR. Posteriormente, as sementes de soja foram infectadas artificialmente nas condições de 1; 0,5 e 0,1% de infecção. Nas amplificações com os primers espécie-específicos desenvolvidos, foi possível detectar as fitobactérias em todos os níveis de infecção testados diretamente do extrato bruto, e nas amplificações após o enriquecimento do extrato (BIO-PCR) o sinal positivo foi potencializado / Abstract: Soybean is considered one of the most important crops in Brazil, due to its high socio-economic value, determined by its several products and sub products and its significant expression on the internal and external market. However, this oleaginous plant is often affected by the occurrence of different diseases, which cause depreciation of the product, reduction in yield and substantial economic losses. Among the main bacterial diseases, the bacterial pustule, caused by Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag), the bacterial blight caused by Pseudomonas savastanoi pv. glycines (Psg), and bacterial tan spot caused by Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff), producing yield losses of up to 40%. The seed health is extremely important since they are considered vehicles of pathogenic agents which can be led to the field, causing germination reduction and vigor; and yielding primary infection of the diseases. This study aimed to develop a new method of diagnosis using molecular tools to detect and identify Psg, Xag or Cff in soybean seeds, through species-specific primers. The primers were designed from sequences of the 16S-23S rRNA and they were highly specific and sensitive. The pair of primers Curto2f/p322anti generated a fragment of 675 bp and was able of detecting down to 0.01 ng of genomic DNA and about 5x103 CFU/PCR; the primer set Psgl/p322anti produced a fragment of 500 bp and reached a detection limit of 1 pg of genomic DNA and about 80 CFU/PCR; and Xanth2f/p322anti yielded a fragment of 545 bp and could detect up to 1 ng of genomic DNA and about 700 CFU/PCR. Subsequently, soybean seeds were artificially infected in the following conditions: 1, 0,5% and 0,1% infection. In the amplifications using the species-specific primers, it was possible to detect the three different phytobacteria at all tested levels of infection directly of the crude extract and in the amplifications after enrichment of the extract (BIO-PCR), the positive signal was enhanced / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Ljubica Tasic / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:34:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Awan_AlmasTaj_D.pdf: 4796874 bytes, checksum: 185a66c389aae68c266f385689030ef0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os biocombustíveis de segunda geração surgiram como fontes energéticas promissoras, podendo ser obtidos a partir de vários tipos de biomassa que não seja utilizada para alimentos. Um tipo de biomassa que apresenta baixo custo além de apresentar níveis elevados de carboidratos, é a biomassa obtida após o processamento da laranja (Citrus processing waste from oranges, CPWO). Há um grande interesse na exploração desta biomassa em termos da produção do bioetanol (etanol da 2G). Nosso trabalho visa melhorar os processos de hidrólise do CPWO comparando o rendimento do processo clássico de hidrólise ácida com aplicação de enzimas comerciais ou provenientes do microrganismo Xanthomonas axonopodis pv. citri, cepa 306 (um fitopatógeno). Os resultados obtidos com a presente investigação evidenciam que ocorreu a conversão bem-sucedida do CPWO em uma mistura de açúcares. A posteriori, os açúcares redutores que foram obtidos foram convertidos em bioetanol por meio da fermentação em mono- e co-cultura. Para tanto, foi empregada a espécie Saccharomyces cerevisiae e duas cepas de Candida parapsilosis IFM 48375 e NRRL Y-12969, sendo que as duas últimas foram isoladas a partir do bagaço da laranja. Os rendimentos em termos de bioetanol obtido nas fermentações aplicando co-culturas estavam ao redor de 50 a 62%, constituindo valores muito maiores comparados com os obtidos por cepas usadas individualmente. Além disso, os açúcares foram consumidos mais rapidamente (6 h), tornando tais processos atraentes em termos de custo e aplicações comerciais / Abstract: Second generation biofuels from renewable resources have come forth as a result of energy security coupled with diminishing fossil fuel resources. Lignocellulosic biomass is a renewable resource, which can be converted in to liquid transportation fuels. Utilization of agro-industrial waste for the generation of biofuels makes it a cleaner production (Green Chemistry). Brazil is the world¿s largest producer of oranges. The current project deals with Citrus Processing Waste from Oranges (CPWO), and obtaining valuable products such as bioethanol, hesperidin, and essential oil. The process of hydrolyzing CPWO was improved and the classical way of biomass saccharification, i.e. acid hydrolysis, was compared with the enzyme hydrolysis. In enzyme hydrolysis, apart from applying commercial enzymes, saccharification was also investigated with protein extracts of Xanthomonas axonopodis pv. citri strain 306 (Xac 306), a potent pathogen that causes Citrus canker disease. Later, the obtained reducing sugars were converted into bioethanol by submerged mono- and co-culture fermentations that involved three yeast strains: Saccharomyces cerevisiae, Candida parapsilosis IFM 48375 and NRRL Y-12969, the last two being isolated from bagasse. Results demonstrated successful hydrolyses by Xac enzymes that released high levels of fermentable sugars. Also during co-culture fermentation processes, it was noticed that ethanol yield was improved from 50% to 62% w/w (calculated on the basis of total dry matter contents) and sugars were consumed faster. Thus by employing co-culture fermentation strategy, apart from getting better bioethanol yields, fermentation time is also reduced that makes it a cost effective technique / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soprano_AdrianaSantos_D.pdf: 24018757 bytes, checksum: 29724fbb81a588e3bb656bf4c2df3390 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri (X. citri), afeta a maioria das espécies de Citrus, ocorre praticamente em todos continentes e se destaca como uma séria ameaça à citricultura brasileira. O mecanismo molecular pelo qual X. citri causa cancro não é inteiramente conhecido, entretanto, sabe-se que a bactéria utiliza o sistema secretório tipo III para injetar proteínas de patogenicidade, entre elas, PthAs da família AvrBs3/PthA, também conhecidas como efetores TAL (transcriptional activator-like). Os efetores TAL atuam como fatores de transcrição transativando genes específicos da planta que vão beneficiar a bactéria ou desencadear respostas de defesa. Com o objetivo de entender os mecanismos moleculares pelos quais os efetores TAL atuam, a técnica de duplo híbrido foi usada para identificar proteínas de laranja doce (Citrus sinensis) que interagem com PthA4, um dos efetores TAL de X. citri necessário para o desenvolvimento do cancro cítrico. A maioria das proteínas de laranja identificadas como alvos de PthA4 apresenta domínios de ligação à DNA ou RNA e está envolvida no controle da transcrição, estabilização de mRNAs e tradução. Várias dessas proteínas interagem entre si, sugerindo a presença de um complexo multiproteico como alvo de efetores TAL. Entre as proteínas envolvidas no controle da transcrição, destacamos a CsMAF1, uma proteína homóloga à MAF1 humana que atua como regulador negativo da RNA Polimerase III. Os resultados obtidos nesse trabalho revelam que CsMAF1 complementa o fenótipo do mutante maf1 de levedura, reprimindo a expressão de tRNAHis e que a expressão de PthA4 na cepa complementada restaura a síntese desse tRNA. Portanto, os dados mostram que CsMAF1 atua como um repressor da RNA Pol III em levedura e que PthA4 altera o estado repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III. De forma surpreendente, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsMAF1 apresentaram aumento significativo no número e intensidade de lesões hiperplásticas ou eruptivas quando infiltradas com X. citri, indicando que CsMAF1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. O aumento das lesões do cancro nas plantas silenciadas para CsMAF1 se correlaciona com um aumento expressivo de tRNAs, incluindo o tRNAHis, confirmando assim o papel repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III em citros. Além disso, mostramos nesse trabalho que CsMAF1 é uma fosfoproteína que se encontra na forma dimérica em solução, uma característica singular ainda não descrita para membros dessa família de proteínas. Verificamos que CsMAF1 é fosforilada in vitro pelas quinases PKA e PKC e que apresenta sítios adicionais de fosforilação conservados para a quinase TOR, incluindo o resíduo Thr62. Curiosamente, tais sítios se localizam na interface de dimerização de CsMAF1, sugerindo que a fosforilação desses sítios deve regular a função da proteína e/ou seu estado multimérico. De fato, verificamos que a substituição do resíduo de treonina Thr 62 para ácido aspártico (Asp 62) diminui a proporção dímero:monômero de CsMAF1, indicando que a fosforilação de resíduos na interface do dímero desestabiliza o dímero, e que esse pode ser um mecanismo regulatório novo para essa classe de proteína. Desse modo, esses achados abrem novas perspectivas para o entendimento não só dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da RNA Pol III pela CsMAF1, como também do papel de PthA4 na interação com CsMAF1 e sua modulação da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri (X. citri), is a disease that affects most of the Citrus species, occurs in almost all continents and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The molecular mechanism by which X. citri causes canker is poorly understood, however the bacterium injects pathogenicity proteins via the type III secretion system (T3S) including proteins of AvrBs3/PthA family, also known as transcriptional activator-like (TAL) effectors. TAL effectors have been extensively studied and are known to act as transcription factors that transactivate specific plant genes which either benefit the bacteria or trigger defense responses. To gain insights into the molecular mode of action of TAL effectors, a twohybrid screening was performed to identify sweet orange (Citrus sinensis) proteins that interact with PthA4, one of the X. citri TAL effectors required for citrus canker development. Among the proteins identified as PthA4 interactors, most are DNA and/or RNA-binding factors involved in chromatin remodeling and repair, transcriptional control and mRNA stabilization/modification. Several of these proteins interact with each other, suggesting the presence of a multiprotein complex as a target of TAL effectors. Among the proteins involved in transcription control, we selected for further studies the CsMAF1, a homolog of the human MAF1 that acts as a negative regulator of RNA polymerase III. The results presented here reveal that CsMAF1 complements the yeast maf1 mutant phenotype by repressing the tRNAHis transcription, and that PthA4 expression in the complemented strain restores the tRNAHis synthesis. Thus, the data show that CsMAF1 acts as a RNA Pol III repressor in yeast and that PthA4 somehow suppresses the repressor activity of CsMAF1 upon on the RNA Pol III. Surprisingly, we found that citrus plants with reduced levels of CsMAF1 showed a significant increase in the number, morphology and size of eruptive or hyperplastic lesions when infiltrated with X. citri, indicating the CsMAF1 plays a critical role in canker development. Increased canker lesions in CsMAF1 silenced plants correlated with a significant increase of tRNAs expression, including tRNAHis, thus confirming the repressor role of CsMAF1 upon the citrus RNA Pol III. Furthermore, we showed in this work that CsMAF1 is a phosphorylated and a dimer in solution, a feature that so far has not been reported for any member of this protein family. We found that CsMAF1 is phosphorylated in vitro by PKA and PKC, and has additional phosphorylation sites for the TOR kinase, including the Thr 62 residue. Interestingly, these phosphorylation sites are located at the dimerization interface of CsMAF1, suggesting that phosphorylation of such sites might regulate the function of the protein and / or its multimeric state. Indeed, mutation of threonine residue Thr62 to aspartic acid (Asp62) decreases the dimer:monomer CsMAF1 ratio, indicating that phosphorylation of the residues at the interface of the dimer destabilizes the dimer, and this may be a novel regulatory mechanism for this class of protein. Thus, these findings open new perspectives for the understanding of the molecular mechanisms involved in RNA Pol III regulation by CsMAF1, as well as for the role of PthA4 in the modulation of RNA Pol III transcription mediated by CsMAF1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Andrea Balan Fernandes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:19:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pegos_VanessaRodrigues_D.pdf: 41543267 bytes, checksum: 0c6ab77fc1de1527fad27fbf8c4b1e70 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri) é o causador do cancro cítrico em diversas espécies de citrus, sobretudo, laranjas. As epidemias de cancro cítrico tem causado severas perdas econômicas à citricultura mundial uma vez que não há estratégias de combate efetiva contra essa bactéria no campo. Diversos estudos demonstraram a importância de genes para a patogênese de X. citri, mas ainda não foram investigados genes envolvidos na aquisição e no metabolismo de micronutrientes tais como o fosfato. X. citri conserva o sistema de transporte do tipo ABC de fosfato inorgânico codificado pelo óperon pstSCAB. Adicionalmente a bactéria possui dois outros operons oprO/phoX e phoBR, os quais codificam, respectivamente, uma porina de membrana externa e uma proteína periplasmática ligadora e o sistema dois componentes de sinalização celular, ambos integrantes do regulon de fosfato (regulon pho). Neste trabalho, estudamos a resposta destes operons à carência de fosfato, bem como o papel da proteína ligadora periplasmática PstS, por meio de análises proteômica, metabolômica, estruturais baseadas em cristalografia de raio-X e funcionais utilizando um mutante de X. citri portador de deleção no gene pstS (Xac::pstS). Os dados obtidos foram comparados entre as linhagens selvagem e mutante. Primeiramente evidenciamos que o sistema ABC de fosfato é ativado em carência do íon, incluindo um aumento de expressão de PhoX e PstS de 49 e 33 vezes, respectivamente, e que X. citri apresenta a maioria dos genes do regulon pho. PhoX e PstS são proteínas ligadoras de fosfato que partilham 70% de identidade de aminoácidos e são originadas de uma duplicação gênica. Na ausência de PstS, PhoX parece exercer a função de captação, mas não é capaz de recuperar todos os fenótipos da bactéria selvagem. Adicionalmente, ensaios de transporte de fosfato com as bactérias selvagem e mutante mostraram diferenças no transporte e que o sistema ABC permance constitutivo na linhagem mutante. A deleção de pstS também culminou no retardamento do crescimendo da bactéria em folhas de C. sinensis, mas não interferiu na adesão bacteriana e na produção da goma, estas sim, influenciadas diretamente pela concentração de fosfato no meio. Análises de metabolômica evidenciaram que a carência de fosfato induz mudanças nas rotas bioquímicas, sobretudo na linhagem mutante que utiliza da via das pentoses e do metabolismo do piruvato para a produção de ATP. Este é o primeiro trabalho que evidencia o papel do sistema ABC de transporte de fosfato nesta bactéria e que relaciona de uma forma multidisciplinar, o papel do íon e dos componentes do regulon pho na bactéria X. citri. Adicionalmente, uma vez que o sistema é bem conservado em outras espécies, os resultados obtidos servem como modelo para o gênero Xanthomonas / Abstract: ! Xanthomonas axonopodis pv. citri (X. citri) is the cause of citrus canker in several species of citrus, especially oranges. The citrus canker epidemics have caused severe economic losses to the citrus industry worldwide since no effective combat strategies against this bacterium. Several studies have demonstrated the importance of genes related to the pathogenesis of X. citri, but there is no studies about mechanisms of micronutrients acquisition such as phosphate. X. citri has an ATP-Binding Cassete transport system for inorganic phosphate encoded by pstSCAB operon. In addition, the bacterium has two other operons oprOphoX and phoBR, which encode respectively, an outer membrane porin and a periplasmic binding protein and two-components system. The three operons and other related genes are members of the phosphate regulon (pho regulon). In this work we studied the response of these operons in phosphate deprivation, and the role of periplasmic-binding protein PstS through proteomics analysis, metabolomics, crystallography and functionally based on a X. citri mutant deleted for pstS gene (Xac::pstS). Data were compared between wild type and mutant strains. We showed that the phosphate ABC system is activated during the ion depletion, including PstS and PhoX that showed increased levels of 49 and 30 times, respectively. In addition, we showed that X. citri displays most of the genes of the pho regulon. PhoX and PstS are phosphate binding proteins that share 70% amino acid identity and have origin from a gene duplication. In the absence of PstS, PhoX seems to complement the uptake function, but it is not able to recover all phenotypes of the wild type bacteria. Additionally, phosphate transport assays with wild type and mutant bacteria showed differences in transport and constitutivity of the ABCsystem in the mutant strain. The deletion of pstS also resulted in slowing of bacteria growth in Citrus sinensis leaves, but did not interfere with bacterial adhesion and gum production, two phenomena directly influenced by the phosphate concentration in the medium. Metabolomic analyzes showed that phosphate deprivation induces changes in biochemical pathways, especially the mutant strain that uses the pentose and pyruvate metabolism for ATP production. This is the first work that highlights the role of the ABC system for phosphate in this bacterium and that reveals in a multidisciplinary way, the role of the ion and the pho regulon components in the phytopathogenic bacterium. Additionally, once the system is well preserved in other species, the results serve as a model for the genus Xanthomonas / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-01Bitstream added on 2014-06-13T18:54:08Z : No. of bitstreams: 1 tezza_rid_me_jabo.pdf: 2155126 bytes, checksum: 33a07381689b0811f980f19b4c0fc487 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Com o seqüenciamento completo do genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), em 2002, inúmeras possibilidades de estudo foram viabilizadas, dando margem à busca de novas formas de controle do cancro cítrico, baseadas em alvos moleculares. Estudos dessa natureza têm mostrado a existência de genes que somente são expressos quando a bactéria está se desenvolvendo in planta. Sabe-se que essa regulação é dependente da região promotora e sua identificação pode possibilitar avanços significativos na busca do controle dessa doença. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais in vitro em biologia molecular, identificar um número significante de promotores ainda é uma tarefa difícil e dispendiosa. Os métodos computacionais existentes enfrentam a falta de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método para predizê-Ios em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. O Modelo Oculto de Markov é um modelo estatístico aplicável a muitas tarefas em biologia molecular. Entre elas, predição e mapeamento de seqüências promotoras no genoma de um procarioto. Neste trabalho, estudou-se o mapeamento in silico de promotores gênicos de todo o genoma da Xac e em 68% dos genes a localização de um promotor foi indicada. A análise comparativa com dados experimentais de proteômica mostrou que 72% das proteínas expressas identificaram-se com elementos desta lista de promotores, o que corresponde a 27% do total de genes do genoma. À partir destes dados foi possível levantar um rol de informações sobre estes candidatos a promotores incitando a novos estudos moleculares. / With the complete genome sequencing of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac), in 2002, several study possibilities were made practical and then creating the search of new citrus canker control ways, based in molecular aims. This kind of studies has shown the genes existences that are only expressed when the bacteria are developing itself in plant. It has been known that this regulation is promoter region dependent and its identification can allow significant advances in the search of this disease control. Although increasing advance of in vitro experimental techniques in molecular biology, identifying a meaningful number of promoters is still a hard and expensive task. The existents computer science methods face the need of a proper number of known promoters to identify conserved patterns among the species. Therefore, a method to predict them in any prokaryote organism is still a challenge. The Hidden Markov Model (HMM) is a statistic model applicable in many tasks in molecular biology. Among them, prediction and mapping of the promoters sequences in prokaryotic genome. In this work, which has studied the genic promoters in silico mapping of the whole Xac genome, in 68% of the genes the promoter localization was indicated. The proteomic experimental data comparative analysis showed that 72% of the expressed proteins identified with elements from the promoters list, which corresponds 27% of the genome genes total. According to these data it was possible to generate an information roll about these promoters candidates inciting new molecular studies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-07-11Bitstream added on 2014-06-13T20:06:02Z : No. of bitstreams: 1 vigoschultz_sc_dr_botfca.pdf: 498277 bytes, checksum: c7de24a4b6e67b28a4f1cf2cd6af9342 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O crestamento bacteriano comum do feijoeiro (CBCF), incitado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, é responsável por expressivos danos na cultura e por reduções no rendimento e qualidade dos grãos. A preocupação com o meio ambiente e o uso indiscriminado de agrotóxicos tem impulsionado a pesquisa para a busca de métodos alternativos ao controle de patógenos em plantas. Os indutores de resistência têm se mostrado eficientes e promissores no controle de diversos patógenos de culturas. O presente trabalho teve como objetivos verificar o potencial de tinturas etanólicas de Lippia alba (erva cidreira), Lippia sidoides (alecrim pimenta), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (cavalinha) e Hedera helix (hera), óleos essenciais de Rosmarinus officinalis (alecrim) e Cinnamomum zeylanicum (canela) e de piraclostrobina e acibenzolar-S-metil no controle do crestamento bacteriano comum em feijão vagem cultivar Bragança. Esses produtos foram utilizados nos seguintes ensaios: atividade antimicrobiana in vitro (exceção ao acibenzolar-S-metil), atividade in vivo em plantas cultivadas sob condições de casa de vegetação, tratadas com os produtos e calculada a área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD); atividade de polifenoloxidases, peroxidases e proteínas solúveis totais em folhas tratadas e não tratadas de feijão vagem, inoculadas e não inoculadas, coletadas em diferentes épocas (0, 3, 5, 8 e 10 dias após pulverização das tinturas etanólicas, óleos essenciais, acibenzolar-S-metil e pyraclostrobin). Os resultados obtidos demonstraram que as tinturas de L. alba e L. sidoides e os óleos essenciais apresentaram atividade in vitro aos isolados de X. axonopodis pv. phaseoli, enquanto que piraclostrobina não apresentou ação in vitro sobre a bactéria. A tintura etanólica de L. alba, pyraclostrobin e acibenzolar-S-metil apresentaram menores valores da AACPD,... / Common bacterial blight of snap bean (CBCSB), caused by Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli responsible for expressive culture damage and reduction of seeds production and quality. The environmental impact of the indiscriminate use of pesticides has lead to search alternative methods of plant pathogens control. Resistance inducers have been efficiently successful on several plant pathogens control. Thus, this study aimed to evaluate the potential of alcohol extracts of Lippia alba (Melissa), Lippia sidoides (pepper-rosmarin), Mikania glomerata (guaco), Equisetum sp. (horsetail) and Hedera helix (English Ivy), essential oils of Rosmarinus officinalis (rosemary) and Cinnamomum zeylanicum (cinnamon) and, pyraclostrobin and acibenzolar-S-metil on the control of common bacterial blight in snap beans, Bragança cultivar. These products were used in the following assays: in vitro bactericidal activity (except for acibenzolar-S-metil), in vivo activity of greenhouse-cultivated plants treated with products and the area under the disease progress curve (AUPDC) was calculated; activity of poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins in treated anduntreated bean leaves, infected and non-infected leave collected in different stages (0, 3, 5, 8 and 10 days after sprinkling with alcohol extracts, essential oils, acibenzolar-S-metil and pyraclostrobin). Results showed in vitro activity against X. axonopodis pv. phaseoli for L. alba and L. sidoides extracts, and essential oils while pyraclostrobin did not show any in vitro activity effect. L. Alba alcohol extract, pyraclostrobin and acibenzolar-S-methy showed the lowest AUPDC values compared to control treatment. The highest poliphenoloxidases, peroxidases and total soluble proteins values were observed in plant leaflets sprinkled with these products which probably are related to resistance induction. Essential oils did not show difference on AUPDC nor protein induction.

Resumo: Com o seqüenciamento completo do genoma do fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), em 2002, inúmeras possibilidades de estudo foram viabilizadas, dando margem à busca de novas formas de controle do cancro cítrico, baseadas em alvos moleculares. Estudos dessa natureza têm mostrado a existência de genes que somente são expressos quando a bactéria está se desenvolvendo in planta. Sabe-se que essa regulação é dependente da região promotora e sua identificação pode possibilitar avanços significativos na busca do controle dessa doença. Apesar do crescente avanço das técnicas experimentais in vitro em biologia molecular, identificar um número significante de promotores ainda é uma tarefa difícil e dispendiosa. Os métodos computacionais existentes enfrentam a falta de um número adequado de promotores conhecidos para identificar padrões conservados entre as espécies. Logo, um método para predizê-Ios em qualquer organismo procariótico ainda é um desafio. O Modelo Oculto de Markov é um modelo estatístico aplicável a muitas tarefas em biologia molecular. Entre elas, predição e mapeamento de seqüências promotoras no genoma de um procarioto. Neste trabalho, estudou-se o mapeamento in silico de promotores gênicos de todo o genoma da Xac e em 68% dos genes a localização de um promotor foi indicada. A análise comparativa com dados experimentais de proteômica mostrou que 72% das proteínas expressas identificaram-se com elementos desta lista de promotores, o que corresponde a 27% do total de genes do genoma. À partir destes dados foi possível levantar um rol de informações sobre estes candidatos a promotores incitando a novos estudos moleculares. / Abstract: With the complete genome sequencing of the phytopathogen Xanthomonas axonopodis pv. Citri (Xac), in 2002, several study possibilities were made practical and then creating the search of new citrus canker control ways, based in molecular aims. This kind of studies has shown the genes existences that are only expressed when the bacteria are developing itself in plant. It has been known that this regulation is promoter region dependent and its identification can allow significant advances in the search of this disease control. Although increasing advance of in vitro experimental techniques in molecular biology, identifying a meaningful number of promoters is still a hard and expensive task. The existents computer science methods face the need of a proper number of known promoters to identify conserved patterns among the species. Therefore, a method to predict them in any prokaryote organism is still a challenge. The Hidden Markov Model (HMM) is a statistic model applicable in many tasks in molecular biology. Among them, prediction and mapping of the promoters sequences in prokaryotic genome. In this work, which has studied the genic promoters in silico mapping of the whole Xac genome, in 68% of the genes the promoter localization was indicated. The proteomic experimental data comparative analysis showed that 72% of the expressed proteins identified with elements from the promoters list, which corresponds 27% of the genome genes total. According to these data it was possible to generate an information roll about these promoters candidates inciting new molecular studies. / Orientadora: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Mestre

Orientador: Ljubica Tasic / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-16T13:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Borin_PaulaFernandaLacarini_M.pdf: 1689128 bytes, checksum: c3f8712ed17691069b7fabb711257101 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é uma bactéria Gram-negativa que parasita plantas cítricas e é responsável pela doença conhecida como cancro cítrico, que apresenta grande importância econômica em todo mundo. Acredita-se que a infecção da célula hospedeira ocorre com atuação dos sistemas de secreção, onde fatores macromoleculares de virulência, normalmente proteínas ou complexos de ácidos nucléicos com proteínas, são excretados para o citosol da célula no caso dos sistemas do tipo III e IV, onde irão interferir no processo celular do hospedeiro. O alvo do estudo é a proteína hipotética XACb0033, codificada pelo locus virB do plasmídio pXac64. Ela foi identificada como possível chaperona secretória do sistema de secreção tipo IV, por apresentar diversas características destas proteínas, como baixo peso molecular, pI ácido e propensão a formação de dímeros, entre outras. A XACb0033 foi clonada no vetor de expressão pET23a(+) e expressa na bactéria Escherichia coli utilizando técnicas de biologia molecular de clonagem e expressão. Os resultados da expressão foram satisfatórios, obtendo-se a proteína em quantidade suficiente para sua purificação seguida pela caracterização estrutural. A XACb0033 foi analisada por Espectrometria de Massas (MALDI-Tof MS), Dicroísmo Circular (CD), fluorescência de emissão estática e dinâmica, Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1 (RMN de H) e Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Todos os dados indicam que a XACb0033 apresenta estrutura enovelada, não interage com os nucleotídeos (ATP e ADP) e tende em agir em forma dimerica seguindo o modelo de uma chaperona secretória, e, por fim, a estrutura do seu envelope molecular foi obtida. / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is a Gram-negative bacterium that parasites citric plants all over the world and is responsible for causing the citrus canker with significant economic importance. It is believed that infection of the host cell occurs with activity of Xac¿s secretion systems, where macromolecular virulence factors, usually proteins or nucleic acid complexes with proteins, are excreted into the cytosol of the host cells as in the case of type III and IV systems, where they will interfere with the key cell processes. The aim of our study was structural characterization of the XACb0033, Xac¿s hypothetical protein, encoded by the locus virB of pXac64 plasmid. This protein was identified as a possible type IV secretion system chaperona because it presents many features of these proteins, such as low molecular weight, acidic pI, and propensity to form dimers, among others. The XACb0033 was cloned at expression vector pET23a (+) and expressed in Escherichia coli using molecular biology techniques for cloning and expression. The expression results were satisfactory, obtaining sufficient protein for its purification followed by structural characterization. The XACb0033 was analyzed by Mass Spectrometry (MALDI-Tof MS), Circular Dichroism (CD), static and dynamic Fluorescence, Nuclear Magnetic Resonance (H NMR) and by Small Angle X-ray Scattering (SAXS). All collected data indicated that XACb0033 has folded structure, does not interact with nucleotides (ATP and ADP) and tends to act in dimeric form, following a model of a secretory chaperona, and, at last but not at least, its molecular envelope structure has been obtained. / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química