Bei neun von vierzehn Serogruppen der Subspezies E. coli Flexneri (SF) konnte ein pHS-2-Plasmid nachgewiesen werden. Es besteht eine positive Korrelation zwischen pHS-2-positiven SF und dem Auftreten einer Reaktiven Arthritis, eine Komplikation der bakteriellen Ruhr. Verschiedene Autoren führen das gehäufte Auftreten der Reaktiven Arthritis bei pHS-2-positiven SF auf eine erhöhte Serumresistenz zurück, die den Bakterien durch das cld(pHS-2)-Gen vermittelt wird. Das cld(pHS-2)-Gen als längstes aller 18 "open reading frames" auf dem pHS-2-Plasmid kodiert für ein 35 kD großes Protein, das aufgrund seiner Funktion als "chain length determinant" (Cld(pHS-2)) bezeichnet wurde. Cld(pHS-2) ist maßgeblich an der Produktion von Lipopolysacchariden vom VL-Typ beteiligt. LPS vom VL-Typ produzieren O-Seitenketten mit mehr als 70 bis 80 Oligosaccharideinheiten und sollen die bakterielle Membran vor einer Komplementbindung und Serum-Antikörpern schützen, wodurch den Bakterien eine erhöhte Serumresistenz vermittelt werde. In dieser Arbeit wurde cld(pHS-2) in einen pHS-2-negativen Stamm der SF Serogruppe 6 integriert, um nachzuweisen, dass cld(pHS-2) das LPS-Muster pHS-2-negativer SF in charakteristischer Weise modifiziert. Während der Expressionsnachweis von cld(pHS-2) als Einzelprotein misslang, war eine Expression von cld(pHS-2) als Fusionsprotein in SF Serogruppe 6 erfolgreich. Im Vergleich zu pHS-2-negativen SF war unsere SF Serogruppe 6-Mutante nun in der Lage, LPS vom VL-Typ in Form einer zusätzlichen Bande mit ca. 80 Oligosaccharideinheiten zu produzieren. Diese phänotypische Veränderung war zwar nur gering ausgeprägt, konnte jedoch den spezifischen Einfluss von cld(pHS-2) als Fusionsprotein auf das LPS-Muster pHS-2-negativer SF nachweisen. / In nine out of fourteen serogroups of E. Coli Flexneri (SF) a pHS-2 plasmid has been isolated. There is a positive correlation between pHS-2-positive SF and the occurence of reactive arthritis (ReA) which is a complication of bacterial dysentery. Different authors reduce the widespread appearance of ReA by pHS-2-positive SF to an increased serum resistance caused by a cld(pHS-2)-gene. The cld(pHS-2)-gene ist the longest of 18 open reading frames in pHS-2 and it is the coding for a 35 kD protein which has been identified as a chain length determinant because of its function. Cld(pHS-2) plays a decisive role in the production of lipopolysaccharides (LPS) of the VL-type. LPS of the VL-type produce O antigen with more than 70-80 repeat units, and protect the bacterial outer membrane from complement factors and serum antibodies by a higher serum resistance. In this research the cld(pHS-2)-gene was integrated in a pHS-2-negative SF serogroup 6 to prove that cld(pHS-2) is able to modify the LPS pattern (destribution) of pHS-2-negative SF in a characteristic manner. The expression of cld(pHS-2) in SF serogroup 6 as an isolated protein failed, but the expression of cld(pHS-2) as a fusion protein was successful. In contrast to the pHS-2-negative SF our SF serogroup 6 mutant was able to produce LPS of the VL-type with 80-90 repeat units. Despite the slight effect, a specific influence of cld(pHS-2) as a fusion protein on LPS pattern and the bacterial phaenotype has to be confirmed.

Multi-Antigen-Komplexe wurden in der Vakzinologie als effizientes Modell genutzt, um eine breite Impfstoffabdeckung gegen mehrere Stämme desselben Pathogens zu erzielen. Hier werden die Ergebnisse zur menschlichen B-Zell-Reaktion auf einen Multi-Antigen-Komplex (Bexsero) in drei Impfstoffen (Vax1, Vax2 und Vax3) dargestellt. Bexsero ist ein Impfstoff, der aus vier Antigenen (fHbp-GNA2091, NHBA-GNA1030, NadA und OMV (NZ98-254)) für Neisseria meningitidis (Nm) B besteht. Bei allen drei Impfstoffen konnten außerordentlich diverse Immunglobuline (Ig) beobachtet werden, die als Reaktion auf Bexsero mit einzigartigen Ig-Genselektionsmustern erzeugt wurden. Die Daten zeigen auch Igs, die eine Reihe von Spezifitäten aufweisen (Bexsero-spezifisch-reaktive Igs (nur Vax3) oder polyreaktive Igs (Vax2, Vax3 und Vax4)) und Affinitäten (hochbindende, mäßig bindende, schwach bindende und nicht reaktive Igs). Es wurde keine eindeutige Korrelation zwischen spezifischen Ig-Genmerkmalen und Ig-Reaktivitätseigenschaften beobachtet, obwohl Igs von allen Impfstoffen kollektiv unterschiedliche Affinitäten innerhalb/zwischen Cluster-Igs und zwischen Nicht-Clustern von Bexsero aufweisen, was potenzielle Vorteile für einen breiten Schutz mit sich bringt. Ig-Gen-Merkmale und Antigen-Reaktivitätseigenschaften von Igs, die gegen NHBA (22 Igs), fHbp (2 Igs) und NadA (2 Igs) erzeugt wurden, sind ebenfalls gezeigt. Diese Ig zeigten schwache Bindungsaffinitäten, wenn sie an endogen exprimierten Antigenen auf Nm mc58 getestet wurden, möglicherweise aufgrund eines ungeordneten N-Terminus von NHBA. Es wurde eine Anreicherung von hochmutierten polyreaktiven Ig beobachtet. Es werden unterschiedliche Immunoselektivitätsgrade für die verschiedenen Antigene beobachtet, was auf eine Antigenimmunodominanz sowie auf Hinweise auf eine Epitopmaskierung hindeutet. Mit einem kontrollierbaren System von 4 Antigenen eröffnen die Daten die Möglichkeit die menschliche B-Zell-Reaktion auf Multi-Antigen-Komplexe zu verstehen und zeigen, dass ein umfassendes Verständnis über die feinen zellulären und humoralen Einzelheiten der Immunantworten des Impfstoffs während klinischer Studien erforderlich ist. / Multi-antigen complexes have been exploited in vaccinology as an efficient model, to achieve broad vaccine coverage against multiple strains of the same pathogen. Here, the findings on the human B cell response to a multi-antigen complex (Bexsero) in three vaccinees (Vax1, Vax2 and Vax3) are shown. Bexsero is a vaccine comprising of four antigens (fHbp-GNA2091, NHBA-GNA1030, NadA and OMV (NZ98-254)) for Neisseria meningitidis (Nm) B. Immensely diverse (isotype distribution, IgVH and IgJH gene usage, CDR3 length distribution and clonal selection) immunoglobulins (Igs) generated in response to Bexsero with unique Ig gene selection patterns in all three vaccinees was observed. The data also shows Igs that exhibit a range of specificities {Bexsero-specific-reactive Igs (Vax3 Only) or polyreactive Igs (Vax2, Vax3 and Vax4)} and affinities (highly binding, moderately binding, weakly binding and unreactive Igs). No unique correlation between specific Ig gene features and Ig reactivity properties was observed, albeit Igs from all vaccinees collectively exhibit varied affinities within/between cluster Igs, and amongst non-clusters to Bexsero, with potential advantages for broad protection. Ig gene features and antigen-reactivity properties of Igs generated against NHBA (22 Igs), fHbp (2 Igs) and NadA (2 Igs) are also shown. These Igs exhibited weak binding affinities when tested on endogenously expressed antigens on Nm mc58, potentially due to disordered N-terminal of NHBA. Enrichment of highly mutated polyreactive Igs was observed. Varying degrees of immunoselectivity to the different antigens, suggesting antigen immunodominance as well as evidence of epitope masking are observed. With a controllable system of 4 antigens, the data opens a potential window to understanding the human B cell response to multi-antigen complexes and evinces the need for expansive understanding of the fine cellular and humoral details of vaccine immune responses during clinical trials.

Die durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierte frühe Immunantwort ist ein wesentlicher Mechanismus der Infektabwehr durch die angeborene Immunität. Bei starker LPS-Exposition kann es andererseits zur Ausbildung eines septischen Syndroms kommen. Der endothelialen Sekretion von Interleukin-8 (IL-8/CXCL8), das als Chemokin die Migration neutrophiler Granulozyten vermittelt, kommt dabei herausragende Bedeutung zu. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Relevanz der Rho-Proteine RhoA, Rac1 und Cdc42 für die LPS-induzierte intrazelluläre Signaltransduktion mittels Überexpression inaktiver Mutanten dieser Proteine zu untersuchen. Diese Untersuchung wurde erschwert durch die schlechte Transfizierbarkeit der Endothelzelllinie HPMEC-ST1.6R, die nahezu alle Charakteristika primärer Endothelzellen aufweist. Deshalb wurde eine Methode etabliert, die durch Kotransfektion des Grünen Fluoreszenzproteins (GFP) die flusszytometrische Selektion der transfizierten Zellen anhand ihrer GFP-bedingten Fluoreszenz und die Messung der Expression von CXCL8 allein in dieser Population ermöglicht. Damit wurde nachgewiesen, dass die inaktiven Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 jeweils die LPS-induzierte Expression von CXCL8 vermindern. Die größte Reduktion der CXCL8-Expression um 38 % der Positivkontrolle zeigte sich nach Transfektion der Mutante Rac1N17. Die Zelllinie CHO-3E10 exprimiert einen artifiziellen Reporter unter der Kontrolle eines Fragments aus der Verstärkerregion des Gens für das Endotheliale Leukozyten-Adhäsionsmolekül ELAM-1 (CD62E). Die Transfektion jeder einzelnen der inaktiven Varianten der drei GTP-bindenden Proteine in Zellen der Linie CHO-3E10 reduzierte die Expression des Reporterproteins nach Stimulation mit LPS signifikant. Die stärkste Reduktion der Reporterexpression um 51 % der Positivkontrolle ergab sich unter Rac1N17. Zusammengefasst zeigt die Studie, dass die Überexpression der inaktiven Mutanten RhoAN19, Rac1N17 und Cdc42N17 zu einer Abnahme der endothelialen Expression von CXCL8 führt. Darüberhinaus ergab sich im Vergleich zu den Mutanten RhoAN19 und Cdc42N17 die stärkste Reduktion der CXCL8-Expression in Endothelzellen nach Transfektion der Mutante Rac1N17. / The early immune response induced by Lipopolysaccaride (LPS) is a crucial mechanism in fighting off infections by the innate immunity. On the other side high amounts of LPS can lead to the development of a sepsis. In this process the endothelial secretion of interleukin-8 (IL-8/CXCL8), which causes the migration of neutrophilic granulocytes to the site of infection is highly important. The aim of this study was to analyze the relevance of each of the three Rho-proteins RhoA, Rac1 and Cdc42 for the intracellular signal transduction resulting in CXCL8-expression by means of overexpressing inactive mutants of these proteins. Cells of the human microvascular endothelial cell line HPMEC-ST1.6R show most characteristics of primary endothelial cells and are extremely difficult to transfect. Therefore a method was established, which allowed sorting of successfully transfected cells by cotransfecting a gene encoding for green fluorescence protein (GFP). This method permitted measuring intracellular expression of CXCL8 in the population successfully transfected with plasmids encoding for RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 mutants. This experiments demonstrated that the inactive mutants RhoAN19 Rac1N17 or Cdc42N17 each decreased the LPS-induced expression of CXCL8. Quantitative comparision showed the greatest reduction of 38 % in CXCL8-expression due to transfection of the Rac1N17 mutant. The LPS-inducible reporter cell line CHO-3E10 used in this study expresses the human CD25-antigene as an artificial reporter protein under the control of a fragment from the enhancer region of the gene for the human endothelial leukocytic adhesionmolecule ELAM-1 (CD62E). Transfecting each of the inactive mutants RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 in CHO-3E10 cells significantly reduced the LPS-induced expression of the reporter protein. The greatest reduction in reporter expression of 51 % resulted from transfection with the Rac1N17 mutant. In conclusion, this study demonstrates that overexpression of nonfunctional GTP-binding proteins RhoAN19, Rac1N17 or Cdc42N17 leads to a decrease in endothelial CXCL8-expression. Moreover, CXCL8-expression in endothelial cells transfected with the Rac1N17 mutant was most efficiently reduced when compared to the other mutants.

Shigellen sind enteroinvasive E. coli-Klone, die beim Menschen das Krankheitsbild der bakteriellen Ruhr verursachen. Wichtige Virulenzeigenschaften dieser Bakterien werden von dem 220 kb großen Plasmid pINV kodiert. Die für das Krankheitsbild typischen blutig-eitrigen Durchfälle sind Folge der retrograden Zerstörung der Kolon-Mukosa ausgehend von der initialen Infektion im Bereich des Recto-Sigmoids. Die Infektion der Darmmukosa erfolgt über M-Zellen und assoziierte Makrophagen, nach deren apoptotischem Untergang das Bakterium Zugang zum basolateralen Pol der Enterozyten erhält; eine direkte Infektion der Enterozyten vom Darmlumen über deren apikalen Pol wird nicht beobachtet. Das eigentliche Ziel der invasiven Shigellen ist das Zytoplasma des Enterozyten, da nur dort eine relevante Replikation der Bakterien stattfindet. Dabei wird die Ausbreitung der Bakterien durch ihre Fähigkeit begünstigt, von einer primär infizierten Epithelzelle ausgehend benachbarte Epithelzellen über Plasmamembran-Ausstülpungen zu infizieren, ohne dabei den geschützten Raum des epithelialen Zytoplasmas zu verlassen. Die Aufklärung des epithelialen Invasionsmechanismus auf molekularer Ebene ist deshalb von essenzieller Bedeutung für das Verständnis sowohl der Pathogenese der Erkrankung als auch der Ökologie des Erregers. Die Infektion humaner Epithelzellen durch Shigellen erfolgt durch bakterielle Induktion von Membranausstülpungen, die über dem Bakterium fusionieren und morphologisch der Makropinozytose ähneln. Die Ausbildung der zellulären Protrusionen geht mit bedeutenden Umbauvorgängen des Zytoskeletts einher. Wir konnten zunächst in einer mikromorphologischen Analyse die einzelnen Etappen des Zytoskelett-Umbaus sowie die Mikroarchitektur der Protrusionen beschreiben. Anschließend gelang es, mit T-Plastin, Rho und einem Myosin IX Struktur- und Regulations-Moleküle zu identifizieren, die für die bakterielle Invasion funktionell bedeutend sind. Dabei fielen unterschiedliche bakteriell induzierte Rekrutierungsmuster verschiedener Rho-Isoformen und verschiedener Proteine der Rho-Familie auf. Insbesondere wurden RhoA und RhoC in unterschiedliche Bereiche des Invasionskomplexes rekrutiert. Mit umfangreichen Mutationsanalysen dieser Rho-Isoformen gelang es schließlich erstmals, ein humanes Proteinmotiv mit Techniken der `zellulären Mikrobiologie´ zu charakterisieren. Das mit Hilfe unseres Shigellen-Infektionsmodells an Epithelzellen beschriebene Rekrutierungsmotiv von Rho dürfte von fundamentaler Bedeutung sein für die räumliche Aktivitätsregulation dieser Proteinfamilie in normalen und in stimulierten Zellen. / Shigella comprise enteroinvasive clones of E. coli and are the cause of bacillary dysentery in humans. Important virulence traits of these bacteria are encoded by the 220 kb pINV plasmid. The bloody-purulent diarrhea typically seen in this disease results from retrograde destruction of colonic mucosa after inital infection of the recto-sigmoid. Infection of intestinal mucosa is via M-cells and associated macrophages. After apoptotic degradation of macrophages the microorganism gains access to the basolateral pole of enterocytes. Direct infection of enterocytes from the intestinal lumen via the apical pole is not observed. Invasive shigella target the cytoplasm of enterocytes since relevant microbial replication only takes place in this compartment. Microbial spread within the epithelial cell layer is via protrusions of the cytoplasmic membrane that reach from cell to cell thus enabling intercellular transitions without leaving the safe cytoplasmic compartment of epithelial cells. Insight into the molecular mechanisms of epithelial cell invasion is therefore essential for the comprehension of the pathogenesis of the disease as well as the ecology of the microorganism. Infection of human epithelial cells by Shigella results from bacteria-induced formation of membraneous protrusions that finally fuse above the bacterium and morphologically resemble macropinocytosis. The formation of cellular protrusions is associated with important rearrangements of the cytoskeleton. In a micromorphological study we first described the different steps of cytoskeletal reorganization and the microarchitecture of the protrusions. We then could identify structure and regulatory molecules that are functionally involved in bacterial entry: T-plastin, Rho and a myosin IX. These studies also showed different bacteria-induced recruitment patterns of Rho isoforms and of various members of the Rho protein family. In particular, RhoA and RhoC were recruited into different regions of the invasion structure. Using exhaustive mutation analysis of these Rho isoforms, we for the first time characterized a human protein motif using methods of `cellular microbiology´. The recruitment motif described using our model of epithelial cell invasion by Shigella should be significant for the spatial regulation of activity of this protein family in normal and in stimulated cells.

Legionella pneumophila ist ein Gram-negatives, ubiqitär verbreitetes Proteobakterium, das als Auslöser der Legionärskrankheit gilt. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Serin eine wichtige Kohlenstoffquelle für Aminosäuren darstellt und dass L. pneumophila für die Aminosäuren Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Prolin und Valin auxotroph ist. Innerhalb der Replikationsvakuole greift L. pneumophila auf Aminosäuren des Wirts zurück und inkorporiert diese in Proteine. Die untersuchte Spezies besitzt die Fähigkeit zur de novo-Biosynthese von Serin. Die vorliegende Arbeit zeigt zudem erstmals, dass Glukose für die Biosynthese von Aminosäuren sowie Polyhydroxybutyrat (PHB) verwendet wird. Der Entner-Doudoroff-Weg (EDW) kann als Haupt-Katabolismusroute von Glukose identifiziert werden. Ein Deletionsstamm des EDW zeigt gegenüber dem Wildtypstamm in nährstoffarmer Umgebung deutlich verminderte Fitness nach erfolgreicher Replikation innerhalb A. castellanii. Die Glukoamylase GamA wird in dieser Arbeit erstmals als verantwortliches Enzym für die Stärke- und Glykogenhydrolyse von L. pneumophila charakterisiert. Der putative Transkriptionsaktivator YozG bindet sowohl im 5’-DNA-Bereich von gamA als auch im eigenen putativen Promotorbereich und reguliert die Hydrolyseaktivität von GamA. Es werden zudem Argumente für die Hypothese erbracht, dass YozG auch als cis-aktives Element fungiert. Die Biosynthese von Polyhydroxybutyrat (PHB) aus Glukose findet während des spät-exponentiellen Wachstums statt und steigert sich in der stationären Phase. Eine verminderte PHB-Menge im EDW-Deletionsstamm wird als Erklärung für die verminderte Fitness in nährstoffarmer Umgebung diskutiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass L. pneumophila neben Aminosäuren auch Glukose sowie die natürlich vorkommenden Glukosepolymere Glykogen und Stärke als Kohlenstoffquellen zur Biosynthese von Aminosäuren und PHB nutzt und dass diese Synthese zur Fitness der Spezies beiträgt. / Legionella pneumophila is a Gram-negative proteobacterium causing Legionnaires’ disease. The results of this study confirm that serine is a carbon source for amino acids and that L. pneumophila is auxotrophic for the amino acids isoleucine, leucine, phenylalanine, tyrosine, histidine, proline, and valine. L. pneumophila uses amino acids of the host cells to incorporate them into proteins. Serine is synthesized de novo. Furthermore, this work demonstrates for the first time that glucose is used for the biosynthesis of amino acids and polyhydroxybutyrate (PHB). The Entner-Doudoroff pathway is identified as the predominant pathway for the catabolism of glucose. In a nutrient-depleted environment, after replication has taken place in A. castellanii, a deletion strain of the Entner-Doudoroff pathway exhibits strongly reduced fitness as compared to the wildtype. The glucoamylase GamA is characterized as the enzyme responsible for the starch and glycogen degrading activity of L. pneumophila for the first time. The putative transcription activator YozG binds to the 5’ region of gamA as well as to his own putative promoter region and regulates GamA activity. Furthermore, arguments are provided to support the hypothesis that YozG also acts as a cis-active element. The biosynthesis of polyhydroxybutyrate (PHB) from glucose starts in the late exponential phase and increases in the stationary growth phase. As an explanation for reduced fitness of the Entner-Doudoroff deletion strain in nutrient-depleted environment, a reduced amount of PHB is proposed. The results of this work prove that L. pneumophila uses not only amino acids but also glucose and the natural glucose polymers starch and glycogen as carbon sources for the biosynthesis of amino acids and PHB and that thereby the fitness of the species is increased.

Bakterien der Gattung Shigella sind die Erreger der bakteriellen Ruhr beim Menschen. Der wesent-liche Virulenzfaktor der Shigellen ist ihre Fähigkeit zur Invasion. Die Invasion in Epithel-zellen ist Ausdruck des erregerspezifischen Infektionsprozesses, der gekennzeichnet ist durch eine vom Bakterium induzierte zelluläre Aufnahme über einen Phagozytose-ähnlichen Mechanismus. In dessen Verlauf führt die charakteristische Reorganisation des Zytoskeletts der Zelle zur Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur an der bakteriellen Eintrittsstelle. Als essentielles Glied der Signalisationskaskade vom Bakterium zum zellulären Zytoskelett erwies sich das kleine G-Protein Rho. Es wurde gezeigt, daß Rho als Regulator der Veränderungen des Zytoskeletts selbst an den bakteriellen Invasionslocus rekrutiert wird. Diese Rekrutierung umfaßt drei Isoformen von Rho: RhoA, RhoB und RhoC. Trotz hoher Sequenzhomologie der Isoformen untereinander ( 85% ) existiert ein unterschiedliches Rekrutierungsmuster dieser Isoproteine an der Eintrittsstelle von Shigella flexneri. RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Bakterien herum. Demgegenüber werden RhoB und RhoC in die bakterieninduzierten zellulären Protrusionen rekrutiert. Der Mechanismus dieser isoformspezifischen Rekrutierung ist nicht bekannt. Anhand unserer Experimente konnten wir zeigen, daß das allen kleinen G-Proteinen gemeinsame C-terminale Peptid-Motiv CAAX ( C = Cystein, A = aliphatische Aminosäure, X = Leucin ) eine wesentliche Voraussetzung für die Rekrutierung von Rho darstellt, sich die isoformspezifische Rekrutierung jedoch nicht anhand des CAAX-Motivs erklären läßt. Bedeutsam für die differentielle Rekrutierung der Isoproteine ist vielmehr die präterminale Region des Moleküls. Diese Beobachtung hat weitreichende Konsequenzen für die funktionelle Rolle von Rho bei der Epithelzellinvasion durch Shigella. / Shigella is the etiologic agent of human bacillary, an infectious large bowel disease. A major feature of Shigella's pathogenic potential is the capacity to invade epithelial cells. Shigella entry into epithelial cells is considered a parasite-induced internalization requiring cytosceletal rearrangements; Shigella entry induces a blossom-like membrane structure at the bacterial entry site. This membrane folding process is dependent on the small GTPase rho. It has been shown that three rho isoforms rhoA, rhoB and rhoC are recruited into bacterial entry sites with different localization relative to the membrane structures. While rhoA preferentially accumulates in close vicinity to entering bacteria, rhoB and rhoC are recruited into the tips of Shigella-induced cellular protrusions. We could show that the C-terminal CAAX-region of rho is a prerequisite for recruitment, but not sufficient for different recruitment of rho isoforms. Additional information for differential recruitment patterns seems to come from the preterminal region of rho proteins. This result is of great importance for the functional role of rho during Shigella-invasion into epithelial cells.

Toxoplasma gondii weist eine weltweite Verbreitung auf und kann fast alle Wirbeltiere, vor allem Vögel und Menschen infizieren. Felide sind Endwirte von T. gondii, welche das infektiöse und umweltresistente Oozysten-Stadium ausscheiden können. T. gondii kann auch ohne sexuelle Vermehrung unterschiedlichste Zwischenwirte und Zwischenwirtspezies infizieren. Obwohl eine sexuelle Phase ein Teil des Lebenszyklus ist, werden rekombinierte Genotypen nur selten beobachtet. Dies ist ein Grund dafür, warum T. gondii eine klonale Populationsstruktur erkennen lässt. Während in Nordamerika und Europa drei klonale Genotypen (Typ I, II und III) dominieren, werden in Südamerika und Asien, neben den drei bekannten auch atypische und andere Genotypen beobachtet. Auch innerhalb der atypischen Genotypen lässt sich eine klonale Populationsstruktur erkennen. Die Linien I, II und III weisen Unterschiede in ihrer Virulenz für Mäuse auf. Typ-I-Stämme sind hochvirulent. Die Infektion mit nur einem Organismus führt bereits zum Tod. Klonale Typ-II- und Typ-III-Stämme sind avirulent für Mäuse. Nur Infektionen mit mehr als 103 Organismen führen zum Tod. In dieser Studie zeige ich, dass die Mehrzahl isolierter T. gondii-Oozysten dem Typ II zuzuordnen ist. Es wurde keine Typ-I-, dafür aber eine Typ-III-Infektion und vereinzelte Hinweise auf Mischinfektionen und nicht-kanonische T. gondii Genotypen beobachtet. Erstmalig kann gezeigt werden, dass aus einer Rekombination zwischen den Typen II und III genetisch unterschiedliche T. gondii in einer natürlich infizierten Katze entstanden sind. Die identifizierten nicht-kanonischen T. gondii Klone weisen unterschiedliche, meist hohe Virulenz im Mausmodell auf. Eine geringe Anzahl von T. gondii-DNA Proben von humanen Toxoplasmose-Fällen deutet auf eine Infektion mit T. gondii des Typs II hin. Ich zeige mit dieser Studie, dass sexuelle Rekombination von T. gondii in Deutschland möglich ist, und diese zur Entstehung von hochvirulenten T. gondii führen kann. / Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that can infect almost all warm-blooded animals, including birds and humans. The definitive host is the cat which excretes the highly infectious and environmental resistant oocyst stage. Equally important for the spread of T. gondii is the transmission of T. gondii by ingestion of contaminated food (prey) between host species. Sexual recombination is a rare event observed in T. gondii. This is one of the reasons why a clonal population structure of T. gondii is observed. In Europe and North America the majority of genotypes (types) of T. gondii are members of only three clonal types, designated type I, type II and type III. In South America and Asia, T. gondii is shown to have an increased genetic diversity with a high prevalence of atypical genotypes. However, even within those atypical genotypes, a clonal population structure can be observed. More importantly, mouse virulence of types I, II and III differ markedly. While infection with T. gondii type I is always lethal in mice, infections with 104–106 parasites of type II or type III are needed to have the same effect in mice. This study shows that the majority of cats in Germany excrete T. gondii oocysts of type II. We have not observed any type I T. gondii, but show that type III and, importantly, mixed type infection as well as non-canonical T. gondii are present in Germany. For the first time we demonstrate that a sexual cross between T. gondii type II and type III in a single, naturally infected cat occurred in Germany resulting in excretion of many genetically different non-canonical T. gondii. Most of the identified non-canonical T. gondii show a high virulence in mice. The RFLP-typing analysis of a limited number of T. gondii-DNA isolated from human samples revealed only alleles of T. gondii type II. I show that genetic recombination of different T. gondii types in Germany can lead to a higher genetic diversity and generation of highly mouse-virulent T. gondii.

Toxoplasma gondii ist wohl der am besten an den Menschen und Tieren angepasste Parasit der Welt und eine der Hauptursachen für Abtreibungen und opportunistsiche Infektionen. Das Verständnis der Stoffwechselflexibilität dieses Parasiten ist essentiel um seine Anpassungsfähigkeit nachzuvollziehen. Lipide sind Grundbestandteile der biologischen Membranen. Doch in den letzten Jahrzehnten sind neben der Biogenese der Membranen noch weitere Funktionen entdeckt worden. Hier berichten wir zum ersten Mal über Phosphatidylthreonin (PtdThr) als Hauptphospholipid von T. gondii und zeigen seine Beziehung mit seinem archetypischen Analogon, Phosphatidylserin (PtdSer). Wir identifizieren auch ein neues Parasitenenzym (TgPTS), welches von der regulären PtdSer-Synthase-Familie abgewichen ist und dieses sonst selten vorkommende Lipid synthetisiert. Die Gendeletion von TgPTS stoppte nicht nur die Synthese von PtdThr, sondern auch stark beeinträchtigt den lytischen Zyklus von T. gondii, insbesondere beim Aus- und Eintritt in die Wirtszellen, ohne dabei die Replikation des Parasiten zu verhindern. Unsere Arbeit zeigt, dass entweder ein niedriger Ca2+-Pool oder eine verminderte Ca2+-Mobilisierung aus dem endoplasmatischen Retikulum des Parasiten eine reduzierte Motilität verursachen, welche den beobachteten Phänotypen zugrunde liegt. Darüber hinaus fehlt es den mutierten Parasiten an PtdThr (Δtgpts), sie sind avirulent und üben vollständigen Schutz gegen akute und chronische Toxoplasmose in einem Mausmodell aus. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung der Parasitenlipide als therapeutisches Ziel und von genetisch abgeschwächten Stämmen für die Entwicklung von wirksamen Impfstoffen gegen Kokzidien. / Toxoplasma gondii is arguably the most succesful parasite in Earth and a major cause of abortion and opportunistic infections in humans and livestock. Understanding the metabolic flexibility of this parasite is essential to comprehend its adaptability. Lipids are basic components of biological membranes. However, in the last decades non-customary roles for lipids beyond membrane biogenesis have been recognized. Here we report for the first time phosphatidylthreonine (PtdThr) as a major phospholipid in T. gondii and show its relationship with its archetypical analog, phosphatidylserine (PtdSer). We also identify a novel parasite enzyme (TgPTS), which diverged from the mainstream PtdSer-synthase family to produce this otherwise rare lipid. Genetic ablation of TgPTS not only abolished PtdThr synthesis, but also impaired severely the lytic cycle of T. gondii, particularly the egress but also the invasion into host cells without affecting the parasite replication. Our work indicates that, either a lower Ca2+ pool and/or a diminished Ca2+ mobilization from the parasite endoplasmic reticulum cause a reduced gliding motility, which underlies the observed phenotypes. Moreover, the mutant parasites lacking PtdThr (Δtgpts) are avirulent and exert full protection against both, acute and chronic toxoplasmosis in a murine model. These results highlight the importance of parasite lipids as therapeutic targets and of genetically-attenuated strains in the development of effective vaccines against coccidian parasites.

Toxoplasma gondii ist ein weit verbreiteter einzelliger Parasit, der fast alle warmblütigen Organismen infizieren kann. Asexuelle Fortpflanzung des Parasiten in seiner Wirtszelle wird durch aufeinanderfolgende lytische Zyklen erreicht, was die Bereitstellung einer signifikanten Menge an Energie und Biomasse erforderlich macht. Diese Arbeit zeigt, dass Glukose und Glutamin die beiden wichtigsten physiologischen Nährstoffe für die Synthese von Makromolekülen (ATP, Nukleinsäure, Proteine und Lipide) in T. gondii sind. Die Verfügbarkeit einer der beiden Kohlenstoffquellen reicht aus, um das Überleben des Parasiten sicherzustellen. Der Parasit kann durch Erhöhen des Flusses von Glutamin-abstammendem Kohlenstoff durch den TCA-Zyklus und durch gleichzeitige Aktivierung der Gluconeogenese, eine stetige Biogenese von ATP und Biomasse zur Wirtszellinvasion und Replikation gewährleisten, bzw. der genetischen Deletion des Glukosetransporters entgegenwirken. Der Wachstumsdefekt in der Glykolyse-Mutante wird durch eine kompromittierte Synthese von Lipiden verursacht, die durch Glutamin nicht ausgeglichen werden kann. Die Zugabe von exogenem Acetat kann diesen Wachstumsdefekt allerdings kompensieren. In dieser Arbeit konnten darüber hinaus zwei unterschiedliche Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEPCK) Enzyme im Parasiten identifiziert werden, von denen eines im Mitochondrium lokalisiert ist (TgPEPCKmt), während das andere Protein nicht in Tachyzoiten (TgPEPCKnet) exprimiert wird. Parasiten mit intakter Glykolyse können die Deletion von TgPEPCKnet, als auch die genetische Deletion von TgPEPCKmt tolerieren, was ihre Redundanz für das Überleben der Tachyzoiten zeigt. TgPEPCKnet kann auch in der Glykolyse-defizienten Mutante deletiert werden, während TgPEPCKmt für das Überleben des Parasiten in dieser Mutante essentiell ist. Dies zeigte sich durch ein konditionelles Knockdown von TgPEPCKmt, das zu einer Inhibierung des Wachstums des Parasiten führte. / Toxoplasma gondii is a widespread protozoan parasite, infecting nearly all warm-blooded organisms. Asexual reproduction of the parasite within its host cells is achieved by consecutive lytic cycles, which necessitates biogenesis of significant energy and biomass. This work shows that glucose and glutamine are the two major physiologically important nutrients used for the synthesis of macromolecules (ATP, nucleic acid, proteins and lipids) in T. gondii, and either of them is sufficient to ensure the parasite survival. The parasite can counteract genetic ablation of its glucose transporter by increasing the flux of glutamine-derived carbon through the TCA cycle and by concurrently activating gluconeogenesis, which guarantee a continued biogenesis of ATP and biomass for host-cell invasion and parasite replication, respectively. Growth defect in the glycolysis-impaired mutant is caused by a compromised synthesis of lipids, which cannot be counterbalanced by glutamine, but can be restored by acetate. Consistently, supplementation of parasite cultures with exogenous acetate can amend the lytic cycle of the glucose transport mutant. Furthermore, this work revealed two discrete phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) enzymes in the parasite, one of which resides in the mitochondrion (TgPEPCKmt), whereas the other protein is not expressed in tachyzoites (TgPEPCKnet). Parasites with an intact glycolysis can tolerate genetic deletions of TgPEPCKmt as well as of TgPEPCKnet, indicating their nonessential roles for the tachyzoite survival. TgPEPCKnet can also be ablated in glycolysis-deficient mutant, whereas TgPEPCKmt is refractory to deletion. In accord, the lytic cycle of a conditional mutant of TgPEPCKmt in the glycolysis-impaired strain was aborted upon induced repression of the mitochondrial isoform, demonstrating its essential role for the glucose-independent survival of tachyzoites.

Die Effektivität und Verträglichkeit von Triclabendazol wurde in einer klinischen Phase 2 Studie untersucht. 81 Patienten (51 weiblich, 30 männlich, Alter 15-81 Jahre) mit chronischer oder latenter Fasciola hepatica Infektion, bei denen mindestens eine antihelminthische Therapie fehlgeschlagen war wurde in die Studie aufgenommen. Die Patienten erhielten 20mg/Kg Triclabendazol in 2 Dosierungen a 10 mg/Kg im Abstand von 12 h postprandial. Der Therapieerfolg wurde durch mikroskopische Stuhluntersuchungen, Bestimmung exkretorisch-sekretorischer Antigene im Stuhl und Ultraschall überprüft. Bei Siebzig (92%) von 76 Patienten konnten in der Nachuntersuchungsperiode (60 Tage) keine Fasciola hepatica-Eier in den mikroskopischen Stuhluntersuchungen nachgewiesen werden. Die häufigsten unerwünschten Wirkungen waren kolikartige Oberbauchbeschwerden, die bei 40 Patienten (49%) zeitgleich mit der Passage der Parasiten durch die Gallengänge beobachtet wurden. Triclabendazol ist eine effektive Therapie für Patienten mit Fasziolose bei denen andere antihelmithische Therapien nicht wirksam sind. / The efficacy and tolerability of triclabendazole (TCZ) was assessed in a clinical phase 2 study. Eighty-one patients (51 female, 30 male, age 15- 81 years) with chronic or latent F. hepatica infection refractory to previous anti-helminthic chemotherapy were enrolled in a 60 day open, non-comparative trial. Patients received 20 mg/kg TCZ as two doses of 10 mg/kg administered after food 12 hr apart. Efficacy of treatment was assessed by stool microscopy, determination of fasciola excretory-secretory antigen in feces, and by ultrasonography. Seventy (92%) of the 76 patients who completed the 60 day follow up period became egg negative. The most important adverse event was colic-like abdominal pain (40 patients [49%]) consistent with the expulsion of the parasite through the bile ducts as confirmed by US on Days 2 - 7. Triclabendazole is an effective therapy for the treatment of F. hepatica infection in patients who have failed to respond to other antihelminthic agents.