Dermatophyten sind keratinophile Pilze, d.h. sie besiedeln und infizieren die Haut und ihre Anhangsgebilde (Haare, Nägel) bei Mensch und Tier. Die derzeit häufigsten durch Dermatophyten hervorgerufenen Infektionen sind die Onychomykose, Tinea pedis, Tinea capitis und Tinea corporis. Da Antimykotika nicht bei alle Erregern von Dermatophytosen gleich wirksam sind, sollte im Vordergrund einer Behandlung zunächst die korrekte Erregerdifferenzierung stehen. Konventionell erfolgt diese Differenzierung über morphologische Merkmale wie Form und Farbe der auf dem Nährmedium gewachsenen Pilzkolonie, charakteristische mikromorphologische Elemente (Konidien) und biochemische Eigenschaften. Diese Merkmale werden jedoch oftmals nicht exprimiert. Damit ist in diesen Fällen keine Speziesdiagnose möglich. Eine zuverlässige Diagnostik sollte zudem das natürliche Klassifizierungssystem direkt reflektieren. Die Studien zur molekularen Biodiversität innerhalb der Dermatophyten sollten deshalb zur Klärung evolutionärer, taxonomischer und populationsgenetischer Zusammenhänge bei den verschiedenen Spezies der Gattungen Arthroderma, Trichophyton, Microsporum und Epidermophyten beitragen und helfen, geeignete DNA-Marker für die Anwendung in der medizinischen Diagnostik zu finden und einzusetzen. Dazu wurden verschiedene Methoden und Zielsequenzen genutzt, wie die Sequezierung der internal transcribed spacer (ITS) Region der ribosomalen DNA, das PCR-Fingerprinting, single strand conformation polymorphism (SSCP) und amplified fragment length polymorphism (AFLP)-Analyse. Es wurden weit über 200 Stämme, die bisher ca. 100 verschiedenen Taxa zuzuordnen waren, analysiert. Die molekularen Studien zeigen, dass die phylogenetisch ältesten Dermatophytenspezies geophil sind und sich die wärmeliebenden, zoophilen Arten erst später durch Koevolution mit warmblütigen Tieren entwickelt haben. Die anthropophilen scheinen dagegen erst mit Entstehung des Menschen evolviert und demzufolge am jüngsten zu sein. Damit kann man ihre geringe Biodiversität und ihr verändertes pathogenetisches Verhalten erklären. Es konnte gezeigt werden, dass die molekularen Phylogenie der Spezies besser mit ihrer Ökologie und dem Krankheitsbild als mit morphologischen Eigenschaften übereinstimmt und dass etliche Dermatophytenspezies überklassifiziert sind. Aus diesem Grunde wurde eine neue Systematik vorgeschlagen. Für den Nachweis des häufigsten Erreger, Trichophyton rubrum wurde eine Gensonde entwickelt, die in der medizinischen Diagnostik einsetzbar ist. / Dermatophytes are keratinophilic fungi which colonise and infect skin, hair and nails of man and animals. The most common infections caused by dermatophytes are onychomycosis, tinea pedis, tinea capitis and tinea corporis. Antimycotics may have different spectra of activity even in related dermatophyte species. Therefore a correct species identification is necessary before onset of antifungal therapy. Conventionally, the identification of dermatophytes is performed by the use of morphological features, such as shape and colour of the colony, micromorphological characteristics (conidia) and biochemical properties. However, these characters may not be expressed and then identification down to the species level is frequently impossible. Reliable diagnostics directly reflects the natural system. Studies of biodiversity in dermatophytes should therefore focus on elucidation of the connection of evolution, taxonomy and population genetics of the species of the genera Arthroderma, Trichophyton, Microsporum and Epidermophyten and thus contribute to development of stable DNA markers to be applied in routine diagnostics. Several methods and targets were applied such as sequencing of the internal transcribed spacer region (ITS) of the ribosomal DNA, PCR fingerprinting, single strand conformation polymor phism (SSCP) and amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis. More than 200 strains belonging to about 100 dermatophyte taxa were analysed. Phylogenetically, the molecular data show the oldest dermatophyte species to be geophilic and subsequently co-evolved as zoophilic dermatophytes with warm blooded animals. In contrast, the anthropophilic dermatophytes are much younger as they evolved in association with humans. This hypothesis is supported by their low biodiversity and changing pathogenicity. The molecular data show correspondence between phylogeny of species and their ecology and clinical picture, rather than with morphological features. Many dermatophyte species were shown to be overclassified. A new systematic system was proposed. For the identification of Trichophyton rubrum, the most common dermatophyte species, an oligonucleotide probe was developed which is applicable in medical routine diagnostics.

Der Austausch von genetischem Material über horizontalen Gentransfer, stellt einen wichtigen Mechanismus in der bakteriellen Evolution dar. Legionella pneumophila Stämme codieren für verschiedene Typ IV Sekretionssysteme (T4SS) und integrative konjugative Elemente, die zur genomischen Variabilität der intrazellulären Erreger beitragen. L. pneumophila Corby codiert auf der genomischen Insel Trb-1 für ein funktionelles Konjugations- und T4ASS. Trb-1 ist innerhalb des tRNAPro Gens integriert und kann in einer chromosomalen oder zirkulären episomalen Form existieren. Zusätzlich zu den trb/tra Genen sind auf der Insel eine Integrase (int-1) und die Gene lvrRABC der Legionella vir Region (lvr) lokalisiert. Durch die Deletion von int-1 konnte gezeigt werden, dass die Exzision von Trb-1 unter Beteiligung der Integrase erfolgt. Zudem wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal demonstriert, dass die lvr-Region, vor allem der putative Phagen-Repressor LvrR an der Regulation der Exzision von Trb-1 beteiligt ist. Die Konjugation von Trb-1 in L. oakridgensis, hatte keinen Effekt auf die in vivo Fitness der Transkonjuganten in humanen Makrophagen. Die genomischen Inseln LpcGI-1 und LpcGI-2 codieren für ein neues putatives GI-T4SS. Für LpcGI-2 konnte erstmals gezeigt werden, dass das T4SS funktionell ist und die Konjugation der genomischen Insel in einen anderen L. pneumophila Stamm vermitteln kann. LpcGI-2 kann anschließend ortsspezifisch in das Genom der Transkonjuganten integriert werden. LpcGI-1 und LpcGI-2 werden vom tRNAThr bzw. tRNAMet Gen flankiert und können in verschiedenen chromosomalen und zirkulären, episomalen Formen existieren. Die Exzision von LpcGI-2 erfolgt ähnlich zu Trb-1, in Abhängigkeit einer ortsspezifischen Integrase. Im Genom von Lp Corby wurden zwei weitere genomische Inseln (LpcGI-Asn und LpcGI-Phe) identifiziert. In silico Analysen zeigten zudem, dass genomische Inseln mit einer Ähnlichkeit zu Trb-1, LpcGI-2 bzw. LpcGI-1 im Genus Legionella verbreitet sind. / Exchange of genetic information by horizontal gene transfer is an important mechanism for the evolution of bacterial genomes. Legionella pneumophila strains encode different type IV secretion systems and integrative conjugative elements contribute to the variability of the intracellular pathogen. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby encodes a functional conjugation and T4ASS. Trb-1 is integrated within the tRNAPro gene and can exist in a chromosomal or an episomal circular form. In addition to the trb/tra genes, a site-specific integrase (int-1) and a Legionella vir region (lvrRABC) are also localized on the genomic island. By deleting the int-1 gene, it could be demonstrated that the excision and of Trb-1 is integrase dependent. Furthermore, in this work it was shown for the first time that the lvr region and especially the putative phage repressor LvrR, is involved in the regulation of Trb-1 excision. Conjugation of Trb-1 in L. oakridgensis does not influence the in vivo fitness of the transconjugants in human macrophages. The genomic islands LpcGI-1 and LpcGI-2 encode a new putative T4SS. For the first time it could be demonstrated, that the T4SS localized on LpcGI-2 is functional. Although LpcGI-2 could be mobilized and transferred via conjugation to another L. pneumophila strain, followed by the site-specific integration into the genome of the transconjugants. LpcGI-1 and LpcGI-2 are flanked by the tRNAThr or tRNAMet gene respectively. Both islands can exist in different chromosomal and episomal forms. The excision of LpcGI-2 occurs similar to Trb-1 in an integrase dependent manner. Two additional genomic islands (LpcGI-Asn and LpcGI-Phe) could be identified in the genome of Lp Corby. Moreover, data of the in silico analysis demonstrated, that genomic islands similar to Trb-1, LpcGI-2 and LpcGI-1 are distributed within the genus Legionella.

In dieser Arbeit wurden zwei serologische Teste zur Unterscheidung inzidenter und prävalenter Proben etabliert und validiert, welche auf der Reifung des Immunsystems in der frühen HIV-Infektion basieren. Im BED-ELISA werden anhand von anti-HIV-gp41-spezifischen IgG-Antikörperspiegeln die Proben klassifiziert. Die Aviditäts-Methode (AI) unterscheidet die Bindungsfähigkeit der Antikörper an spezifische Antigene. Das Probenpanel wurde in einem weiteren Inzidenztest, dem IDE-V3-ELISA (Kooperation F. Barin), gemessen welcher den Anstieg der Antikörperreaktivität gegen zwei verschiedene immundominante Epitope nutzt. Wirtsspezifische Marker und virale Eigenschaften wurden untersucht, um Merkmale zu identifizieren, welche die Sensitivität und Spezifität der Teste verbessern könnten. Mit dem BED-ELISA wurde eine Pilotstudie unter Berliner HIV-Patienten durchgeführt. Zur Vereinfachung des Probentransports in Studien wurde der Einfluss einer Filtertrocknung der Plasmaproben auf die Infektiosität von HIV, Stabilität der HIV-RNA und die Antikörperreaktivität im BED-ELISA untersucht. In den Testen wurden inzidente Plasmaproben mit folgenden Sensitivitäten und Spezifitäten richtig klassifiziert: 80% und 86% (BED-ELISA); 74% und 82% (AI); 73% und 84% (IDE-V3). Von allen untersuchten wirtsspezifischen Faktoren korrelierte nur der Gehalt an Antikörpern der IgG3-Subklasse mit der Fehlklassifikation der Proben. Für die Pilotstudie wurden zwischen Feb. 2005 und Nov. 2007 von 132 erstmalig HIV-1 positiv diagnostizierten Patienten Proben genommen und im BED-ELISA analysiert (51% Anteil inzidente Infektionen). Die Antikörperreaktivitäten blieben nach der Filtertrocknung erhalten, so das auf der Grundlage der Ergebnisse eine deutschlandweite Inzidenzstudie mit Filter-getrockneten Plasmaproben geplant wurde, die seit Januar 2008 im Auftrag des BMG zur Verbesserung der Datenlage zur HIV-Inzidenz in Deutschland durchgeführt wird. / In this PhD thesis two methods that can differentiate between incident and prevalent infections were established and validated. Both tests are based on the maturation of the immune system during early HIV-infection. The BED-ELISA uses anti-HIV-gp41 specific IgG-antibody levels for differentiation. The avidity method (AI) is based on the binding-capacity of the antibodies to specific antigens in the presence of a chaotropic agent. The sample panel was also evaluated using an additional incidence ELISA, the IDE-V3-ELISA (cooperation with F. Barin). This test is also based on the antibody''s reactivity to two different immune dominant epitopes, allowing incident and prevalent infections to be differentiated. Host specific factors and viral determinants were analysed to provide information that could lead to improvements in the sensitivity and specificity of the incidence tests. With the BED-ELISA a pilot study with HIV-infected patients in Berlin was carried out. The inactivation of HIV-1 after filter-drying of samples, the stability of viral RNA and reactivity of antibodies in the BED-ELISA were analysed to simplify the transport of samples in future studies. Incident plasma samples were identified correctly with following sensitivities and specificity’s: 80% and 86% (BED-ELISA); 74% and 82% (AI); 73% and 84% (IDE-V3). Of all host factors analysed, only the titre of IgG3-antibodies correlated with the incorrect classification of samples. In the pilot study samples from 132 newly diagnosed HIV-positive patients were obtained between February 2005 and November 2007 and analysed in the BED-ELISA (51% proportion of incident infections). It could be shown that filter-drying of plasma samples rendered HIV non-infectious but did not influence antibody reactivity. Based on these results, a German HIV incidence study using filter-dried plasma samples, designed to improve knowledge of HIV-incidence in Germany, was sponsored by the BMG and has been ongoing since January 2008.

Bacillus amyloliquenaciense FZB42 ist ein bekanntes Pflanzenwachstum-stimulierendes Rhizobakterium. Es produziert neben einer Vielzahl an Sekundärmetaboliten mit antibakterieller und antifungaler Wirkung, auch das Pflanzenhormon IAA. Obwohl viele dieser Mechanismen diskutiert werden, ist wenig darüber bekannt, auf welche Weise die Bakterien das Pflanzenwachstum fördern. In dieser Arbeit wurde eine Transposonmutagenese mithilfe des ‘mariner-transposons’ durchgeführt, und so eine Transposonbibliothek erstellt. Diese wurde dann auf geeignete Phänotypen untersucht, um die Gene zu finden, welche bestimmte Phänotypen verursachen. So konnten drei Mutanten erzeugt werden, die auf Grund der gestörten Biofilmbildung und der Fähigkeit zu schwärmen die Pflanzenwurzeln nicht mehr kolonialisieren konnten. Eine solche degU-Mutante, welche in der Biofilmbildung und ‚Swarming’ defizitär war und zwei Mutanten (yusV und pabB), die eine Beeinträchtigung in der Biofilmbildung aufwiesen, konnten durch Komplementation und Retransformation bestätigt werden. Mithilfe des Lemna-Biosystems und anderer Analysen mit A. thaliana konnten drei Gene bei B. amyloliqufaciens FZB42 gefunden werden, die wichtig für die Förderung des Pflanzenwachstums sind. Koloniesierungsexperimente der Wurzeln von A. thaliana mit diesen Mutanten zeigten deutlich verändertes Wachstum, verglichen mit dem Wildtypstamm. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es neue Antibiotika in Mutanten, die in ihren nicht-ribosomalen Synthesen blockiert sind, zu finden. So konnten durch die Untersuchungen der Transposonbibliothek der Mutanten zwei neue Antibiotika entdeckt werden. Genauere Analysen dieser Antibiotika bestätigten, dass es sich um ein neues Bacteriocin (Amylocyclicin A) und ein neues Thiazol/Oxazole-modifiziertes Microcin (Plantazolicin) handelt. Die abschließenden Arbeiten beschäftigten sich dann mit Untersuchungen von Genen, welche für die Produktion von Substanzen gegen Nematoden verantwortlich sind. Hierbei konnten vier Mutanten gefunden werden, die durch eine Transposoninsertion eine schlechtere. / Bacillus amyloliqufaciens FZB42 has been known as PGPR which has an impressive effect to improve plant growth. It produces not only vast array of secondary metabolites with antibacterial and antifungal activities, but also produces the plant hormone IAA. Although many mechanisms have been elucidated, our knowledge about basic molecular mechanisms responsible for its beneficial action is far from complete. In this study, transposon mutagenesis based on mariner tranposon was applied to generate tranposon library which then was screened to identify the genes involved in plant growth-promoting activity. Three mutants that were impaired in their ability to colonize plant surface due to defects in biofilm formation and swarming motility were found. One mutant (degU mutant) showed defect in biofilm formation and swarming motility, as well, two mutants (yusV mutant and pabB mutant) impaired in biofilm formation were confirmed by complementation and retransformation. Screening by the Lemna biosystem and further assays with A. thaliana revealed three genes responsible for reduction in plant growth promoting activity of B. amyloliqufaciens FZB42. Colonization studies of these mutants in A. thaliana roots revealed patterns different to the wild type. A further issue pursued in this study was to discover new antibiotics using a mutant which has been blocked in its nonribosomally pathway. Screening of tranposon librabries from this mutant led to the finding of two novel ribosomally synthesized antibiotics. Further characterization revealed that these new antibiotics belonged to a novel bacteriocin (Amylocyclicin A) and a novel thiazole/oxazole-modified microcin (Plantazolicin). Last work in this study was looking for genes responsible for nematocidal production. Four mutants which showed reduction in nematocidal activity due to transposon insertion were found.

Neisseria gonorrhoeae verursacht die sexuell übertragbare Krankheit Gonorrhoe und ist ein Typ-IV-Pili (Tfp) exprimierendes Bakterium, das den Urogenitaltrakt besiedelt. Frühe Infektionsstadien piliierter N. gonorrhoeae (P+GC) sind durch die Tfp-vermittelte Adhärenz an Wirtszellen gekennzeichnet, dann erfolgt die Bildung von Mikrokolonien auf Wirtszellepithelien. Hier wird gezeigt, dass die Wirtszellen an der effizienten Bildung der extrazellulären Mikrokolonien beteiligt sind. P+GC die fixierte Wirtszellen infizieren weisen eine verzögerte Mikrokoloniebildung gegenüber einer Infektion lebender Wirtszellen auf. Kortikales Aktin wird zusammen mit Signalproteinen innerhalb der Wirtszellen zu den adhärierten Bakterien rekrutiert, darunter das Hauptstrukturprotein von Caveolae-Membrandomänen, Caveolin-1 (Cav1). Eine Reduzierung der Expression von Cav1 führt zu einer verstärkten Aufnahme von P+GC in die Wirtszellen, wohingegen die Expression von Cav1 in Cav1-negativen Zellen eine Internalisierung verhindert. Internalisierte Bakterien weisen dabei geringere Überlebensraten auf je länger sie in den Wirtszellen verbleiben. Die Rekrutierung von Cav1 ist eine unmittelbare und kontinuierliche zelluläre Antwort auf eine Infektion mit P+GC, welche die Phosphorylierung von Cav1 an Tyrosin 14 bedingt. Zusätzlich erforderte die Cav1-vermittelte Blockierung der Internalisierung der Bakterien und die Verankerung von Cav1 mit dem Zytoskelett eine Tyrosinphosphorylierung von Cav1. Eine Analyse möglicher Interaktionspartner von phosphoryliertem Cav1 zeigte eine direkte Interaktion mit Vav2. Sowohl Vav2 als auch sein Substrat, die kleine GTPase RhoA, blockieren die Aufnahme von Bakterien in die in Wirtszellen. Die Aktivierung von RhoA nach P+GC Infektion erfordert die Expression von Cav1, was auf einen Cav1-Vav2-RhoA Signalweg hindeutet. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit sechs neue, eine SH2-Domäne-beinhaltende Interaktionspartner von phosphoryliertem Cav1 identifiziert. / Neisseria gonorrhoeae causes the sexually transmitted disease gonorrhea and colonizes mucosal epithelia of the human urogenital tract. The early stages of infection with piliated N. gonorrhoeae (P+GC) are characterized by Tfp-mediated adherence to host cells, followed by formation of bacterial microcolonies on the surface of host cells. This study provides evidence that host cell participation is required for the efficient formation of extracellular microcolonies during Neisseria infection. P+GC infecting fixed host cells demonstrate altered motility and delayed microcolony formation compared to infecting living host cells. Cortical actin and various signal transducing proteins are recruited to the site of bacterial attachment within host cells, one of them being the major structural protein of plasma membrane caveolae, Caveolin-1 (Cav1). Down-regulation of Cav1 results in increased uptake of P+GC into host cells whereas expression of the protein in Cav1-negative cells blocks bacterial internalization. Host cell entry results in decreased viability of internalized bacteria over time. Cav1 recruitment is demonstrated to be an immediate and continuous cellular response to P+GC infection that involves Cav1 phosphorylation on its tyrosine 14 residue. Prevention of bacterial uptake mediated by Cav1 as well as tight association of Cav1 with the cytoskeleton also requires tyrosine phosphorylation. A broad analysis of interaction partners of phosphorylated Cav1 revealed a direct interaction with the Rho-family guanine nucleotide exchange factor Vav2. Both Vav2 and its substrate, the small GTPase RhoA, are involved in preventing bacterial uptake and RhoA activation after P+GC infection requires Cav1 expression, thus providing evidence for a Cav1-Vav2-RhoA signaling cascade. Moreover, six novel SH2-domain containing interaction partners of tyrosine phosphorylated Cav1 have been identified, all of which have been implicated in modulating the cytoskeleton.

Neuartige Vakzinierungsstrategien zur Aktivierung einer Tumor-spezifischen zellulären Immunantwort sind vielversprechende Ansätze zur Therapie von Tumoren, insbesondere Human Papillomvirus (HPV)-assoziierte Tumore. Bisherige HPV-Impfstudien zeigen zwar die Aktivierung einer spezifischen zellulären Immunantwort, eine Tumorreduktion bleibt jedoch aus. Um diesen Effekt auf Immunzellebene zu definieren, wurde die Wirkung der HPV-Vakzine Ad p14 im Mausmodell und an Untersuchungsmaterial humaner Tumore analysiert. In Mäusen bildeten sich HPV+ TC1-Tumore einer frühen Entwicklungsphase nach Vakzinierung zurück. Tumore einer späten Entwicklungsphase wuchsen dagegen in zwei Intervallen aus. Immunologische Eigenschaften der Tumorzellen blieben dabei unverändert. Unterschiede zeigten sich in den Frequenzen Tumor-infiltrierender Lymphozyten; in progressiven Phasen wurden nur CD4+ T Zellen nachgewiesen, in Regressionsphasen zusätzlich zytotoxische CD8+ T Zellen. Immunmodulatoren, wie Interferon alpha oder DTA-1, einem Antikörper für den Glucocorticoid-induzierten Tumornekrosefaktor-Rezeptor, unterstützten die Wirkung der Vakzine; letzterer erhöhte die Anzahl zytotoxischer CD8+ T Zellen und führte zur Abstoßung der TC1-Tumore. HPV+ Tumorgewebe des Menschen, wie auch ihre Vorstufen, zeigten im Vergleich zu anderen Tumoren, wie Bronchial oder Kolonkarzinomen einen signifikant höheren Anteil an CD4+ und CD8+ T Zellen und an Forkhead Box P3+ regulatorischen T Zellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die immunologischen Abläufe bei der Entwicklung HPV-assoziierter Tumore mit denen vorangeschrittener chronischer Erkrankungen vergleichbar sind, in denen sich CD4+ und CD8+ T Zellantworten erschöpfen während sich gleichzeitig immunsuppressive Mechanismen verstärken. Um die Entwicklung von Impfstoffen zur Therapie HPV-assoziierter Tumore zu verbessern sollten diese Mechanismen ausführlicher betrachtet werden. / Novel vaccination strategies, activating cellular tumour specific immune responses represent a promising approach for the treatment of cancer. Especially featured for these treatments are tumours evolving from chronic human papillomavirus (HPV) infections. But current strategies have not yet proved efficacious for complete tumour regression. Addressing cellular immunological aspects of tumour vaccination, this work focused on effects of HPV vaccine Ad p14 in mice and in samples of human tumours. In mice vaccination resulted in complete regression of early stage murine HPV+ TC1 tumours. Late stage TC1 tumours increased discontinuously. During that process, TC1 cells preserved their immunological characteristics. But frequencies of tumour-infiltrating lymphocytes varied; in progressing tumours only CD4+ T cells occurred, in temporary regressing tumours also CD8+ T cells were detected. Immune modulators, like interferon alpha or glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor targeting antibody DTA-1 aggravated the effects of vaccination; latter raised cytotoxic CD8+ T cell numbers and resulted in complete tumour regression. Human HPV+ tumours as well as HPV+ precancerous stages revealed numbers of CD4+ and CD8+ T cells and especially of forkhead box P3+ regulatory T cells that were significantly increased compared to melanoma, bronchial or colon carcinoma. To assist further analysis of human HPV-associated cervical cancer and facilitate studies on therapeutic approaches, a humanized mouse model was established. The present work points to immunological exhaustion in the development of HPV-related tumours comparable to chronic diseases where CD4+ and CD8+ T cells exhaust and immunosuppression by regulatory T cells increases at the same time. For the development of appropriate strategies to enhance efficacy in HPV-associated tumour therapy, further knowledge of mechanisms involved in specific T cell activation, T cell exhaustion and immunosuppression is necessary.

Endotoxin-tolerante Zellen zeigen über mehrere Tage eine verminderte Produktion pro-inflammatorischer Zytokine, sodass epigenetische Veränderungen ein Grund für die Endotoxintoleranz sein könnte. Im 1. Teil wurden epigenetische Veränderungen an gezielten LPS-tolerisierbaren Genen mithilfe eines in-vitro-Modells mit humanen Monozyten untersucht. Die Gene kodierend für TNF und CXCL10 zeigten eine Reduktion der transkriptionsaktivierenden Histonmarker H3K27ac und H4ac, die durch eine stark reduzierte Genexpression in toleranten Monozyten begleitet wurde. Demgegenüber wiesen Gene wie IL6 und IL1B eine Zunahme an H4ac und H3K27ac auf, während ihre Genexpression in widersprüchlicher Weise reduziert war. Repressive epigenetische Marker (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA-Methylierung) konnten in den untersuchten Genen nicht nachgewiesen werden. Zudem war die IL6-Genexpression verstärkt abhängig von der Signaltransduktion toleranter Monozyten, was auf unterschiedliche Repressionsmechanismen schließen lässt. Im 2. Teil konnte gezeigt werden, dass die genomweite transkriptionelle Reprogrammierung durch eine globale Verschiebung von aktiven H3K27ac und H4ac in naiven Monozyten zu repressiven H3K9me2, H3K27me3 und H4K20me3 in toleranten, restimulierten Zellen einherging. Mehr als 10000 Genombereiche wiesen Veränderungen an Histonmarkern auf, obwohl nur 3638 Gene unterschiedlich exprimiert waren. Circa 27% der differentiell exprimierten Gene zeigten ein Expressionsmuster, welches mit Veränderungen an aktiven und/oder repressiven Markern innerhalb der Promoterregion korrelierte. Zudem zeigten intergenische Regionen einen verstärkten Anstieg an repressiven Histonmarkern, was auf eine mögliche regulatorische Funktion dieser Bereiche in der Endotoxintoleranz schließen lässt. Die Studie zeigt, dass die Epigenetik der Monozyten stark von der Endotoxintoleranzinduktion betroffen ist, wenn auch nicht alle Veränderungen dem beobachteten Genexpressionsmuster zugeordnet werden konnten. / Endotoxin-tolerant cells show a reduced ability to produce pro-inflammatory cytokines for several days, which assumes an impact of epigenetic changes in endotoxin tolerance induction. Using an in vitro model with human monocytes, the first part focused on the analysis of epigenetic changes in specific LPS-tolerizable genes. The genes encoding for TNF and CXCL10 showed a reduction in the transcription-activating histone marks H3K27ac and H4ac in tolerant monocytes, which was accompanied by a strongly reduced gene expression. In contrast, the IL6 and IL1B genes showed an increase in activating histone modifications, while their gene expressions were moderately reduced. Repressive epigenetic marks (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA methylation) were not specifically enhanced in the genes studied. Particularly the IL6 gene expression was more susceptible to the signaling strength in tolerant monocytes implying distinct mechanisms in the repression of the genes analyzed. Within the second part, genome-wide reprogramming of tolerant monocytes was accompanied by a global shift from activating H3K27ac and H4ac in naive monocytes to repressive H3K9me2, H3K27me3 and H4K20me3 in tolerant cells treated with LPS. More than 10000 genomic regions were distinctly regulated by histone marks, though only 3638 genes were differentially expressed. Correlation analyses identified 27 % of the differentially expressed genes that showed a transcriptional level consistent with changes in activating and/or repressive histone marks within their promoter regions. Intergenic regions were highly enriched for repressive histone marks in LPS-tolerant monocytes implying a regulatory function in endotoxin tolerance. The data indicate that the epigenetic environment of monocytes is highly affected by endotoxin tolerance induction, though not all changes are directly linked to the gene expression pattern observed.

Die Transplantation von porzinen Organen könnte eine Lösung des akuten Mangels von Allotransplantaten in der Transplantationsmedizin darstellen. Bevor die Xenotransplantation klinische Realität werden kann, sind jedoch zahlreiche Hürden zu überwinden. Insbesondere die mögliche Übertragung porziner endogener Retroviren (PERVs), die integraler Bestandteil des porzinen Genoms sind, stellt ein mikrobiologisches Risiko dar. PERVs können humane Zellen in vitro produktiv infizieren. Mögliche Strategien zur Abwehr von Xenosen sind die Verwendung von PERV-knockout Tieren oder die Entwicklung eines effektiven Impfstoffes, durch den der Transplantatrezipient vor einer möglichen Übertragung geschützt werden kann. Dazu wurden Antiseren gegen die Hauptstrukturproteine von PERV generiert. Es konnte gezeigt werden, dass in Ziegen und Ratten durch Immunisierung mit der rekombinant generiereten Ektodomäne des transmembranen Hüllprotein p15E neutralisierende Antikörper induziert werden konnten. Die Epitopkartierung der induzierten Antikörper zeigt eine Bindung an eine Domäne im N-terminalen, nahe des Fusionspeptids (E1, GPQQLEK) und eine Domäne im C-terminalen, membranproximalen (E2, FEGWFN) Bereich der p15E-Ektodomäne. Diese Sequenzen sind in allen PERVs identisch und innerhalb der Gammaretroviren hochkonserviert. Aus AIDS-Patienten isolierte neutralisierende Antikörper (mAb2F5: ELDKWA, mAb4E10: LWNWFN) binden ebenfalls an den C-terminalen Bereich der Ektodomäne des Transmembranproteins gp41. Der Bindungsmechannismus dieser Antikörper wurde in ELISA-Experimenten und in vitro-Inhibitionsassays analysiert. Die Ergebnisse legen die Bindung eines Konformationsepitopes nahe, das aus der E1 und der E2 Domäne gebildet wird. Die Aufklärung des Bindungsmechnismus breit neutralisierender Antikörper gegen Transmembranproteine von Retroviren könnte die Basis für neue Impfstoffansätze darstellen. / Porcine xenotransplants may offer a potential solution to the problem posed by the limited supply of allotransplants. However, xenotransplantation may be associated with the risk of transmission of microorganisms, in particular of porcine endogenous retroviruses (PERVs) that are an integral part of the porcine genome and able to infect human cells in vitro. Possible strategies to prevent virus transmission include the development of PERV knockout animals or of effective vaccines. When antisera prepared against the main structural proteins of PERV were screened, goat and rat antisera against the recombinant ectodomain of the transmembrane envelope protein p15E were found to neutralize PERV infectivity. Epitope mapping using overlapping peptides revealed two epitopes, one near the fusion peptide (E1, GPQQLEK) and the other near the transmembrane domain (E2, FEGWFN). These sequences are identical for all PERVs and are highly conserved among all gammaretroviruses. Interestingly, neutralizing antibodies isolated from AIDS patients that recognize regions partially homologous with E2 (mAb4E10, LWNWFN) or located in close proximity to E2 (mAb2F5, ELDKWA) are known to neutralize a broad range of HIV-1 strains. The binding mechanisms of these HIV neutralizing antibodies were analyzed in ELISA experiments and in vitro inhibition assays. The results indicate that the two most broadly reactive HIV-1 envelope gp41 human mAbs are specific for a discontinuous epitope composed of the E1 and the E2 domain. If so, these two transmembrane protein domains in different retroviruses act as effective targets for neutralizing antibodies and may provide the basis for effective antiretroviral vaccines.

Infektionen mit dem intestinalen Parasiten Giardia duodenalis, verursachen weltweit eine der häufigsten humanen Parasitosen. Bislang konnten keine eindeutigen Virulenz- oder Pathogenitätsmarker des Erregers beschrieben werden. Es wird allerdings vermutet, dass potentielle G. duodenalis Virulenzfaktoren Enzyme sind, die während des Kontaktes des Erregers mit den Dünndarmepithelzellen sezerniert werden. Eines dieser Enzyme ist die Arginin Deiminase (ADI), die Arginin zu Citrullin umwandelt. Ziel dieser Arbeit war es Merkmale zu identifizieren, die für die ADI als Virulenzfaktor sprechen. Dazu wurde das Enzym zunächst hinsichtlich seiner Bedeutung für die Wirt-Pathogen-Interaktion untersucht. Die mit rekombinanter, katalytisch aktiver ADI (Assemblage A) behandelten LPS-stimulierten humanen moDC zeigten eine Veränderung in ihrem Phänotyp als auch in ihrer Cytokinsekretion. Diese ließ sich auf die durch das Enzym hervorgerufene Arginindepletion und/oder auf die Bildung der Metabolite, Citrullin und NH4+, zurückführen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Parasitenisolate verschiedener G. duodenalis Assemblage A-Subtypen, vermutlich durch die katalytische Aktivität der ADI, die Stickstoffmonoxid-Bildung einer intestinalen Epithelzelllinie inhibiert. Neben dem Einfluss auf die Wirtsimmunantwort wurde auch die Variabilität in der kodierenden Sequenz des Enzyms in verschiedenen Parasitenisolaten analysiert. Anschließend erfolgte die funktionelle Charakterisierung des nativen (verschiedene Assemblage A-Subtypen) als auch des rekombinant aufgereinigten Enzyms (Assemblage A, B und E). Dabei zeigten sich Unterschiede in der Substrataffinität der ADI für Arginin, sowohl zwischen unterschiedlichen Assemblage A-Subtypen als auch unterschiedlichen Assemblage-Klassen. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die G. duodenalis ADI immunmodulatorische Effekte hat und das vermutlich eine Korrelation zwischen der Variation in der Primärstruktur und der Funktion des Enzyms besteht. / Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite that causes giardiasis, one of the most prevalent parasitic diseases worldwide. So far, little is known concerning host-parasite interaction, in particular what determines the parasite’s pathogenicity. Several potential virulence factors, among them the arginine deiminase (ADI) that hydrolyzes arginine into citrulline and NH4+, are discussed. The ADI was identified to be released upon contact with intestinal epithelium by Giardia trophozoites and was recognized as an immunoreactive protein during acute human giardiasis. Aim of the study was to identify hints for G. duodenalis ADI to be a virulence factor. First, to analyze the enzyme’s impact on host-parasite interplay, its influence on human monocyte-derived dendritic cells (moDC) was investigated. Treatment of LPS-stimulated cells with recombinant ADI of assemblage A changed DC phenotype (CD83, CD86) and cytokine secretion (TNF-α, IL-10, IL-12p40). These immunomodulatory changes in DC response were due to arginine depletion and the formation of reaction products, in particular, ammonium ions. Furthermore, trophozoites of different assemblage subtypes were shown, probably due to consumption of arginine by ADI, to reduce nitric oxide formation by intestinal epithelial cells in vitro. Second, variation in the ADI coding sequence of different G. duodenalis isolates being collected in a Giardia biobank was analyzed by sequencing. Subsequently, functional genetics were performed with native ADI of different assemblage A subtypes expressed by these strains as well as with purified, recombinant ADI of assemblage A, B and E. It was recognized that enzymes of the same subtype as well as of different assemblages types had different substrate affinities for arginine. To sum up, this report identified G. duodenalis ADI to be immunomodulatory and gives first indications of a correlation between enzyme function and variation of the protein primary structure.

Einige Patienten mit Raynaud-Syndrom, Urtikaria, koronarer Herzkrankheit, Angina pectoris, oder Pulmonaler Hypertonie haben funktionelle Autoantikörper gegen die Thrombin-Rezeptoren PAR1/2 und/oder gegen den Endothelin-Rezeptor ET(A). In dieser Arbeit wurde die Wirkung solcher Patienten-IgG-Präparate auf Funktionen von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten; humanen, glatten Muskelzellen aus Coronararterien (hCASMC), frisch isolierten, humanen Thrombozyten sowie von Monozyten untersucht. Zum Vergleich wurden die PAR-Agonisten Thrombin und das stimulierende Peptid SFLLRN sowie Endothelin-1 verwendet. Während aufgereinigte ET(A)-Autoantikörper ERK1/2 in Kardiomyozyten nicht aktivierten, bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern hier eine ähnliche Aktivierung wie das Peptid SFLLRN. Überraschenderweise bewirkte Kontroll-IgG eine starke Aktivierung von ERK1/2. Die Coinkubation der Kardiomyozyten mit Antikörper-Präparaten und IL-1beta erhöhte die Phosphorylierung von ERK1/2 in allen Fällen. In hCASMCs bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern und Kontroll-IgGs eine Aktivierung von ERK1/2, ET(A)-Autoantikörper nicht. Die Ergebnisse der Thrombozytenaktivierung durch Patienten-IgG waren unterschiedlich. Versuche mit vorstimulierten Thrombozyten zeigten, dass ein stimulierender Einfluss der Autoantikörper auf präaktivierte Thrombozyten nicht ausgeschlossen werden kann. Ohne Vorstimulation jedoch schien Patienten-IgG eher einen hemmenden Einfluss auf die Thrombozytenfunktion zu haben. Eine Vorinkubation von Monozyten mit Patienten-IgG hatte keinen Einfluss auf die PMA-induzierte Produktion von Superoxidanion im Vergleich zu Kontroll-IgG. Nur bei zwei von fünf Patienten-IgGs konnte eine stimulierende Wirkung anhand der monozytären ERK1/2-Phosphorylierung gefunden werden. Die Schlussfolgerung aus dieser Arbeit liegt darin, dass PAR1/2- und ET(A)-Autoantikörper keine allgemeine Wirkung auf die Funktion von glatten Gefäßmuskelzellen, Thrombozyten und Monozyten zeigten. Die Unterscheidung von Autoantikörper-positiven und -negativen IgG-Präparaten war nur über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten möglich. / Some patients with Raynaud’s syndrome, urticaria, coronary artery disease, Angina or pulmonary hypertension have functional autoantibodies against thrombin receptors PAR1/2 and/or against endothelin receptor ET(A). In this work the effects of such patients’ IgG preparations on functions of ventricular cardiomyocytes of neonatal rats, human smooth muscle cells from coronary arteries (hCASMC); freshly isolated, human platelets as well as monocytes were investigated. For comparison, the PAR agonists thrombin and the stimulating peptide SFLLRN as well as endothelin-1 were used. While purified autoantibodies against ET(A) did not activate ERK1/2 in cardiomyocytes, IgG preparations with autoantibodies against PAR1/2 resulted in a similar activation as the peptide SFLLRN. Surprisingly, control IgG also caused a strong activation of ERK1/2. Coincubation of cardiomyocytes with antibody preparations and IL-1beta increased the phosphorylation of ERK1/2 in all cases. In hCASMCs, IgG preparations with PAR-autoantibodies and control IgGs caused activation of ERK1/2, whereas ET(A)-autoantibodies did not. The results of platelet activation with patients’ IgG were varying. Tests with prestimulated platelets showed, that a stimulating effect of the autoantibodies on preactivated platelets can not be excluded. However, without prestimulation patients’ IgG rather seemed to have an inhibiting effect on platelet function. Preincubation of monocytes with patients’ IgG had no influence on PMA-induced production of superoxide anion compared with control IgG. Only two of five patients’ IgGs showed a stimulating effect on monocytic ERK1/2 phosphorylation. In conclusion, PAR1/2- and ET(A)-autoantibodies showed no common effects on the function of vascular smooth muscle cells, platelets and monocytes. The differentiation of autoantibody-positive and -negative preparations of IgG only was possible by determining the beating rate of cardiomyocytes.