Infektionen mit H. pylori führen zu Veränderungen im Aufbau und der zellulären Zusammensetzung des Magenepithels. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass Stromazellen, die sich in unmittelbarer Nähe der epithelialen Stammzelle befinden, die funktionelle Nische für dieses Kompartiment bilden und wichtige Faktoren für die Regulierung des Stammzellumsatzes und Differenzierung darstellen. Daher konzentriere ich mich bei dieser Arbeit auf die Rolle der Myh11+ Myofibroblasten, die sich sowohl unter als auch zwischen den Epitheldrüsenzellen befinden. Ich fand heraus, dass die Myofibroblasten in der Homöostase einen BMP-Gradienten entlang der Drüsenachse mit erhöhter Expression von Bmp2 im oberen Teil erzeugen, während die Drüsenbasis von Zellen umgeben ist, die Bmp-Inhibitoren produzieren. Basierend auf der Funktionsanalyse mit 3D-Organoidmodellen ist der Bmp-Signalweg ein zentraler Faktor für die rasche Differenzierung von Stammzellen in faveoläre mukusproduzierende Zellen. Darüber hinaus wurde ein auto-parakriner Signalweg gefunden, der zur Bildung von Bmp2 in Epithelzellen führt. Meine Untersuchungen Daten zeigten eine Verringerung des BMP-Signalwegs in H. pylori-infizierten Myofibroblasten. Darüber hinaus führte eine Infektion mit H. pylori nicht nur zum Verlust der stromalen, sondern auch der epithelialen Bmp2-Expression. Diese Beobachtung ging mit einer Zunahme von IFNγ einher, was auf eine Verbindung zwischen beiden Signalwegen hinwies. Tatsächlich zeigten anschließende Experimente mit Organoiden, dass IFNγ den Bmp-Signalweg hemmt und dadurch die terminale Differenzierung blockiert. Zusammenfassend zeigen meine Untersuchungen, dass das Schicksal einer Zelle, die zur Oberfläche der Magendrüse wandert, eine Induktion des BMP-Signalwegs erfährt. Die Reduktion dieses Signals durch IFNγ deutet auf einen Mechanismus hin, der Veränderungen in der zellulären Differenzierung und die Entwicklung von prämalignen epithelialen Läsionen im Verlauf einer H. pylori-Infektion bewirkt. / Infection with Helicobacter pylori (H. pylori) leads to alterations of the topology and cellular composition of the gastric epithelium. Recent studies have shown that stromal cells located in close proximity to the epithelial stem cell are creating the niche for this compartment and provide crucial factors that regulate stem cell turnover and fate decisions. Therefore, this thesis focuses on of Myh11+ myofibroblasts that are located beneath and between the epithelial gland cells. I found that during homeostasis, the myofibroblasts generate a BMP gradient along the gland axis with strong expression of Bmp2 in the upper part, whereas the base is surrounded by cells producing BMP inhibitors. Based on functional analysis with 3D organoid models, the BMP gradient occurs to be a main factor responsible for rapid differentiation of stem cells into pit surface mucous cells. Moreover, experiments led me to identify an auto-paracrine feed-forward BMP2 loop in epithelial cells, which further stabilizes BMP signaling once it is activated and induces terminal differentiation. Data presented in this study demonstrated a reduction of BMP signaling in H. pylori-infected myofibroblasts. Furthermore, infection with H. pylori resulted in loss of not only stromal, but also epithelial Bmp2 expression. This observation was accompanied with increase of Interferon γ (IFNγ), which indicated a link between both pathways. Consistently, stimulation of organoids with IFNγ impairs BMP signaling and the BMP2 feed-forward loop, and thereby blocks terminal differentiation. Together, this study shows that the fate of a cell migrating into the surface of the gastric gland is determined by an induction of BMP signaling and stabilized by an auto-paracrine BMP signaling enhancement. Reduction of this signaling by IFNγ revealed a mechanism which contributes to altered cellular differentiation and development of premalignant epithelial alterations in the context of H. pylori infection.

Der Eintritt von Influenza A Viren in Wirtszellen erfolgt anhand des Hämagglutinin (HA) Proteins. Neueste Entwicklungen zielen darauf ab, die fusionsinduzierende Konformations-änderung des HA und damit die Freisetzung des viralen Genoms in die Wirtszelle zu inhibieren. Der Fusionsprozess ist pH-abhängig da nur bei einem niedrigen pH-Wert (~5.0-6.0) die Protonierung bestimmter Reste innerhalb des HA eine Konformationsänderung, und somit die Membranfusion, auslöst. Die Identifizierung von konservierten, titrierbaren Resten und die Aufklärung der Strukturveränderungen im HA ermöglichen eine gezielte Entwicklung neuer antiviraler Medikamente. In dieser Arbeit wurden bestimmte Histidine im HA mittels umfassender experimenteller und theoretischer Methoden als potentielle pH-Sensoren untersucht. Dabei konnte das Histidin an Position 184 als wichtiger Schalter der pH-induzierten Konformationsänderung identifiziert werden. Außerdem bewirkte der Austausch des geladenen Rests an Position 216 in der Nähe des His184 eine Veränderung der pH-Abhängigkeit des H5 HA aufgrund der Beeinflussung des pKa-Werts des His184. Da die Mutation R216E im HA des hochpathogenen H5N1 Virus in allen Isolaten während der Vogelvirenseuche im Jahr 2003/04 detektiert wurde, deutet das Ergebnis daraufhin, dass diese Mutation zur Entstehung des hochvirulenten Vogelvirus und dessen Adaptierung an den Menschen beigetragen hat. In diesem Zusammenhang wurde auch der Einfluss der pH-Abhängigkeit des HA auf die Fusion und Infektiosität von Viren in lebenden Zellen getestet. Eine destabilisierende Mutation im HA eines rekombinanten WSN-H3 Virus reduzierte dessen Infektions- und Replikationseffizienz in MDCK-Zellen, was auf den endosomalen pH-Wert dieser Zellen zurückgeführt werden konnte. Die Messung der Virus-Endosom-Fusionskinetik in lebenden Zellen machte außerdem die Bedeutung der pH-Abhängigkeit des HA für den Zeitpunkt der Membranfusion und dessen Einfluss auf die Effizienz der Virusinfektion deutlich. / The entry of influenza A virus into host cells is established by the hemagglutinin (HA) protein. New antiviral strategies aim to inhibit the fusion inducing conformational change of HA and thereby liberation of the viral genome into the cell. This process is strictly pH dependent since the conformational change of HA initiating the fusion of membranes only occurs upon protonation of yet unknown residues within HA at low pH (~5.0-6.0). The identification of conserved titrable residues and better understanding of the sequential structural rearrangements within HA may facilitate the development of new broad-spectrum antivirals. In the present work His184 and His110 were characterized as potential pH sensors by a comprehensive mutational and computational analysis. The results suggest that His184, but not His110, is an important regulator of HA conformational change at low pH. Furthermore, an exchange of charge at position 216 in vicinity to His184 was shown to alter the pH dependence of conformational change and of fusion in correlation to the known pKa dependence of histidines on neighboring residues. The result advocates that the mutation R216E, which emerged in the highly pathogenic H5 HA in 2003-2004, contributed to an altered acid stability of H5 HA via its effect on His184 and thus to the adaptation of avian H5N1 viruses to the human host. Therefore, the role of an altered acid stability of HA for viral fusion and infectivity in living cells was assessed. Recombinant viruses containing a destabilizing mutation in the HA protein were found to have a reduced infectivity and replication efficiency in MDCK cells compared to the respective wild type. Studying virus-endosome fusion kinetics in these cells we could resolve a significant difference in the timing of fusion induction suggesting that the time-point of fusion is a critical determinant of viral infection efficiency which depends on the endosomal acidification as well as on the acid stability of HA.

Etliche Membran Transport Proteine (MTP) sind essentiell in den Plasmodium Blutstadien, und geraten zunehmend in den Fokus der Wirkstoffentwicklung. Die physiologischen Rollen der Transporter sind jedoch oft ungeklärt. In dieser Arbeit wurden mittels experimenteller Genetik funktionelle Charakteristika der MTPs untersucht. Am Maus Parasiten Plasmodium berghei und der Plasmodium falciparum Blutstadien-Kultur wurden vier MTPs ausgewählt: ein konservierter Folat Transporter (FT2), sowie eine P. falciparum-spezifisches P-Typ ATPase und zwei essentielle MTPs (CRT und ATP4). Diese Auswahl verkörpert ein breites Spektrum an MTP Kandidaten und reflektieren zudem das Potenzial und die Grenzen funktioneller Analysen von Plasmodium MTPs mittels reverser Genetik. Für den Folat Transporter 2 (FT2) wurde eine Kombination von transgenen Strategien auf P. berghei angewandt. Durch ein endogenes tag von FT2 wurde die Lokalisierung im Apicoplast, sowie dessen Expression über fast den kompletten Zyklus hinweg gezeigt. Nach der Deletion von FT2, wiesen die Parasiten einen Defekt während der Sporulation auf. Demzufolge bilden sich nur nicht infektiöse Sporozoiten, was letztendlich zur Unterbrechung des Lebenszyklus der Parasiten führt. Eine Aminophospholipid P-Typ ATPase, wurde mittels CRISPR/Cas9 in P. falciparum genetisch deletiert und die Mutante analysiert. Im Gegensatz zu den meisten vitalen P-Typ ATPasen erweist sich das Gen in den asexuellen Blutstadien als entbehrlich. Des Weiteren bilden die MTPs ATP4 und CRT einen einflussreichen Faktor bei Malaria-Therapien. Eine umfassende Analyse von räumlichen und zeitlichen Expressionsmustern von transgenen Parasiten mit mCherry-getaggten Proteinen zeigt ein Expression der beiden MTPs über die Blutstadien hinaus, was auf zusätzliche Funktionen in den jeweiligen Stadien verweist. Diese Studie trägt, basierend auf Lokalisation, Expression und funktioneller Deletion, zur funktionellen Entschlüsselung der vier untersuchten MTPs bei. / Many membrane transport proteins (MTP) are essential for Plasmodium infection and gain importance as candidate drug targets in malaria therapy, whereas the physiological functions often remain enigmatic. In this thesis, we applied experimental genetics to determine key characteristics of four Plasmodium MTPs. We employed the murine malaria model parasite Plasmodium berghei and in vitro blood cultures of Plasmodium falciparum. We selected one conserved MTP called FT2, which was previously shown to transport folate, a P-type ATPase that is specific for P. falciparum as well as two essential MTPs, CRT and ATP4. These targets exemplify the range of druggable candidates and illustrate the potential and limitations of reverse genetics to decipher their physiological roles. A combination of transgenic and knockout strategies was applied to the P. berghei folate transporter 2 (FT2). We show that endogenously tagged FT2 localises to the apicoplast membranes, and is broadly expressed throughout the parasite’s life cycle. Analysis of FT2-deficient parasites revealed a severe sporulation defect in the vector; the vast majority of ft2– oocysts form large intracellular vesicles which displace the cytoplasm. Very few sporozoites are generated and these are non-infectious to the mammalian host, resulting in a complete arrest of Plasmodium transmission. A candidate aminophospholipid P-type ATPase, was assessed by a CRISPR/Cas9-mediated gene disruption. Compared to many vital P-type ATPases this gene is dispensable for asexual blood replication. Two MTPs, ATP4 and CRT are prime targets for antimalarial therapies. A comprehensive spatio-temporal expression analysis of transgenic parasites expressing mCherry-tagged proteins revealed expression beyond blood infection, indicative of functions in additional parasite stages. The findings of this study contribute towards a better understanding of the roles of the four MTPs based on localisation, expression and functional deletion.

Die Bildung infektiöser Viruspartikel des humanen Zytomegalievirus (HCMV) ist ein mehr-stufiger Prozess. Sie beginnt mit der Verpackung der DNA in die Kapside im Kern, gefolgt von weiterer Reifung während des Transports durch das Zytoplasma und der abschließenden Freisetzung aus der Zelle. Im Zuge dieser Arbeit wurden zwei Proteine, die Einfluss auf die ebengenannten Prozesse haben, analysiert. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung des HCMV Pro-teins pUL77. Es ist bekannt, dass das homologe Protein pUL25 in alpha-Herpesvirinae essentiell für die DNA-Verpackung ist. Zunächst konnte das Protein als Kapsid-assoziiertes strukturelles Protein identifiziert werden. Es wurden Interaktionen von pUL77 mit DNA-Verpackungs- und Kapsidproteinen gezeigt. Weiterhin wurde die DNA-Bindungsfähigkeit von pUL77 in verschiedenen „in vitro“-Experimenten untersucht. Zusammengefasst weisen unsere Ergebnisse auf eine Funktion von HCMV pUL77 bei der DNA-Verpackung hin. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das HCMV Protein pUL71 charakterisiert, das in allen Herpesviren konserviert vorkommt, dessen Funktion jedoch nicht charakterisiert ist. Zunächst wurde das Protein als strukturelles Tegumentprotein mit “earlylate“ Expressionskinetik klassifiziert. Weiterhin wurden die subzelluläre Lokalisation sowie virale und zelluläre Interaktionspartner untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Funktion von HCMV pUL71 bei der Reifung und beim Transport der Virionen im Zytoplasma hin. „In silico“-Vorhersagen zeigten ein „Leuzin Zipper“-Motiv in pUL71, das als mögliche Oligomerisationsdomäne dienen könnte. Mutationen wurden in dieses Motiv eingebracht und die resultierenden Proteine auf ihre Oligomerisationsfähigkeit mit „in vitro“-Methoden und in rekombinanten Viren untersucht. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das „Leuzin Zipper“-Motiv wichtig für die Funktion von pUL71 ist und diese mit einer unbeeinträchtigten Oligomerisation des Proteins zusammen hängt. / The morphogenesis of Human cytomegalovirus (HCMV) virions starts with the capsid assem-bly and DNA insertion in the nucleus followed by maturation during transport through the cytoplasm prior to release of virus progeny. In this study we are functionally characterising two proteins that are involved in those steps. The function of essential HCMV protein pUL77 is characterised in the first part of the study. HCMV pUL77 was shown to be a structural protein associated with capsids. Furthermore, our experiments demonstrated that HCMV pUL77 interacts with DNA packaging motor compo-nents and capsid proteins. The ability of HCMV pUL77 to bind double-stranded DNA was studied in “in vitro” assays designed for this study. The homologue α-Herpesvirinae protein pUL25 is described to be involved in processes connected with DNA packaging. Data ob-tained in this study demonstrates that HCMV pUL77 might serve a similar function. In the second part of the study HCMV pUL71, conserved throughout the Herpesvirus family but to date unclassified, was functionally characterised. HCMV pUL71 was defined a struc-tural tegument protein with early-late expression kinetics. We studied the sub-cellular local-isation and interactions of pUL71 with a subset of cellular and viral proteins. Thereby we could show that HCMV pUL71 function might be connected with processes of viral egress. By in silico analyses we identified a leucine zipper motif in pUL71 that might serve as a puta-tive oligomerisation domain. In order to investigate the function of the leucine zipper motif, we performed in vitro assays and investigated the alterations of the motif in the viral context. Taken together we can conclude that (i) an intact leucine zipper motif is crucial for the func-tion of pUL71 and (ii) this function is dependent upon undisturbed oligomerisation of the pro-tein.

Helmintheninfektionen induzieren in ihren Wirten Typ 2 (Th2) Immunantworten, welche parasitäre Larvenstadien hemmen und/oder zur Abstoßung von intestinalen Würmern führen. Th2-Antworten können auch gegenüber Umweltallergenen ausgebildet werden und allergische Reaktionen vermitteln. Mastzellen (MZ) spielen eine herausragende Rolle für die Wirtsantwort gegen Parasiten. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Infektion von MZ-defizienten Mäusen mit Helminthen zu einer reduzierten Produktion von IL-25, IL-33 und TSLP, einer beeinträchtigten Etablierung von Th2 Immunantworten und einer erhöhten Wurmlast führt. Diese Parameter konnten allerdings nach einem erfolgreichen Transfer von Knochenmark aus Wildtypmäusen wiederhergestellt werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt somit eine wichtige Funktion von Mastzellen für die Initialisierung von Th2 Immunantworten. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Cystein-Protease-Inhibitor - AvCystatin sowohl Parameter von Atemwegsentzündung und -hyperreaktivität als auch Lieschgraspollen (Phl p 5b)-spezifische Immunantworten in einem klinisch relevanten Mausmodell für Atemwegsentzündung inhibiert. Gleichzeitig führte die Behandlung mit AvCystatin zu einem Anstieg von IL-10 und erhöhten Frequenzen von CD4+CD25+Foxp3+ T Zellen. Die in vivo Effekte von AvCystatin wurden unabhängig von der Protease-inhibitorischen Aktivität des Immunmodulators oder dessen Fähigkeit zur Oligomerisation vermittelt. AvCystatin unterdrückte zudem die Allergen-spezifische Produktion von IL-13 und induzierte in vitro unter Verwendung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut (PBMCs) von Graspollen allergischen Patienten einen IFN-gamma vermittelten Th1 shift. Zusammenfassend tragen die Ergebnisse der Arbeit zu einem besseren Verständnis für die frühen Ereignisse von Th2 Immunantworten bei und zeigen, dass Helminthenmoleküle Bystandereffekte auf Immunantworten vermitteln können, die gegen andere Antigene gerichtet sind. / Helminth infections induce protective type 2 (Th2) immune responses in the host leading to arrested larval development and/or intestinal worm expulsion. Moreover, Th2 immune responses are initiated against harmless environmental allergens and mediate development of allergic disease. Among multiple mechanisms implicated in host responses to parasites and allergens, mast cells (MCs) play a pivotal role. The present study shows that MC-deficient mouse strains following infection with two gastrointestinal helminths had dramatically reduced early production of the tissue-derived cytokines IL-25, IL-33, and TSLP, which resulted in impaired induction of Th2 immune responses as well as increased parasite burden. These parameters were restored after transfer of WT bone marrow. These data reveal an important role for MCs in orchestrating type 2 immune responses. Parasites have developed various strategies to modulate the immune system via induction of a range of regulatory mechanisms. In this study AvCystatin, the filarial cysteine inhibitor, was found to inhibit airway inflammation and hyperreactivity induced by a clinically relevant allergen of timothy grass pollen (Phl p 5b). AvCystatin increased levels of the regulatory cytokine IL-10 and total numbers of CD4+CD25+Foxp3+ T cells. The immunomodulatory effect in vivo was found to be independent of AvCystatin’s protease inhibitor activity or oligomerization. Finally, AvCystatin suppressed allergen-specific production of IL-13 and created a shift towards Th1 immunity by increased levels IFN-gamma of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from grass pollen allergic patients. The findings contribute to a better understanding of the early events that dictate the priming of type 2 immune responses. Furthermore, helminth product-induced suppression may also have effects on bystander responses to unrelated antigens, thus, suggesting a promising preventive and therapeutic concept in the treatment of aberrant inflammations.

Die in Europa und Asien verbreiteten humanpathogenen Hantaviren sind mit dem "Hämorrhagischen Fieber mit renalem Syndrom" (HFRS) assoziiert, während die humanpathogenen Hantaviren in Nord- und Südamerika das "Hantavirale Pulmonale Syndrom" hervorrufen. In Mitteleuropa kommen die humanpathogenen Hantavirus-Spezies Puumalavirus (PUUV) und Dobravavirus (DOBV) vor. Infektionen mit dem PUUV führen zu milden klinischen Verläufen des HFRS, die auch als "Nephropathia epidemica" bezeichnet werden. Für das DOBV konnte in Mitteleuropa die sympatrische Existenz von 2 genetischen Linien, DOBV-Aa und DOB-Af, nachgewiesen werden, die von unterschiedlichen Nagetierwirten (Apodemus agrarius und A. flavicollis) getragen werden und möglicherweise unterschiedlich virulent für den Menschen sind. Chimäre Hepatitis B Virus-Corepartikel und Hefe-exprimiertes, rekombinantes PUUV-Nukleokapsid (N)-Protein stellen vielversprechende Impfstoffkandidaten dar, die in der Rötelmaus, dem natürlichen Wirt und Überträger des PUUV, eine schützende Immunantwort induzieren können. Eine hauptprotektive Determinante konnte im N-Protein des PUUV zwischen den Aminosäuren (AS) 1-45 lokalisiert werden; eine zweite, schwach protektive Determinante ist zwischen AS 75-119 lokalisiert. Die schwache Protektivität der 45 aminoterminalen AS des PUUV-N-Proteins (Stamm Vranica/Hällnäs) konnte durch Verwendung eines 120 AS-langen Segments deutlich verbessert werden. Ein Hefe-exprimiertes PUUV-N-Protein mit aminoterminalem Hexahistidinschwanz induzierte bei Verwendung von komplettem Freund´schen Adjuvans in allen vakzinierten Rötelmäusen eine schützende Immunität. Bei Verwendung von Aluminiumhydroxid, einem für humane Anwendungen zugelassenen Adjuvans, wurden alle immunisierten Tiere mindestens partiell, darunter 75 % der Tiere sogar komplett, vor einem nachfolgenden Viruschallenge geschützt. An der Induktion einer schützenden Immunität sind wahrscheinlich nicht nur zelluläre, sondern auch humorale N-Protein-spezifische Immunantworten beteiligt. / Human infections with European hantaviruses are associated with the "Haemorrhagic fever with renal syndrome" (HFRS), whereas North and South-American hantaviruses cause in human the "Hantavirus pulmonary syndrome". In Central Europe two hantavirus species, Puumala virus (PUUV) and Dobrava virus (DOBV), are pathogenic to human. PUUV infections result in milder clinical courses of HFRS, designated also as "Nephropathia epidemica". For DOBV the sympatric occurrence of two genetic lineages, DOBV-Aa and DOBV-Af, has been detected. These lineages are carried by two different rodent hosts (Apodemus agrarius and A. flavicollis) and might be of different pathogenicity to human. Chimaeric hepatitis B virus core particles and yeast-expressed recombinant PUUV nucleocapsid (N) protein are promising vaccine candidates. They are able to induce a protective immune response in bank voles, the natural host of PUUV. A major protective determinant has been localized between amino acids (aa) 1-45; a second, minor protective determinant is located between aa 75-119. The low protectivity of the 45 amino-terminal aa of the N protein of PUUV (strain Vranica/Hällnäs) can be overcome by the use of a larger, 120 aa-long segment of this N protein. A yeast-expressed PUUV N protein harboring an amino-terminal hexahistidin tag is able to induce a protective immunity in all immunized bank voles when applied with Freund´s complete adjuvant. Using alum, an adjuvant certified for human use, all immunized animals were protected at least partially, 75% even completely, against a subsequent virus challenge. Likely, the protective immunity is mediated not only by cellular but also by humoral immune responses against the N protein.

In diese Dissertation, Ich konzentriere mich insbesondere darauf, wie die Artbestimmung in der Gattung Eimeria mit der Wirtsspezifität bei Nagetierarten zusammenhängt. Zunächst bietet diese Arbeit eine Reihe von Methoden zur Beurteilung der Prävalenz auf der Ebene der Parasitenarten in Mus musculus. Als Ergebnis war es möglich, drei verschiedene Eimeria-Spezies zu identifizieren, Mäuse mit Doppelinfektionen zu erkennen und die artenspezifische Prävalenz in Abhängigkeit von der Wirtsdichte vorherzusagen. Zur Identifizierung von Eimeria spp. über verschiedene Wirtsarten hinweg wurde eine neuartige Hochdurchsatz-Multi-Locus-Genotypisierungsmethode etabliert und mit der auf zuvor etablierten Markern basierenden Einzelmarker-Genotypisierung verglichen. Dies bestätigte, dass die Art E. falciformis in einer einzigen Wirtsart, der Hausmaus, vorkommt. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breitem Wirtsspektrum hindeutet. E. vermiformis und E. apionodes konnten jedoch nicht unterschieden werden, was auf eine einzige Art mit breiter Wirtsverwendung in einem phylogenetischen Artkonzept schließen lässt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hohe Wirtsspezifität, die traditionell für Eimeria-Parasiten angenommen wird, fragwürdig ist und dass die Identifizierung von Arten durch Wirtsassoziation vermieden werden sollte. Durch molekulare Amplifikation, Sequenzierung, Genotypisierung und phylogenetische Analyse war es möglich, Eimerien auf Artniveau zu identifizieren und die Wirtsspezifität in Isolaten aus natürlichen Systemen in Frage zu stellen. In einer breiteren Perspektive betonte diese Arbeit die Notwendigkeit, Strategien bei der Erkennung, Quantifizierung und Identifizierung von Parasiten zu standardisieren und zu kombinieren, um ein besseres Verständnis auf evolutionärer und ökologischer Ebene zu erlangen. / This PhD thesis combines different approaches for parasite identification to assess the diversity of parasites in natural systems. Particularly, I focus on how species identification in the genus Eimeria is linked to its host specificity in rodent species. First, this thesis provides a set of methods to assess prevalence at the species level in Mus musculus systems. The approach integrates morphological description with molecular methods for detection, niche approximation and phylogenetic reconstruction. As a result, three different Eimeria species were identified, mice with double infections were detected and species-specific prevalence were predicted to be host density-dependent. For identification of Eimeria spp. across different host species, a novel high-throughput multi-locus genotyping was established and compared with single-marker genotyping. The multi-locus genotyping approach provided a higher resolution to distinguish closely related Eimeria isolates. This confirmed the species E. falciformis to have a single host species, the house mice. However, E. vermiformis and E. apionodes could not be distinguished suggesting a single species with broader host usage in a phylogenetic species concept. These findings show that the high host specificity traditionally assumed for Eimeria parasites is questionable, and that identification of species by host association should be avoided. The approaches for identification of Eimeria spp. Developed here allowed differentiation of closely related isolates with indistinguishable morphology. Molecular amplification, sequencing, genotyping and phylogeny allowed the identification of Eimeria at species level and to question host specificity in isolates from natural systems. In a broader perspective, this work emphasised the necessity to standardise and combine strategies in parasite detection, quantification and identification to gain better understanding at an evolutionary and ecological level.

Wenige Studien haben erste Hinweise darauf geliefert, dass die insektivore Fledermausart Mops condylurus ein natürliches Reservoir von Ebolaviren sein könnte. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden weitere Hinweise gesucht, um die Bedeutung dieser Fledermausart als Reservoirwirt für Ebolaviren besser beurteilen zu können. Dafür wurden die Expressionslevel des Membranproteins Niemann-Pick C1 (NPC1), welches essentiell für den Eintritt von Ebolaviren in ihre Wirtszellen ist, in vitro durch konfokale Mikroskopie und Durchflusszytometrie charakterisiert. In dieser Arbeit generierte Primärzellkulturen aus 12 verschiedenen Organen von M. condylurus zeigten für die meisten Primärzellen deutlich niedrigere Expressionslevel als Kontrollzellen von Mensch, Affe oder einer europäischen Fledermaus. Die untersuchte Replikationskinetik von Ebola virus (EBOV) zeigte in allen Primärzellen von M. condylurus niedrigere Replikationsraten, die meistens mit den niedrigen NPC1 Rezeptor-Expressionsleveln korrelierten. Geringere Mengen von NPC1 könnten in vivo zur Virusreplikation auf niedrigerem Niveau beitragen. Desweiteren zeigten alle Primärzellen von M. condylurus eine hohe Toleranz gegenüber EBOV ohne Zelltot. Eine beobachtete Persistenz in Lungenprimärzellen könnte die intrinsische Fähigkeit widerspiegeln, dass Ebolaviren auch in vivo in dieser Fledermausart persistieren könnten. Mit den geringeren NPC1-Rezeptor-Expressionsleveln, der geringeren Virusreplikation, der hohen Toleranz gegenüber EBOV und der Etablierung von persistenten Infektionen in Primärzellen von M. condylurus wurden in vitro zusätzliche Hinweise gewonnen, die die Wahrscheinlichkeit dieser Fledermausspezies als ein mögliches natürliches Reservoir von Ebolaviren erhöht. Ergebnisse von zusätzlichen Temperaturversuchen lassen vermuten, dass die Heterothermie der Fledermäuse einen Schlüsselfaktor für die Toleranz von Ebolaviren in vivo darstellen und darüber hinaus an der Balance zwischen Viruskontrolle und Virusvermehrung beteiligt sein könnte. / Few studies provide first evidence that Mops condylurus, an insectivorous microbat, could be a natural reservoir for ebolaviruses. The aim of this thesis was to investigate indicators to determine the potential role of this bat species in the ecology of ebolaviruses. Therefore, the expression levels of the membrane protein Niemann-Pick C1 (NPC1), essential for the entry of ebolaviruses into their host cells, were characterized in vitro by confocal microscopy and flow cytometry. Our generated primary cell cultures from 12 different organs from M. condylurus showed significantly lower expression levels in most primary cells compared to control cells from human, monkey or a European bat. In most cases, lower Ebola virus (EBOV) replication rates in primary cells from M. condylurus, determined by RT-qPCR, correlated to lower NPC1 receptor expression levels. Low NPC1 receptor expression levels may contribute to decreased virus replication rates also in vivo. Additionally, all primary cells were highly tolerant to EBOV infections without cell death. The observed establishment of persistent EBOV infections in lung primary cells from M. condylurus may reflect the intrinsic ability to persist in vivo in this bat species. With lower NPC1 receptor expression levels, lower virus replication rates, high tolerance to EBOV infections and establishment of persistent infections in primary cells from M. condylurus, the in vitro experiments provided further evidence that this bat species is a potential reservoir of ebolaviruses. Results from additional temperature experiments suggest, that heterothermy of M. condylurus could be a key factor for tolerance to EBOV infections in vivo and be involved in balancing the level of virus replication.

Antikörper gegen Circumsporozoite protein (CSP), ein Oberflächenantigen von Plasmodium falciparum (Pf), können sterile Immunität hervorrufen und dadurch die Entwicklung von Malaria im Tierversuch verhindern. Im Menschen werden protektive B-Zell Gedächtnisantworten gegen CSP durch natürliche Malariaerkrankung bzw. Vakzinierung jedoch nur unzureichend erzeugt. - Für die Entwicklung von Gedächtnis-B-Zellen stellt die Affinitätsreifung, welche durch somatische Immungobulin Hypermutation sowie der nachfolgenden Selektion von B-Zellen mit verbesserter Antigenaffinität charakterisiert ist, eine Schlüsselfunktion in der Generierung von protektiven Immunantworten dar. Wie Affinitätsreifung gegen CSP im Menschen stattfindet ist jedoch nicht bekannt. In dieser Arbeit wird die Affinitätsreifung von CSP Gedächtnis B-Zellen auf Einzelzellebene im Menschen über drei kontrollierte Infektionen mit Pf Sporozoiten unter Chemoprophylaxe untersucht. Durch Hochdurchsatz-Einzelzell-Sequenzierung der Immunoglobulin (Ig) gene loci und der Produktion von rekombinanten monoklonalen Antikörpern gewährt diese Arbeit Einsicht in die Selektion und Affinitätsreifung von humanen Gedächtnis-B-Zell Antworten gegen komplexe Proteinantigene und identifiziert Keimbahn kodierte Immunglobulin Charakteristika, die mit hoher CSP-Affinität und Pf-Inhibition einhergehen. Überraschenderweise zeigen die Daten, dass initiale klonale Selektion von hochaffinen B Zellen eine weitaus wichtigere Rolle als Affinitätsreifung in dieser Infektion spielt. Diese Arbeit zeigt fundamentale Eigenschaften von humanen Gedächtnisantworten in einer komplexen Parasiteninfektion und liefert die Grundlage für ein mögliches Design von neuartigen Immunogenen um hoch-affine B-Zellen gegen CSP effizienter zu induzieren. / Antibodies against the major Plasmodium falciparum (Pf) sporozoite surface protein, circumsporozoite protein (CSP), can mediate sterile immunity thereby preventing malaria disease symptoms as shown by passive transfer in animal models. However, protective anti- CSP memory antibody responses are not efficiently induced by natural Pf exposure or vaccination. Affinity maturation, i.e. the diversification of antigen-activated naïve precursor B cells by a somatic immunoglobulin (Ig) gene mutation process and the subsequent selection of B cells expressing antigen receptors with improved antigen affinity in germinal center reactions is considered key to the formation of protective memory B cell responses. However, how the anti-PfCSP memory B cell response matures in humans is not known. To address this question, the clonal evolution of the human anti-Pf CSP memory B cell response over three successive controlled Pf infections under chemoprophylaxis was assessed at single cell level by high throughput paired full-length Ig gene sequencing and recombinant monoclonal antibody production. The work provides basic insights in the longitudinal development of human memory B cell responses and identified germline-encoded Ig gene features that were associated with high anti-CSP affinity and Pf inhibitory antibody activity. The clonal selection of germline B cells expressing such antibodies, rather than affinity maturation, was associated with high quality anti-PfCSP memory B cell responses. The data provide insights into the evolution of antibody response to a complex protein antigen during infection and a strong rational for the design of novel CSP immunogens to target naïve B cell precursors expressing potent anti-CSP antibodies for the induction of protective memory B cell responses by vaccination.

Der Austausch von genetischem Material über horizontalen Gentransfer, stellt einen wichtigen Mechanismus in der bakteriellen Evolution dar. Legionella pneumophila Stämme codieren für verschiedene Typ IV Sekretionssysteme (T4SS) und integrative konjugative Elemente, die zur genomischen Variabilität der intrazellulären Erreger beitragen. L. pneumophila Corby codiert auf der genomischen Insel Trb-1 für ein funktionelles Konjugations- und T4ASS. Trb-1 ist innerhalb des tRNAPro Gens integriert und kann in einer chromosomalen oder zirkulären episomalen Form existieren. Zusätzlich zu den trb/tra Genen sind auf der Insel eine Integrase (int-1) und die Gene lvrRABC der Legionella vir Region (lvr) lokalisiert. Durch die Deletion von int-1 konnte gezeigt werden, dass die Exzision von Trb-1 unter Beteiligung der Integrase erfolgt. Zudem wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal demonstriert, dass die lvr-Region, vor allem der putative Phagen-Repressor LvrR an der Regulation der Exzision von Trb-1 beteiligt ist. Die Konjugation von Trb-1 in L. oakridgensis, hatte keinen Effekt auf die in vivo Fitness der Transkonjuganten in humanen Makrophagen. Die genomischen Inseln LpcGI-1 und LpcGI-2 codieren für ein neues putatives GI-T4SS. Für LpcGI-2 konnte erstmals gezeigt werden, dass das T4SS funktionell ist und die Konjugation der genomischen Insel in einen anderen L. pneumophila Stamm vermitteln kann. LpcGI-2 kann anschließend ortsspezifisch in das Genom der Transkonjuganten integriert werden. LpcGI-1 und LpcGI-2 werden vom tRNAThr bzw. tRNAMet Gen flankiert und können in verschiedenen chromosomalen und zirkulären, episomalen Formen existieren. Die Exzision von LpcGI-2 erfolgt ähnlich zu Trb-1, in Abhängigkeit einer ortsspezifischen Integrase. Im Genom von Lp Corby wurden zwei weitere genomische Inseln (LpcGI-Asn und LpcGI-Phe) identifiziert. In silico Analysen zeigten zudem, dass genomische Inseln mit einer Ähnlichkeit zu Trb-1, LpcGI-2 bzw. LpcGI-1 im Genus Legionella verbreitet sind. / Exchange of genetic information by horizontal gene transfer is an important mechanism for the evolution of bacterial genomes. Legionella pneumophila strains encode different type IV secretion systems and integrative conjugative elements contribute to the variability of the intracellular pathogen. The genomic island Trb-1 of L. pneumophila Corby encodes a functional conjugation and T4ASS. Trb-1 is integrated within the tRNAPro gene and can exist in a chromosomal or an episomal circular form. In addition to the trb/tra genes, a site-specific integrase (int-1) and a Legionella vir region (lvrRABC) are also localized on the genomic island. By deleting the int-1 gene, it could be demonstrated that the excision and of Trb-1 is integrase dependent. Furthermore, in this work it was shown for the first time that the lvr region and especially the putative phage repressor LvrR, is involved in the regulation of Trb-1 excision. Conjugation of Trb-1 in L. oakridgensis does not influence the in vivo fitness of the transconjugants in human macrophages. The genomic islands LpcGI-1 and LpcGI-2 encode a new putative T4SS. For the first time it could be demonstrated, that the T4SS localized on LpcGI-2 is functional. Although LpcGI-2 could be mobilized and transferred via conjugation to another L. pneumophila strain, followed by the site-specific integration into the genome of the transconjugants. LpcGI-1 and LpcGI-2 are flanked by the tRNAThr or tRNAMet gene respectively. Both islands can exist in different chromosomal and episomal forms. The excision of LpcGI-2 occurs similar to Trb-1 in an integrase dependent manner. Two additional genomic islands (LpcGI-Asn and LpcGI-Phe) could be identified in the genome of Lp Corby. Moreover, data of the in silico analysis demonstrated, that genomic islands similar to Trb-1, LpcGI-2 and LpcGI-1 are distributed within the genus Legionella.