Shigellen sind Erreger der bakteriellen Dysenterie beim Menschen. Ein notwendiger Schritt bei der Pathogenese der Shigellose ist die Invasion von Darmepithelzellen durch das Bakterium. Der Mikroorganismus löst dabei in der Wirtszelle Veränderungen des Aktinzytoskeletts aus, die zur Bildung einer blütenähnlichen Membranstruktur und schließlich zur Internalisierung des Pathogens führen. Diese Umbauvorgänge am Zytoskelett sind abhängig von einem Wirtszellprotein, der kleinen GTPase Rho. Drei Isoformen von Rho (A, B und C) sind beschrieben, deren Aminosäuresequenzen zu etwa 90% identisch sind. Während der Zellinvasion durch Shigella akkumulieren verschiedene Rho-Isoformen an unterschiedlichen Lokalisationen des Invasionskomplexes. Dabei werden RhoA vorwiegend um die eindringenden Bakterienherum, RhoB und RhoC hingegen hauptsächlich in die bakterieninduzierten zellulären Protrusionen rekrutiert. Durch Untersuchung von Rho-Hybridkonstrukten konnte gezeigt werden, daß ein prä-C-terminales, acht Aminosäuren umfassendes Modul die Rekrutierungsmuster von RhoA bzw. RhoC bestimmt. Der Austausch zweier Aminosäuren innerhalb des Moduls führte zu einer Konversion des Rekrutierungsmusters von RhoA. Wir konnten zeigen, daß die Rekrutierung von RhoA vom Funktionszustand der GTPase (Bindung von GTP/GDP) sowie von der Phosphorylierung durch die Proteinkinase A unabhängig ist. Schließlich wurde hier nachgewiesen, daß auch RhoD, das zu RhoA, B und C auf der Primärstrukturebene nur zu etwa 50% homolog ist, an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert werden kann. RhoD folgt dabei dem Rekrutierungsmuster von RhoB und RhoC. / Shigella causes bacillary dysentery in humans. Bacterial invasion of enterocytes is an essential step in the pathogenesis of shigellosis. Pathogen-triggered rearrangements of the host cell actin cytoskeleton induce a blossom-like membrane structure for internalisation of the microorganism. Actin remodeling requires activity of the host cell small GTPase rho. Three highly homologous rho isoforms (A, B and C) have been described with amino acid identities of about 90%. During Shigella invasion these rho isoforms accumulate at different sites of the invasion complex. While rhoA is chiefly recruited around entering bacteria, rhoB and rhoC are essentially translocated to the bacteria-induced cellular protrusions. Using a variety of rho hybrid constructs in a HeLa cell transfection-infection assay we were able to show that a pre-C-terminal stretch of eight amino acids determines the recruitment patterns of rhoA and rhoC. Exchange of two amino acids was sufficient for conversion of the rhoA recruitment pattern into a rhoC-like pattern. We could demonstrate that rhoA recruitment is independent of its functional state (GDP- or GTP-bound) or phosphorylation by the proteinkinase A (PKA). Finally, we have shown that rhoD, another member of the rho family which shares only 50% of its primary structure with rhoA, B or C, is also recruited to the bacterial entry site exhibiting a rhoB/C-like pattern of distribution.

Legionellen sind stäbchenförmige Bakterien, die in nennenswerten Konzentrationen und als Krankheitserreger vorrangig in technischen Systemen in Erscheinung treten. Ziel dieser Arbeit ist es, die bisher erschienene Literatur sowohl aus dem mikrobiologisch-hygienischen Bereich als auch aus dem technischen Bereich zu sichten, zu vergleichen und auf dieser Basis, unter Berücksichtigung der ökonomischen Konsequenzen an dem konkreten Beispiel des Carl-Thiem-Klinikum Cottbus, ein sinnvolles Konzept zur Legionellenprävention vorzuschlagen. Das Konzept ist so aufgebaut, daß es durch Betrachtung verschiedener Risikobereiche leicht auf andere Pflegeeinrichtungen oder auch Wohnanlagen bzw. Industriebetriebe übertragbar ist. Regelmäßige Messungen werden von verschiedenen Arbeitsgruppen alternativ oder zusätzlich zu Präventionsmaßnahmen gefordert. In dieser Arbeit werden jährliche Messungen in jedem Kollektor zur Beurteilung des Gesamtsystems, 1/2-jährliche Kontrollen in den Gebäuden, in denen sich Pflegestationen befinden, und 1/4-jährliche Kontrollen in Bereichen mit hohem Risiko, wie zum Beispiel den Isolierzimmern der Hämatologie, empfohlen. Die tolerierten Grenzwerte variieren entsprechend des Riskobereiches, in dem sie auftreten. Das in dieser Arbeit am Beispiel des Carl-Thiem-Klinikum Cottbus dargestellte Präventionskonzept beruht im wesentlichen auf regelmäßigen Kontrollen und sieht die Durchführung einer differenziert angewandten Präventionsmaßnahme nur bei nachgewiesener erhöhter Belastung des Systems durch Legionellen vor. Hier hat sich die Dezentralisierung des Warmwassersystems mit Hilfe dezentral installierter Plattenwärmetauscher in das zentrale Heiznetz als die wirtschaftlichste der hygienisch sinnvollen Maßnahmen herausgestellt. Aber auch diese Art der Prävention entbindet nicht von den weiterhin durchzuführenden Kontrollmessungen - mindestens zur Qualitätssicherung. Insgesamt bleibt jedoch jede Festlegung von Grenzwerten, jede Anwendung einer Präventionsmaßnahme immer ein Kompromiß zwischen dem technisch Machbaren und dem ökonomisch Realisierbaren. Große Studien, die hierzu detailliertere Auskunft geben könnten fehlen bis heute, so daß auch weiterhin jeder Betreiber einer Warmwasseranlage seine eigenen Festlegungen treffen muß. / Legionella is a rod-shaped bacteria, that occur with priority in considerable numerus aswell as pathogens concentration in technical systems. Target of this work is to sight the literature appeared so far both from the micro-biological-hygenic area and from the technical area to compare and on this base to suggest with consideration of the economic consequences by the concrete example Carl Thiem clinical center (Cottbus), a meaningful concept to the Legionella - prevention. The concept is structured by view of different risk areas and therefor easily portable to other nursing facilities or also housing estates and industrial companies. Regular measurements are required by different working groups alternatively or additionally to prevention measures. Recommended in this work are annual measurements in each central warmwater line for the evaluation of the total system, 1/2-annual checks in the buildingswith maintenance stations, and 1/4-annual checks within areas with high risk, like for example, the isolating rooms of the Haematology. The tolerated limit values vary according to the risk-area, in which they occur. The prevention concept put up for Carl Thiem clinical center (Cottbus) has been based essentially on regular checks and more detailed means of prevention for areas with proven increased numbers of Legionella. Here the decentralization of the warm-water system by means of peripherally installed plate-type heat exchanger fed by the central heating network has prooven to be the most economical and aswell hygenically meaningful measure. Never the less, this concept of prevention does not relieve of the regularly check on Legionella - at least for quality assurance. Altogether however each definition of Legionella limit values as well as each prevention concept always is a compromise between the technically feasible means and the economically realizable ones. Large studies, to gain more information on this problem are missing until today, so that further on each operator of a warm water system must find his own definitions out of the broad possibilities of regulations.

Das Überleben und die Vermehrung der parasitär lebenden Apicomplexa setzen eine effiziente Synthese von Phospholipiden während ihres gesamten Lebenszyklus voraus. In dieser Arbeit nutzten wir zunächst Eimeria falciformis um den Prozess der Lipid-Biogenese in Sporozoiten zu untersuchen. Durch Lipidomics-Analysen wurde das Auftreten von zwei exklusiven Lipiden, Phosphatidylthreonin (PtdThr) und Inositolphosphorylceramid. Der Parasit exprimiert fast das gesamte Lipid-Biogenese- Netzwerk aus eukaryotischen und prokaryotischen Enzymen. Toxoplasma gondii diente als genmanipulierbarer Ersatz für die Untersuchung der Eimeria-Enzyme, mit dem wir ein stark räumlich segmentiertes Netzwerk der Lipidsynthese im Apicoplast, ER, Golgi und Mitochondrium zeigen konnten. Ebenso legte die Komplementierung einer T. gondii-Mutante mit einer PtdThr-Synthase von E. falciformis eine konvergente Funktion von PtdThr für den lytischen Zyklus von Kokzidien-Parasiten nahe. Außerdem setzten wir T. gondii als etablierten Modelorganismus ein, um die De- novo-Synthese und die metabolische Rolle eines bedeutenden Lipidvorläufers, CDP- Diacylglycerin (CDP-DAG), zu untersuchen. Wir konnten zwei phylogenetisch divergente CDP-DAG-Synthase (CDS) Enzyme in T. gondii nachweisen. Das eukaryotisch-typische TgCDS1 und das prokaryotisch-typische TgCDS2 lokalisieren im ER bzw. im Apicoplast. Der konditionierte Knockdown von TgCDS1 bremst das Parasitenwachstum stark ab, was den fast vollständigen Verlust der Virulenz im Mausmodell hervorruft. Das restliche marginale Wachstum der TgCDS1 Mutante wird durch zusätzliche Deletion der TgCDS2 verhindert. Lipidomics-Analysen zeigten eine signifikante und spezifische Abnahme der Phosphatidylinositol (PtdIns)- und Phosphatidylglycerol (PtdGro)-Level bei Verlust der TgCDS1- bzw. TgCDS2-Gene. Zusammengenommen zeigt unsere Arbeit ein Phospholipid-Biogenese-Modell mit erstaunlicher Kooperation verschiedener Organellen und einem extensiven Lipidtransport im Parasiten. / The survival and proliferation of apicomplexan parasites oblige efficient synthesis of phospholipids throughout their life cycles. Here, we first deployed Eimeria falciformis to investigate the process of lipid biogenesis in sporozoites. Lipidomics analyses demonstrate the occurrence of two exclusive lipids phosphatidylthreonine (PtdThr) and inositol phosphorylceramide along with other prototypical lipids. The parasite expresses nearly the entire lipid biogenesis network, which is an evolutionary mosaic of eukaryotic- and prokaryotic-type enzymes. Using Toxoplasma gondii as a gene- tractable surrogate to examine the Eimeria enzymes, we show a highly compartmentalized network of lipid synthesis distributed primarily in the apicoplast, ER, Golgi and mitochondrion. Likewise, trans-species complementation of a T. gondii mutant with a PtdThr synthase from E. falciformis suggests a convergent function of PtdThr in promoting the lytic cycle in coccidian parasites. We also employed the well-established model parasite T. gondii to explore de novo synthesis and metabolic roles of one major lipid precursor CDP-diacylglycerol (CDP- DAG). We report the occurrence of two phylogenetically divergent CDP-DAG synthase (CDS) enzymes in T. gondii. Eukaryotic-type TgCDS1 and prokaryotic-type TgCDS2 reside in the ER and apicoplast, respectively. Conditional knockdown of TgCDS1 severely attenuates parasite growth, which translates into a nearly complete loss of virulence in a mouse model. Residual growth of the TgCDS1 mutant is abolished by subsequent deletion of TgCDS2. Lipidomics analyses reveal significant and specific decline in phosphatidylinositol (PtdIns) and phosphatidylglycerol (PtdGro) upon loss of TgCDS1 and TgCDS2, respectively. Taken together, our work establishes a phospholipid biogenesis model involving significant inter-organelle cooperation and lipid trafficking in apicomplexan parasites.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Analytik eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch auf Cisplatin-behandelte DNA reagiert und bereits routinemäßig zu diagnostischen Zwecken bei der Krebstherapie mit ebendiesem Zytostatikum eingesetzt wird. Zu diesem Zweck wurden vor allem massenspektrometrische Methoden eingesetzt, um einerseits den genauen Aufbau sowie die Zusammensetzung des Antikörpers zu untersuchen und andererseits die Antigenspezifität einer genaueren Betrachtung zu unterziehen. Mit Hilfe von nano-ESI-MS konnte der Antikörper unter Erhalt der nativen Struktur in der Gasphase analysiert werden. Tandem-MS-Experimente lieferten nicht nur einen Einblick in typische Fragmentierungs-muster, sondern generierten z. T. auch Informationen über die Primärsequenz einiger Bereiche des Antikörpers. Die im Fc-Teil gebundenen Glycanstrukturen, die sowohl für die Struktur als auch die Funktionalität des Antikörpers eine entscheidende Rolle spielen, wurden nach enzymatischer Abspaltung separat mit Hilfe von MALDI-MS analysiert. Die vollständige Antikörpersequenz wurde durch proteolytische Spaltung des Antikörpers, Analytik mittels hochaufgelöster Tandem-MS und anschließendem Vergleich mit Daten aus der Sequenzierung auf DNA-Ebene bzw. bekannten Antikörpersequenzen aus Proteindatenbanken aufgeklärt. Im selben Zug konnten auf Peptidebene eine Vielzahl verschiedener posttranslationaler Modifikationen nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Antikörper unter Erhalt seiner Struktur und der antigenbindenden Eigenschaften an den Zuckerstrukturen mit einem eigens synthetisierten Metallkomplex markiert werden kann. Die für die Spezifitätsstudie des Antikörpers notwendigen Antigene wurden durch Inkubation synthetischer einzel- und doppelsträngiger DNA-Oligomere mit Cisplatin erzeugt und analysiert. Anschließend wurden die verschiedenen Antikörper-Antigen-Komplexe unter nativen Bedingungen hergestellt und massenspektrometrisch charakterisiert. Um einen Eindruck von der Komplexstabilität zu erhalten wurden zusätzlich MS/MS-Untersuchungen des Komplexes mit der platinierten doppelsträngigen DNA durchgeführt. Wie bei der Analytik des freien Antikörpers konnten auch hier spezifische Fragmente detektiert werden. / The focus of the thesis was the characterization of a monoclonal antibody, which binds specifically to cisplatin-treated DNA and is already used for diagnostic purposes in cancer therapy. The structure and composition of the antibody, as well, as the antigen specificity were investigated by mass spectrometry. Using nano-ESI-MS it was possible to analyse the antibody in its native state. Tandem-MS experiments revealed not only specific antibody fragments but also gave information on the primary structure of the antibody. The Fc-bound glycans that are responsible for antibody structure and functionality, were cleaved enzymatically and studied with MALDI-MS. For a detailed determination of the primary structure, the antibody was proteolysed with different enzymes and analyzed via high resolution Tandem-MS. The data was evaluated by comparism with results from sequence analysis on DNA level and known antibody sequences from protein databases. Simultaneously many different posttranslational modifications were identified. Furthermore, the antibody was successfully labelled with a metal complex at its sugar structures without loss of its structure and function. For investigation of the antibody specificity antigens were generated by incubation of well-defined single and double stranded DNA oligomers with cisplatin. Antibody-antigen-complexes were synthesized and analyzed by mass spectrometry under native conditions. The stability of the complex with double stranded DNA was also investigated by MS/MS-experiments. Thus, it was also possible to determine the specific fragmentation behavior for the complex just as for the free antibody.

Malaria wird durch den einzelligen Parasiten Plasmodium verursacht. Hierbei handelt es sich um einen obligat intrazellulären, eukaryotischen Erreger, der zum Phylum der Apicomplexa gehört. Apicomplexa zeichnen sich durch das einzigartige Vorhandensein eines ungewöhnlichen Plastids, genannt Apicoplast, aus. Die Exklusivität dieser Organelle und ihre metabolische Notwendigkeit für das Parasitenwachstum haben sie als attraktives pharmakologisches Ziel bestätigt. In dieser Arbeit wurden, unter Anwendung des Nagetier-Malariaerregers Plasmodium berghei, zwei verschiedene Aspekte von Apicoplast Proteinfunktionen untersucht. Zum Ersten wurde ein bislang unbeschriebenes Plasmodium Apicoplast Protein, Plasmodium-specific Apicoplast protein important for Liver Merozoite formation (PALM), charakterisiert. Drei voneinander unabhängige palm— Parasitenlinien, wurden durch zielgerichtete Gendeletion generiert. Die PALM Knockout-Mutanten entwickelten sich während eines Großteils des Lebenszyklus normal, jedoch war die Abgabe von Merozoiten in den Blutstrom und die Fähigkeit eine Blutstadien-Infektion zu etablieren signifikant beeinträchtigt. Experimentelle Immunisierung von Mäusen mit palm— Sporozoiten bewirkte einen starken und langanhaltenden Schutz gegen Reinfektion mit Malaria. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Parasiten mit einem Arrest in den finalen Schritten der Bildung von Leberstadien-Merozoiten einen Vorteil gegenüber genetisch attenuierten Parasiten der ersten Generation haben, die in der frühen Leberstadienentwicklung arretiert sind. Zum Zweiten wurden die sechs Nucleus-kodierten Komponenten der [Fe-S] Cluster Biosynthese im Apicoplast systematisch durch experimentelle Genetik analysiert. Insgesamt zeigen meine Studien, dass bisher unbekannte Ziele im Plasmodium Apicoplast für Interventionsstrategien gegen Malaria geeignet sind. / Malaria is caused by Plasmodium, an obligate intracellular eukaryotic pathogen that belongs to the phylum Apicomplexa. Apicomplexan parasites harbor an unusual plastid organelle, termed apicoplast. Because this unique organelle is indispensable for parasite growth it is a validated and attractive drug target. Using the rodent malaria parasite Plasmodium berghei, two different aspects of apicoplast protein functions were analyzed in this study. Firstly, a previously uncharacterized Plasmodium apicoplast protein, Plasmodium-specific Apicoplast protein important for Liver Merozoite formation (PALM), was investigated. Three independent palm— knockout parasite lines were generated by targeted gene deletion. While the resulting knockout mutants developed normally for most of the life cycle, merozoite release into the blood stream and the ability to establish an infection was severely impaired. Experimental immunization of mice with palm— sporozoites elicited unprecedented potent and long-lasting protection against malaria re-infection. The results indicate that a tailor-made arrest in the final steps of hepatic merozoite formation could be an improvement over first-generation early liver-stage genetically arrested parasites (GAPs). Secondly, the six nuclear-encoded components of the apicoplast [Fe-S] cluster biosynthesis pathway were systematically targeted by experimental genetics. Together, my studies show that the Plasmodium apicoplast harbors previously unrecognized targets for anti-malaria intervention strategies.

Trotz weltweiter Bemühungen, die Tropenkrankheit Malaria zurückzudrängen, erkranken jährlich bis zu einer halben Milliarde Menschen an Malaria mit der Folge von über einer Million Todesopfern. Da zur Zeit eine wirksame Impfung nicht in Sicht ist und sich Resistenzen gegen gängige Medikamente ausbreiten, werden dringend neue Antimalariamittel benötigt. Um die Suche nach neuen Angriffsorten für Medikamente zu unterstützen, untersucht die vorliegende Arbeit mit einem rechnergestützten Ansatz den Stoffwechsel von Plasmodium falciparum, dem tödlichsten Malaria-Erreger. Basierend auf einem aus dem aktuellen Forschungsstand rekonstruierten metabolischen Netzwerk des Parasiten werden metabolische Flüsse für die einzelnen Stadien des Lebenszyklus von P. falciparum berechnet. Dabei wird ein im Rahmen dieser Arbeit entwickelter Fluss-Bilanz-Analyse-Ansatz verwendet, der ausgehend von in den jeweiligen Entwicklungsstadien gemessenen Genexpressionsprofilen entsprechende Flussverteilungen ableitet. Für das so ermittelte stadienspezifische Flussgeschehen ergibt sich eine gute Übereinstimmung mit bekannten Austauschprozessen von Stoffen zwischen Parasit und infiziertem Erythrozyt. Knockout Simulationen, die mit Hilfe einer ähnlichen Vorhersagemethode durchgeführte werden, decken essentielle metabolische Reaktionen im Netzwerk auf. Fast 90% eines Sets von experimentell bestimmten essentiellen Enzymen wird wiedergefunden, wenn die Annahme getroffen wird, dass Nährstoffe nur begrenzt aus der Wirtszelle aufgenommen werden können. Die als essentiell vorhergesagten Enzyme stellen mögliche Angriffsorte für Medikamente dar. Anhand der Flussverteilungen, die für die einzelnen Entwicklungsstadien berechnet wurden, können diese potenziellen Targets nach Relevanz für Malaria Prophylaxe und Therapie sortiert werden, je nachdem, in welchem Stadium die Enzyme als aktiv vorhergesagt wurden. Dies bietet einen vielversprechenden Startpunkt für die Entwicklung von neuen Antimalariamitteln. / Despite enormous efforts to combat malaria, the disease still afflicts up to half a billion people each year, of which more than one million die. Currently no effective vaccine is within sight, and resistances to antimalarial drugs are wide-spread. Thus, new medicines against malaria are urgently needed. In order to aid the process of drug target detection, the present work carries out a computational analysis of the metabolism of Plasmodium falciparum, the deadliest malaria pathogen. A comprehensive compartmentalized metabolic network is assembled, which is able to reproduce metabolic processes known from the literature to occur in the parasite. On the basis of this network metabolic fluxes are predicted for the individual life cycle stages of P. falciparum. In this context, a flux balance approach is developed to obtain metabolic flux distributions that are consistent with gene expression profiles observed during the respective stages. The predictions are found to be in good accordance with experimentally determined metabolite exchanges between parasite and infected erythrocyte. Knockout simulations, which are conducted with a similar approach, reveal indispensable metabolic reactions within the parasite. These putative drug targets cover almost 90% of a set of experimentally confirmed essential enzymes if the assumption is made that nutrient uptake from the host cell is limited. A comparison demonstrates that the applied flux balance approach yields target predictions with higher specificity than the topology based choke-point analysis. The previously predicted stage-specific flux distributions allow to filter the obtained set of drug target candidates with respect to malaria prophylaxis, therapy or both, providing a promising starting point for further drug development.

Das Influenza A Virus (IAV) stellt weltweit eine ernstzunehmende Bedrohung für Gesundheit und Wirtschaft der Menschheit dar. Ein universeller und langanhaltender Impfstoff konnte noch nicht entwickelt werden und klinisch zugelassene Medikamente verlieren durch die rasante Entstehung von resistenten Stämmen zunehmend ihre Wirkung. Aus diesem Grund gewinnt die Erforschung neuer antiviraler Strategien zur Bekämpfung des Influenzavirus an Bedeutung zum Schutze unserer Gesellschaft. Eine vielversprechende Zielstruktur für die Entwicklung neuer antiviraler Medikamente stellt das virale Hämagglutinin (HA) dar. Das HA liegt in hoher Dichte auf Influenzaviren vor und ermöglicht die Bindung an Sialinsäuren (SA) auf Wirtszellen und die Verschmelzung mit deren Lipidmembran. HA-bindende Moleküle entfalten eine hemmende Wirkung bereits bei dem ersten Kontakt mit Zellen, sodass eine Infektion erst gar nicht stattfinden kann. Aufgrund einer hohen HA-Dichte auf der Virusoberfläche eignen sich besonders multivalente SA tragende Nanopartikel für die Hemmung einer viralen Infektion. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, wurden in der vorliegenden Arbeit neue multivalente Binder gegenüber dem viralen Hämagglutinin (HA) entwickelt und studiert. Im Gegensatz zu bereits bekannten multivalenten Sialosiden, die in einer undefinierten räumlichen Orientierung auf Polymergerüsten präsentiert wurden, konnten in der vorliegenden Arbeit strukturelle Aspekte identifiziert werden, um Gerüstsysteme mit optimaler Rezeptorpräsentation gegenüber der Influenza A Virusoberfläche zu generieren. Neben SA-basierten Polymersystemen wurde auch ein gegen HA gerichtetes Peptid aus einem Antikörper identifiziert, welches sich auch für eine multivalente Interaktion mit IAV eignet. Diese Arbeit ermöglicht neue Einblicke in die Auswahl geeigneter Trägersysteme, eines optimalen Rezeptorabstandes und der Verwendung alternativer Rezeptoren mit dem Ziel einer Infektionshemmung von IAV. / Influenza A virus (IAV) still poses a serious threat to global health and economy of mankind. So far, a universal, long-lasting vaccine could not be developed, and clinically approved drugs are prone to lose activity due to the fast development of resistant strains. Because of this, research on new antiviral compounds and strategies to combat influenza viruses is of great importance for the protection of our society. A promising candidate for the development of novel antiviral drugs is the viral hemagglutinin (HA) protein. HA is present at high density on the viral envelope, which allows binding to sialic acid (SA) molecules on host cells and fusion with their membrane. Following, HA binding molecules have an inhibitory effect at the very first step of the infection cycle, leading to the inability of an infection. Based on a high HA density on the viral surface, SA carrying nanoparticles qualify for the inhibition of a viral infection. Based on this knowledge the study at hand demonstrates the development of new multivalent binders against viral HA and discusses them critically. In contrast to published multivalent sialosides, which are displayed in an undefined fashion on polymer scaffolds, the results of this thesis support the identification of structural requirements for the design of new scaffold systems with an optimal match to the viral surface. Beside sialoside based polymer systems, completely new peptide based systems, based on an HA binding antibody, were developed. Similar to polyglycerolsialosides, such multivalent peptide-decorated polymers were able to achieve nanomolar binding inhibition constants, too. In summary, this thesis enables new insights into the choice of a suitable carrier system, the optimal receptor spacing, and the use of alternative receptors with the ultimate goal of virus neutralization.

Salmonellen spp. sind invasive, intrazelluläre Pathogene, die in einem membranumhüllten Kompartiment innerhalb der infizierten Wirtszelle überleben. Wie auch andere intrazelluläre Pathogene repliziert Salmonella in dieser intrazellulären Nische, obwohl es anscheinend von sowohl extra- als auch intrazellulären Nährstoffquellen isoliert ist. Wir zeigen hier, dass intrazelluläre Salmonella den Proteinabbau des Wirts ausnutzen, um Aminosäuren in Form von Peptiden zu erhalten. Dieser spezielle, auch als Chaperon-vermittelte Autophagie bekannte, Abbauweg spielt eine Rolle im Transport zytosolischer Proteine zum Abbau im Lysosom. Ein Salmonellenmutant, der nur in Anwesenheit von Peptiden im Medium als Aminosäurenquelle wächst, wies intrazellulär eine Wachstumsrate auf, die der des Wildtyps ähnlich war. Dies deutet darauf hin, dass Peptide intrazellulär für Salmonella zugänglich sind. Wir fanden heraus, dass die Salmonella-enthaltende Vakuole (SCV, Salmonella containing vacuole) die Wirtproteine LAMP-2A und Hsc73, Kernkomponenten von CMA, anzieht, jedoch nicht lysosomale Proteine wie LAMP-2B und LIMP-2. Im Gegensatz zum Salmonellawildtyp zeigte der peptidabhängige Mutantentstamm stark verringertes Wachstum, wenn die Wirtszellen mit CMA-Inhibitoren behandelt wurde. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen Mechanismus auf, durch den ein intrazelluläres Pathogen vom membranumhüllten Kompartiment aus Zugriff auf Cytosol der Wirtzelle zur Beschaffung von Nährstoffen hat. Wir schlagen vor, dass diese Ergebnisse eine Erklärung für die Rückfälle von persistenten Salmonellainfektionen liefern können. Des Weitern schlagen wir diesen Mechanismus als moegliches Ziel antibakterieller Therapeutika zur Bekämpfung intrazellulärer Pathogene vor. / Salmonella spp. are invasive, intracellular pathogens which survive and proliferate within a membrane-bound compartment inside infected host cells. Like other intracellular pathogens, Salmonella replicates within this intracellular niche, despite its apparent isolation from both extra- and intracellular sources of nutrients. Here, we show that intracellular Salmonella acquire amino acids in the form of peptides by co-opting the host protein degradation pathway known as chaperone-mediated autophagy (CMA) involved in the transport of cytosolic proteins to the lysosome for degradation. A mutant of Salmonella strictly dependent upon peptides in growth media as a source of amino acids, showed intracellular growth similar to the wild-type strain in host cells, indicating intracellular access to peptides. We found that the Salmonella-containing vacuole (SCV) acquires the host cell proteins LAMP-2A and Hsc73, key components of CMA, but excludes lysosomal proteins such as LAMP-2B and LIMP-2. In contrast to wild-type Salmonella, the peptide-dependent mutant strain showed a severe reduction in growth when host cells were treated with inhibitors of CMA.. These results reveal a novel means whereby an intracellular pathogen can access the host cell cytosol to acquire nutrients from within its membrane-bound compartment. We suggest these results may provide an explanation for relapse infections resulting from persistent Salmonella infections, and suggest a possible means of targeting antibacterials against intracellular pathogens.

In der vorliegenden Untersuchung wurde der Postantibiotische Effekt (PAE) von Amikacin und Ceftazidim alleinig und in Kombination beider Antibiotika nach einmaliger und mehrfacher Exposition bei Pseudomonas aeruginosa bestimmt. Es wurden verschiedene Stämme mit unterschiedlicher Resistenz gegen Amikacin und Ceftazidim untersucht. Die MHK-Werte bewegten sich für Ceftazidim zwischen < 0,25 µg/ml bis 4 µg/ml und für Amikacin zwischen < 2 µg/ml bis 32 µg/ml. Der PAE lag nach der einmaligen Inkubation von Amikacin bei 0 bis 2,65 Stunden, von Ceftazidim bei 0 bis 2,78 Stunden und in der Kombination beider bei 2,4 bis 5,37 Stunden. Außerdem ergab die mehrmalige Exposition bei Amikacin nach der 1. Inkubation einen PAE von 0,75 bis 2,25 Stunden und stieg auf 2,3 bis 3,5 Stunden nach der 3. Inkubation an; bei Ceftazidim von 1,1 bis 2,18 Stunden Anstieg auf 1,18 bis 2,5 Stunden und bei der Kombination von Amikacin und Ceftazidim von 2,3 bis 3,75 Stunden war ein geringer Abfall auf 1,25 bis 3,25 Stunden zu verzeichnen. Es wurde ein Zusammenhang zwischen dem PAE und der MHK beobachtet: je höher die Resistenz, desto kürzer der PAE. Die Dosierungsintervalle wurden so gewählt, daß sie der klinisch üblichen dreifach Applikation pro Tag entsprachen. Aus unseren Untersuchungen läßt sich theoretisch eine einmalige Applikation pro Tag für Aminoglykoside und eine Kombinationstherapie Aminoglykosid plus Beta-Lactamantibiotika ableiten; vor allem auch, daß bei Mehrfachapplikation der PAE nicht kürzer wird. Für Ceftazidim erscheint eine Dauerinfusion bei fehlendem PAE sinnvoll. / In the current study we examinated the postantibiotic effect (PAE) of the antimicrobial agents amikacin and ceftazidime in vitro. We analyzed the PAE using both agents alone and in combination and after once and several expositions of different isolates of Pseudomonas. Different resistant stains of Pseudomonas were explored versus amikacin and ceftazidime. The observed minimum inhibitory concentration values (MIC) for ceftazidime ranged from < 0.25µg/ml to 4.0µg/ml and for amikacin from < 2.0µg/ml to 32µg/ml. After unique incubation the PAE of amikacin ranged from 0 to 2.65 hours while ceftazidime ranged from 0 to 2.78 hours. In combination of both we observed PAEs between 2.4 to 5.37 hours. A several exposition of amikacin showed after the first incubation PAEs between 0.75 to 2.25 hours increasing after third incubation from 2.3 to 3.5 hours whereas ceftazidime ranged from 1.1 to 2.18 hours and 1.18 to 2.5 hours. Both antimicrobial agents in combination had PAEs between 2.3 and 3.75 hours after first incubation and decreased low after third incubation between 1.25 and 3.25 hours. There is significant correlation to be seen between PAE and MIC-values: the higher resistance is, the shorter PAE will become.

Streptococcus pyogenes ist ein humanpathogenes Bakterium, welches verschiedene Gewebe besiedeln kann und dadurch unterschiedliche Krankheiten verursacht. Die enorme Anpassungsfähigkeit des Bakteriums beruht auf dessen Fähigkeit, verschiedene, vom Wirt induzierte Stresskonditionen zu ertragen. Genetische Faktoren, die in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen, sind Toxin-Antitoxin (TA) Systeme. Typ II TA Systeme kodieren für zwei Proteine, ein Toxin und ein Antitoxin, die einen stabilen TA Komplex bilden. Verschlechtern sich die Wachstumsbedingungen, kann das Antitoxin proteolytisch abgebaut werden, wodurch das freigesetzte Toxin essentielle zelluläre Prozesse des Bakteriums inhibiert. In dieser Studie charakterisierte ich zwei chromosomal kodierte ParDE TA Systeme des pathogenen Bakteriums S. pyogenes. Ähnlich zu anderen Systemen werden das Toxin und das Antitoxin beider hier charakterisierten Systeme co-transkribiert und durch Stresseinwirkung (z.B. Aminosäure-mangel) induziert. Zudem konnten weitere posttranskriptionelle bzw. posttranslationale Mechanismen zur Regulierung der Genexpression beider Systeme nachgewiesen werden. Die extrachromosomale Expression der Toxine ParE1 und ParE2 führten in S. pyogenes und Escherichia coli zum Zelltod, wobei die Co-expression der entsprechenden Antitoxine ParD1 und ParD2 die Toxizität minderte. Allerdings verursachte die Überexpression der Antitoxine allein ebenfalls eine Inhibierung des Zellwachstums. ParD1 hemmte die Zellteilung in E. coli, wobei der N-Terminus des Proteins entscheidend für diesen Effekt zu sein schien. Zusammengefasst erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit unser Verständnis von ParE Toxinen und verdeutlichen die diversen Mechanismen, welcher sich TA Systeme bedienen, um die bakterielle Physiologie zu beeinflussen. Zusätzlich gibt diese Arbeit einen Einblick in mögliche Mechanismen, die S. pyogenes implementiert, um Stresskonditionen im Wirt zu überdauern. / Streptococcus pyogenes is a human pathogen with a remarkable ability to colonize different tissues and to endure diverse host-induced stress conditions through mechanisms that have yet to be fully understood. One strategy employed by bacteria to cope with changing environments are toxin-antitoxin (TA) genetic modules. Under non-ideal conditions, the antitoxin is subject to proteolysis and thus the freed toxin protein can target crucial pathways in the cell modulating bacterial growth. This study, describes the characterization of two chromosomally encoded ParDE-like TA systems from the human pathogen S. pyogenes. The antitoxin-toxin genes of the parDEF1 and parDE2 TA systems are co-transcribed and triggered by stress-induced conditions. The parDE2 TA showed an inspected mRNA processing under amino acid starvation which suggest a putative post-transcriptional regulation. At the post-translational level, both systems are controlled by ClpXP antitoxin-protein degradation in vivo, an important factor for TA triggering. Furthermore, bacterial plasmid-based expression of the toxins ParE1 and ParE2 resulted in effects in cell viability while the antitoxin molecules ParD1 and ParD2 were able to prevent the toxins lethality, respectably. Unlike canonical antitoxins, both ParD1 and ParD2 molecules also displayed deleterious effects, which seemed to be exclusive and related with the N-terminus domain potentially involved in DNA-interaction. Finally, the ParE toxins presented remarkable plasticity, able to harm not only gyrase but also topoisomerase IV, two important bacterial drug targets that modulate DNA-topology. These results expand the view on the ParE molecular targets and highlight the diverse mechanisms TAs employ to modulate bacterial physiology. We also provide more insights into possible mechanisms that S. pyogenes employs to endure stress in the host and efficiently cause disease.