Die Entwicklung eines effektiven HIV-Impfstoffes ist bis heute nicht gelungen.Konventionelle Immunisierungsstrategien mit rekombinant hergestellten Hüllproteinen des Virus in verschiedensten Formen induzierten keine subtypenübergreifende, protektive Immunantwort gegen HIV. Die Gewinnung und Charakterisierung der gp41-spezifischen breit neutralisierenden monoklonalen Antikörper 2F5 und 4E10 bildete die Grundlage einer Reihe neuer epitopgerichteter Ansätze für die HIV-Impfstoffentwicklung. Bisherige Immunisierungsstudien basierten auf der Verwendung des linearen Hauptepitopes (E2) der beiden Antikörper aus dem C-terminalen Teil der Ektodomäne von gp41. Nach neueren Erkenntnissen, reicht für eine effektive Neutralisation durch 2F5 oder 4E10 die Bindung dieser Antikörper an ihr lineares Epitop in der membran proximalen externen Region (MPER) von gp41 allein nicht aus. Vielmehr wurde die Beteiligung einer N-terminalen Domäne (E1) von gp41 an der neutralisationsaktiven Bindung von 2F5 bzw. 4E10 postuliert. In dieser Arbeit wurden die beiden 2F5 und 4E10 spezifischen Epitopbereiche E1 und E2 des gp41 erstmals in das strukturell verwandte transmembrane Hüllprotein des Koala Retrovirus (KoRV) eingebracht. Die Applikation der hergestellten Antigene erfolgte sowohl in Form der codierenden DNA mittels ballistischer Immunisierung (GeneGun®) als auch durch bakteriell exprimierte Proteine. Mit beiden Strategien konnten für drei Hybridproteine in den ersten Studien eine HIV-1 gp41 spezifische, breit neutralisierende humorale Immunantwort induziert werden. Diese Ergebnisse konnten jedoch in späteren Studien nicht reproduziert werden. Die Analyse der induzierten Immunantworten zeigte eine Verlagerung der Hauptimmunantwort als deren Ursache eine bakterielle Fremdinfektion der Versuchtiere diskutiert wurde. Zur Evaluierung der Immunisierungsstudien wurde ein neuartiger real time PCR basierter in vitro Neutralisationstest um Kontrollen zur Virusspezifität und Cytotoxizität erweitert. / The development of an effective HIV vaccine is considered the to play a key role in controlling the HIV pandemic. Conventional immunisation strategies using recombinant envelope proteins of the virus did not lead to the induction of a broad range protective immunity. A new target sequence for the induction of a broadly neutralising humoral immune response has been discovered through the characterization of the gp41 specific broadly neutralising monoclonal antibodies 2F5 and 4E10. Until now all attempts to induce 2F5/4E10 like neutralising antibodies failed. So far only the linear main epitope (E2) of 2F5 and 4E10, located in the C-terminal part of the gp41 ectodomain was used as the target sequence. However, it was recently shown that an N-terminal domain (E1) of gp41 increases the avidity of 2F5 to its epitope. The E1 domain may therefore be involved in the mediation of a neutralisation active binding. For the first time immunisation strategies have been developed that target both previously identified domains (E1 and E2) of gp41. The sequences corresponding to E1 and E2 have been introduced at homologous positions in the structurally related transmembrane envelope protein p15E of the Koala Retrovirus (KoRV). These generated hybrid antigens have been used for immunisation of wistar rats. They were applied as recombinant proteins expressed in E.coli and as DNA using a ballistic immunisation (GeneGun®) approach. Although in first trials neutralising antibodies specific for gp41 of HIV-1 were induced, these results could not be reproduced. Analysis of the induced antibodies showed a shift of their binding specifity. A bacterial infection of the used animals was identified as the cause of the unexpected shift in the antigen specific humoral immune response. For evaluation of the immunisation studies a new neutralisation assay based on the measurement of provirus integration by duplex real time PCR has been extended for controls of virus specifity and cytotoxicity.

Neuartige Vakzinierungsstrategien zur Aktivierung einer Tumor-spezifischen zellulären Immunantwort sind vielversprechende Ansätze zur Therapie von Tumoren, insbesondere Human Papillomvirus (HPV)-assoziierte Tumore. Bisherige HPV-Impfstudien zeigen zwar die Aktivierung einer spezifischen zellulären Immunantwort, eine Tumorreduktion bleibt jedoch aus. Um diesen Effekt auf Immunzellebene zu definieren, wurde die Wirkung der HPV-Vakzine Ad p14 im Mausmodell und an Untersuchungsmaterial humaner Tumore analysiert. In Mäusen bildeten sich HPV+ TC1-Tumore einer frühen Entwicklungsphase nach Vakzinierung zurück. Tumore einer späten Entwicklungsphase wuchsen dagegen in zwei Intervallen aus. Immunologische Eigenschaften der Tumorzellen blieben dabei unverändert. Unterschiede zeigten sich in den Frequenzen Tumor-infiltrierender Lymphozyten; in progressiven Phasen wurden nur CD4+ T Zellen nachgewiesen, in Regressionsphasen zusätzlich zytotoxische CD8+ T Zellen. Immunmodulatoren, wie Interferon alpha oder DTA-1, einem Antikörper für den Glucocorticoid-induzierten Tumornekrosefaktor-Rezeptor, unterstützten die Wirkung der Vakzine; letzterer erhöhte die Anzahl zytotoxischer CD8+ T Zellen und führte zur Abstoßung der TC1-Tumore. HPV+ Tumorgewebe des Menschen, wie auch ihre Vorstufen, zeigten im Vergleich zu anderen Tumoren, wie Bronchial oder Kolonkarzinomen einen signifikant höheren Anteil an CD4+ und CD8+ T Zellen und an Forkhead Box P3+ regulatorischen T Zellen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die immunologischen Abläufe bei der Entwicklung HPV-assoziierter Tumore mit denen vorangeschrittener chronischer Erkrankungen vergleichbar sind, in denen sich CD4+ und CD8+ T Zellantworten erschöpfen während sich gleichzeitig immunsuppressive Mechanismen verstärken. Um die Entwicklung von Impfstoffen zur Therapie HPV-assoziierter Tumore zu verbessern sollten diese Mechanismen ausführlicher betrachtet werden. / Novel vaccination strategies, activating cellular tumour specific immune responses represent a promising approach for the treatment of cancer. Especially featured for these treatments are tumours evolving from chronic human papillomavirus (HPV) infections. But current strategies have not yet proved efficacious for complete tumour regression. Addressing cellular immunological aspects of tumour vaccination, this work focused on effects of HPV vaccine Ad p14 in mice and in samples of human tumours. In mice vaccination resulted in complete regression of early stage murine HPV+ TC1 tumours. Late stage TC1 tumours increased discontinuously. During that process, TC1 cells preserved their immunological characteristics. But frequencies of tumour-infiltrating lymphocytes varied; in progressing tumours only CD4+ T cells occurred, in temporary regressing tumours also CD8+ T cells were detected. Immune modulators, like interferon alpha or glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor targeting antibody DTA-1 aggravated the effects of vaccination; latter raised cytotoxic CD8+ T cell numbers and resulted in complete tumour regression. Human HPV+ tumours as well as HPV+ precancerous stages revealed numbers of CD4+ and CD8+ T cells and especially of forkhead box P3+ regulatory T cells that were significantly increased compared to melanoma, bronchial or colon carcinoma. To assist further analysis of human HPV-associated cervical cancer and facilitate studies on therapeutic approaches, a humanized mouse model was established. The present work points to immunological exhaustion in the development of HPV-related tumours comparable to chronic diseases where CD4+ and CD8+ T cells exhaust and immunosuppression by regulatory T cells increases at the same time. For the development of appropriate strategies to enhance efficacy in HPV-associated tumour therapy, further knowledge of mechanisms involved in specific T cell activation, T cell exhaustion and immunosuppression is necessary.

Endotoxin-tolerante Zellen zeigen über mehrere Tage eine verminderte Produktion pro-inflammatorischer Zytokine, sodass epigenetische Veränderungen ein Grund für die Endotoxintoleranz sein könnte. Im 1. Teil wurden epigenetische Veränderungen an gezielten LPS-tolerisierbaren Genen mithilfe eines in-vitro-Modells mit humanen Monozyten untersucht. Die Gene kodierend für TNF und CXCL10 zeigten eine Reduktion der transkriptionsaktivierenden Histonmarker H3K27ac und H4ac, die durch eine stark reduzierte Genexpression in toleranten Monozyten begleitet wurde. Demgegenüber wiesen Gene wie IL6 und IL1B eine Zunahme an H4ac und H3K27ac auf, während ihre Genexpression in widersprüchlicher Weise reduziert war. Repressive epigenetische Marker (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA-Methylierung) konnten in den untersuchten Genen nicht nachgewiesen werden. Zudem war die IL6-Genexpression verstärkt abhängig von der Signaltransduktion toleranter Monozyten, was auf unterschiedliche Repressionsmechanismen schließen lässt. Im 2. Teil konnte gezeigt werden, dass die genomweite transkriptionelle Reprogrammierung durch eine globale Verschiebung von aktiven H3K27ac und H4ac in naiven Monozyten zu repressiven H3K9me2, H3K27me3 und H4K20me3 in toleranten, restimulierten Zellen einherging. Mehr als 10000 Genombereiche wiesen Veränderungen an Histonmarkern auf, obwohl nur 3638 Gene unterschiedlich exprimiert waren. Circa 27% der differentiell exprimierten Gene zeigten ein Expressionsmuster, welches mit Veränderungen an aktiven und/oder repressiven Markern innerhalb der Promoterregion korrelierte. Zudem zeigten intergenische Regionen einen verstärkten Anstieg an repressiven Histonmarkern, was auf eine mögliche regulatorische Funktion dieser Bereiche in der Endotoxintoleranz schließen lässt. Die Studie zeigt, dass die Epigenetik der Monozyten stark von der Endotoxintoleranzinduktion betroffen ist, wenn auch nicht alle Veränderungen dem beobachteten Genexpressionsmuster zugeordnet werden konnten. / Endotoxin-tolerant cells show a reduced ability to produce pro-inflammatory cytokines for several days, which assumes an impact of epigenetic changes in endotoxin tolerance induction. Using an in vitro model with human monocytes, the first part focused on the analysis of epigenetic changes in specific LPS-tolerizable genes. The genes encoding for TNF and CXCL10 showed a reduction in the transcription-activating histone marks H3K27ac and H4ac in tolerant monocytes, which was accompanied by a strongly reduced gene expression. In contrast, the IL6 and IL1B genes showed an increase in activating histone modifications, while their gene expressions were moderately reduced. Repressive epigenetic marks (H3K9me2, H3K27me3, H4K20me3, DNA methylation) were not specifically enhanced in the genes studied. Particularly the IL6 gene expression was more susceptible to the signaling strength in tolerant monocytes implying distinct mechanisms in the repression of the genes analyzed. Within the second part, genome-wide reprogramming of tolerant monocytes was accompanied by a global shift from activating H3K27ac and H4ac in naive monocytes to repressive H3K9me2, H3K27me3 and H4K20me3 in tolerant cells treated with LPS. More than 10000 genomic regions were distinctly regulated by histone marks, though only 3638 genes were differentially expressed. Correlation analyses identified 27 % of the differentially expressed genes that showed a transcriptional level consistent with changes in activating and/or repressive histone marks within their promoter regions. Intergenic regions were highly enriched for repressive histone marks in LPS-tolerant monocytes implying a regulatory function in endotoxin tolerance. The data indicate that the epigenetic environment of monocytes is highly affected by endotoxin tolerance induction, though not all changes are directly linked to the gene expression pattern observed.

Die Transplantation von porzinen Organen könnte eine Lösung des akuten Mangels von Allotransplantaten in der Transplantationsmedizin darstellen. Bevor die Xenotransplantation klinische Realität werden kann, sind jedoch zahlreiche Hürden zu überwinden. Insbesondere die mögliche Übertragung porziner endogener Retroviren (PERVs), die integraler Bestandteil des porzinen Genoms sind, stellt ein mikrobiologisches Risiko dar. PERVs können humane Zellen in vitro produktiv infizieren. Mögliche Strategien zur Abwehr von Xenosen sind die Verwendung von PERV-knockout Tieren oder die Entwicklung eines effektiven Impfstoffes, durch den der Transplantatrezipient vor einer möglichen Übertragung geschützt werden kann. Dazu wurden Antiseren gegen die Hauptstrukturproteine von PERV generiert. Es konnte gezeigt werden, dass in Ziegen und Ratten durch Immunisierung mit der rekombinant generiereten Ektodomäne des transmembranen Hüllprotein p15E neutralisierende Antikörper induziert werden konnten. Die Epitopkartierung der induzierten Antikörper zeigt eine Bindung an eine Domäne im N-terminalen, nahe des Fusionspeptids (E1, GPQQLEK) und eine Domäne im C-terminalen, membranproximalen (E2, FEGWFN) Bereich der p15E-Ektodomäne. Diese Sequenzen sind in allen PERVs identisch und innerhalb der Gammaretroviren hochkonserviert. Aus AIDS-Patienten isolierte neutralisierende Antikörper (mAb2F5: ELDKWA, mAb4E10: LWNWFN) binden ebenfalls an den C-terminalen Bereich der Ektodomäne des Transmembranproteins gp41. Der Bindungsmechannismus dieser Antikörper wurde in ELISA-Experimenten und in vitro-Inhibitionsassays analysiert. Die Ergebnisse legen die Bindung eines Konformationsepitopes nahe, das aus der E1 und der E2 Domäne gebildet wird. Die Aufklärung des Bindungsmechnismus breit neutralisierender Antikörper gegen Transmembranproteine von Retroviren könnte die Basis für neue Impfstoffansätze darstellen. / Porcine xenotransplants may offer a potential solution to the problem posed by the limited supply of allotransplants. However, xenotransplantation may be associated with the risk of transmission of microorganisms, in particular of porcine endogenous retroviruses (PERVs) that are an integral part of the porcine genome and able to infect human cells in vitro. Possible strategies to prevent virus transmission include the development of PERV knockout animals or of effective vaccines. When antisera prepared against the main structural proteins of PERV were screened, goat and rat antisera against the recombinant ectodomain of the transmembrane envelope protein p15E were found to neutralize PERV infectivity. Epitope mapping using overlapping peptides revealed two epitopes, one near the fusion peptide (E1, GPQQLEK) and the other near the transmembrane domain (E2, FEGWFN). These sequences are identical for all PERVs and are highly conserved among all gammaretroviruses. Interestingly, neutralizing antibodies isolated from AIDS patients that recognize regions partially homologous with E2 (mAb4E10, LWNWFN) or located in close proximity to E2 (mAb2F5, ELDKWA) are known to neutralize a broad range of HIV-1 strains. The binding mechanisms of these HIV neutralizing antibodies were analyzed in ELISA experiments and in vitro inhibition assays. The results indicate that the two most broadly reactive HIV-1 envelope gp41 human mAbs are specific for a discontinuous epitope composed of the E1 and the E2 domain. If so, these two transmembrane protein domains in different retroviruses act as effective targets for neutralizing antibodies and may provide the basis for effective antiretroviral vaccines.

Infektionen mit dem intestinalen Parasiten Giardia duodenalis, verursachen weltweit eine der häufigsten humanen Parasitosen. Bislang konnten keine eindeutigen Virulenz- oder Pathogenitätsmarker des Erregers beschrieben werden. Es wird allerdings vermutet, dass potentielle G. duodenalis Virulenzfaktoren Enzyme sind, die während des Kontaktes des Erregers mit den Dünndarmepithelzellen sezerniert werden. Eines dieser Enzyme ist die Arginin Deiminase (ADI), die Arginin zu Citrullin umwandelt. Ziel dieser Arbeit war es Merkmale zu identifizieren, die für die ADI als Virulenzfaktor sprechen. Dazu wurde das Enzym zunächst hinsichtlich seiner Bedeutung für die Wirt-Pathogen-Interaktion untersucht. Die mit rekombinanter, katalytisch aktiver ADI (Assemblage A) behandelten LPS-stimulierten humanen moDC zeigten eine Veränderung in ihrem Phänotyp als auch in ihrer Cytokinsekretion. Diese ließ sich auf die durch das Enzym hervorgerufene Arginindepletion und/oder auf die Bildung der Metabolite, Citrullin und NH4+, zurückführen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Parasitenisolate verschiedener G. duodenalis Assemblage A-Subtypen, vermutlich durch die katalytische Aktivität der ADI, die Stickstoffmonoxid-Bildung einer intestinalen Epithelzelllinie inhibiert. Neben dem Einfluss auf die Wirtsimmunantwort wurde auch die Variabilität in der kodierenden Sequenz des Enzyms in verschiedenen Parasitenisolaten analysiert. Anschließend erfolgte die funktionelle Charakterisierung des nativen (verschiedene Assemblage A-Subtypen) als auch des rekombinant aufgereinigten Enzyms (Assemblage A, B und E). Dabei zeigten sich Unterschiede in der Substrataffinität der ADI für Arginin, sowohl zwischen unterschiedlichen Assemblage A-Subtypen als auch unterschiedlichen Assemblage-Klassen. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die G. duodenalis ADI immunmodulatorische Effekte hat und das vermutlich eine Korrelation zwischen der Variation in der Primärstruktur und der Funktion des Enzyms besteht. / Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite that causes giardiasis, one of the most prevalent parasitic diseases worldwide. So far, little is known concerning host-parasite interaction, in particular what determines the parasite’s pathogenicity. Several potential virulence factors, among them the arginine deiminase (ADI) that hydrolyzes arginine into citrulline and NH4+, are discussed. The ADI was identified to be released upon contact with intestinal epithelium by Giardia trophozoites and was recognized as an immunoreactive protein during acute human giardiasis. Aim of the study was to identify hints for G. duodenalis ADI to be a virulence factor. First, to analyze the enzyme’s impact on host-parasite interplay, its influence on human monocyte-derived dendritic cells (moDC) was investigated. Treatment of LPS-stimulated cells with recombinant ADI of assemblage A changed DC phenotype (CD83, CD86) and cytokine secretion (TNF-α, IL-10, IL-12p40). These immunomodulatory changes in DC response were due to arginine depletion and the formation of reaction products, in particular, ammonium ions. Furthermore, trophozoites of different assemblage subtypes were shown, probably due to consumption of arginine by ADI, to reduce nitric oxide formation by intestinal epithelial cells in vitro. Second, variation in the ADI coding sequence of different G. duodenalis isolates being collected in a Giardia biobank was analyzed by sequencing. Subsequently, functional genetics were performed with native ADI of different assemblage A subtypes expressed by these strains as well as with purified, recombinant ADI of assemblage A, B and E. It was recognized that enzymes of the same subtype as well as of different assemblages types had different substrate affinities for arginine. To sum up, this report identified G. duodenalis ADI to be immunomodulatory and gives first indications of a correlation between enzyme function and variation of the protein primary structure.

Einige Patienten mit Raynaud-Syndrom, Urtikaria, koronarer Herzkrankheit, Angina pectoris, oder Pulmonaler Hypertonie haben funktionelle Autoantikörper gegen die Thrombin-Rezeptoren PAR1/2 und/oder gegen den Endothelin-Rezeptor ET(A). In dieser Arbeit wurde die Wirkung solcher Patienten-IgG-Präparate auf Funktionen von Ventrikel-Kardiomyozyten neonataler Ratten; humanen, glatten Muskelzellen aus Coronararterien (hCASMC), frisch isolierten, humanen Thrombozyten sowie von Monozyten untersucht. Zum Vergleich wurden die PAR-Agonisten Thrombin und das stimulierende Peptid SFLLRN sowie Endothelin-1 verwendet. Während aufgereinigte ET(A)-Autoantikörper ERK1/2 in Kardiomyozyten nicht aktivierten, bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern hier eine ähnliche Aktivierung wie das Peptid SFLLRN. Überraschenderweise bewirkte Kontroll-IgG eine starke Aktivierung von ERK1/2. Die Coinkubation der Kardiomyozyten mit Antikörper-Präparaten und IL-1beta erhöhte die Phosphorylierung von ERK1/2 in allen Fällen. In hCASMCs bewirkten IgG-Präparate mit PAR-Autoantikörpern und Kontroll-IgGs eine Aktivierung von ERK1/2, ET(A)-Autoantikörper nicht. Die Ergebnisse der Thrombozytenaktivierung durch Patienten-IgG waren unterschiedlich. Versuche mit vorstimulierten Thrombozyten zeigten, dass ein stimulierender Einfluss der Autoantikörper auf präaktivierte Thrombozyten nicht ausgeschlossen werden kann. Ohne Vorstimulation jedoch schien Patienten-IgG eher einen hemmenden Einfluss auf die Thrombozytenfunktion zu haben. Eine Vorinkubation von Monozyten mit Patienten-IgG hatte keinen Einfluss auf die PMA-induzierte Produktion von Superoxidanion im Vergleich zu Kontroll-IgG. Nur bei zwei von fünf Patienten-IgGs konnte eine stimulierende Wirkung anhand der monozytären ERK1/2-Phosphorylierung gefunden werden. Die Schlussfolgerung aus dieser Arbeit liegt darin, dass PAR1/2- und ET(A)-Autoantikörper keine allgemeine Wirkung auf die Funktion von glatten Gefäßmuskelzellen, Thrombozyten und Monozyten zeigten. Die Unterscheidung von Autoantikörper-positiven und -negativen IgG-Präparaten war nur über die Bestimmung der Pulsationsrate von Kardiomyozyten möglich. / Some patients with Raynaud’s syndrome, urticaria, coronary artery disease, Angina or pulmonary hypertension have functional autoantibodies against thrombin receptors PAR1/2 and/or against endothelin receptor ET(A). In this work the effects of such patients’ IgG preparations on functions of ventricular cardiomyocytes of neonatal rats, human smooth muscle cells from coronary arteries (hCASMC); freshly isolated, human platelets as well as monocytes were investigated. For comparison, the PAR agonists thrombin and the stimulating peptide SFLLRN as well as endothelin-1 were used. While purified autoantibodies against ET(A) did not activate ERK1/2 in cardiomyocytes, IgG preparations with autoantibodies against PAR1/2 resulted in a similar activation as the peptide SFLLRN. Surprisingly, control IgG also caused a strong activation of ERK1/2. Coincubation of cardiomyocytes with antibody preparations and IL-1beta increased the phosphorylation of ERK1/2 in all cases. In hCASMCs, IgG preparations with PAR-autoantibodies and control IgGs caused activation of ERK1/2, whereas ET(A)-autoantibodies did not. The results of platelet activation with patients’ IgG were varying. Tests with prestimulated platelets showed, that a stimulating effect of the autoantibodies on preactivated platelets can not be excluded. However, without prestimulation patients’ IgG rather seemed to have an inhibiting effect on platelet function. Preincubation of monocytes with patients’ IgG had no influence on PMA-induced production of superoxide anion compared with control IgG. Only two of five patients’ IgGs showed a stimulating effect on monocytic ERK1/2 phosphorylation. In conclusion, PAR1/2- and ET(A)-autoantibodies showed no common effects on the function of vascular smooth muscle cells, platelets and monocytes. The differentiation of autoantibody-positive and -negative preparations of IgG only was possible by determining the beating rate of cardiomyocytes.

Die Mehrzahl der im Thymus generierten CD4+CD25high regulatorischen T-Zellen (Treg) besitzt hohe Affinität gegenüber körpereigenen Antigenen. Es ist bekannt, dass T-Zell Rezeptoren (TCR) auf Treg Zellen in der Peripherie zusätzlich auch fremde Antigene verschiedener Pathogene wie Parasiten, Bakterien und Viren erkennen. Wenig ist bekannt über das klonale T-Zell Rezeptor Repertoire dieser Treg Populationen und ihre Beziehung zu CD4+CD25low effektor T-Zellen (Teff) im Menschen. In dieser Studie analysieren wir humane TCR auf expandierten Treg and Teff Zellen mit definierter Antigen Spezifität für Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II restringierte „fremde“ Epitope des Cytomegalovirus (CMV). Bemerkenswerterweise fanden wir, dass der gleiche TCR Vb-CDR3 Klon in beiden funktionell unterschiedlichen Subpopulationen in vitro dominant expandiert ist. Im Unterschied zu ihren klonal-identischen Teff Gegenspielern, exprimieren die suppressiven Treg Zellen kaum CD127 und IL-2, aber hohe Mengen an IFNg und IL-10. Zusammen mit der signifikant erhöhten FOXP3 Expression, trotz unvollständiger foxp3-DNA Demethylierung, lassen sich die CMV-spezifischen CD4+CD25high Treg Zellen einem induzierten Treg (iTreg) Phänotyp zuordnen mit Ähnlichkeit zum beschriebenen Tr-1 Phänotyp. Darüber hinaus konnten wir die klonale TCR Identität auch in frisch isolierten CD4+CD25low und CD4+CD25high Subpopulationen bestätigen, was die Entstehung von CMV-spezifischen Treg Zellen bereits in vivo nahe legt. Periphere CD25high Treg Zellen supprimieren die anti-virale Immunantwort in Patienten mit häufigen CMV-Reaktivierungen, was auf ihre Bildung als Reaktion chronischer Antigenexposition interpretiert werden kann. Unsere Ergebnisse beweisen erstmals direkt, dass aus dem gleichen humanen T-Zell Klon Teff und Treg Zellen mit identischer Spezifität entstehen können und lassen vermuten, dass die Treg Induktion in der Peripherie durch häufige Antigenexposition vorangetrieben wird. / The majority of thymically arised regulatory CD4+CD25high T cells (Treg) show high affinity to self-antigens. It has been proposed that T-cell receptors (TCR) on Treg cells in the periphery also recognize foreign-antigens from pathogens, such as bacteria and viruses. Studies in mice have shown that peripheral Treg cells can be generated not only from naïve T cells but also from effector T cells (Teff). However, in humans the clonal TCR-repertoire of these Treg populations and their relation to effector CD4+CD25low Teff is not sufficiently known up to date. Here, we analyzed human TCRs derived from expanded Treg and Teff cells with defined specificity to MHC class-II restricted “foreign” epitopes of Cytomegalovirus (CMV). Remarkably, we found that both functionally distinct subsets share the same dominant TCR-CDR3 clones in vitro. In contrast to their Teff counterparts, the Treg cells express low CD127 and IL-2, but high IL-10 upon antigen stimulation. Therefore, together with increased FOXP3 expression, but incomplete foxp3 DNA-demethylation, human CMV-antigen specific Treg cells exhibit an induced phenotype (iTreg) in vitro with similarity to recently described Tr-1 phenotype. Moreover, the clonal identity was confirmed in freshly isolated CD4+CD25low and CD4+CD25high subsets, suggesting their generation occurred already in vivo. Peripheral CD25high Treg cells suppress the anti-viral immune response in patients with frequent CMV-reactivations, implying their development as reaction on chronic antigen-exposure. Our results demonstrate directly for the first time, that the same human T-cell clone can possess the phenotype of Teff and Treg cells with specificity to identical foreign epitopes and suggest that Treg-induction in the periphery is supported by frequent antigen-exposure.

Einleitung: Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 (EcN) wird seit einigen Jahren erfolgreich in der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen angewendet, der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist jedoch nur unzureichend geklärt. T-Zellen spielen in der intestinalen Immunhomöostase und der Pathogenese von CED eine zentrale Rolle. Ziel: Den Einfluss von EcN auf humane T-Zellen weitergehend zu charakterisieren. Methoden: CD3-stimulierte periphere und Lamina propria T-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen eines E. coli Nissle 1917 konditionierten Mediums (EcN-CM) oder aber hitzeinaktivierten E. coli Nissle 1917 (hi-EcN) kultiviert. Die Expression von zellzyklus- und apoptoseassoziierten Regulationsproteinen sowie DNA-Gehalt, Zellzykluskinetik, Apoptoserate und Zellexpansion wurden durchflusszytometrisch und im Western Blot bestimmt. Die Sekretion von Cytokinen wurde mit dem Cytometric Bead Assay bestimmt. Ergebnisse: EcN-CM, nicht aber hitzeinaktivierte E. coli Nissle 1917 hemmt die Zellzyklusprogression und die Expansion von stimulierten, humanen peripheren T-Zellen. Ursächlich hierfür ist eine verminderte Expression der Cykline A, B1, D2 und E mit einer konsekutiv verminderten Phosphorylierung des Retinoblastomaproteins. Periphere T-Zellen sezernieren unter EcN-CM vermindert IL-2, IFN-gamma und TNF-alpha, während die Sekretion des antiinflammatorischen IL-10 durch EcN-CM heraufreguliert wird. Im Gegensatz zur potenten Beeinflussung des Zellzyklus, wurde die Apoptose von PBT durch E. coli Nissle 1917 nicht moduliert. Während periphere T-Zellen durch EcN-CM in ihrer Zellzyklusprogression und Expansion gehemmt wurden, zeigte sich kein derartiger Effekt auf ortständige Lamina propria T-Lymphozyten. Diskussion: Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer Rekrutierung und Aktivierung von peripheren T-Zellen in die intestinale Mukosa. Durch die differenzielle Beeinflussung des Immunsystems, bei der aktivierte periphere T-Zellen inhibiert, die ortsständigen T-Zellen jedoch in ihrer Funktion nicht gestört werden, könnte E. coli Nissle 1917 dazu beitragen, die mukosale Entzündungsreaktion zu limitieren, während die intestinale Immunhomöostase gewahrt bleibt. Als wirksames Agens kommen kleine, hitzestabile bakterielle Produkte wie Lipopolysaccharide, bakterielle Lipoproteine, CPG-DNA, Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane in Frage. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern weitere Hinweise, dass Probiotika einen breiten Einfluss auf das humane Immunsystem haben und decken zugrundeliegende Mechanismen auf. / Introduction: Although probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been proven to be efficacious for the treatment of inflammatory bowel diseases, the underlying mechanisms of action still remain elusive. T cells play a major role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Aims: To analyze the effects of E. coli Nissle 1917 on cell cycling and apoptosis of peripheral blood and lamina propria T cells. Methods: Anti-CD3-stimulated peripheral or lamina propria T cells were treated with E. coli Nissle 1917-conditioned medium (EcN-CM) or heat-inactivated E. coli Nissle 1917. Expression of cell cycle or apoptosis related proteins was determined by immunoblotting, DNA content, cell cycle kinetics, cell expansion and apoptosis were measured by flow cytometry. Cytokine levels in culture supernatants were assessed by cytometrc bead array. Results: EcN-CM but not heat-inactivated EcN inhibits cell cycling and expansion of peripheral T cells. EcN-CM decreases expression of Cyclin A, B1, D2 and E and thus reduces phosphorylation of retinoblastomaprotein in CD3-stimulated peripheral T cells. Further, secretion of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-gamma and TNF-alpha is reduced while antiinflammatory IL-10 is increased under treatment with EcN-CM. In contrast to peripheral T cells, expansion and cell cycle progression of lamina propria T cells was not affected by EcN-CM. Apoptosis of was not modulated by EcN-CM. Discussion: The differential reaction of circulating and tissue-bound T cells towards E. coli Nissle 1917 may explain the beneficial effect of EcN in intestinal inflammation. EcN may downregulate the expansion of newly recruited T cells into the mucosa and thus limit intestinal inflammation, while already activated tissue-bound T cells may eliminate deleterious antigens in order to maintain immunological homeostasis. Possible agents, for which immunomodulatory effects are known, include heat-stable bacterial products like lipopolysaccharids, bacterial lipoproteins or bacterial DNA-motifs.

Interleukin(IL)-22, ein Zytokin der IL-10-Interferon-Familie, beeinflusst die Funktion von Gewebezellen, wirkt jedoch nicht auf Immunzellen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass IL-22 in Keratinozyten nur eine begrenzte Anzahl von Genen in ihrer Expression reguliert, was eine Hemmung der terminalen Differenzierung und eine Steigerung der antimikrobiellen Abwehr und der zellulären Mobilität bewirkt. Diese IL-22-Effekte konnten in vivo aufgrund ihrer Induzierbarkeit durch eine IL-22-Behandlung in Mäusen bestätigt werden und fanden sich darüber hinaus in der läsionalen Haut von Patienten mit Psoriasis wieder. Eine pathogenetische Rolle von IL-22 bei Psoriasis wurde durch eine gefundene Erhöhung der IL-22-Spiegel im Blut dieser Patienten und eine Korrelation dieser mit dem Schweregrad der Erkrankung untermauert. Eine Untersuchung der Wirkung von IL-22 auf Hepatozyten zeigte, dass IL-22 in diesen Zellen die Produktion des LPS-Bindungsproteins (LBP) steigert, welches in hohen Konzentrationen bakterielle Bestandteile neutralisiert. In vivo zeigte sich, dass eine IL-22-Gabe in der Maus eine verstärkte Expression von LBP in der Leber und erhöhte sytemische LBP-Spiegel bewirkt. Diese Hepatozyten-spezifische IL-22-Wirkung spiegelte sich bei Patienten mit Morbus Crohn in erhöhten systemischen LBP-Spiegeln wieder. Bei der Psoriasis steht vor allem der regenerative Phänotyp der Keratinozyten, gekennzeichnet durch eine verminderte terminale Differenzierung und eine gesteigerte Mobilität, im Vordergrund und bildet die Ursache für die klinisch sichtbaren epidermalen Veränderungen. Demgegenüber könnte bei Morbus Crohn IL 22 durch die Induktion von hepatozytärem LBP zur Neutralisierung von durch die gestörte Darmbarriere ins Blut translozierte bakterielle LPS zur lokalen Begrenzung der Entzündung beitragen. Ausgehend von diesen Beobachtungen wäre eine IL-22-Neutralisierung bzw. IL-22-Applikation ein innovativer Therapieansatz für die Behandlung von Psoriasis und Morbus Crohn. / Interleukin(IL)-22, a cytokine belonging to the IL-10-Interferon-family, regulates the function of tissue cells, but not of immune cells. Here, I could show, that in keratinocytes IL-22 regulates the expression of a limited number of genes leading to an inhibition of the terminal differentiation and an increase of the antimicrobial defense and cellular mobility. These IL-22 effects were also confirmed in vivo as they could be induced in mice by IL-22-treatment and moreover, were also found to be present in the lesional skin of psoriasis patients. A pathogenetic role of IL-22 in psoriasis was substantiated by the finding that IL-22 level are elevated in the blood of these patients and correlated with the disease severity. By investigating the influence of IL-22 on hepatocytes, I found an increase of LPS-binding protein (LBP) production by IL-22, a protein which neutralizes bacterial components at high concentrations. In vivo, IL-22 treatment of mice led to a high hepatic LBP expression and elevated blood LBP level. This hepatocyte-specific IL-22 effect was reflected in patients with crohn´s disease in elevated systemic LBP level. In psoriasis, especially the regenerative phenotype of keratinocytes, characterized by the distorted terminal differentiation and enhanced mobility, is a key feature and the basis for the clinically visible epidermal alterations. In contrast, in crohn´s disease by inducing hepatic LBP production IL-22 likely contributes to the neutralisation of LPS translocated into the blood via the distorted intestinal barrier and thereby to a local limitation of inflammation. Based on these observations a neutralisation or application of IL-22 would be an innovative therapeutic approach for the treatment of psoriasis and crohn´s disease, respectively.

Das Humane Cytomegalievirus (HCMV) ist ein ubiquitäres Pathogen, welches den Metabolismus der Wirtszelle auf vielfältige Weise manipuliert, um seine eigene Vermehrung zu begünstigen. In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass auch das Ubiquitin-Proteasom-System in die HCMV-Replikation involviert ist. So konnte zunächst gezeigt werden, dass die Chymotrypsin-ähnliche (CT-L) Aktivität des konstitutiven Proteasoms in HCMV-infizierten Zellen signifikant erhöht ist. Wurde die CT-L Proteasomaktivität durch Proteasominhibitoren (PI) blockiert, so hatte dies die Hemmung der HCMV-Replikation zur Folge. Die Charakterisierung des Einflusses von PI auf die virale Proteinexpression ergab, dass bei niedriger MOI (MOI 0.1) deutlich verringerte Mengen der sehr frühen Proteine vorlagen, dieser Effekt jedoch bei hoher MOI (ab MOI 1) aufgehoben war. Die Expression früher Proteine war MOI-unabhängig reduziert. Hingegen war die Expression der späten Proteine MOI-unabhängig vollständig unterdrückt. Studien mit dem Nukleosidanalogon BrdU ergaben zudem, dass die de novo Synthese viraler DNA blockiert war. Um erste Hinweise auf den Wirkungsmechanismus von PI zu erhalten, wurde untersucht, ob der Transkriptionsfaktor NF-kappaB oder zelluläre Transkriptionsrepressoren wie z.B. hDaxx am anti-HCMV-Effekt beteiligt sind. Durch die Charakterisierung einer Virusmutante mit Deletion der NF-kappaB-Bindestellen im MIE-Enhancer/Promotor konnte gezeigt werden, dass der antivirale Effekt von PI nicht auf der Hemmung der Aktivierung von NF-kappaB beruht. Experimente mit hDaxx-knockdown Zellen ergaben hingegen, dass die Stabilisierung des Transkriptionsrepressors hDaxx partiell zum anti-HCMV-Effekt von PI beiträgt. Darüber hinaus müssen jedoch weitere virale oder zelluläre Zielproteine existieren, deren Beeinflussung durch PI kritisch für die Virusreplikation ist. Zusammenfassend stellt das Proteasom somit einen neu identifizierten potentiellen Angriffspunkt für die anti-HCMV-Therapie dar. / The Human Cytomegalovirus (HCMV) is a ubiquitous pathogen that manipulates many aspects of the host cell metabolism to enhance viral replication. This work demonstrates that the ubiquitin-proteasome system is also involved in HCMV replication. First of all, the chymotrypsin-like (CT-L) activity of the constitutive proteasome was significantly increased in HCMV infected cells. In the presence of proteasome inhibitors (PI) viral replication was efficiently blocked. Characterisation of the influence of PI on viral protein expression showed that immediate early protein expression was clearly reduced at low MOI (MOI 0.1); however, this effect was abolished at high MOI (starting from MOI 1). Expression of early proteins was significantly decreased independently of the MOI used for infection. In contrast, late protein expression was completely suppressed at both low and high MOI. Additionally, studies using the nucleoside analogue BrdU showed that PI block the de novo synthesis of viral DNA. In order to gain insight into the working mechanism of PI the involvement of the transcription factor NF-kappaB and cellular repressors of transcription (e.g. hDaxx) in the antiviral effect of PI was examined. Studies using a mutant virus carrying deletions of the NF-kappaB binding sites in the MIE-enhancer/promoter revealed that the anti-HCMV effect of PI is not due to inhibition of NF-kappaB activation. Analyses using hDaxx-knockdown cells showed that stabilisation of the transcriptional repressor hDaxx partially contributes to the antiviral effect of PI. However, the existence of additional viral or cellular target proteins of PI is very likely. In summary, the proteasome thus represents a newly identified and promising target for anti-HCMV therapy.