Im Fokus dieser Arbeit stand die Analyse von Faktoren, die den Zusammenbau des Flagellenapparates von Legionella pneumophila (Lp) regulieren. Mit einem kombinierten Replikations-/ Überlebensversuchs mit Lp Corby oder Lp Paris und ihren zugehörigen Regulationsmutanten wurde eine verminderte Fitness für dfliA und erstmals für drpoN, dfleQ defiziente Stämme nachgewiesen. Zur Validierung von Microarray-Daten aus Lp Paris wurden wachstumsphasenabhängige Transkriptions- und Translationsanalysen mit Lp Corby Wildtyp und drpoN, dfleQ, dfliA und dflaA defizienten Stämmen durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die basale Expression von fliA in den späteren Phasen unabhängig von RpoN und FleQ stattfindet. In dieser Arbeit konnte erstmals der Transkriptionsstartpunkt des Hauptregulators FliA bestimmt werden. Es zeigte sich eine putative RpoD (S70) Bindungsstelle. Ein Modell zur Regulation der fliA Expression wurde weiterentwickelt. Demnach kommt es in der exponentiellen Phase durch das Zusammenwirken von RpoD und DksA, aber unabhängig von FleQ, zur basalen fliA Promotoraktivität. Durch den Übergang in die transmissive Phase und direkte oder indirekte Interaktion mit FleQ sowie dem Alarmon ppGpp scheint es zu einem Austausch des Sigmafaktors S70 gegen SS und zu einer Aktivierung der fliA Expression zu kommen. Elektronenmikroskopische Studien zeigten, dass drpoN und dfleQ defiziente Mutanten wahrscheinlich aufgrund des fehlenden Basalkörpers nicht flagelliert sind. Mutanten für dfliA, dflaA und dfliD hatten ebenfalls keine Flagelle, zeigten aber eine ungewöhnliche, gerade Hook Struktur, die den Zusammenbau des Basalkörpers demonstriert. Weiterhin wurden durch in silico Studien 15 Legionella Spezies in Bezug auf das Flagellensystem und ein putatives Chemotaxissystem untersucht. So konnte L. oakridgensis als erste Art ohne beide Systeme sequenziert werden. Andererseits konnten mit LLAP12, L. bozemanii, L. gormanii und L. lytica Stämme beschrieben werden, die beide Systeme tragen. / This work focused on the analysis of factors contributing to the regulation of the flagellum self-assembly of Legionella pneumophila (Lp). With a combined replication/survival assay with Lp Corby or Lp Paris and their corresponding regulatory mutants a reduced fitness could be verified for dfliA and for the first time for drpoN, dfleQ deficient strains. For validation of microarray-data for Lp Paris with strain Lp Corby a growth phase dependent analysis of transcription and translation rates was done with wild-type and the drpoN, dfleQ, dfliA and dflaA deficient strains. A regulation of basal fliA expression independently from RpoN and FleQ was shown in the later growth phases. Furthermore the transcriptional start site of fliA could be shown for the first time. A RpoD (S70) binding site could be identified. According to a further developed model for the regulation of the fliA expression RpoD and DksA lead to a basal fliA promotor activity, independently from FleQ. Most likely, during transition to stationary phase, direct or indirect interaction with FleQ and the alarmone ppGpp results in the exchange of the sigma factor S70 and the binding of RpoS. This leads to the activation of fliA expression. Electron microscopic studies revealed that drpoN and dfleQ deficient mutants are not flagellated caused by the missing basal body. Mutants of dfliA, dflaA and dfliD were also aflagellated, but there was a uncommon straight hook structure visible which demonstrates a filament-independent assembly of the basal body. Furthermore, in silico analysis was done with 15 Legionella species with regard to the flagellum regulation system and a putative chemotaxis system. Analysis revealed that the strain L. oakridgensis is the first strain lacking both systems. On the other hand the strains LLAP12, L. bozemanii, L. gormanii and L. lytica could be characterized as strains carrying both systems.

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit Nachweismöglichkeiten von Helicobacter pylori und deren Vergleich. Hierfür ist eine genaue Kenntnis der Helicobacter-Proteine notwendig. Zu diesem Zweck wurde die humorale Immunantwort gegenüber Helicobacter pylori unter Anwendung der Methodik des zweidimensionalen Immunoblots analysiert. Zunächst wurden Proteine des autologen Helicobacter pylori-Stammes über zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrocellulose-Membranen geblottet und sodann mit Antikörpern aus autologem Plasma sowie Antikörpern aus dem Überstand von in vitro kultiviertem autologem Biopsiematerial detektiert. Zur Bestimmung einer Helicobacter-Infektion wurden andere invasive und nicht invasive Tests genutzt. In einer prospektiven Untersuchung wurden über 200 konsekutive Patienten mit gastrointestinalen Beschwerden und unbekanntem H. pylori-Status, die für eine Gastroskopie vorgesehen waren, routinemäßig untersucht. Bei jeder Gastroskopie wurden zwei Antrum- und zwei Korpusbiopsien zur Gastritis-Diagnostik und zur Bestimmung des H. pylori-Status entnommen. Es wurden Assoziationen zwischen einer Infektion mit Helicobacter pylori und Erkrankungen wie akute und chronische Gastritis, gastraler und duodenaler Ulkus, Magenkarzinom und Folgeerkrankungen der Gastritis überprüft. Dabei wurden auch die eindeutig Helicobacter pylori-negativen Seren mit den positiven Seren verglichen. Trotz ungleichmäßiger Verteilung der Patientenzahlen über die einzelnen Krankheitsgruppen (Gastritis, Ulkus, Karzinom) wurden bestimmte Proteine nur bei einer der Erkrankungen erkannt. Einige Proteinspots kamen deutlich intensiver bei einer einzigen Krankheitsgruppe vor. Anzustreben sind Studien mit größeren Patientenzahlen innerhalb der einzelnen Krankheitsgruppen, um mögliche weitere Assoziationen bestimmter Helicobacter-Antigene mit Folgeerkrankungen zu analysieren und zu verifizieren. Ferner wurde das Vorliegen einer Assoziation des zweidimensionalen Immunoblots mit anderen invasiven und nicht invasiven Nachweisverfahren der H. pylori-Infektion analysiert. Dabei wurde das Antigenprofil des H. pylori, sowohl qualitativ als auch quantitativ, berücksichtigt. Durch die Charakterisierung und Identifizierung einer bedeutenden Anzahl von Helicobacter-Proteinen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit für ein zukünftig beschleunigtes Screening in Richtung protektiver Vakzine-Kandidaten. / The present study is concerned with practicable methods of detecting Helicobacter pylori and comparing them. As a precondition, a precise knowledge of the proteins of Helicobacter is necessary. To this end the humoral immune response of Helicobacter pylori was analysed by using the method of two-dimensional immuno blots. First, the proteins of each autologous Helicobacter pylori strain were separated by two-dimensional electrophoresis, then blotted onto nitrocellulose membranes and eventually detected by using antibodies from autologous plasma and antibodies taken from the overflow of in vitro cultivated autologous biopsy material. For determining a Helicobacter infection various invasive and non-invasive tests were carried out. In a prospective study on more than 200 patients with gastrointestianal disorders but unknown H. pylori status were consecutively tested. At each gastroscopy two bioptic specimen each were taken from the antrum and from the corpus region in order to determine the H. pylori status. Associations were assessed between Helicobacter pylori infections and manifestations such as acute or chronic gastritis, gastric or duodenal ulcers, gastric carcinoma and gastritis induced disorders. In the process, clearly Helicobacter pylori negative sera were also compared with positive sera. Inspite of the unequal distribution of numbers of patients over different groups of disorders (gastritis, ulcers, carcinoma) certain proteins were only detected in connection with one group of disorder. Several of the protein spots only occurred in a single group of disorders. More studies will be necessary using greater numbers of patients within each group of diseases in order to analyse and verify associations between Helicobacter antigenes and other disorders. Further, evidences of an association between two-dimensional immunoblots and other invasive and non-invasive methods of assessing H. pylori were analysed with regard to respective antigene profiles, qualitatively as well as quantitatively. Based upon the presented characterizations and identifications of an unusually great number of Helicobacter proteins the probability is thus increased considerably with regard to improved screening methods towards protective vaccine candidates.

Die Allele (*R1, *R2, *S1 und *S2) des A. gambiae complement-like thioester-containing Protein 1 (TEP1) bestimmen die Fitness der Mücken, welches die männlichen Fertilität und den Resistenzgrad der Mücke gegen Pathogene wie Bakterien und Malaria-Parasiten. Dieser Kompromiss zwischen Reproduktion und Immunnität hat Auswirkungen auf die Größe der Mückenpopulationen und die Rate der Malariaübertragung. Wie die genetische Diversität von TEP1 die genetische Struktur natürlicher Vektorpopulationen beeinflusst, ist noch unklar. Die Zielsetzung dieser Doktorarbeit waren: i) die biogeographische Kartographierung der TEP1 Allele und Genotypen in lokalen Malariavektorpopulationen in Mali, Burkina Faso, Kamerun, und Kenia, und ii) die Bemessung des Einflusses von TEP1 Polymorphismen auf die Entwicklung humaner P. falciparum Parasiten in der Mücke. Die Analysen der TEP1 Polymorphismen zeigten, dass die natürliche Selektion auf Exone, sowie Introne wirkt, was auf eine starke funktionale Beschränkung an diesem Lokus hindeutet. Außerdem zeigen unsere Daten die strukturierte Erhaltung natürlicher genetischer Variation im TEP1 Lokus, in welchem die Allele und Genotypen spezifische evolutionäre Wege verfolgen. Diese Ergebnisse weisen auf die Existenz von arten- und habitatspezifischen Selektionsdrücken hin, die auf den TEP1 Lokus wirken. Resultate haben gezeigt, dass TEP1*S1 und *S2 Mücken gleichermassen empfänglich für Plasmodium-Infektionen sind. Insgesamt tragen die Resultate der biogeographischen Kartographierung des TEP1 Lokus und der Züchtungs- und Infektionsexperimente zu einem besseren Verständnis über den Einfluss der verschiedenen Vektorarten und lokale Umwelteinflüsse auf die Vektorpopulationen und Malariaübertragung bei. Des weiteren kann die hier beschriebene hochdurchsatz-genotypisierungs Methode, zur Studie lokaler A. gambiae Mückenpopulationen, in der Feldforschungsarbeit eingesetzt werden. Dieser neue Ansatz wird die epidemiologisch relevante Überwachung und Vorhersage dynamischer Prozesse in lokalen Malariavektorpopulationen unterstützen, welche die Entwicklung neuer Strategien der Vektorkontrolle ermöglichen könnten. / The alleles (*R1, *R2, *S1 and *S2) and genotypes of A. gambiae complement-like thioester-containing protein 1 (TEP1) determine the fitness in male fertility and the degree of mosquito resistance to pathogens such as bacteria and malaria parasites. This trade-off between the reproduction and the immunity impacts directly on mosquito population abundance and malaria transmission respectively. How TEP1 genetic diversity influences the genetic structure of natural vector populations and development of human malaria parasites is unclear. The aims of this thesis were to: i) map distribution of TEP1 alleles and genotypes in local malaria vector populations in Mali, Burkina Faso, Cameroon and Kenya, and ii) assess the impact of TEP1 polymorphism on development of human P. falciparum parasites in mosquitoes. Analyses of TEP1 polymorphism revealed that natural selection acts in concert on both exons and introns, suggesting strong functional constrains acting at this locus. Moreover, our data demonstrate a structured maintenance of natural TEP1 genetic variation, where the alleles and the genotypes follow distinct evolutionary paths. These findings suggest the existence of species- and habitat-specific selection patterns that act on TEP1 locus. Results revealed that the TEP1*S1 and *S2 mosquitoes are equally susceptible to Plasmodium infections. Collectively, results of my thesis on the biogeographic TEP1 mapping, and on the breeding and infection experiments contribute to a better understanding of how the vector species and local environmental factors, shape vector population structures and malaria transmission. Furthermore, the high throughput TEP1 genotyping approach reported here could be used for field studies of local A. gambiae mosquito populations. This new approach will benefit surveilance and prediction of dynamics in local malaria vector populations that may have epidemiological significance, and therefore inform the development of novel vector control measures.

Im Unterschied zu anderen RNA Viren vervielfältigen Influenzaviren ihr Genom im Zellkern infizierter Zellen. Für die erfolgreiche Vermehrung müssen neu gebildete Genomsegmente (virale Ribonukleoproteine, vRNPs) wieder aus dem Zellkern exportiert werden. Dafür nutzt Influenza einen Exportkomplex, der sich aus dem viralen Matrixprotein 1 (M1) und Nukleusexportprotein (NEP) zusammensetzt und vRNPs unter Verwendung des zellulären Exportproteins CRM1 aus dem Zellkern transportiert. Zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit dem Exportkomplex sind noch unbeantwortet: Wie viele Exportkomplexe werden pro vRNP gebunden? Wie interagieren die Proteine innerhalb des Komplexes mit vRNPs? Wie wird die zeitliche und räumliche Präsenz der beteiligten Proteine im Verlauf der Infektion reguliert? Um zu einem besseren Verständnis beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie und molecular brightness-Analysen genutzt, um die Oligomerisierung der beteiligten Exportkomplexproteine zu quantifizieren. Werden Fluoreszenzproteine für solche Untersuchungen verwendet, treten häufig nicht-fluoreszente Zustände auf, die die Bestimmung des Oligomerzustandes beeinflussen. Daher wurde in dieser Arbeit ein einfaches Korrekturmodel vorgestellt, das die Population an nicht-fluoreszenten Zuständen berücksichtigt, und somit die genaue Bestimmung des Oligomerzustandes erlaubt. Dadurch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass NEP Homodimere im Zytoplasma ausbildet, wohingegen eine um das 2,5-fach geringere Homodimerpopulation im Zellkern vorhanden war. Durch die Integration von Informationen über den Lokalisationsphänotyp und den Oligomerzustand von NEP sowie mehrerer Mutanten, konnte ein Modell abgeleitet werden, dass den Regulationsmechanismus beschreibt: Durch vorrübergehendes Maskieren und Demaskieren der beiden Nukleusexportsignale wird der Transport von NEP reguliert. Die Dimerisierung im Zytoplasma und Monomerisierung im Zellkern unterstützen diesen Mechanismus. / Influenza viruses are the causative agent of severe epidemics and pandemics, causing up to 650,000 deaths annually. Unlike other RNA viruses, Influenza viruses replicate their genome within the nucleus of cells. Hence, progeny genome segments - viral ribonucleoproteins (vRNPs) - need to be exported from the nucleus to complete the replication cycle. To fulfil this task, Influenza relies on a viral nuclear export complex built from M1 and NEP, that mediates export by hijacking the cellular CRM1-dependent export machinery. In this context a number of questions remain unanswered, such as how many export complexes bind to a single vRNP, what is the exact interaction pattern of vRNPs with export complex proteins, and how translocation of nuclear export relevant proteins such as NEP are regulated and optimally timed during the course of infection? In the present study, the potential of NEP to form homo-dimers in situ was shown for the first time by applying fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) and molecular brightness analysis, that allows determination of protein oligomerization in living cells. However, when using fluorescent proteins in FFS studies non-fluorescent states are observed, which strongly affect molecular brightness analysis. Therefore, in this study a simple correction model was described, taking into account quantified non-fluorescent state fractions, to finally allow accurate and unbiased determination of oligomerization. This way it was shown, that NEP forms homo-dimers within the cytoplasm of cells, whereas a 2.5-fold lower homo-dimer population was observed in the nucleus. Combining the subcellular localization dependent oligomeric state of NEP and several NEP mutants with their localization phenotypes, a regulation mechanism was proposed in which the translocation of NEP is regulated by transient masking and unmasking of its two NESs, which is supported by dimerization in the cytoplasm and monomerization in the nucleus of cells, respectively.

Influenza Viren stellen eine große Bedrohung der öffentlichen Gesundheit dar. Die saisonale Grippeschutzimpfung induziert Antikörper gegen den Kopfbereich des viralen Oberflächenproteins Hämagglutinin (HA), in dem verstärkt Antigendrift auftritt. Dadurch wird die Effektivität der saisonalen Grippeimpfung auf den Impfstamm beschränkt und es besteht kein ausreichender Schutz gegen virale Driftvarianten. Eine universellere Grippeimpfung wird dringend benötigt. Die Entdeckung breit reaktiver Antikörper gegen den konservierten HA-Stammbereich hat die Erforschung neuartiger Impfstrategien vorangetrieben. Mit Chimären oder Headless HA kann eine Fokussierung der Immunantwort auf immunsubdominante Bereiche im HA-Stammbereich erzielt werden. Auch innovative Impfstoffplattformen wie Adeno-assoziierte Virus (AAV)-Vektoren bergen ein immenses Potenzial, da sie zum einen für die Verwendung im Menschen zugelassen sind und zum anderen die Immunogenität des Antigens positiv beeinflusst. Die Immunisierung mit AAV-Vektoren, die wildtypisches HA, Chimäre HA oder Nukleoprotein exprimieren, führte in dieser Arbeit in Mäusen zur Induktion breit reaktiver Antikörper, nicht aber die Immunisierung mit AAV-Headless HA oder inaktiviertem Grippeimpfstoff. Die AAV-Vektor Impfstoffe führten zur robusten Induktion Fc-Gamma-Rezeptor-aktivierender Antikörper, die beispielsweise Antikörper-vermittelte zelluläre Zytotoxizität auslösen können. Nicht nur die Impfung mit AAV-Chimären HA, sondern auch mit AAV-wildtypischem HA induzierte Antikörper gegen den HA-Stammbereich. Somit kann anscheinend allein durch eine AAV-Vektor vermittelte Expression des Antigens die Immundominanz des HA-Kopfbereiches abgemildert werden. Abschließend konnte zum ersten Mal die Schutzwirkung einer AAV-Vektor Immunisierung gegen HA im Frettchen demonstriert werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse zeigen somit das große Potenzial von AAV-Vektoren als Impfvehikel für eine breit reaktive Grippeschutzimpfung auf. / Influenza viruses represent a severe threat to public health. A seasonal vaccine is available, which readily leads to the induction of antibodies against the head domain of the viral surface protein hemagglutinin (HA), which is prone to antigenic drift. Thus, seasonal vaccination induces only strain specific protection, while it is not effective against drifted virus strains. Hence, there is an urgent need for a universal influenza vaccine. The discovery of broadly reactive antibodies against the highly conserved HA-stalk domain has prompted great interest into research on vaccination strategies to induce broadly protective HA antibodies. Chimeric and headless HA have shown promising results with respect to re-focusing immunity towards immunosubdominant epitopes in the HA-stalk to induce protective HA-stalk antibodies. Also, innovative vaccine delivery platforms such as Adeno-associated virus (AAV)-vectors offer an attractive developmental perspective. AAV-vectors are licensed for use in humans and the AAV-vectored antigen expression positively influences its immunogenicity. In this thesis, immunization with AAV-vectors expressing wildtype HA, chimeric HA or nucleoprotein induced broad protection in mice, but not vaccination with AAV-vectors expressing headless HA or an inactivated influenza vaccine. Protection was associated with the ability of the AAV-vectored vaccines to induce Fc-gamma-receptor-activating antibodies, which might activate antibody-dependent cellular cytotoxicity. Not only chimeric HA but also wildtype HA induced antibodies against the HA-stalk, suggesting that AAV-vectored antigen expression can mitigate the immunodominance of virus strain-specific epitopes in the HA-head. Importantly, for the first time a protective effect AAV-vectored immunization towards HA could be shown in ferrets. Thus, results described in this thesis suggest a large potential for the development of AAV-vectors as carriers for a broadly protective influenza vaccine.

Eimeria falciformis ist ein Apicomplexa-Parasit, welcher das Blinddarmepithel der Maus befällt. Aufgrund des monoxenen Lebenszyklus in einem exzellent-erforschten Wirt, bietet sich E. falciformis als Modellorganismus an, um Wirts-Parasit-Interaktionen zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Hilfe von Genexpressionsanalysen bei E. falciformis-infizierten Zellen und Mäusen Wirtsfaktoren identifiziert, welche für die in vitro bzw. in vivo Entwicklung des Parasiten vonnöten sind. Der Transkriptionsfaktor c-FOS (FBJ osteosarcoma oncogene) zeigte eine erhöhte Expression bei der Infektion einer Epithelzelllinie mit E. falciformis. C-FOS ist ein Bestandteil des AP-1 (activator protein 1) Komplexes, welcher die Transkription zahlreicher Gene unterschiedlichster Funktion steuert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Entwicklung von E. falciformis in Zellen, welche den Transkriptionsfaktor nicht besitzen (c-FOS knockout Zellen) beeinträchtigt war. Diese Beobachtung betont eine mögliche Ausbeutung des Transkriptionsfaktors des Wirtes durch den Parasiten. In E. falciformis-infizierten Mäusen war die Expression des Enzyms Indoleamin 2,3-Dioxygenase (IDO1) bemerkenswert induziert. IDO1 katalysiert die erste und geschwindigkeits-bestimmende Reaktion des Tryptophan-Abbaus innerhalb des Kynurenin-Stoffwechselweges. Wir zeigen in dieser Studie, dass in den E. falciformis-infizierten Epithelzellen IDO1 IFN-gamma abhängig induziert wird. Das Wachstum des Parasiten war zudem beeinträchtigt in IDO1-/- Mäusen sowie in Mäusen, in welchen zwei weiterer Enzyme des Kynurenin-Stoffwechselweges pharmakologisch inhibiert wurden. Bemerkenswerterweise konnte das Parasitenwachstum in IDO1-/- Mäusen durch Gabe von Xanthurensäure, ein Nebenprodukt des Tryptophan-Abbaus, auf Wildtyp-Niveau angehoben werden. Diese Daten demonstrieren, dass sich der intrazelluläre Parasit E. falciformis die wirtseigenen Verteidigungsmechanismen (IFN-gamma, IDO1) für seine eigene Entwicklung zu Nutze macht. / Eimeria falciformis is a highly host- and tissue-specific parasite of murine caecum epithelium. Its monoxenous life cycle in a well-investigated host makes it an excellent model to examine parasite-host interactions. To identify the host determinants of the parasite infection, this work involved the comparative in vitro and in vivo analyses of mouse gene modulation by E. falciformis. The in vitro microarray analyses identified the transcription factor FBJ osteosarcoma oncogene (c-FOS) as highly induced during E. falciformis infection. C-FOS is part of the activator protein 1 (AP-1) complex, which controls the transcription of genes involved in various biological processes. We show that infection of c-FOS-deficient mouse cells results in an impaired development of E. falciformis, highlighting an exploitation of the host transcription factor by an apicomplexan parasite. Our ex vivo gene expression analyses using mouse caecum cells revealed a substantial modulation of the host transcriptome. The indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1), the first and rate-limiting enzyme of tryptophan catabolism in the kynurenine pathway, was one of the most up-regulated epithelial transcripts. Induction of IDO1 supposedly depletes tryptophan in host cells, which is proposed to inhibit the in vitro growth of pathogens auxotrophic for this essential amino acid. We show that E. falciformis induces IDO1 in the epithelial cells in an IFN-gamma-dependent manner. The absence or inhibition of IDO1 and two downstream enzymes of the pathway in the mouse impairs parasite growth. Noticeably, the parasite development was entirely rescued by xanthurenic acid, a by-product of tryptophan catabolism. These data demonstrate contrasting roles of IFN-gamma signaling and a conceptual subversion of the host defense (IFN-gamma, IDO1) by an intracellular pathogen for progression of its natural life cycle.

Hintergrund: Die Pathogenese nicht-familiärer kolorektaler Neoplasien ist heute noch nicht bekannt. Die Besonderheiten der Epidemiologie der Erkrankung sprechen für die Beteiligung von Umweltfaktoren, wie sozioökonomischer Faktoren, der Ernährung oder der bakteriellen Flora des Darmes. Eine intrazelluläre, von E.coli dominierte Flora wurde in Kolonbiopsien dieser Patienten beschrieben. Methoden: Es wurden Virulenzfaktoren von Escherichia coli untersucht, die aus gewaschenen koloskopischen Biopsien von 43 Patienten mit kolorektalen Adenomen und Karzinomen isoliert worden waren. 100 Stämme wurden mittels PCR auf Gene für folgende Virulenzfaktoren untersucht: s-Fimbrien (sfa), pyelonephritisassoziierter Pilus (pap), Hämolysin A (hlyA), hitzestabiles und -labiles Toxin (ST, LT, EAST), Intimin (eae), Verotoxin (stx), Invasionsplasmid (ipa), cytolethal distending toxin (cdt) und cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1). Für die Kontrollgruppe wurden E.coli aus Biopsien von 55 Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) und unspezifischer Kolitis, von 16 Patienten mit Colon irritabile (IBS) und aus Stuhlproben von 29 gesunden Probanden isoliert und untersucht. Ergebnisse: Bei 69% der Patienten mit kolorektalen Karzinomen und bei 58% der Patienten mit kolorektalen Adenomen wurde mindestens einer der Virulenzfaktoren gefunden, dagegen nur bei 25 bis 39% der IBS- und CED- Patienten sowie der gesunden Probanden (p / Background: Pathogenesis of non-hereditary colorectal neoplasia is poorly understood. The differences in regional incidence indicate an influence of environmental factors, as socio-economic conditions, nutrition and intestinal flora. An intracellular flora with a predominance of Escherichia coli in colon biopsies has been described in these patients. Methods: We studied virulence factors of Escherichia coli isolated from washed colonoscopic biopsies of 43 patients with colorectal carcinoma and adenoma. 100 strains of E.coli were isolated and used for detection of a broad range of virulence genes by PCR encoding: s-fimbriae (sfa), pyelonephritis-associated pili (pap), hemolysin A (hlyA), heatstable and heatlable toxins (ST, LT, EAST), verotoxin (stx), invasionplasmidantigen (ipaH), intimin (eae), cytolethal distending toxin (cdt) and cytotoxic necrotizing factor 1 (cnf1). E.coli from biopsies of 55 patients with inflammatory bowel disease (IBD) and non-specific colitis, of 16 patients with irritable bowel syndrom (IBS) and from stool samples of 29 healthy individuals were isolated and examined as controls. Results: The prevalence of virulent strains bearing at least one of the tested genes was 69% in colorectal carcinoma and 58% in colorectal adenoma, but only 25 to 39% of IBD and IBS patients and healthy individuals (p

Humorale Immunantworten gehen einher mit der Veränderung der Zusammensetzung und der Konzentration des Antikörper (AK)-Repertoires. Signalintensitäts-basierte AK-Bindungsprofile (ABP), gemessen mit Zufallspeptidmikroarrays, versuchen diese Veränderungen zu detektieren, um sie für serologische Diagnostik nutzbar zu machen. Gegenstand dieser Arbeit ist die Analyse des Einflusses des AK-Repertoires auf ABP mittels eines mathematischen Modells für AK-Peptidbindung. Das Modell basiert auf dem MWG und beinhaltet als Parameter (i) AK- und Peptidsequenzen sowie (ii) AK-Konzentrationen. Die Affinität simulierter monoklonaler AK hängt nichtlinear von den Aminosäurepositionen in den Peptidsequenzen ab. Das Modell wurde mathematisch analysiert und in silico implementiert. Simulationen ergaben, dass ABP von Mischungen hochdiverser, zufällig generierter AK-Sequenzen, welche nicht durch wenige AK konzentrationsdominiert sind, genannt ideale Mischungen, linear ausschließlich mit Hilfe der Aminosäurezusammensetzung der Peptidbibliothek vorhergesagt werden können. Dieser Zusammenhang führte zu der Formulierung eines linearen Regressionsmodells, aus welchem Aminosäure-assoziierte Gewichte (AAWS) hervorgehen, welche eine kompakte, verlustfreie Abbildung von ABP idealer Mischungen darstellen. Für niedrig-diverse Mischungen ist die Vorhersagekraft des Regressionsmodells eingeschränkt. Die in vitro-Relevanz der mathematisch vorhergesagten Ensembleeigenschaften von AK-Mischungen wurde durch Inkubationen monoklonaler AK und Serum-AK mit derselben Peptidbibliothek bestätigt. Diese Arbeit zeigt, dass Kenntnisse über die Zusammensetzung einer polyklonalen Mischung essentiell für die Interpretation von ABP in Bezug auf serologische Diagnostik und Epitopkartierung sind. Die Spezifität und damit auch die Klassifizierbarkeit von ABP ist sowohl eine Funktion der untersuchten AK-Mischung als auch technologischer Faktoren. / Humoral immune responses are associated with changes of both the composition and the concentration of serum antibodies. Signal intensity- based antibody binding profiles (ABP) measured with random-sequence peptide microarrays attempt to capture these changes to render them applicable to serological diagnostics. In this work, the antibody repertoire’s impact on ABP is studied. This model is based on the law of mass action and incorporates as parameters (i) antibody and peptide sequences and (ii) antibody concentrations. The binding affinity of simulated monoclonal antibodies depends non-linearly on amino acid positions in the peptide sequences. The model was both mathematically analyzed and implemented in silico. Mathematical analysis and simulations predicted that mixtures of highly diverse random antibodies which are not dominated concentration-wise by few antibodies, termed unbiased mixtures, could be linearly predicted based only on the amino acid composition of the peptide library used. This linear relationship led to the formulation of a linear regression model of which amino acid associated-weights (AAWS) emerge as a compact, lossless representation of unbiased mixtures’ ABP. For lowly diverse antibody mixtures, this linear regression model breaks down. In order to test the in vitro relevance of the mathematically predicted ensemble properties of antibody mixtures, monoclonal and serum antibodies were incubated with the same peptide library. In conclusion, this work shows that serum antibody ensemble properties impact the genesis of ABP measured with random-sequence peptide microarrays. This thesis indicates that a knowledge of both a polyclonal mixture’s diversity and composition is essential for the interpretation of ABP with respect to both serological diagnostics and B-cell epitope mapping. Specificity, and thus classifiability, of serum ABP is a function of both the investigated antibody mixtures and technological features.

In der vorliegenden Arbeit wurde in einem in vitro-Modell mit porcinen intestinalen Epithelzellen (IPEC-J2) der Einfluss des probiotischen E. coli Nissle 1917 (EcN) auf die Infektion mit atypischen EPEC (aEPEC) untersucht. EcN reduzierte bei Vorinkubation auf IPEC-J2 die aEPEC-Infektion drastisch. Konfokale Laserscanning- und Elektronenmikroskopie zeigten, dass EcN die Adhäsion und Mikrokoloniebildung inhibierte, jedoch nicht die Ausbildung von Attaching and Effacing-Läsionen adhärenter aEPEC. Der inhibierende Effekt von EcN wurde durch dessen sehr gute Adhäsionsfähigkeit an IPEC-J2 vermittelt. Die F1C-Fimbrien wurden als wichtigster Adhäsionsfaktor von EcN identifiziert. Darüber hinaus waren auch H1-Flagellen durch Ausbildung interbakterieller Verbindungen maßgeblich an der Adhäsion des Stammes beteiligt. In gleichem Maß wie die Vorinkubation von EcN reduzierte die Koinkubation seines Kulturüberstandes die aEPEC-Infektion, was auf die Abgabe eines inhibierenden Faktors in den Kulturüberstand schließen lässt. Dieser Faktor wurde auch von anderen pathogenen sowie nicht pathogenen E. coli-Stämmen in Schüttelkultur gebildet und scheint deshalb nicht spezifisch für EcN zu sein. Jedoch ermöglichte erst die gute Adhäsionsfähigkeit von EcN auf der Epithelzelloberfläche die Abgabe ausreichender Mengen des Inhibitors und eine Beeinflussung der aEPEC-Infektion. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass durch EcN die initiale Anheftung von aEPEC an die Wirtszelle unterbunden wird. Der inhibierende Effekt von EcN auf die aEPEC-Infektion war zeitabhängig. Im Gegensatz zur Vorinkubation erhöhten Ko- und Nachinkubation von EcN die Adhäsion von aEPEC und hatten einen geringeren inhibierenden Effekt auf die Mikrokoloniebildung. Dieser gegensätzliche Effekt auf die Adhäsion von aEPEC wird möglicherweise von einem zweiten Faktor hervorgerufen. Dieser scheint nur dann wirksam zu sein, wenn der inhibierende Faktor in zu geringer Konzentration oder erst nach Adhäsion von aEPEC vorliegt. / In this study, the effects of the probiotic E. coli strain Nissle 1917 (EcN) on host cell infection with atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) were investigated in an in vitro porcine intestinal epithelial cell model (IPEC-J2). In pre-incubation experiments, EcN drastically reduced the infection efficiencies of aEPEC. Using confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy, it was shown that EcN inhibited the attachment and formation of microcolonies, but not the formation of attaching and effacing lesions by adherent aEPEC. The inhibitory effect was mediated by the adherent properties of EcN to epithelial cells. The F1C fimbriae were identified as the most important adhesion factor of EcN in vitro. Furthermore, the H1 flagellae were also shown to be involved in the adhesion of EcN, serving as bridges between bacterial cells. Co-incubation of culture supernatants of EcN reduced the infection efficiencies of aEPEC to the same extent as in pre-incubation with EcN bacteria, indicating the secretion of an inhibitory factor by EcN. This factor was also secreted by other pathogenic and non-pathogenic E. coli strains in shaking culture and therefore does not appear to be specific for EcN. However, the outstanding ability of EcN to adhere to epithelial cells largely contributes to the secretion of sufficient concentrations of this inhibitory factor und to the influence on the aEPEC infection. The results suggest that EcN interferes with the initial adhesion of aEPEC to host cells. The inhibitory effect of EcN was found to be time-dependent. In contrast to pre-incubation experiments, co- and post-incubation of EcN actually increased the adhesion efficiencies of aEPEC and showed only minor effects on microcolony formation. This second effect of EcN on aEPEC adhesion, possibly due to a second factor, appears only to be effective when the putative inhibitory factor is either present at low concentrations or after aEPEC is already adherent to host cells.

Parasitische Würmer gehören mit über 3,5 Milliarden Betroffenen zu den weltweit verbreitetesten Infektionskrankheiten. Der Erfolg dieser Parasiten beruht auf ihren ausgefeilten Mechanismen mit denen sie das Immunsystem ihrer Wirte manipulieren. Interessanter Weise gehen Wurminfektionen mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit an Allergien zu erkranken einher. Wie genau die Parasiten das Immunsystem manipulieren ist weitgehend unbekannt. Um diese Mechanismen besser studieren zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht RNA interference (RNAi), anhand des Modellmoleküls Tropomyosin zu etablieren. Wie sich am Beispiel des Strongyliden Heligmosomoides polygyrus bakeri zeigte, ist RNAi als Manipulationsmethode für Nematoden nicht oder nur in geringem Maße geeignet. Dies lässt sich auf das Fehlen von Aufnahme- und Verbreitungsmechanismen für Doppelstrang-RNA zurückführen. Desweiteren wurden die Auswirkungen von rekombinantem Tropomyosin der Filarie Acanthocheilonema viteae (rAv-TMY) auf die Entstehung allergischer Atemwegserkrankungen im Mausmodell untersucht. Eine viermalige Behandlung mit rAv-TMY in einem Zeitraum von vier Wochen führte zu verringerten entzündlichen Reaktionen in den Atemwegen. Die Analyse immunologischer Parameter ergab, dass rAv-TMY signifikant den Einstrom von Entzündungszellen in die Atemwege reduziert, allem voran den Einstrom von Eosinophilen. Dies lässt sich durch die verringerte Ausschüttung an IL-5, Eotaxin und MCP-5 zurückführen. Zudem wurde die Bildung von antigenspezifischen IgE verringert während sich die Produktion blockierender IgG1 Antikörper erhöhte. Diese Arbeit belegt somit die anti-allergischen Eigenschaften von rAv-TMY. Damit stellt rAv-TMY ein interessantes Kandidatenmolekül zur Behandlung allergischer Reaktionen dar. Desweiteren kann der Vergleich von allergenem, nicht allergenem und modulatorischem Tropomyosin wichtige Informationen über die allgemeinen Eigenschaften von Allergenen und ihrer molekularen Struktur geben. / Parasitic worms are among the world''s most prevalent infectious diseases with more than 3.5 billion. The success of these parasites is based on their sophisticated ways to manipulate the immune system of their hosts. Interestingly, worm infections abate the risk to develop allergic disorders. How exactly parasitic worms modulate the immune system is so far largely unknown. In order to be able to investigate parasite induced modulation, this work aimed to establish RNA interference (RNAi), a method of genetic manipulation, using tropomyosin as target gene. As shown for the example of Heligmosomoides polygyrus RNAi is not or only to a small extent useful as method to genetically manipulate nematodes. This can be explained with the lack of uptake and spreading mechanisms for double stranded RNA. Furthermore, this work examined the impact of the recombinant muscle protein tropomyosin of Acanthocheilonema viteae (rAv-TMY) on the course of a rodent model of allergic airway inflammation. A four-time treatment with rAv-TMY over a period of four weeks resulted in decreased inflammatory responses in the airways. The analysis of immunological parameters showed that rAv-TMY significantly reduces the influx of inflammatory cells into the airways, especially eosinophils. The reduced eosinophil influx can be attributed to the decreased expression of IL-5, eotaxin and MCP-5 in the airways. In addition, the formation of antigen-specific IgE was impaired whereas the production of the blocking antibody IgG1 was increased. These results demonstrate the anti-allergic properties of rAv-TMY. For this reason rAv-TMY becomes an interesting model molecule for the treatment of allergic diseases. Furthermore, the comparison of allergenic, non-allergenic and modulatory tropomyosin might put some light on the nature of allergens and their molecular patterns.