In dieser Arbeit wurde die Affinitätsreifung des murinen anti-c-myc-Peptid-Antikörpers 9E10 analysiert. Hierfür wurden Fab-Fragmente mit Keimbahnrückmutationen gentechnisch hergestellt und in ihrem Bindungsverhalten zum humanen c-myc-Peptid charakterisiert. Das von 9E10 erkannte Epitop besitzt die Aminosäuresequenz EQKLISEEDLLRKR mit den darin sehr selektiv erkannten Schlüsselpositionen LISEXXL.Der 3300-fache Affinitätsgewinn während der 9E10-Reifung kommt sowohl durch eine Zunahme der Assoziations- als auch durch eine Abnahme der Dissoziationsgeschwindigkeit des Komplexes zustande. Der Affinitätsgewinn resultiert weniger aus zusätzlichen Kontakten des Antikörpers zum Peptid, sondern vor allem aus der Beeinflussung der Konformation und/oder der Flexibilität der an der Bindung beteiligten CDRs. Die außergewöhnlich lange CDR-H3 liefert einen wesentlichen Beitrag zur Affinitätsreifung. Die variable leichte Domäne dient dabei mit der langen CDR-L1 und -L3 als eine Bindungsplattform für die flexible CDR-H3. Änderungen in der Spezifität von 9E10 sind vorrangig auf die Reifung der variablen schweren Domäne zurückzuführen. Dabei ist die selektive Erkennung der Schlüsselpositionen im Peptid im Anfangsstadium der Affinitätsreifung von 9E10 stark ausgeprägt. / In this work the affinity maturation of the murine anti c-myc-peptide antibody 9E10 was analysed. Therefore Fab fragments with reversed mutations directed towards germline genes were genetically produced and characterised for their binding to the human c-myc peptide. The epitope recognized by 9E10 consists of the amino acid sequence EQKLISEEDLLRKR of which the key positions LISEXXL are very selectively recognized. The maturation of 9E10 leads to a 3300-fold higher affinity, which is achieved by a faster association as well as by a slower dissociation of the complex. For the gain in affinity formation of additional contacts to the peptide is less important than conformational and/or flexibility changes of the CDRs which are involved in binding. The exceptionally long CDR-H3 contributes essentially to the affinity maturation. The variable light domain serves thereby with its long CDR-L1 and -L3 as a binding platform for the flexible CDR-H3. Changes in specificity of 9E10 are primarily due to maturation of the variable heavy domain. Selective recognition of the key positions in the peptide is already highly pronounced in the initial stage of affinity maturation of 9E10.

Durch Immunregulation und -modulation sorgt das Immunsystem dafür, daß von außen in den Organismus gelangende Agentien nicht zu dauerhaften Schäden führen. Wesentliche Funktionen des Immunsystems stützen sich dabei auf die zelluläre Immunität. Gerät dieses komplizierte Regelwerk aus dem Gleichgewicht, können schwere Erkrankungen autoimmuner oder atopischer Genese resultieren. Der erste Teil der Arbeit befaßt sich mit zwei Aspekten der zellulären Immunantwort. Allergische Immunantworten sind durch die Typ 2 T Zellantwort charakterisiert. Für die Induktion einer Typ 2 Antwort wird Interleukin-4 benötigt, dessen Herkunft nicht geklärt ist. NK1.1 positive T Zellen als Quelle des initialen IL-4 konnten durch in vivo und in vitro Messung von allergie-spezifischen Parametern ausgeschlossen werden. Der MHC-Komplex präsentiert T Zellen Antigene in Form von Peptiden. Pathologische T Zellantworten können durch fortwährende Antigenpräsentation unterhalten werden. Durch Untersuchungen zur molekularen Charakteristik der MHC - Peptid Interaktion ließen sich Bindungsmotive so verfeinern, daß Peptide mit sehr starker Bindung an den MHC ohne gleichzeitige Erkennungssequenz für den T Zellrezeptor entwickelt werden konnten. Peptide dieser Art könnten zur Blockierung einer pathologischen T Zellantwort genutzt werden. Für viele immunologische Erkrankungen ist die Beteiligung genetischer Faktoren beschrieben worden. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit der Bedeutung genetischer Disposition bei Allergien im Mausmodell. Homozygote Inzuchtstämme konnten als High- und Low-Responder für den Phänotyp "allergische Soforttypreaktion der Haut" gegenüber Birkenpollenextrakt definiert werden. Die Phänotypisierung der F1 Generation wies auf dominante Vererbung hin, die informative Rückkreuzung auf die Beteiligung von mindestens zwei Genen für die Ausprägung des Merkmals. Wie die Analyse MHC congener Mäuse zeigte, entspricht einer dieser Loci dem MHC Komplex. Durch eine genomweite Kartierung mit Mikrosatelliten wurde als weiterer Kandidat der IL-5 Rezeptor identifiziert. Die detaillierte Analyse des Gens in High-und Low-Respondern weist auf eine Anzahl funktionell bedeutsamer Polymorphismen hin. Dabei imponiert das Low-Responder Allel als Suszeptibilitätsallel. Die Unterschiede haben Auswirkung auf Transkription/Translation und Spleißvorgänge, die zu quantitativer Differenz der Genprodukte führt. Die Daten weisen damit auf einen regulatorischen Mechanismus hin, da die Proteinstruktur des Rezeptors bei High- und Low-Respondern identisch ist. / Immune deviations can lead to serious autoimmune or atopic disorders. Two possible candidates for such pathological immune responses have been investigated: (i) the MHC class I allele HLA-B27, which is strongly linked to ankylosing spondylitis and reactive arthritis. Its presentation of potentially pathogenic peptides and therapeutical modifications of peptidic ligands have been studied. (ii) Interleukin-4 (IL-4), which is the key player in the induction and maintenance of allergic immune responses. A subpopulation of natural killer (NK1.1) cells have been discussed as a source of initial IL-4. Through experiments with NK1.1 deficient mice we could demonstrate, that such immune resonses are not dependent on the presence of NK1.1 cells. Both, autoimmunity and atopy belong to the large group of multifactorial diseases, i. e. genetic and environmental factors influence the expression of the various phenotypes. To dissect the genetics of allergic diseases systematically, a mouse model of immmediate cutaneous hypersensitivity (ICHS) upon birch pollen sensitization has been etablished. Phenotyping of the F1 progeny of high- and low-responder mice revealed ICHS as a dominant trait with incomplete penetrance. Mice from a backcross to the low-responder strain did split into the three classes of high-, intermediate and low-response. Genotyping of these mice revealed a strong candidate gene on chromosome 6: the interleukin-5 receptor (IL-5R). Analysis of the IL-5R gene resulted in the detection of genetic variance of the high- and low-responder allele in non-coding regions with functional relevance. Additional regulatory variance is implicated through differential alternative splicing of the three receptor isoforms. A second gene cluster contributes to the expression of the allergic phenotype: MHC class II alleles, as has been demonstrated for other immunologic disorders in mice and humans.

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die sich in einem membranumschlossenen Kompartiment namens Inklusion vermehren. Nach Infektion fragmentiert der Golgi-Apparat der Wirtszelle in kleine Membranstapel. Dies verbessert die Aufnahme von Sphingolipiden und ist deshalb für die chlamydiale Vermehrung essentiell. Die infektionsinduzierte Golgi-Fragmentierung geschieht nach Spaltung des Golgi-Matrix-Proteins Golgin-84. In dieser Arbeit konnte, durch den Vergleich mit bekannten Substraten und Inhibitorstudien, die chlamydiale Protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) als das Enzym identifiziert werden, das diese Spaltung induziert, abhängig von der Anwesenheit zweier Rab-Proteine, Rab6 und Rab11, die den zellulären Vesikeltransport kontrollieren und zur Inklusion rekrutiert werden. Die Fragmentierung des Golgi-Apparates verhinderte dessen Relokalisierung während der Zellpolarisierung nach Einbringen eines migratorischen Stimulus. Sowohl infizierte als auch Golgin-84-depletierte Zellen migrierten langsamer und randomisiert in einem Motilitätsassay. Die Relokalisierung des Golgi-Apparates konnte durch seine Stabilisierung mittels WEHD oder Rab-Depletion wieder gewonnen werden, was die Zellmotilität teilweise wieder herstellte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Infektion außer der Golgi-Reorientierung die Signaltransduktion durch GTPasen beeinflusst. Die Aktivität von Cdc42 in infizierten Zellen war erhöht und die Interaktionen mit vielen ihrer Effektoren laut quantitativer Massenspektrometrie stark verändert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass CPAF die für Chlamydien lebenswichtige Golgin-84 Prozessierung und Fragmentierung des Golgi-Apparates auslöst. Dies verringert die Mobilität der Wirtszelle, vor allem da der Golgi-Apparat während der Polarisierung nicht mehr ausgerichtet werden kann, des Weiteren durch Modulierung der Protein-Protein-Interaktionen von Cdc42. / Chlamydia are obligate intracellular human pathogens that proliferate inside a membrane-bound compartment called the inclusion. In infected cells, the Golgi apparatus is fragmented into small ministacks that are aligned around the inclusion. This facilitates uptake of host cell sphingolipids and is essential for chlamydial development. Infection-induced Golgi fragmentation happens after processing of the Golgi matrix protein golgin-84. This work could, via comparison with well-known substrates and inhibitor studies, identify the chlamydial protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) as the enzyme accountable for this cleavage. Golgi Fragmentation depended on two Rab proteins, Rab6 and Rab11, which control vesicle transport and are recruited to the Chlamydia inclusion. As a consequence of Golgi fragmentation, cells lost the capacity to reorient the Golgi apparatus during polarization after a migratory stimulus. Both infected and golgin-84 depleted cells with a permanently fragmented Golgi apparatus displayed decelerated and furthermore randomized migration in a motility assay. Relocalization of the Golgi apparatus could be restored via stabilizing WEHD treatment or Rab depletion which partly rescued cell motility. Moreover, it could be shown that migration signaling via small GTPases was influenced by Chlamydia infection. Infected cells exhibited activation of the small polarity GTPase Cdc42. Numerous interactions with downstream effectors were strongly altered in infected cells according to quantitative mass spectrometry. Particularly, the binding of Cdc42 to migration-associated effectors was decreased. The results of this work show that CPAF, by processing of golgin-84, induces Golgi fragmentation which is vitally important for Chlamydia. This disturbs host cell motility because the Golgi apparatus cannot be reoriented during polarization and, additionally, via the modulation of protein-protein-interactions of Cdc42.

Herpes simplex virus Typ 1 (HSV-1) ist ein humanpathogenes Virus der Familie Herpesviridae. Für eine erfolgreiche Virusreplikation besitzt HSV-1 mehrere Gene, die in den meisten infizierten Zelltypen Apoptose verhindern. Im Gegensatz dazu führt die HSV-1 Infektion eines zentralen Zelltyps des Immunsystems, den unreifen dendritischen Zellen (iDCs), zu Apoptose. Dies könnte ein Aspekt der HSV-1 Immunevasion sein. Bisher waren die Ursachen der Apoptose von HSV-1 infizierten iDCs unzureichend aufgeklärt. Es wurde jedoch gezeigt, dass das antiapoptotische zelluläre Protein c-FLIP in HSV-1 infizierten iDCs reduziert ist. In dieser Arbeit wurde die c-FLIP Menge in iDCs erstmalig mit Hilfe von RNA Interferenz erfolgreich reduziert. Dies bestätigte die Bedeutung von c-FLIP für die Lebensfähigkeit von iDCs. Folglich könnte auch die Reduktion der c-FLIP Menge nach HSV-1 Infektion iDCs für Apoptose empfindlich machen. Die HSV-1 induzierte c-FLIP Reduktion erfolgte in späten Stadien der Infektion, abhängig von der ordnungsgemäßen Expression viraler „early“ und „leaky late“ Gene. Sie fand nicht auf RNA Ebene statt und war unabhängig vom Proteasom und der Bindung an den „death inducing signaling complex“. Stattdessen wurde c-FLIP wahrscheinlich von einer viralen oder zellulären Protease abgebaut. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass zusätzlich zu Veränderungen im zellulären Apoptosesignalnetzwerk der Mangel an einem antiapoptotischen viralen Faktor zur Apoptose von HSV-1 infizierten iDCs beiträgt. Eine Microarray Analyse der HSV-1 Genexpression ergab, dass HSV-1 Latenz-assoziierte Transkripte (LATs) in apoptotischen iDCs signifikant geringer exprimiert waren als in nicht-apoptotischen epithelialen Zellen. LATs besitzen in Neuronen und epithelialen Zellen eine antiapoptotische Aktivität. Diese könnte den Mangel an c-FLIP kompensieren. Übereinstimmend mit dieser Hypothese induzierte eine HSV-1 LAT-Deletionsmutante mehr Apoptose in iDCs im Vergleich zum Wildtyp-Virus. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a human pathogen which belongs to the family Herpesviridae. HSV-1 encodes several genes, which serve to efficiently prevent apoptosis in most infected cell types, thereby ensuring successful virus replication. In contrast, HSV-1 infection of one central cell type of the immune system, immature dendritic cells (iDCs), results in apoptosis. This could be one aspect of HSV-1 immunevasion. So far, the mechanisms underlying apoptosis of HSV-1 infected iDCs were poorly defined. However, it has been shown that the antiapoptotic cellular protein c-FLIP is reduced in HSV-1 infected iDCs. In this work, the amount of c-FLIP was for the first time successfully reduced in iDCs by RNA interference. This confirmed the importance of c-FLIP for viability of iDCs. Therefore, it is likely that c-FLIP reduction after HSV-1 infection also sensitizes iDCs to apoptosis. HSV-1 induced c-FLIP reduction occurred at late stages of infection and was dependent on proper expression of early and leaky late virus genes. Furthermore, it was not operative at the RNA level and was independent from the proteasome and binding to the death inducing signaling complex. Rather, c-FLIP was presumably degraded by a viral or cellular protease. In this work it was shown for the first time, that in addition to changes in the cellular apoptosis signaling network, the lack of one antiapoptotic viral factor contributes to apoptosis of HSV-1 infected iDCs. HSV-1 latency-associated transcripts (LATs) were significantly lower expressed in apoptotic iDCs compared to non-apoptotic epithelial cells, determined by microarray analysis of HSV-1 gene expression. It is known that in neurons and epithelial cells, LATs possess a potent antiapoptotic activity. This could compensate the lack of c-FLIP. Consistent with this hypothesis, a LAT deletion mutant of HSV-1 induced more apoptosis in iDCs compared to the respective wild type virus.

Die vorliegende Studie wurde in einer Gruppe von Dörfern im Ostsudan, Gedaref State, durchgeführt. Bei 100 Patienten mit der Verdachtsdiagnose Kala Azar- oder Post-Kala Azar- Leishmaniose war der Erregernachweis mit der PCR direkt in klinischen Proben, die auf Filterpapier aufgebracht worden waren, ohne vorherige Kultivierung erfolgreich. In dieser PCR wurden die ribosomalen, internal transcribed spacer (ITS1 & ITS2) amplifiziert, weil sie sehr variabel sind, eine klare Speziesidentifizierung gestatten und bei weiterführenden Analysen der PCR-Produkte auch der Nachweis stammspezifischer Unterschiede erwartet werden konnte. Für die Analyse der Diversität von Leishmania donovani-Isolaten aus dem Sudan wurden 4 verschiedene PCR-basierte Methoden eingesetzt: das PCR-Fingerprinting mit unspezifischen Einzelprimern, die RFLP- Analyse des amplifizierten ITS-Locus, ,,single strand conformation polymorphism (SSCP)- Analysen der amplifizierten ITS-Region, des Gens, welches für die Hauptoberflächenprotease (gp63) kodiert, und anonymer DNA- Fragmente sowie Sequenzanalysen der entsprechenden Zielregionen. Das PCR-Fingerprinting und die Restriktionsanalyse der ITS-Region lieferten weitgehend übereinstimmende Fragmentmuster für alle untersuchten L.donovani-Stämme. 12 unterschiedliche Profile wurden bei der SSCP-Analyse des ITS1-Locus für 86 Isolate aus dem Sudan erhalten, während der ITS2-Locus bei diesen Stämmen hochkonserviert war und nur ein Stamm ein unterschiedliches SSCP-Muster aufwies. L. Donovani -Stämme anderer geographischer Herkunft hatten unterschiedliche ITS2-Profile in der SSCP. Für den gp63 - Locus waren 3 polymorphe SSCP-Muster bei 31 untersuchten sudanesischen Isolaten nachweisbar. Für die meisten der anonymen DNA-Fragmente, L510, L413, LK413, L0308 UND L0114, konnten leider nur von 8 kultivierten Stämmen gute PCR-Produkte erhalten werden. Lediglich das Fragment L0110 konnte erfolgreich von 31 auf Filterpapier aufgebrachten Proben direkt amplifiziert werden. Die Suche nach Polymorphismen mit der SSCP ergab keine Unterschiede in diesen anonymen DNA-Regionen, mit Ausnahme des Fragments L0114, das zwei verschiedene Muster aufwies. Die Ergebnisse der SSCP-Analysen und der DNA- Sequenzierung stimmten gut überein, wodurch bestätigt wurde, dass die SSCP genetische Unterschiede auf dem Niveau einzelner Basenaustausche nachweisen kann. Die SSCP- Technik hat Vorteile gegenüber den anderen Methoden, die für die Untersuchung von Sequenzvariationen innerhalb der Spezies L. donovani angewandt wurden. Es konnten keine Korrelationen zwischen der Form der klinischen Manifestation und den Ergebnissen des PCR- Fingerprinting, der ITS-RFLP- und ITS-SSCP- Analysen festgestellt warden. Diese Studie ist von besonderem Nutzen in epidemiologischen Feldstudien, bei denen die Kultivierung der Erreger besonders in Entwicklungsländern extrem schwierig sein kann. / This study was carried out in clusters of villages that represent an endemic focus of visceral leishmaniasis (VL). These villages were located in Gedaref state, eastern Sudan. For diagnostic purposes polymerase chain reaction (PCR) was performed successfully, directly from clinical samples spotted on filter papers with no prior cultivation from 100 patients suspected of having kala-azar or post kala-azar dermal leishmaniasis. Mainly the ribosomal internal transcribed spacer (ITS1 & ITS2) were targeted in PCR because this region is more variable and allows clear species identification and also strain differences could be expected by further analysis of these PCR products. PCR was found to be more sensitive compared to the gold standard microscopic method. Four PCR based approaches were used to analyse diversity within Sudanese isolates of Leishmania donovani. Methods compared were fingerprinting with single non-specific primers, restriction analysis of the amplified ITS locus (RFLP), single-stranded conformation polymorphism (SSCP) of the ITS region, major surface protease (gp63) gene, anonymous DNA fragments and sequencing of these targeted regions. When PCR fingerprinting and restriction analysis of ITS region were applied, highly similar fragment patterns were observed for all strains of L. donovani studied. The ITS1 locus gave 12 different SSCP profiles among the 86 Sudanese isolates, where as the ITS2 locus was highly conserved among the 86 samples with the exception of 1 isolate. Strains of L. donovani derived from other geographical areas were found to have different ITS2 patterns. The gp63 locus gave 3 polymorphic patterns among 31 Sudanese isolates. Concerning most of the anonymous DNA fragments namely, L510, L413, LK413, L0308 and L0114 unfortunately, we succeeded to get good PCR products only from DNA extracted 8 successful cultures. Only for the fragment L0110 we were able to get good PCR products from 31 samples spotted on filter papers. When these PCR products were investigated for polymorphisms using SSCP no differences were observed with exception of L0114 region, which showed 2 patterns. SSCP analysis correlates well with results of DNA sequencing and confirmed that SSCP was able to detect genetic diversity at the level of a single nucleotide. SSCP had advantages over the other methods employed for investigating of sequence variation within the species L. donovani. There was no correlation between the form of clinical manifestation of the disease and the PCR fingerprinting, ITS-RFLP, or ITS-SSCP characteristics. This study is beneficial particularly in epidemiological studies based on field-work where obtaining cultures can be extremely difficult especially in developing countries.

Obwohl der Wildtyp des Hepatitis-B-Virus (HBV) nicht zytopathogen und die Pathogenese der Hepatitis B generell immunvermittelt ist, können in immunsupprimierten Nierentransplantatempfängern mit chronischer Hepatitis B schwere Leberschäden bis hin zu Leberzirrhose und Leberversagen entstehen. Die Entwicklung von Leberzirrhose in den Nierentransplantierten ist assoziiert mit der Akkumulation und Persistenz von komplexen HBV-Varianten mit Mutationen im Core-Promotor / X-Gen, Deletionen im Core (C)-Gen und teilweise zusätzlichen Deletionen im präS-Bereich. Dies lässt eine Rolle der Varianten in der speziellen Pathogenese bei Immunsupprimierten vermuten. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Analysen der komplexen Varianten im Vergleich zu Referenz-Wildtypgenomen und Wildtyp-ähnlichen Genomen der Patienten aus der frühen Infektionsphase durchgeführt, um Hinweise auf den potentiellen Beitrag der Varianten zur Pathogenese zu erlangen. Die Analysen erfolgten durch transiente Transfektion der humanen Hepatomazelllinie HuH7 mit repräsentativen HBV-Gesamtgenomen, die aus 2 Patienten während des Krankheitsverlaufs von einer asymptomatischen Infektion hin zur Leberzirrhose isoliert und kloniert worden waren. Trotz einiger Unterschiede im Detail wiesen die komplexen Varianten einen gemeinsamen, drastisch vom Wildtyp abweichenden Phänotyp auf. Dieser war gekennzeichnet durch eine veränderte Transkription mit reduzierten präC- und Oberflächen-mRNAs und verstärkter Expression der prägenomischen RNA, eine starke Reduktion des häufigsten Spleißprodukts der prägenomischen RNA, SP1, eine extrem reduzierte oder fehlende Expression und/oder Sekretion aller Oberflächenproteine und des HBeAg, ein verändertes intrazelluläres Verteilungsmuster des schwach exprimierten Core-Proteins und teilweise der Oberflächenproteine sowie eine erhöhte Replikation und Anreicherung gegenüber Wildtyp-HBV aufgrund einer verstärkten reversen Transkription der prägenomischen RNA. Dieser Phänotyp basierte zum Teil auf den Mutationen in Core-Promotor und C-Gen, wurde jedoch deutlich durch zusätzliche Mutationen in den übrigen Genomabschnitten beeinflusst. Die vielfältigen Veränderungen der Varianten unterstützen ihren vermuteten Beitrag zur Pathogenese. / Although wild-type hepatitis B virus is not cytopathogenic and the pathogenesis of hepatitis B is generally immune mediated, also immuno-suppressed patients, such as renal transplant recipients, with chronic hepatitis B may develop liver cirrhosis and end-stage liver disease. In renal transplant recipients, the development of liver cirrhosis is associated with the accumulation and persistence of complex HBV variants with mutations in core promoter / X gene, deletions in core (C) gene and sometimes additional deletions in the preS region. This suggests a role of these variants in the special pathogenesis in immuno-suppressed patients. In the present work, the complex variants were functionally analyzed in comparison to reference wild-type genomes and wild-type-like HBV genomes from the early asymptomatic phase of infection. For the analyses, representative cloned full-length HBV genomes isolated from 2 patients before and during liver cirrhosis were transiently transfected into the human hepatoma cell line HuH7. In spite of some variations, the complex variants showed a common phenotype, which was drastically altered compared to wild-type. It was characterized by reduced preC and surface mRNAs and increased expression of pregenomic RNA, by a strong reduction of the major spliced pregenomic RNA, SP1, by a partial or complete defect in expression and/or secretion of surface proteins and HBeAg, by an aberrant intracellular localization of the weakly expressed core protein and in some cases of the surface proteins, and by an enhanced replication and enrichment over wild-type HBV due to an enhanced reverse transcription of variant pregenomic RNA. The phenotypic alterations were often based on the mutations in core promoter and C gene but were considerably influenced by the additional mutations in other genomic regions. The multiple functional changes of the variants support their assumed contribution to pathogenesis.

Die Infektion mit dem Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, verläuft individuell unterschiedlich. Während manche der Infizierten rasch an einer komplizierten Malaria versterben, zeigen andere keinerlei Symptomatik, obwohl jahrelang eine Parasitämie besteht. Was diese Individuen voneinanderen unterscheidet, ist weitgehend unbekannt. Morbidität und Mortalität der Erkrankung sind von der Auseinandersetzung zwischen Wirt und Parasit abhängig, die von exogenen und endogenen Faktoren beeinflußt wird. Unter den endogenen Faktoren spielen die genetischen Determinanten, die sowohl an angeborenen als auch an erworbenen Resistenz- und Immunmechanismen beteiligt sind, eine besondere Rolle. In den hier zusammengefaßten Arbeiten wurden als Determinanten der angeborenen Resistenz gegenüber Malaria die Sichelzellanämie, Alpha-Thalassämie, G6PD-Mangel und der HLA-Klasse-II-Polymorphismus und als genetische Einflußfaktoren von erworbenen Immunmechanismen Varianten des TNF-Promotors, von ICAM-1 und iNOS untersucht. Die Arbeiten unterstützen die Hypothese, daß die Interaktion von Mensch und Plasmodien zu einer ständigen gegenseitigen Beeinflussung und Anpassung geführt hat. Die koevolutonäre Veränderung der Genome der beiden Organismen ist wahrscheinlich mitverantwortlich für die unterschiedliche geographische Verteilung von Genvarianten sowohl des Menschen als auch der Plasmodien und scheint auch heute noch Teil einer komplexen und dynamischen Anpassung von Wirt und Parasit zu sein. / The manifestation of an infection with Plasmodium falciparum, the pathogen of malaria, is individually different. Some indiviuals have a high risk of developing severe malaria, whereas others remain asymptomatic despite a long-lasting parasitemia. The basis of these differences is unknown. Morbidity and mortality of malaria are dependent on the interaction between the host and the parasite which is influenced by exogenic and endogenic factors. The latter are determined by genetic elements involved in innate and acquired mechanisms of resistance and immunity. The studies summerized here address genetic determinants of innate resistance against malaria (sickle cell trait, alpha-thalassemia, G6PD deficiency, blood groups and HLA class II alleles) and those of acquired immunity (variants of the TNF promoter, ICAM-1, and iNOS). The results support the view that the interaction between humans and plasmodia has led to continuous mutual influences and adaptations. Probably, the co-evolution of the genomes of both organisms is jointly responsible for the different geographical distribution of parasitic and human gene variants. This process seems to be part of an ongoing complex and dynamic adaptation of the host and the parasite.

Ansätze der mathematischen Modellierung ermöglichen die Analyse der dynamischen Eigenschaften biologischer Systeme und den Einfluß spezifischer Funktionen. Das Ziel dieser Arbeit ist es verschiedene Aspekte der Interaktionen zwischen Wirt und Krankheitserregern zu analysieren. In Kapitel 3 diskutiere ich ein Modell der zellulären Antwort auf Hitzeschockstress im Pilz Candida albicans. Das Modell in Form von gewöhnlichen Differentialgleichungen erörtert mehrere Aspekte des Systems, wie z.B. die erworbene Thermotoleranz und eine perfekte Anpassung an die Beanspruchung durch die Temperaturwechsel. Im Rahmen der Interaktionen zwischen Wirt und Krankheitserreger ist die Studie relevant, da die Entwicklung von Fieber eine primäre Antwort des Organismus auf eine Pilzinvasion ist. Die Dynamik von C. albicans Virulenzfaktoren, wie z.B. der Übergang vom Hefe- zum Hyphenstadium, und die Abwehrmechanismen des Wirts bestimmen den Zustand des Pilzes, d.h. ob er als Kommensale oder Krankheitserreger vorkommt. Mit Hilfe einer agenten-basierten Modellierungstechnik, in Kapitel 4, untersuche ich die Auswirkungen potenzieller medikamentöser Behandlungen von Pilzpopulationen und ihre Effektivität. In Kapitel 5 analysiere ich die Dynamik der C. albicans Hefe- und Hyphenpopulationen unter der Annahme, das zwischen den Individuen beider Populationen paarweise Wechselwirkungen bestehen, die zusätzlich von Fresszellen und Ernährungsbedingungen beeinflusst werden. Das erste Modell basiert auf den Prinzipien der Spieltheorie. Aus dieser Studie lässt sich die Hypothese aufstellen, dass sich im Verlauf der Infektion die evolutionäre Spieldynamik von der Snowdrift Spieldynamik in Richtung Gefangendilemma verschiebt. Im zweiten Modell untersuche ich die Umschaltraten zwischen Hefen und Hyphen. Das Modell zeigt, dass in Pilzpopulationen die Ausprägung verschiedener Phänotypen der Grund für die erhöhte Überlebensfähigkeit der Population sein könnte. / Mathematical modeling approaches facilitate the analysis of dynamic properties of mechanisms triggering specific functions of biological systems. Through this work I aim to shed light on various aspects of host-pathogen interactions. In Chapter 3, I discuss a model of heat shock stress response activated in the fungus Candida albicans. The model in form of ordinary differential equations reveals several features of the system, such as acquired thermotolerance and a perfect molecular adaptation to the thermal insult. The study is relevant in the context of host-pathogen interactions since development of fever is a primary host response to fungal invasion. The dynamics of C. albicans virulence factors, e.g., yeast to hypha transition, and defense mechanisms of the host determine the state of the fungi, i.e. whether to act as a commensal or as a foe. Through application of an agent-based modeling technique, in Chapter 4, I investigate effects of potential drug treatments on fungal populations and their effectivity in the fungal clearance. In Chapter 5, I analyze the dynamics of candida yeast and hyphal populations assuming pairwise interactions influenced by phagocytic cells and nutritional conditions. The first model is based on game theory principles. From the study it can be hypothesized that during the course of infection the evolutionary game dynamics shift from Snowdrift game dynamics toward Prisoners’ dilemma. In the second model, I examine switching rates between yeast and hypha. The model reveals that phenotypic variations may occur in order to increase the fitness of the population.

Die Entwicklung einer mukosal verabreichbaren, effektiven DNA-Vakzine gegen Infektionskrankheiten oder Tumorerkrankungen auf der Basis invasiver attenuierter Bakterien ist eine vielversprechende Alternative zu bisherigen parenteralen Strategien der genetischen Vakzinierung. Innerhalb dieser Arbeit wurden Salmonellen-Impfstämme für die orale Übertragung eines eukaryontischen Expressionsplasmids mit dem kleinen Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) als Modellantigen optimiert. Die kontinuierliche Sezernierung von Plasmiden als filamentöse Phagenpartikel wurde als ein erster Ansatz getestet, um mit lebenden Bakterien eine DNA-Vakzine innerhalb infizierter Zellen freizusetzen. Die Salmonellen-vermittelte Phagensekretion in der Wirtszelle ist jedoch nicht effizient genug, die Expression des Transgens zu vermitteln. Alternativ wurde ein Ansatz gewählt, durch eine spontan induzierte Lyse der Impfbakterien, Plasmid-DNA in die Wirtszelle zu übertragen. Dazu wurde ein neuartiges bakterielles Autolysesystem etabliert, basierend auf einem Zwei-Phasen-Expressionssystem und von Bakteriophagen abgeleiteten Lysedeterminanten. Dieses System ermöglicht erstmals die kontinuierliche Freisetzung von Plasmid-DNA und Proteinen aus einzelnen, lysierenden Salmonellen innerhalb einer sonst gesunden bakteriellen Gesamtpopulation. Innerhalb infizierter COS7-Zellen führt die Freisetzung des porenformierenden Proteins Listeriolysin O durch autolytische Salmonellen zur Zerstörung der Vakuole, in der die Impfbakterien replizieren, und erleichtert somit den Transfer der Plasmid-DNA aus den Bakterien in das Zytoplasma der Wirtszelle. Die Lysedeterminante und die eukaryontische Expressionskassette für HBsAg wurden auf einem Plasmid kombiniert, sowie eine Kassette zur konstitutiven Expression des Histon-ähnlichen Proteins aus Thermotoga maritima (TmHU) in ein solches Konstrukt integriert. TmHU stabilisiert die Plasmiderhaltung unter nicht selektiven Bedingungen und besitzt das Potential, die Effizienz der DNA-Translokation innerhalb der Wirtszelle zu erhöhen. Durch die orale Gabe optimierter autolytischer Impfbakterien konnte eine potente HBsAg-spezifische Antikörperantwort sowie eine zytotoxische zelluläre Antwort induziert werden. Bereits die einmalige Gabe der autolytischen Bakterien induzierte eine höhere antigenspezifische Antikörperantwort, als die herkömmliche intramuskuläre DNA-Vakzine. Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Konzept autolytischer Salmonellen stellt also eine neuartige, effiziente Strategie für den mukosalen DNA-Transfer dar. Die Übertragung des Konzeptes der Autolyse auf andere bakterielle Trägersysteme ist möglich und kann zur Erweiterung des Anwendungspektrums bakterieller Vektoren beitragen. / The development of an effective mucosal DNA vaccine against infectious diseases or tumors based on invasive attenuated bacteria is a very promising alternative to common parenteral routes of genetic vaccination. This work aimed at the optimization of Salmonella vaccine strains for the oral delivery of an eukaryotic expression plasmid encoding the small Hepatitis B Virus surface antigen (HBsAg), here used as model antigen. The continuous secretion of plasmids as filamentous phage particles was first tested as a mean for the delivery of the DNA vaccine by living bacteria inside infected host cells. However, Salmonella-mediated phage secretion inside cells did not suffice for the induction of transgene expression. As alternative approach, inducible spontanous lysis of bacteria was used to mediate the release of plasmid DNA into host cells. For this purpose a novel bacterial autolytic system was established on the basis of a two-phase expression system and lysis determinants derived from bacteriophages. This system allows for the first time the continuous release of plasmid DNA and proteins from only few lysing Salmonella within an otherwise healthy bacterial population. Inside COS7 cells the release of the pore-forming protein listeriolysin O by autolytic Salmonella mediates the destruction of the Salmonella-harbouring vacuole, thereby facilitating the transfer of plasmid DNA from bacteria into the host cell cytoplasm. The lysis determinant was combined with the eukaryotic expression cassette for HBsAg on one plasmid. In addition, a cassette for the constitutive expression of TmHU, a histon-like protein derived from Thermotoga maritima, was integrated in such vector. TmHU stabilizes the plasmid propagation in the absence of selective pressure and has the potential to increase the efficiency of plasmid translocation inside the host cell. The oral administration of the optimized autolytic bacteria stimulated a potent HBsAg-specific antibody response as well as a cytotoxic cellular response. Already a single inoculation of the oral vaccine induced a higher specific antibody response than the conventional intramuscular DNA vaccine. Therefore the concept of autolytic Salmonella carrier strains developed in this work constitutes a novel efficient strategy for mucosal DNA delivery. The transfer of this concept to other bacterial carriers is possible and may widen the application field for bacterial vectors.

Die Therapie der HIV Infektion besteht aus Kombination mehrerer antiretroviraler Substanzen und birgt ein erhöhtes Risiko an Arzneimittelwechselwirkungen. Das bekannte Problem der Virusresistenz kann zudem durch Enzyminduktion begünstigt werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag in Untersuchungen zu Einflüssen der Virustatika auf die Expression von Cytochrom P450 Enzymen: 1A1, 1B1, 3A4 sowie der P-Glykoproteins (MDR1) an immortalisierten Zellsystemen. Die Protease Inhibitoren Indinavir, Nelfinavir, Ritonavir und Saquinavir induzierten die Regulation der mRNA Expression über den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor (AhR) und den Pregnan-X-Rezeptor (PXR) dosisabhängig und signifikant. Die Nukleosidischen Reverse Transkriptase Inhibitoren Zalcitabin, Zidovudin und Lamivudin sowie der Nicht-Nukleosidische Inhibitor Nevirapin zeigten induktive Eigenschaften nur für die AhR Zielgene CYP1A1 und CYP1B1. Amprenavir und Efavirenz aktivierten die PXR-Regulation. Die möglichen Auswirkungen der Induktion der untersuchten Gene wurden ausführlich diskutiert. Die molekularen Grundlagen der interindividuell variierenden Aktivität von CYP3A wurden in einer Probandenstudie untersucht. Es wurden die mRNA Expression in den Leukozyten, die Aktivität des Enzyms und einige bekannte Polymorphismen unter Einwirkung von Rifampicin untersucht und diskutiert. / The therapy of HIV infection requires a combination of several antiretroviral substances accompanying risk factors for drug-drug interactions. Moreover, virus resistance can be promoted by enzyme induction caused by antiretroviral drugs. The aim of the study was to investigate the influences of antiretroviral substances on the expression of cytochrome P450 enzymes: 1A1, 1B1, 3A4 and p-glycoprotein (MDR1) using immortalized cell systems. The protease inhibitors indinavir, nelfinavir, ritonavir and saquinavir induced significantly the regulation of mRNA expression through the aryl hydrocarbon receptor (AhR) and the pregnane-x-receptor (PXR) in a concentration-dependent manner. The nucleoside reverse transcriptase inhibitors zalcitabine, zidovudine and lamivudine and the non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor nevirapine showed inductive properties only for the AhR target genes CYP1A1 and CYP1B1.Amprenavir and efavirenz activated the PXR target genes. Potentially effects of the described induction are discussed. In a second part of the work, the molecular mechanisms of the individual varying activity of the CYP3A enzyme were investigated applying an in vivo study. CYP3A4 mRNA expression and rifampicin mediated induction in leucocytes were correlated with systemic enzyme activity under induction and known polymorphisms.