Hintergrund: Karzinoid-Tumoren des embryonalen Mitteldarms sind seltene intestinale neuroendokrine Tumoren, bei denen zum Zeitpunkt der Diagnose häufig Metastasen vorliegen. Im Gegensatz zu Karzinoiden des Vorderdarms und Respirationstraktes sind sie nicht mit der Multiplen Endokrinen Neoplasie Typ 1 (MEN1) vergesellschaftet. Die Mechanismen ihrer Tumorigenesis sind weitgehend unbekannt. Methoden: Tumorgewebe acht sporadischer, maligner Dünndarm-Karzinoide war Objekt dieser Studie über Verlust der Heterozygotie ("Loss Of Heterozygosity" (LOH)) mit 131 fluoreszierenden Mikrosatelliten. DNA Sequenz-Analyse mit Oligonucleotid Primern, die Exon 8-11 des SMAD4/DPC4 Gens flankieren sowie immunhistochemische Färbung mit Smad4/DPC4 antikörpern wurde durchgeführt. Ergebnis: Chromosom 18 wies Deletionen in 88% der Tumoren auf. Alle außer einem Tumor hatten sowohl 18p als auch 18q verloren, in einem der Tumoren war eine kleine Region telomer zu den SMAD4/DPC4/DCC Genen auf 18q21 verloren. Andere Chromosomen waren nur in drei Tumoren betroffen. LOH auf Chromosom 11q13, dem MEN1 Lokus, wurde nicht gefunden.Sequenzierung der DNA und immunhistochemische Färbung für das SMAD4/DPC4 Gen zeigten keine Aberrationen. Diskussion: Die Funde der Chromosom 18 Deletionen weisen eindeutig auf ein entscheidendes Ereignis in der Tumorigenese von Karzinoiden des Mitteldarms hin. An der Entstehung dieser Tumoren könnte ein mutmaßliches Tumor Suppressor Gen beteiligt sein, welches auf Chromosom 18 lokalisiert ist. Dahingegen ist SMAD4/DPC4 wahrscheinlich nicht in die Tumorneogenese von Carcinois Tumoren involviert. / Background: Midgut carcinoid tumors are rare malignant tumors with origin in the neuroendocrine cells of the small intestine. Due to secretion of a variety of peptide hormones and biogenic amines they cause the carcinoid syndrome. Metastases are often present at first diagnosis. Despite this, patients have a realistic chance to survive for a prolonged period (30% (unresectable/metastatic disease) -79% (non-metastatic disease) 5-year survival rate) if treated by a combination of surgery and medication. Unlike their foregut counterparts, midgut carcinoid tumors are not or rarely associated with the multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) syndrome. The genetic back-ground to tumorigenesis of these neoplasms is unknown. In contrast, the events involved in tumorigenesis of gastroenteropancreatic adenocarcinomas are better characterized with frequent mutations e.g. of the Smad4/DPC4, Smad2/MADR2/JV18-1 and DCC genes on chromosome 18. Methods: Eight metastatic midgut carcinoids were analysed by a genome-wide screening for loss of heterozygosity using 131 PCR-amplified fluorescent-labelled microsatellite markers. DNA sequence analysis using oligonucleotide primers flanking exons 8-11 of the Smad4/DPC4 gene and immunohistochemical staining with Smad4/DPC4 antibodies was performed. Results: Chromosome 18 was deleted in seven out of eight tumors (88%). All but one of these tumors had lost both 18p and 18q, the remaining tumor had lost the long arm but retained the short arm. Several other chromosomal alleles were lost in a subset of the tumors. Loss of heterozygosity (LOH) on chromosome 11q13, the MEN 1 locus, was not found. Smad4/DPC4 wild-type sequence and normal immunohistochemical staining for Smad4/DPC4 protein was found for all analysed tumors. Conclusions: Our finding of a high frequency of chromosome 18 deletions in 88% of the tumors strongly suggests that midgut carcinoid tumorigenesis might involve inactivation of a candidate tumor suppressor gene located in that region while Smad4/DPC4 is unlikely to be involved in that process. A more detailed analysis of the genetic events in midgut carcinoid tumors is warranted to clarify their neogenetic origin.

Alternatives mRNA-Splicing ist ein häufig beobachtetes Phänomen, das es der Zelle ermöglicht, unterschiedliche Proteine aus einem Gen zu generieren. In den letzten Jahren wurden immer mehr alternativ gespleißte Transkripte entdeckt, und einigen der daraus resultierenden Protein-Isoformen konnten geänderte biologische Funktionen zugeordnet werden. In dieser Arbeit ist erstmals ein alternativ gespleißtes Transkript der Interleukin-4 Rezeptor alpha (IL-4R-alpha) Kette beschrieben. Dieser mRNA Splice-Variante, genannt IL-4R-alpha-IT, fehlt im membranproximalen Bereich der zytoplasmatischen Domäne ein komplettes Exon. Dies führt zur Verschiebung des Leserasters und so zur Entstehung eines vorzeiten Stop-Codons. Der resultierenden Protein-Isoform fehlt der größte Teil der intrazellulären Kette mit den dort enthaltenen, für die Signaltransduktion essentiellen Domänen. Die Untersuchung der biologischen Funktion der Rezeptor-Varianten in einem geeigneten Zellsystem der Maus zeigte, daß die Splice-Variante IL-4R-alpha-IT keine Proliferation der Zellen vermitteln und auch den Übergang der Zellen in die Apoptose nicht verhindern kann. Bei der Quantifizierung der Expression von IL-4R-alpha-IT-mRNA in Relation zum IL-4R-alpha voller Länge mit einer kompetitiven RT-PCR an Knochenmark und peripheren Blutlymphozyten von Kindern mit ALL zeigte sich zunächst ein irreführender Unterschied zwischen Proben von Kindern mit ALL-Ersterkrankung und Rezidiv. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, daß der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials für diesen scheinbaren Zusammenhang verantwortlich war. Während direkt nach Abnahme aufgearbeitetes Untersuchungsmaterial eine nur niedrige relative Expression der Splice-Variante zeigte, nahm diese bei verzögerter Aufarbeitung drastisch zu. Diese Beobachtung wurde experimentell an Proben gesunder Probanden wiederholt bestätigt. Interessanterweise konnte derselbe Effekt in unterschiedlicher Ausprägung auch bei Splice-Variante anderer Zytokine und -Rezeptoren wie IL-7, IL-7R und beta-C beobachtet werden. mRNA-Stabilitäts-Assays und die Bestimmung der einzelnen Transkripte mit einer semiquantitativen RT-PCR zeigten, daß es tatsächlich zu einer absoluten Hochregulation der IL-4R-alpha-IT-mRNA in den verzögerte aufgearbeiteten Proben kommt. Wurden die Zellen wieder in Kultur genommen, war dies innerhalb weniger Stunden reversibel. Desweiteren scheinen auch unterschiedlichen mRNA-Stabilitäten eine Rolle zu spielen. / Alternative pre-mRNA splicing is a widespread mechanism contributing to the diversity of gene expression. The number of newly detected alternatively spliced transcripts has continuously risen, and distinct biological functions have been attributed to some protein isoforms resulting from these mRNA variants. We report on the detection of a novel alternatively spliced transcript of the human interleukin-4 receptor alpha (IL-4R-alpha) chain, which has been called IL-4R-alpha-IT mRNA. A premature stop codon due to omission of one exon in the membrane-proximal region of the cytoplasmic domain leads to an mRNA variant, which encodes an intracellular truncated receptor protein lacking domains which are essential for signal transduction. The investigation of the biological function of the IL-4Ra splice variants in a suitable mouse cell system showed, that the truncated receptor variant is not able to mediate cell proliferation or prevention of apoptosis. Bone marrow and peripheral blood samples from children with acute lymphoblastic leukemia were analyzed for the expression of IL-4R-alpha-IT mRNA relative to the full-length receptor transcript by competitive RT-PCR. Initially, there was found a difference of IL-4R-alpha-IT mRNA expression in patients with initial ALL versus relapsed ALL. However, this difference turned out to be due to the time interval between collection and preparation of samples. While freshly isolated material was associated with low levels of IL-4R-alpha-IT mRNA, samples with a longer period until cell preparation exhibited a drastic increase of IL-4R-alpha-IT mRNA levels. The same results were obtained for peripheral blood samples from healthy donors by imitating a prolonged time of transport until cell preparation. Interestingly, a similar effect could be demonstrated for splice variants of other cytokine receptors and cytokines (beta-C, IL-7R, and IL-7), although to different extents. mRNA stability assays and semiquantitative RT-PCR specific for IL-4Ra or IL-4R-alpha-IT, respectively, indicated that the expression of IL-4R-alpha-IT mRNA increases absolutely in these samples, although mRNA degradation may be of importance as well.

Charakterisierung des Zytokinprofils in Erwachsenen mit einer latenten oder aktiven Tuberkulose in einem hoch endemischen Gebiet Die Tuberkulose (TB) stellt mit rund 2 Milliarden Infizierten weltweit ein globales gesundheitliches Problem dar. Während die große Mehrheit der infizierten Personen in der Lage sind die Krankheit zu kontrollieren, entwickelt sich bei ungefähr 10 % die aktive Form der TB aus. Der zugrunde liegende immunologische Prozess für diese Verteilung ist bis heute nicht bekannt und im Fokus dieser Arbeit. Das adaptive Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle in der Immunabwehr gegen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), dem Erreger der TB. Hierbei sind besonders CD4+ T-Zellen für die erfolgreiche Eingrenzung der Erkrankung verantwortlich. Im Vorfeld konnte bereits mehrmals eine Assoziation zwischen polyfunktionalen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen verschiedenste Krankheitserreger gezeigt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird versucht die Frage zu beantworten, ob eine erhöhte Frequenz von polyfunktionalen CD4+ T-Zellen auch gegen die Ausbildung einer aktiven TB schützen kann. Zur Bearbeitung dieser Fragestellung wurde das TH1 Zytokinprofil von Patienten mit aktiver TB untersucht und mit dem von gesunden latent infizierten Probanden (LTBI) verglichen. Desweiteren wurden die TB Patienten während der antimikrobiellen Therapie begleitet um Änderungen im Zytokinprofil von CD4+ T-Zellen beobachten zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die simultane Expression der vier TH1 Zytokine IFNg, TNFa, IL-2 und GM-CSF mit Hilfe der multifarben Durchflusszytometrie untersucht. Nach antigenspezifischer Stimulation konnten sowohl in unbehandelten und behandelten Patienten mit aktiver TB ein großer Anteil an multifunktionale Gedächtnis-T-Zellen nachgewiesen werden, die alle vier Zytokine gleichzeitig exprimierten. Bemerkenswerterweise konnte diese Population ebenfalls in LTBI gezeigt werden. Nach den ersten zwei Monaten der Therapie war der Anteil an multifunktionalen T-Zellen signifikant erhöht welches auf einen positiven Einfluss dieser Zellen auf die Behandlung hinweist. Um detaillierte Information über das Expressionspotential von CD4+ T-Zellen zu gewinnen wurden PBMCs mit einem Superantigen inkubiert. Hierbei unterschied sich das Zytokinprofil zwischen den beiden Studiengruppen signifikant und veränderte sich ebenfalls unter Therapie. Während die Expression von IFNg in TB Patienten niedriger war als in LTBI, war die Frequenz von TNFa, IL-2 und GM-CSF-positiver CD4+ T-Zellen signifikant höher in Patienten mit aktiver TB. Zusammenfassend ist zu sagen, dass sowohl in TB Patienten vor und nach Therapie, als auch in LTBI, multifunktionale CD4+ T-Zellen nachgewiesen werden können. Ein Unterschied in der Frequenz konnte dabei nicht festgestellt werden. Daher kann ein Zusammenhang zwischen der Existenz von multifunktionellen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen eine mögliche Reaktivierung von der latenten zu der aktiven TB nicht beschrieben werden. / Characterization of the cytokine profile in adults with latent and active tuberculosis from a high endemic country Tuberculosis (TB) is a global health problem with ~2 billion infected people worldwide. The vast majority of infected individuals is able to control TB, while only ~10% develop active disease. The immunologic correlates determining the protection against reactivation of the latent form of active TB remain elusive. The adaptive immune system plays an important role in the response against Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), especially CD4+ T cells are crucial for efficient containment of the pathogen. Since polyfunctional CD4+ T cells have been associated with protection against various pathogens, the question was raised if higher frequencies of polyfunctional CD4+ T cells can be linked to protection against reactivation of active TB. To address this the TH1 T cell cytokine profile of active TB patients was analyzed and compared with healthy latently infected individuals (LTBI). Furthermore TB patients were followed up under anti-microbial therapy to monitor changes in the cytokine pattern expressed by CD4+ T cells. Hereby, for the first time, the simultaneous expression of four TH1 cytokines, IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF, was investigated using multi color flow cytometry. After antigen-specific stimulation multifunctional memory T cells (CD45RO+) co-expressing IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF were strongly represented in both treated and untreated TB patients. Interestingly, this proportion of polyfunctional memory T cells was also found in LTBI. After the first two months of drug treatment the proportion of antigen-specific polyfunctional T cells was significantly increased, indicating a positive impact of these cells during therapy. To gain detailed information about the potential of CD4+ T cells to produce cytokines we incubated PBMCs with a superantigen. In this case the profile was significantly different between these two groups and it changed during therapy. While the expression of IFNg was significantly lower in CD4+ T cell of TB patients in comparison to LTBI, the expression of TNFa, IL2 and GM-CSF showed significant higher frequencies in memory T cells of TB patients. To conclude, upon antigen stimulation, polyfunctional memory T cells are found in TB patients pre- and post therapy as well as in LTBI. A difference in the frequency between active TB patients and LTBI could not be detected and therefore a correlation with protection against reactivation from the latent to the active form of TB cannot be drawn.

Hantaviren sind wichtige menschliche Krankheitserreger und können das Hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrome (HFRS) auslösen, welches sich durch endotheliale Dysfunktion kennzeichnet. Pathogene und nicht-pathogene Hantaviren replizieren sich in Endothelzellen, ohne zytopathische Effekte auszulösen. Dies legt nahe, dass immunpathologische Mechanismen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielen. Wir haben die antivirale Antwort nach Infektion mit dem pathogenen Hantaan Virus (HTNV) sowie mit dem weniger pathogenen Tula Virus (TULV) in humanen Endothelzellen (HUVEC) verglichen. Die mit HTNV und auch die mit TULV infizierten Zellen zeigten eine erhöhte Expression von Antigen-präsentierenden Molekülen. Hierbei induzierte TULV die Expression von HLA Klasse I-Molekülen noch effizienter. HTNV sorgte für die Induktion von Interferon (IFN)-???während dieses Zytokin im Überstand von TULV-infizierten HUVEC kaum nachzuweisen war. Trotzdem konnte die Hochregulation von HLA Klasse I-Molekülen auf HTNV- und TULV-infizierten Zellen durch anti-IFN-?-Antikörper blockiert werden. Interessanterweise wurde das antiviral wirksame MxA-Protein, welches die virale Replikation hemmt, bereits 16 Stunden nach einer Infektion mit TULV induziert. Im Gegensatz dazu war MxA in HTNV-infizierten Zellen erst nach 48 Stunden der Infektion nachzuweisen. Der Kinetik der MxA-Expression entsprechend, replizierte sich TULV nur sehr schwach in HUVEC, wohingegen HTNV-infizierte Zellen hohe Virustiter aufwiesen, die nach 48 Stunden der Infektion wieder zurückgingen. Beide Hantavirus-Spezies waren jedoch gleichermaßen effizient in der Lage, sich in Vero E6-Zellen zu replizieren, denen die IFN-induzierte MxA-Antwort fehlt. Die verzögerte Induktion des MxA nach einer Infektion der HUVEC mit HTNV, könnte die Virusausbreitung ermöglichen und mit zur Pathogenese des HFRS beitragen. Das Risiko, sich während der Arbeit im Forschungslabor versehentlich mit Hantaviren zu infizieren, macht spezielle Sicherheitsmaßnahmen zwingend erforderlich. Die Wirkung von chemischen oder physikalischen Inaktivierungsmethoden wurde an HTNV-infizierten Proben untersucht. Die beschriebenen Maßnahmen zur Virus-Desinfektion sind geeignet, eine sichere Handhabung der Proben zu gewährleisten. / Hantaviruses represent important human pathogens and can induce hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS), which is characterised by endothelial dysfunction. Both pathogenic and nonpathogenic hantaviruses replicate without causing any apparent cytopathic effect suggesting that immunopathological mechanisms play an important role in pathogenesis. We compared the antiviral response triggered by Hantaan virus (HTNV), a pathogenic hantavirus associated with HFRS, and Tula virus (TULV), a rather nonpathogenic hantavirus, in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Both HTNV- and TULV-infected cells showed increased levels of molecules involved in antigen presentation. However, TULV-infected HUVEC more rapidly upregulated HLA class I molecules. Interestingly, HTNV clearly induced the production of interferon (IFN)-( whereas expression of this cytokine was barely detectable in the supernatant or in extracts from TULV-infected HUVEC. Nevertheless, upregulation of HLA class I on both TULV- and HTNV-infected cells could be blocked by neutralising anti-IFN-( antibodies. Most strikingly, antiviral MxA protein, which interferes with hantavirus replication, was induced already 16 h after infection with TULV. In contrast, HTNV-infected HUVEC showed no expression of MxA until 48 h postinfection. In accordance with the kinetics of MxA expression TULV only inefficiently replicated in HUVEC whereas HTNV-infected cells produced high titers of virus particles that decreased 48 h postinfection. Both hantavirus species, however, could replicate equally well in Vero E6 cells which lack an IFN-induced MxA response. Thus, a delayed induction of antiviral MxA in endothelial cells after infection with HTNV could allow viral dissemination and contribute to the pathogenesis leading to HFRS. The potential risk of accidental infection by hantaviruses in a clinical or research laboratory necessitates special precautionary measures. To study the elimination of hantavirus infectivity, the effects of different chemical and physical inactivation and depletion procedures were investigated on HTNV-containing materials. The virus inactivation and depletion methods described herein are suitable to prepare non-infectious samples for further use in immunological, virological and cell biological assays.

Cytokine steuern die Kommunikation von verschiedenen Zelltypen untereinander und regulieren deren Überleben, Differenzierung und Wachstum. Kommt es zu einer Deregulation der Expression von Cytokinen oder deren Rezeptoren, kann es zu autoimmunen oder malignen Erkrankungen kommen. Ein besonderes Beispiel der aberranten Cytokinexpression ist das klassische Hodgkin Lymphom. Die malignen Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) Zellen des Hodgkin Lymphoms stammen ursprünglich aus Keimzentrums B-Zellen ab, haben aber ihren B-Zell Phänotyp verloren. Des Weiteren exprimieren sie eine Vielzahl von verschiedenen Cytokinen und Cytokinrezeptoren, die ursprünglich nicht in einem Genexpressionsprogramm von B-Zellen vorkommen. In dieser Arbeit wurden zwei dieser Cytokin-Rezeptorsysteme (IL-21/IL-21R und CSF-1/CSF1R) hinsichtlich ihrer Funktionen für die HRS Zellen des Hodgkin Lymphoms charakterisiert. Die Expression des T-Zell assoziierten Cytokins IL-21 konnte in dieser Arbeit erstmals in HRS Zellen nachgewiesen werden. Für die Expression des myeloiden CSF1R zeigen Ergebnisse dieser Arbeit eine neuartige Regulation durch ein Long Terminal Repeat (LTR) Element, welche zu einem bis dahin unbekannten mRNA Transkript des Protoonkogens CSF1R in den HRS Zellen führt. Sowohl für IL-21 als auch für CSF1R konnte in der Doktorarbeit die Expression und Funktionalität des jeweilig korrespondierenden Rezeptors (IL-21R) bzw. Cytokins (CSF-1) nachgewiesen werden. Die Bedeutung dieser B-Zell fremden Gene für die HRS Zellen lag hauptsächlich in der Stimulation von Wachstum und Überleben und der Induktion von wichtigen Signalwegen (z.B. STAT3). Die Ergebnisse der Dissertation können als Ausgangspunkt für neue Strategien in der Diagnostik und der spezifischeren Therapie von Hodgkin Lymphom Patienten dienen. Der außergewöhnliche Mechanismus der Genregulation des CSF1R Gens über ein endogenes LTR Element kann in anderen Tumorentitäten ebenfalls ein Grund für die Aktivierung von Onkogenen sein. / Cytokines in the human body are responsible for cell-cell communication and regulate survival, differentiation and proliferation of different cell types. Deregulation of expression levels of cytokines might contribute to autoimmune diseases or tumor growth. One of the most prominent examples of aberrant cytokine expression is the classical Hodgkin Lymphoma. The malign Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) cells of classical Hodgkin Lymphoma are derived from germinal centre B cells, however they lost their B cell-specific phenotype. Moreover they express a huge variety of cytokines and cytokine receptors, normally not expressed in B cells. Two of these cytokine-receptor systems (IL-21/IL-21R and CSF-1/CSF1R) and their expression and function in HRS cells are subject of this dissertation. The expression of the T cell-associated cytokine IL-21 has been shown for the first time in HRS cells. The results for the myeloid-specific proto-oncogene CSF1R identified a unique, so far unknown mRNA transcript, expressed due to activation of a long terminal repeat (LTR) element. For both, IL-21 and CSF1R, the expression and functionality of the corresponding receptor (IL-21R) or cytokine (CSF-1), respectively, was demonstrated in this dissertation. Protection from apoptosis, proliferation and stimulation of several pathways are the main functional consequences of auto- and paracrine stimulation of HRS cells with either IL-21 or CSF-1. These results might lead to new diagnostic and more specific treatment strategies for Hodgkin Lymphoma patients. Regarding the unusual expression of CSF1R via LTR activation this mechanism might also be the reason for oncogene activation in several other tumor entities.

Dermatophyten sind keratinophile Pilze, d.h. sie besiedeln und infizieren die Haut und ihre Anhangsgebilde (Haare, Nägel) bei Mensch und Tier. Die derzeit häufigsten durch Dermatophyten hervorgerufenen Infektionen sind die Onychomykose, Tinea pedis, Tinea capitis und Tinea corporis. Da Antimykotika nicht bei alle Erregern von Dermatophytosen gleich wirksam sind, sollte im Vordergrund einer Behandlung zunächst die korrekte Erregerdifferenzierung stehen. Konventionell erfolgt diese Differenzierung über morphologische Merkmale wie Form und Farbe der auf dem Nährmedium gewachsenen Pilzkolonie, charakteristische mikromorphologische Elemente (Konidien) und biochemische Eigenschaften. Diese Merkmale werden jedoch oftmals nicht exprimiert. Damit ist in diesen Fällen keine Speziesdiagnose möglich. Eine zuverlässige Diagnostik sollte zudem das natürliche Klassifizierungssystem direkt reflektieren. Die Studien zur molekularen Biodiversität innerhalb der Dermatophyten sollten deshalb zur Klärung evolutionärer, taxonomischer und populationsgenetischer Zusammenhänge bei den verschiedenen Spezies der Gattungen Arthroderma, Trichophyton, Microsporum und Epidermophyten beitragen und helfen, geeignete DNA-Marker für die Anwendung in der medizinischen Diagnostik zu finden und einzusetzen. Dazu wurden verschiedene Methoden und Zielsequenzen genutzt, wie die Sequezierung der internal transcribed spacer (ITS) Region der ribosomalen DNA, das PCR-Fingerprinting, single strand conformation polymorphism (SSCP) und amplified fragment length polymorphism (AFLP)-Analyse. Es wurden weit über 200 Stämme, die bisher ca. 100 verschiedenen Taxa zuzuordnen waren, analysiert. Die molekularen Studien zeigen, dass die phylogenetisch ältesten Dermatophytenspezies geophil sind und sich die wärmeliebenden, zoophilen Arten erst später durch Koevolution mit warmblütigen Tieren entwickelt haben. Die anthropophilen scheinen dagegen erst mit Entstehung des Menschen evolviert und demzufolge am jüngsten zu sein. Damit kann man ihre geringe Biodiversität und ihr verändertes pathogenetisches Verhalten erklären. Es konnte gezeigt werden, dass die molekularen Phylogenie der Spezies besser mit ihrer Ökologie und dem Krankheitsbild als mit morphologischen Eigenschaften übereinstimmt und dass etliche Dermatophytenspezies überklassifiziert sind. Aus diesem Grunde wurde eine neue Systematik vorgeschlagen. Für den Nachweis des häufigsten Erreger, Trichophyton rubrum wurde eine Gensonde entwickelt, die in der medizinischen Diagnostik einsetzbar ist. / Dermatophytes are keratinophilic fungi which colonise and infect skin, hair and nails of man and animals. The most common infections caused by dermatophytes are onychomycosis, tinea pedis, tinea capitis and tinea corporis. Antimycotics may have different spectra of activity even in related dermatophyte species. Therefore a correct species identification is necessary before onset of antifungal therapy. Conventionally, the identification of dermatophytes is performed by the use of morphological features, such as shape and colour of the colony, micromorphological characteristics (conidia) and biochemical properties. However, these characters may not be expressed and then identification down to the species level is frequently impossible. Reliable diagnostics directly reflects the natural system. Studies of biodiversity in dermatophytes should therefore focus on elucidation of the connection of evolution, taxonomy and population genetics of the species of the genera Arthroderma, Trichophyton, Microsporum and Epidermophyten and thus contribute to development of stable DNA markers to be applied in routine diagnostics. Several methods and targets were applied such as sequencing of the internal transcribed spacer region (ITS) of the ribosomal DNA, PCR fingerprinting, single strand conformation polymor phism (SSCP) and amplified fragment length polymorphism (AFLP) analysis. More than 200 strains belonging to about 100 dermatophyte taxa were analysed. Phylogenetically, the molecular data show the oldest dermatophyte species to be geophilic and subsequently co-evolved as zoophilic dermatophytes with warm blooded animals. In contrast, the anthropophilic dermatophytes are much younger as they evolved in association with humans. This hypothesis is supported by their low biodiversity and changing pathogenicity. The molecular data show correspondence between phylogeny of species and their ecology and clinical picture, rather than with morphological features. Many dermatophyte species were shown to be overclassified. A new systematic system was proposed. For the identification of Trichophyton rubrum, the most common dermatophyte species, an oligonucleotide probe was developed which is applicable in medical routine diagnostics.

Eines der prävalentesten humanen Pathogene ist das Magenbakterium Helicobacter pylori, welches ca. die Hälfte der Weltbevölkerung infiziert. Die Persistenz geht mit einer chronischen Gastritis einher, welche bis zu Magenkrebs fortschreiten kann. H.pylori bedient sich diverser Mechanismen um sich der Erkennung des Immunsystems zu entziehen und somit eine chronische Infektion zu ermöglichen. Erhöhte Expression des Immunzellinhibitors PD-L1 wurde in Magenepithelzellen gefunden, welche mit diesem Gram-negativen Erreger infiziert wurden. In dieser Arbeit wurde die Regulation auf in vitro Ebene untersucht, wobei zwei unterschiedliche Mechanismen identifiziert wurden. Ursächlich für die frühe PD-L1-Induktion ist die ADP-heptose/ALPK1 Signalkaskade. Der bakterielle Metabolit ADP-heptose, welcher für die Bildung von LPS benötigt wird, wurde als PAMP identifiziert, welcher durch das Sekretionssystems cagT4SS in die infizierte transportiert und anschließend von der Host Kinase ALPK1 erkannt wird. Gegensätzlich hierzu, wurde festgestellt, dass die zweite PD-L1-Hochregulation auf der metabolischen Reprogrammierung des Wirts beruht. Ein Merkmal von H. pylori ist dessen Bedarf an Cholesterin, welches es aus dem Medium oder aus membranösen Lipidregionen des Wirts extrahiert wird. Es konnte bewiesen werden, dass dieser Sterol-Abbauprozess zu einer erhöhten Stoffwechselaktivität führt, die spezifisch mit einer Zunahme der Glykolyse verbunden ist und mit einer Expressionsverschiebung des ersten Glykolyseenzyms Hexokinase von der Isoform 1 zu 2 einhergeht. Knockdown und Knockout- Experimente wiesen auf einen Zusammenhang mit der Regulation des Immunzellinhibitoren PD-L1 hin. / One of the most prevalent bacteria is the gastric bacterium Helicobacter pylori, which infects half of the world’s population. Persistence is accompanied with chronic gastritis which can progress towards gastric cancer. Several strategies are used by H.pylori to evade the immune system, enabling chronic infection. Heightened expression of the immune cell inhibitor PD-L1 was found in gastric epithelial cells, infected with this Gram-negative pathogen. Within this thesis, upregulation was studied in in vitro models, revealing two distinct mechanism. Causative for early PD-L1 induction is the ADP heptose/ALPK1 signaling axis. The bacterial metabolite ADP heptose, which is needed for LPS synthesis, was identified as PAMP, which is transported through the secretion system cagT4SS into the infected cell and is recognized by the host kinase ALPK1. In contrast, late upregulation of PD-L1 was found to be linked to metabolic reprogramming upon infection. Characteristic to H.pylori is its need of cholesterol, which it has to extract from the surrounding medium or lipid-rich regions within the host membrane. It could be shown that this sterol extraction process is accompanied with an increased metabolic activity which is linked with enhanced glycolysis and an expression shift of the glycolytic enzyme hexokinase isoform 1 to 2. Knockdown and knockout experiments showed a link between HK2 and regulation of the immune checkpoint PD-L1.

Salmonella spp. sind fakultative intrazelluläre Pathogene, die gastrointestinale und systemische Erkrankungen in einem umfassenden Wirtsbereich, einschließlich Tier und Mensch, hervorrufen. Salmonella benötigt verschiedene Virulenzgene für die Infektion welche auf sogenannten Salmonella Pathogenitäts-Inseln (SPI) kodiert sind. Hinzu kommt, dass auch zahlreiche im Salmonella Genom verstreuten Gene an verschiedenen Aspekten von Virulenz und Pathogenese beteiligt sind. In der vorliegenden Studie wurde die Funktion eines zuvor nicht beschriebenen putativen transkriptionellen Regulators (STM0029) charakterisiert und definiert. Dieser scheint für die Abwehr von zellulären bakterizid wirkenden Verbindungen und das Überleben des Bakteriums innerhalb einer intrazellulären Nische von entscheidender Bedeutung zu sein. Die STM0029-deletierte Mutante wies eine gesteigerte Sensitivität gegenüber antimikrobiellen Peptiden und bakteriziden Verbindungen auf. Dazu zählten α-Defensin-1, β- Defensin-1, β-Defensin-2, LL-37 und Polymyxin B sowie Komponenten des Komplementsystems. Unerwartet war die Beobachtung, dass die Expression von STM0029 durch das PmrA/B Zwei Komponenten System reprimiert vorlag, während das PhoP/Q Zwei Komponenten System keinen Einfluss auf die Expression von STM0029 zu scheinen hat. Beide Komponent Systeme spielen bekanntlich eine entscheidende Rolle bei der Expressionsregulation von Genen die für das intrazelluläre Überleben von Salmonella wichtig sind. Bemerkenswert ist, dass ein Set von Genen welche an der Biosynthese und/oder der Modifikation für das LPS O-Antigen sowie des Peptidoglykans in der bakteriellen Zellwand beteiligt ist, im STM0029 Deletionshintergrund herab reguliert vorlag. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das STM0029 Genprodukt die Persistenz des Pathogen in Wirtszellen beeinflusst. Möglicherweise geschieht dies durch das Umgehen von wirtseigenen Abwehrmechanismen. / Salmonella spp. are facultative intracellular pathogens, which cause gastrointestinal and systemic diseases in a broad range of hosts including animals and humans. In addition to virulence genes clustered within pathogenicity islands, numerous additional genes scattered throughout the genome are also involved in various aspects of Salmoenlla virulence and pathogenesis. In this study, I identified a Salmonella putative transcriptional regulator encoded by a previously uncharacterized open reading frame designated STM0029. Deletion of STM0029 altered the expression of genes involved in both the resistance to host bactericidal challenges, and bacterial cell wall biosynthesis in S. Tyhpimurium. The ΔSTM0029 strain showed a defect in the resistance to host antimicrobial peptides, including α-defensin-1, β-defensin-1, β-defensin-2, LL-37, and polymyxin B as well as serum challenges compared to the wildtype. Unexpectedly, expression of STM0029 was found to be repressed by the PmrA/B two component system, but appeared to be independent of the PhoP/Q two component system, both of which are well-known regulatory systems involved in the regulation of expression of genes involved in Salmonella intracellular survival. Notably, the expression of a set of genes involved in bacterial LPS O-antigen and peptidoglycan biosyntheses and modifications showed decreases in the absence of STM0029. These experimental results indicate that the STM0029 gene product in S. Typhimurium contributes to resistance against host cell defense mechanisms, likely through regulation of genes involved in LPS O-antigen and peptidoglycan biosynthesis and modifications.

Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die sich in einem membranumschlossenen Kompartiment namens Inklusion vermehren. Nach Infektion fragmentiert der Golgi-Apparat der Wirtszelle in kleine Membranstapel. Dies verbessert die Aufnahme von Sphingolipiden und ist deshalb für die chlamydiale Vermehrung essentiell. Die infektionsinduzierte Golgi-Fragmentierung geschieht nach Spaltung des Golgi-Matrix-Proteins Golgin-84. In dieser Arbeit konnte, durch den Vergleich mit bekannten Substraten und Inhibitorstudien, die chlamydiale Protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) als das Enzym identifiziert werden, das diese Spaltung induziert, abhängig von der Anwesenheit zweier Rab-Proteine, Rab6 und Rab11, die den zellulären Vesikeltransport kontrollieren und zur Inklusion rekrutiert werden. Die Fragmentierung des Golgi-Apparates verhinderte dessen Relokalisierung während der Zellpolarisierung nach Einbringen eines migratorischen Stimulus. Sowohl infizierte als auch Golgin-84-depletierte Zellen migrierten langsamer und randomisiert in einem Motilitätsassay. Die Relokalisierung des Golgi-Apparates konnte durch seine Stabilisierung mittels WEHD oder Rab-Depletion wieder gewonnen werden, was die Zellmotilität teilweise wieder herstellte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Infektion außer der Golgi-Reorientierung die Signaltransduktion durch GTPasen beeinflusst. Die Aktivität von Cdc42 in infizierten Zellen war erhöht und die Interaktionen mit vielen ihrer Effektoren laut quantitativer Massenspektrometrie stark verändert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass CPAF die für Chlamydien lebenswichtige Golgin-84 Prozessierung und Fragmentierung des Golgi-Apparates auslöst. Dies verringert die Mobilität der Wirtszelle, vor allem da der Golgi-Apparat während der Polarisierung nicht mehr ausgerichtet werden kann, des Weiteren durch Modulierung der Protein-Protein-Interaktionen von Cdc42. / Chlamydia are obligate intracellular human pathogens that proliferate inside a membrane-bound compartment called the inclusion. In infected cells, the Golgi apparatus is fragmented into small ministacks that are aligned around the inclusion. This facilitates uptake of host cell sphingolipids and is essential for chlamydial development. Infection-induced Golgi fragmentation happens after processing of the Golgi matrix protein golgin-84. This work could, via comparison with well-known substrates and inhibitor studies, identify the chlamydial protease CPAF (Chlamydia protease-like activity factor) as the enzyme accountable for this cleavage. Golgi Fragmentation depended on two Rab proteins, Rab6 and Rab11, which control vesicle transport and are recruited to the Chlamydia inclusion. As a consequence of Golgi fragmentation, cells lost the capacity to reorient the Golgi apparatus during polarization after a migratory stimulus. Both infected and golgin-84 depleted cells with a permanently fragmented Golgi apparatus displayed decelerated and furthermore randomized migration in a motility assay. Relocalization of the Golgi apparatus could be restored via stabilizing WEHD treatment or Rab depletion which partly rescued cell motility. Moreover, it could be shown that migration signaling via small GTPases was influenced by Chlamydia infection. Infected cells exhibited activation of the small polarity GTPase Cdc42. Numerous interactions with downstream effectors were strongly altered in infected cells according to quantitative mass spectrometry. Particularly, the binding of Cdc42 to migration-associated effectors was decreased. The results of this work show that CPAF, by processing of golgin-84, induces Golgi fragmentation which is vitally important for Chlamydia. This disturbs host cell motility because the Golgi apparatus cannot be reoriented during polarization and, additionally, via the modulation of protein-protein-interactions of Cdc42.

In der vorliegenden Arbeit wurden modernste Multiplexing-Ansätze der quantitativen Proteomanalyse angewandt, um das neuartige Virus SARS-CoV-2 zu untersuchen, den Erreger der globalen COVID-19 Pandemie, die Ende 2019 begann. Trotz enormer internationaler Anstrengungen zur Erforschung dieser Krankheit sind viele Aspekte der grundlegenden Virusbiologie, Virus-Wirt-Interaktionen und der COVID-19-Pathophysiologie noch immer unbekannt. Dies verhindert die Entwicklung gezielter Behandlungen, insbesondere für COVID-19-Patienten mit schwerem Verlauf. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Infektionsdynamik in lungenähnlichen Zelllinien untersucht. Der Vergleich von SARS-CoV mit SARS-CoV-2-Infektion in Zellen mit niedriger ACE2 Expression ermöglichte es, die Rolle anderer Membranproteine ​​als Virus Eintrittsfaktoren neu zu bewerten. In SARS-CoV-2 infizierten Calu-3-Zellen konnten Reaktionen der Wirtszellen beobachtet werden, die die Interaktion zwischen viralen Proteinen und Proteikinasen der Wirtszelle vermitteln. Im nächsten Teil wurde die angeborene Immunantwort des Wirts auf das Virus untersucht. Primäre, aus Blut isolierte Monozyten, die mit SARS-CoV-2 behandelt wurden, wiesen eine spezifische Protein-Signatur auf, die auf eine Polarisierung der Zellen zu einem profibrischen Makrophagen-Phänotyp hindeutet. Weitere Analysen zeigten, dass dieser Prozess weitgehend unabhängig von bekannten antiviralen Reaktionen und viraler RNA-Sensoren in Monozyten abläuft. Die durch das Virus hervorgerufene Phosphoproteom-Signatur deutet an, dass die profibrotische Polarisierung durch die kombinierte Wechselwirkung von viralen Proteinen und Infektionsnebenprodukten mit Wirtsrezeptoren induziert wurde. Zusammenfassend liefert diese Arbeit einen wertvollen Beitrag zur Aufklärung von Mechanismen, die zu einem schweren COVID-19 Verlauf führen können und hebt dabei die Bedeutung von Proteomanalysen in der Erforschung viraler Erkrankungen hervor. / In this thesis, we used cutting-edge multiplexed quantitative proteomics and phosphoproteomics approaches to study the virus SARS-CoV-2. The newly emerged betacoronavirus is the causative agent of the global pandemic of COVID-19 that began in late 2019. Despite the tremendous research effort in studying this disease, many aspects of the basic viral biology, virus-host interactions and COVID-19 pathophysiology still remain obscure. This prevents the development of targeted treatments, especially for severe COVID-19 patients. In the first part of this thesis, we studied infection dynamics in lung-like cell lines. Comparison between SARS-CoV and SARS-CoV-2 infections in low-ACE2-expressing cells allowed us to re-evaluate the role of other membrane proteins as entry factors. In Calu-3 cells, we could observe host responses mediating the interactions between viral proteins and host kinases. Next, we focused on the innate immune response of the host to the virus. Ex vivo monocytes treated with SARS-CoV-2 exhibited a specific proteomic signature indicating a polarization toward a profibric macrophage phenotype. Further dissection of this response revealed it to be largely independent from the viral RNA sensing and antiviral response cellular mechanisms. Furthermore, the specific phosphoproteomics signature induced by the virus indicated that the profibrotic polarization was induced by the combined interaction between viral proteins and infection byproducts with host receptors. In summary, this thesis shows the power of mass spectrometry based proteomics to study the complex dynamics between viruses and host cells. Furthermore, we uncovered a potential mechanism contributing to the development of severe COVID-19.