Bakterien der Gattung Shigella sind die Erreger der bakteriellen Ruhr beim Menschen. Der wesent-liche Virulenzfaktor der Shigellen ist ihre Fähigkeit zur Invasion. Die Invasion in Epithel-zellen ist Ausdruck des erregerspezifischen Infektionsprozesses, der gekennzeichnet ist durch eine vom Bakterium induzierte zelluläre Aufnahme über einen Phagozytose-ähnlichen Mechanismus. In dessen Verlauf führt die charakteristische Reorganisation des Zytoskeletts der Zelle zur Ausbildung einer blütenartigen Membranstruktur an der bakteriellen Eintrittsstelle. Als essentielles Glied der Signalisationskaskade vom Bakterium zum zellulären Zytoskelett erwies sich das kleine G-Protein Rho. Es wurde gezeigt, daß Rho als Regulator der Veränderungen des Zytoskeletts selbst an den bakteriellen Invasionslocus rekrutiert wird. Diese Rekrutierung umfaßt drei Isoformen von Rho: RhoA, RhoB und RhoC. Trotz hoher Sequenzhomologie der Isoformen untereinander ( 85% ) existiert ein unterschiedliches Rekrutierungsmuster dieser Isoproteine an der Eintrittsstelle von Shigella flexneri. RhoA akkumuliert vorwiegend um die eindringenden Bakterien herum. Demgegenüber werden RhoB und RhoC in die bakterieninduzierten zellulären Protrusionen rekrutiert. Der Mechanismus dieser isoformspezifischen Rekrutierung ist nicht bekannt. Anhand unserer Experimente konnten wir zeigen, daß das allen kleinen G-Proteinen gemeinsame C-terminale Peptid-Motiv CAAX ( C = Cystein, A = aliphatische Aminosäure, X = Leucin ) eine wesentliche Voraussetzung für die Rekrutierung von Rho darstellt, sich die isoformspezifische Rekrutierung jedoch nicht anhand des CAAX-Motivs erklären läßt. Bedeutsam für die differentielle Rekrutierung der Isoproteine ist vielmehr die präterminale Region des Moleküls. Diese Beobachtung hat weitreichende Konsequenzen für die funktionelle Rolle von Rho bei der Epithelzellinvasion durch Shigella. / Shigella is the etiologic agent of human bacillary, an infectious large bowel disease. A major feature of Shigella's pathogenic potential is the capacity to invade epithelial cells. Shigella entry into epithelial cells is considered a parasite-induced internalization requiring cytosceletal rearrangements; Shigella entry induces a blossom-like membrane structure at the bacterial entry site. This membrane folding process is dependent on the small GTPase rho. It has been shown that three rho isoforms rhoA, rhoB and rhoC are recruited into bacterial entry sites with different localization relative to the membrane structures. While rhoA preferentially accumulates in close vicinity to entering bacteria, rhoB and rhoC are recruited into the tips of Shigella-induced cellular protrusions. We could show that the C-terminal CAAX-region of rho is a prerequisite for recruitment, but not sufficient for different recruitment of rho isoforms. Additional information for differential recruitment patterns seems to come from the preterminal region of rho proteins. This result is of great importance for the functional role of rho during Shigella-invasion into epithelial cells.

Shigellen sind Erreger der bakteriellen Dysenterie beim Menschen. Ein notwendiger Schritt bei der Pathogenese der Shigellose ist die Invasion von Darmepithelzellen durch das Bakterium. Der Mikroorganismus löst dabei in der Wirtszelle Veränderungen des Aktinzytoskeletts aus, die zur Bildung einer blütenähnlichen Membranstruktur und schließlich zur Internalisierung des Pathogens führen. Diese Umbauvorgänge am Zytoskelett sind abhängig von einem Wirtszellprotein, der kleinen GTPase Rho. Drei Isoformen von Rho (A, B und C) sind beschrieben, deren Aminosäuresequenzen zu etwa 90% identisch sind. Während der Zellinvasion durch Shigella akkumulieren verschiedene Rho-Isoformen an unterschiedlichen Lokalisationen des Invasionskomplexes. Dabei werden RhoA vorwiegend um die eindringenden Bakterienherum, RhoB und RhoC hingegen hauptsächlich in die bakterieninduzierten zellulären Protrusionen rekrutiert. Durch Untersuchung von Rho-Hybridkonstrukten konnte gezeigt werden, daß ein prä-C-terminales, acht Aminosäuren umfassendes Modul die Rekrutierungsmuster von RhoA bzw. RhoC bestimmt. Der Austausch zweier Aminosäuren innerhalb des Moduls führte zu einer Konversion des Rekrutierungsmusters von RhoA. Wir konnten zeigen, daß die Rekrutierung von RhoA vom Funktionszustand der GTPase (Bindung von GTP/GDP) sowie von der Phosphorylierung durch die Proteinkinase A unabhängig ist. Schließlich wurde hier nachgewiesen, daß auch RhoD, das zu RhoA, B und C auf der Primärstrukturebene nur zu etwa 50% homolog ist, an die Bakterieneintrittsstelle rekrutiert werden kann. RhoD folgt dabei dem Rekrutierungsmuster von RhoB und RhoC. / Shigella causes bacillary dysentery in humans. Bacterial invasion of enterocytes is an essential step in the pathogenesis of shigellosis. Pathogen-triggered rearrangements of the host cell actin cytoskeleton induce a blossom-like membrane structure for internalisation of the microorganism. Actin remodeling requires activity of the host cell small GTPase rho. Three highly homologous rho isoforms (A, B and C) have been described with amino acid identities of about 90%. During Shigella invasion these rho isoforms accumulate at different sites of the invasion complex. While rhoA is chiefly recruited around entering bacteria, rhoB and rhoC are essentially translocated to the bacteria-induced cellular protrusions. Using a variety of rho hybrid constructs in a HeLa cell transfection-infection assay we were able to show that a pre-C-terminal stretch of eight amino acids determines the recruitment patterns of rhoA and rhoC. Exchange of two amino acids was sufficient for conversion of the rhoA recruitment pattern into a rhoC-like pattern. We could demonstrate that rhoA recruitment is independent of its functional state (GDP- or GTP-bound) or phosphorylation by the proteinkinase A (PKA). Finally, we have shown that rhoD, another member of the rho family which shares only 50% of its primary structure with rhoA, B or C, is also recruited to the bacterial entry site exhibiting a rhoB/C-like pattern of distribution.

This thesis covers the development of an application. The application is developed in terms of helping sellers, who in turn help customers in, for example, a clothing store. This is done by obtaining information about the various productsof the store by means of various search functions. The result of the search is a list of products that match the search parameters the user enters, these products lead to a product page where further information about the product is displayed. The fact that a seller has the opportunity to download this applicationin a mobile device gives the seller a very good tool to help the customers. This is because the seller does not have to go to a fixed computer to check productinformation, such as stock balance, but it is directly in the mobile device.The result of this is that the customer gets a better experience with the seller, and that the seller can work more effciently. / Detta examensarbete omfattar utvecklingen av en applikation. Applikationenar utvecklad i avseende för att hjälpa säljare, som i sin tur hjälper kunder i exempelvis en klädaffär. Detta genom att med hjälp av olika sök funktioner få information angående butikens olika produkter. Resultatet av sökningen blir en lista av produkter som stämmer mot de sökparametrar användaren matar in, dessa produkterna leder till en produktsida där vidare information om produktenvisas. Att en säljare har möjligheten att ladda ner denna applikation i en mobil enhet ger säljaren ett mycket bra redskap för att hjälpa kunderna. Detta för att säljaren inte behöver ta sig till en fast dator för att kolla upp produktinformation, exempelvis lagersaldo, utan det  finns direkt i den mobila enheten. Resultatet av detta är att kunden får en bättre upplevelse med säljaren, och att säljaren kan arbeta mer effektivt.

Im Rahmen einer prospektiven Studie wurde die Inzidenz der Reaktivierung des Humanen Cytomegalievirus (HCMV) bei stillenden Müttern, sowie die Virusübertragung auf ihre Frühgeborenen untersucht. Mit In vitro Experimenten wurde der Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung und Replikation vom HCMV untersucht. Die Muttermilch von 73 Müttern, sowie Urin- und Trachealproben ihrer 89 Frühgeborenen wurden über 2 Monate post partum wöchentlich auf HCMV DNA untersucht. Eine Reaktivierung des Virus wurde bei 95% der latent infizierten Mütter beobachtet. Zu einer Virusübertragung kam es bei 42% der HCMV-positiven Müttern auf ihre gestillten Kinder. Insgesamt infizierten sich 22 der 89 Frühgeborenen im Untersuchungszeitraum, in zwei Fällen kam es zu schweren symptomatischen Krankheitsverläufen. Infizierte Frühgeborene zeigten im Vergleich zu Nicht-Infizierten höhere Inzidenzen von Amnioninfektionssyndrom, respiratory distress syndrome und Bronchopulmonarer Dysplasie. Die Studie bestätigt ein signifikant hohes Risiko einer Übertragung von HCMV durch Muttermilch auf Frühgeborene mit teils schwerwiegendem Verlauf und eine hohe Reaktivierungsrate von HCMV in der laktierenden Brust. Daher wurde ein möglicher Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung bzw. Replikation von HCMV konstatiert und der Effekt von Muttermilch auf die Aktivität des HCMV Immediate Early (IE)1/2 Enhancer/Promotors, die Virusreplikation und IE Protein Synthese in monozytären Zellen und humanen Lungenfibroblasten untersucht. Sämtliche Milchproben stimulierten den HCMV Immediate Early (IE)1/2 Enhancer/Promotor und die IE Protein Synthese in einer charakteristischen Kinetik, mit höchsten Stimulationsraten durch Molkeproben der 1.-2. Woche post partum, 2-3 Wochen vor dem Zeitpunkt der höchsten Viruslast in der Muttermilch. Durch Promotermutanten und inhibitorische Substanzen wurde gezeigt, dass die Stimulation des IE1/2 Enhancer/Promotors ein multifaktorieller Prozeß ist, an dem Glukokortikoide eine signifikante Rolle spielen. / In a clinical trial, the incidence of human cytomegalovirus (HCMV) reactivation in breastfeeding mothers, virus transmission to their breastfed preterm infants and the effects of breast milk on HCMV reactivation and replication were studied. Breast milk from 73 mothers as well as urine and tracheal aspirates of their 89 infants were screened weekly for HCMV-DNA during 2 months after delivery. HCMV reactivation and virus shedding could be confirmed in 95% of latently infected mothers. Mother-to-child transmission was concluded for 42% HCMV DNA positive mothers. 22 breastfed infants acquired HCMV infection, two of them with severe symptomatic HCMV infection. The infected infants demonstrated higher incidences of amniotic infection, respiratory distress syndrome and bronchopulmonary dysplasia compared to noninfected infants. We could therefore confirm a high incidence of HCMV reactivation in lactating mothers and a significant risk of transmission to preterm infants by breastfeeding with the possibility of severe disease. The high rates of virus reactivation in mothers led us to focus on the effect of human milk on HCMV reactivation and replication in vitro: Breast milk from 12 breastfeeding mothers was tested for their effects on HCMV Immediate Early (IE)1/2 enhancer/promoter activity, viral replication and IE protein expression in monocytic cell lines and human embryonal lung fibroblasts. All milk samples stimulated HCMV IE1/2 enhancer/promoter activity und IE protein synthesis in these cell lines. The effects followed a characteristic kinetics over time: highest stimulation rates were seen with milk whey collected during the first and second week after delivery preceding the peak in viral load for 2-3 weeks. By using promoter mutants and inhibitors it could be demonstrated that stimulation of the IE1/2 enhancer/promoter is a multifactorial effect in which glucocorticoids play a significant role.

Der Einzeller Eimeria tenella zählt zu den hochpathogenen Parasiten des Haushuhns und ist Verursacher der Blinddarm-Kokzidiose, eine Erkrankung, die zu hohen ökonomischen Belastungen in der Geflügelindustrie führt. Zur Zeit existiert noch kein Impfstoff, der auf Basis von einzelnen Antigenen wirksam ist. Insbesondere die Identifizierung und Charakterisierung von sekretorischen Proteinen, welche an der Parasit-Wirtszell-Interaktion beteiligt sind, könnte einen Beitrag zur Entwicklung einer Immunprophylaxe darstellen. Ziel dieser Arbeit war es, sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren und ausgewählte cDNA-Sequenzen in DNA-Immunisierungsstudien zu überprüfen. Um ein DNA-Immunisierungsprotokoll für Hühner zu erarbeiten, wurden die cDNAs von drei schon bekannten E. tenella-Antigenen alleine oder in Fusion zur cDNA des stabilisierenden enhanced green fluorescence protein (EGFP) in zwei unterschiedliche DNA-Immunisierungsvektoren (pCDNA3, pVR1012) kloniert. Die Überprüfung der Serokonversion zeigte, dass nach DNA-Immunisierung von Hühnern mit beiden Vektoren bzw. mit und ohne EGFP-Fusion vergleichbare Immunantworten induziert wurden. D.h. mit dem etablierten DNA-Immunisierungsprotokoll konnte eine Expression heterologer (Eimerien) Gene im Huhn erzielt werden. Um neue sekretorische E. tenella-Proteine zu identifizieren wurden bioinformatische und experimentelle Methoden eingesetzt. Über die bioinformatischen Analysen wurden aus E. tenella-expressed sequence tag (EST)-Datenbanken 54 putativ sekretierte E. tenella-Sequenzen extrahiert für die aufgrund ihrer beschriebenen Funktion und Lokalisierung eine Beteiligung an der Wirts-Parasit-Interaktion abgeleitet wurde. Mittels funktioneller Komplementierung in Hefen konnten aus einer E. tenella-Sporozoiten-cDNA-Bank 25 sekretorische Sequenzen identifiziert werden. Die cDNA-Sequenzen von 13 neu identifizierten sekretorischen Proteinen wurden in DNA-Immunisierungsstudien überprüft. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Methoden geeignet sind, um sekretorische Proteine von E. tenella zu identifizieren. Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit, sollten jedoch weitere verbesserte Immunisierungsprotokolle erarbeitet werden, um die immunprotektive Wirkung der isolierten Kandidaten-Antigene von E. tenella in Hühnern zu überprüfen. Wie die vorliegende Arbeit bestätigt, eignet sich die Methode der DNA-Immunisierung vermutlich als Grundlage solcher Verfahren, wobei zukünftig die Induktion der essentiellen intestinalen Immunantwort im Vordergrund stehen sollte. / The protozoan parasite Eimeria tenella is highly pathogenic in chickens and causes caecal coccidosis that contribute to high economic losses in poultry farming. At the moment no vaccine based on a single antigen is available. The identification and characterization of proteins that are involved in host parasite interaction could particularly contribute to the development of immunoprophylactic control strategies. In order to establish a DNA immunisation protocol, cDNA of three already known E. tenella antigens were subcloned alone or in fusion to the stabilising fusion partner enhanced green flurescence protein (EGFP) into two different DNA immunisation vectors (pCDNA3, pVR1012). Following DNA immunisation of chickens using both vectors with or without EGFP fusion, respectively, the induction of comparable immune responses were shown by serum conversion. This implies it was possible to achieve heterologous (Eimeria) gene expression in chickens with the established immunisation protocol. In order to identify new E. tenella secretory proteins bioinformatic and experimental approaches were used. Following bioinformatic analysis 54 putatively secretory E. tenella sequences were identified for which roles in host parasite interaction were surmised, due to their localisation and function. The identification of secreted proteins from a E. tenella sporozoite cDNA library using a functional complementation assay in yeast resulted in 25 unique sequences. The cDNA of 13 newly identified secretory proteins were tested in DNA immunisation studies. The results showed that both methods are capable of identifying secretory proteins of E. tenella. Owing to the results presented here, new immunisation protocols should be established to test the immune protective capacity of candidate antigens of E. tenella in chickens. The present study confirmed the method of DNA immunisation as a basic tool for such new protocols. In future, however, DNA immunisation protocols should focus on the induction of essential intestinal immune responses.

Epidemiologische Daten belegen eine Assoziation von Infektionen mit der Exazerbation von Autoimmunerkrankungen, wobei man aber die Wege, die dahin führen noch nicht voll versteht. Die gängigste Hypothese sieht die Ursache für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen in der Kreuzreaktivität zwischen mikrobiellen und Selbst-Antigenen, die von der selben T-Zelle erkannt werden. Dieser Antigen-spezifische Mechanismus konnte allerdings bisher nicht durch die Forschung belegt werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass im Modell der experimentellen autoimmunen Enzephalitis durch die Aktivierung mit Lipopolysacchariden gramnegativer Bakterien (LPS) Schübe in normalen Mäusen ausgelöst werden können. Diese Art der Behandlung führt in-vitro zur Proliferation und zur Zytokinproduktion bei einem Teil der T-Helfer (Th)-Effektor/Gedächtniszellen. Dabei ist zwar der physische Kontakt zwischen Th-Zellen und CD4--LPS-responsiven Zellen essentiell, jedoch geschieht die Aktivierung nicht über den T-Zellrezeptor. Als entscheidend hat sich die Bindung von kostimulatorischen Rezeptoren auf Th-Zellen durch kostimulatorische Moleküle auf CD4--Zellen erwiesen. Diese Form der Bystander-Aktivierung bietet eine Antigen-unabhängige Erklärung für die Zusammenhänge von Infektion und Autoimmunität, die mit den klinischen und epidemiologischen Daten besser vereinbar ist als die Antigen-spezifischen Modelle. / Infections sometimes associate with exacerbations of autoimmune diseases through pathways that are poorly understood. Antigen-specific mechanisms such as cross-reactivity between a microbial antigen and a self-antigen have received no direct support. Here it is shown that activation by lipopolysaccharide (LPS) induces relapses of experimental autoimmune encephalitis (EAE) in normal mice. This form of treatment induces proliferation and cytokine production in a fraction of effector/memory T helper (Th) lyphocytes in vitro via physical contact of Th cells with CD4--LPS-responsive cells. TCR mediated signals are not necessary; rather what is required is ligation of costimulatory receptors on Th cells by costimulatory molecules on the CD4- cells. This form of bystander activation provides an antigen-independent link between infection and autoimmunity that might fit the clinical and epidemiological data on the connection between infection and autoimmunity better than the antigen-specific models.

Das Schicksal aktivierter T-Zellen wird durch eine Vielzahl NF-kappaB regulierter Ziel-Gene bestimmt, wobei aktivierende und deaktivierende Signale für die Ausbalancierung einer adäquaten T-Zell Antwort benötigt werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die negativ-regulatorische Modulierung des Carma1-Bcl10-Malt1 (CBM)-Proteinkomplexes für die Steuerung der NF-kappaB Aktivität in T-Zellen von großer Bedeutung ist. Überraschenderweise ist die Bildung des CBM-Komplexes abhängig von IKKbeta, einer Kinase, die zuvor ausschließlich mit CBM-nachgelagerten Effektorfunktionen in Verbindung gebracht wurde. IKKbeta übernimmt eine duale Funktion bei der Regulation des CBM-Komplexes: Obwohl IKKbeta zunächst für die Bildung des CBM-Komplexes benötigt wird, führt die Phosphorylierung der CBM-Komplexkomponente Bcl10 durch IKKbeta bereits kurze Zeit nach Beginn der T-Zell Aktivierung zu einer Dämpfung der Signalübertragung. Biochemische Analysen zeigen, dass die Phosphorylierung von Bcl10 die Proteinaffinitäten innerhalb des CBM-Komplexes beeinflusst, wodurch es zu einer Umlagerung des Komplexes mit negativ-regulatorischem Effekt kommt. Weiterführende Experimente haben aufgedeckt, dass Bcl10 im Zuge anhaltender T-Zell Stimulation lysosomal degradiert wird. Die Degradation von Bcl10 führt zum Zerfall des CBM-Komplexes und unterbindet die weitere Signalübertragung trotz persistenter Stimulation. Die Tatsache, dass beide in dieser Arbeit identifizierten negativ-regulatorischen Mechanismen am CBM-Komplex angreifen, unterstreicht die Bedeutung dieses Komplexes für die Signalübertragung in T-Zellen. Weiterhin besteht aufgrund der präsentierten Daten Anlass zur Annahme, dass in aktivierten T-Zellen ein vielfältig positiv und negativ regulierter Multikomponentenkomplex gebildet wird, der eine nicht-hierarchische Signalübertragung unterstützt. / A multitude of NF-kappaB regulated target genes determines the fate of activated T cells, whereas activating and de-activating signals are crucial for balancing adequate T cell responses. The presented data illustrate that negative-regulatory modulation of the Carma1-Bcl10-Malt1 (CBM)-complex is of great importance for the control of NF-kappaB activity in T cells. Surprisingly IKKbeta, a kinase that so far was thought to be involved in CBM-downstream effector functions, is needed for CBM-complex formation. IKKbeta exhibits a dual function regulating the CBM-complex: while initially being essential for the formation of the CBM-complex, phosphorylation of the CBM-complex component Bcl10 by IKKbeta shortly after the onset of T cell activation leads to a damping of signal transduction. Biochemical analysis reveal that Bcl10 phosphorylation influences the intermolecular protein affinities of the CBM-complex components causing a remodeling of the complex with a negative-regulatory effect. Further experiments uncover that upon persistent T cell activation Bcl10 is degraded by the lysosome. Bcl10 degradation promotes the collapse of the CBM-complex and thereby interferes with ongoing signal transduction despite persistent stimulation. Considering the fact that both negative-regulatory processes affect CBM-complex activity underscores the important role of this complex in T cell signal transduction. Moreover, the presented data demonstrate that formation of a multi-component signaling complex in activated T cells facilitates versatile positive, negative and non-hierarchical regulation.

Hantaviren (Familie Bunyaviridae) sind Erreger, die von Nagetieren auf den Menschen übertragen werden und Hämorrhagische Fieber mit Renalem Syndrom (HFRS) auslösen. Die vorgelegte Arbeit beinhaltet derartige Ergebnisse zu zwei europäischen Hantaviren, dem Dobravavirus (DOBV) und dem Tulavirus (TULV). DOBV ist ein wichtiger HFRS-Erreger in Europa. DOBV Stämme kommen in mindestens zwei Nagerspecies, der Gelbhalsmaus (Apodemus flavicollis) und der Brandmaus (A. agrarius) vor. In Übereinstimmung mit diesen natürlichen Wirten bilden die Virusstämme zwei genetische Linien: DOBV-Af und DOBV-Aa. Die phylogenetischen Analysen von den Nukleotidsequenzen der S-, M- und L-Segmente von sympatrisch vorkommenden DOBV-Af und DOBV-Aa Stämmen aus Mitteleuropa zeigten das Vorkommen von Reassortmentprozessen der Genomsegmente während der Evolution der Virusspecies. Ausserdem, wurde die virale Nukleotidsequenz aus einem DOBV-seropositiven HFRS-Patienten aus Detschland amplifiziert. Damit wurde erstmalig der molekulare Beweis erbracht, dass DOBV in Mitteleuropa HFRS auslöst und dass die DOBV-Aa Linie humanpathogen ist. Aus einer in der Slowakei gefangenen A. agrarius Maus haben wir ein neues Virusisolat gewonnen, welches "Slovakia (SK/Aa)" genannt wurde. SK/Aa ist das bisher einzige Virusisolat, das die DOBV-Aa Linie repräsentiert. Es wurde gemeinsam mit einem Isolat der DOBV-Af Linie zur vergleichenden Typisierung der Antikörper von mitteleuropäischen HFRS-Patienten mittels Fokusreduktionsneutralisationstest eingesetzt. Die Seren der meisten Patienten zeigten die höchsten neutralisierenden Antikörpertiter gegenüber SK/Aa, was die Schlussfolgerung zulässt, dass DOBV-Aa Stämme für die meisten DOBV-Infektionen in Mitteleuropa verantwortlich sind. TULV wird durch die Feldmaus (Microtus arvalis) beherbergt. Die Fähigkeit zur Auslösung von HFRS war bisher wenig bekannt. Wir haben den ersten Fall von HFRS gefunden, der mit einer TULV Infektion assoziiert ist. Aus demselben geographischen Gebiet in Nordostdeutschland konnten aus Feldmäusen TULV Nukleotidsequenzen amplifiziert werden. In phylogenetischen Analysen clustern sie mit Stämmen aus Polen und bilden mit diesen gemeinsam eine eigene, neue genetische Linie. Ausser dem hier untersuchten DOBV und dem länger bekannten Puumalavirus ist TULV offenbar das dritte Hantavirus, das in Mitteleuropa HFRS hervorruft. / Hantaviruses (Bunyaviridae family) are rodent-borne bunyaviruses that cause hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Eurasia. This thesis presents novel data about two European hantaviruses, Dobrava virus (DOBV) and Tula virus (TULV). DOBV is an important etiologic agent of HFRS in Europe. DOBV strains were found to be hosted by at least two different rodent species, yellow-necked mouse (Apodemus flavicollis) and striped field mouse (A. agrarius). According to their natural hosts they form the distinct genetic lineages DOBV-Af and DOBV-Aa, respectively. We have determined and analysed the complete S and M, and partial L segment nucleotide sequences of sympatrically occurring DOBV-Af and DOBV-Aa strains from Central Europe. Molecular phylogenetic analyses gave evidence for genetic reassortment in the evolution of the virus species. Moreover, we amplified a DOBV-Aa nucleotide sequence from a DOBV-seropositive HFRS patient from Germany. This is the first molecular identification of human infection by DOBV in Central Europe and the first direct proof that a virus strain related to the DOBV-Aa lineage, carried by A. agrarius rodents, is able to cause HFRS. Under biosafety level 3 conditions, we have established a DOBV isolate named Slovakia (SK/Aa) from an A. agrarius animal captured in Slovakia. SK/Aa, as the only isolate clearly belonging to the DOBV-Aa lineage, can be taken as the representative of this virus lineage. The new virus isolate, in comparison to a DOBV-Af strain, was used for serotyping neutralising antibodies of HFRS patients in Central Europe by the use of a focus reduction neutralisation assay. Most patients'' sera exhibited a higher end-point titer towards SK/Aa suggesting that DOBV-Aa strains are responsible for most of the DOBV HFRS cases in this region. TULV is carried by European common voles (Microtus sp.). Its pathogenic potential for humans was rather unknown. We have described the first case of HFRS which can be associated with TULV infection. Moreover, TULV strains detected in M. arvalis near the home village of the patient in North-East Germany clustered with strains from Poland and represent a new, well-supported genetic lineage within the TULV species. In addition to DOBV and longer known Puumala virus, TULV is most likely an additional causative agent of HFRS in Central Europe.

Bei neun von vierzehn Serogruppen der Subspezies E. coli Flexneri (SF) konnte ein pHS-2-Plasmid nachgewiesen werden. Es besteht eine positive Korrelation zwischen pHS-2-positiven SF und dem Auftreten einer Reaktiven Arthritis, eine Komplikation der bakteriellen Ruhr. Verschiedene Autoren führen das gehäufte Auftreten der Reaktiven Arthritis bei pHS-2-positiven SF auf eine erhöhte Serumresistenz zurück, die den Bakterien durch das cld(pHS-2)-Gen vermittelt wird. Das cld(pHS-2)-Gen als längstes aller 18 "open reading frames" auf dem pHS-2-Plasmid kodiert für ein 35 kD großes Protein, das aufgrund seiner Funktion als "chain length determinant" (Cld(pHS-2)) bezeichnet wurde. Cld(pHS-2) ist maßgeblich an der Produktion von Lipopolysacchariden vom VL-Typ beteiligt. LPS vom VL-Typ produzieren O-Seitenketten mit mehr als 70 bis 80 Oligosaccharideinheiten und sollen die bakterielle Membran vor einer Komplementbindung und Serum-Antikörpern schützen, wodurch den Bakterien eine erhöhte Serumresistenz vermittelt werde. In dieser Arbeit wurde cld(pHS-2) in einen pHS-2-negativen Stamm der SF Serogruppe 6 integriert, um nachzuweisen, dass cld(pHS-2) das LPS-Muster pHS-2-negativer SF in charakteristischer Weise modifiziert. Während der Expressionsnachweis von cld(pHS-2) als Einzelprotein misslang, war eine Expression von cld(pHS-2) als Fusionsprotein in SF Serogruppe 6 erfolgreich. Im Vergleich zu pHS-2-negativen SF war unsere SF Serogruppe 6-Mutante nun in der Lage, LPS vom VL-Typ in Form einer zusätzlichen Bande mit ca. 80 Oligosaccharideinheiten zu produzieren. Diese phänotypische Veränderung war zwar nur gering ausgeprägt, konnte jedoch den spezifischen Einfluss von cld(pHS-2) als Fusionsprotein auf das LPS-Muster pHS-2-negativer SF nachweisen. / In nine out of fourteen serogroups of E. Coli Flexneri (SF) a pHS-2 plasmid has been isolated. There is a positive correlation between pHS-2-positive SF and the occurence of reactive arthritis (ReA) which is a complication of bacterial dysentery. Different authors reduce the widespread appearance of ReA by pHS-2-positive SF to an increased serum resistance caused by a cld(pHS-2)-gene. The cld(pHS-2)-gene ist the longest of 18 open reading frames in pHS-2 and it is the coding for a 35 kD protein which has been identified as a chain length determinant because of its function. Cld(pHS-2) plays a decisive role in the production of lipopolysaccharides (LPS) of the VL-type. LPS of the VL-type produce O antigen with more than 70-80 repeat units, and protect the bacterial outer membrane from complement factors and serum antibodies by a higher serum resistance. In this research the cld(pHS-2)-gene was integrated in a pHS-2-negative SF serogroup 6 to prove that cld(pHS-2) is able to modify the LPS pattern (destribution) of pHS-2-negative SF in a characteristic manner. The expression of cld(pHS-2) in SF serogroup 6 as an isolated protein failed, but the expression of cld(pHS-2) as a fusion protein was successful. In contrast to the pHS-2-negative SF our SF serogroup 6 mutant was able to produce LPS of the VL-type with 80-90 repeat units. Despite the slight effect, a specific influence of cld(pHS-2) as a fusion protein on LPS pattern and the bacterial phaenotype has to be confirmed.

Für den Zusammenbau des HBV-Partikels ist die Interaktion zwischen Oberflächenproteinen und dem Nukleokapsid notwendig. Sich überlappende synthetische Peptide aus dem Bereich der HBcAg-Bindungsdomäne im C-Terminus der PreS1-Region und dem TLM, sind nach Internalisierung vor allem im Kern lokalisiert. Die Aminosäuren 101-115 der PreS1-Region interagieren mit dem Nukleokapsid, während die PreS2-Domäne keine Interaktion mit dem Nukleokapsid eingeht. Mit den synthetischen Peptiden konnte Einfluss auf die Sekretion viraler Partikel genommen werden. Die Lokalisation von HBcAg als Interaktionspartner in HBV-produzierenden Zellen verändert sich bei Inkubation mit den synthetischen Peptiden, es tritt vermehrt im Kern auf. Rekombinante Proteine ähnlich den synthetischen Peptiden aber mit der vollständigen PreS2-Region, sind nach Internalisierung im Zytosol nachweisbar. Die Sekretion viraler Partikel wurde partiell inhibiert. Das HBV-Genom kodiert zwei virale Aktivatoren, das HBx und die PreS2-Region im LHBs. Beide aktivieren den c-Raf-1/MEK-Signalweg. Durch die selektive Inhibierung der Effektoren (Ras oder Proteinkinase C) von HBx oder PreS2 im LHBs konnte kein Effekt auf die Genexpression/ Sekretion nachgewiesen werden. Durch simultane Inhibierung der Signalkaskade so kommt die Virussekretion fast vollständig zum Erliegen. Die Ursache hierfür ist in einer reduzierten Neusynthese von viralen Proteinen zu finden und nicht in der Akkumulation der Proteine in der Zelle. Zur Untersuchung des Einflusses der Funktionalität der beiden Aktivatoren wurden HBx- bzw. PreS2- und HBx/PreS2-defiziente HBV-Expressionsplasmide generiert. Die Einzelmutanten zeigten nur einen geringen reduzierenden Einfluss auf die Genexpression/Virussekretion. Beim Einsatz der Doppelmutante wurde die Genexpression/Virussekretion fast vollständig inhibiert. HBx und PreS2 im LHBs sind für die Virusreplikation von Bedeutung aber sie können einander ersetzen. / Assembly of HBV particles and subsequent secretion of mature virus requires the interaction of the nucleocapsid with defined domains of the surface proteins. Overlapping synthetic peptides covering the C-terminal part of the PreS1 domain and the cell permeable domain of PreS2 (TLM) were shown to localize most of all in the nucleus. Based on these peptides aa 101-115 of PreS1 were found to be essential for the interaction with the nucleocapsid, while the PreS2 domain does not interact with the nucleus. Presence of the peptides that compete the nucleocapsid surface protein interaction a block of HBV and antigen secretion was achieved. HBcAg as natural interaction partner of the surface proteins then arises increased in the nucleus. Recombinant proteins similar to the synthetic peptides but with the whole PreS2 domain localize in the cytoplasm and block HBV and antigen secretion. The genome of HBV encodes two transcriptional activators: the HBx protein and the PreS2 activator LHBs. Both trigger activation of c-Raf-1/MEK kinase cascade. To evaluate the importance of both activators for viral replication selective inhibitions of signal transduction cascades were performed and do not result in a decrease of viral replication. Simultaneous inhibition of both activators abolished viral secretion. It is due to a reduced de novo synthesis and not to an accumulation of viral proteins in cells. The relevance of activator function was tested by mutated HBV genome defective for HBx and / or PreS2 activator function. After transfection single mutants show no significant reduced HBV expression whereas at the double mutated HBV genome a strong reduced virus expression could be observed. The HBx protein and the PreS2 activator LHBs are important for viral replication but they can replace each other.