Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T18:38:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lisboa_CesarGustavoSerafim_D.pdf: 1945488 bytes, checksum: 831197d663c65044a02bdfd7ba13598f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Aplicações biotecnológicas de polissacarídeos de plantas: uma estratégia sustentável para a produção em demanda. Atualmente, a busca por novas fontes de materiais pode levar ao depósito de patentes. Isto é importante para que novos produtos, que apresentem características inovadoras, potencial de redução de custos, rotas de produção ambientalmente corretas, partição de benefícios e, finalmente, possibilitem a exploração de novos mercados de maneira sustentável. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de uso de polissacarídeos de plantas de diferentes fontes nos setores de alimentos, farmacosméticos e papel. Os resultados são apresentados na forma de um artigo e 4 patentes. Os xiloglucanos de sementes de espécies nativas de plantas (Hymenaea courbaril) e de plântulas de eucalipto foram aplicados no processo de confecção do papel, demonstrando que suas propriedades mecânicas podem ser melhoradas. Resultados similares foram obtidos com galactomananos de sementes de Sesbania virgata e Dimorphandra mollis. O xiloglucano de H. courbaril foi estudado mais profundamente e demonstrou-se que pode ser também aplicado em cosméticos, pois não é citotóxico, é capaz de espessar formulações e interfere na produção de colágeno pela pele. As propriedades reológicas do galactomanano de D. mollis foram estudadas em comparação a outros galactomananos já utilizados na indústria. Demonstrou-se que ele é apropriado para várias aplicações em alimentos. Como um todo, nossos resultados indicam que tanto os polissacarídeos de sementes de espécies nativas como o de eucalipto podem ser utilizados em várias aplicações de tal forma que possam fazer parte de programas de uso sustentável da biodiversidade, levando a benefícios tecnológicos e também sociais. / Abstract: Biotechnological applications of plant polysaccharides: a sutainable strategy for production and demand. Nowdays, the search for new sources of materials can lead to new patent deposits. This is important because new products that display innovative features, cost reduction potential, environmentally clean production routes, partition of benefits and finally, may turn possible to explore differential market shares. These may be excellent socio-environmental and market shares for biotechnology companies. In this context, the present work aimed at evaluating the potential of use of plant polysaccharides from different sources in the food, farmacosmetic and paper industrial sectors. In the present work, we present studies that focus on the use of seed polysaccharides on applications on paper, cosmetics and food industries. The results are presented in the form of one article and 4 patents. The xyloglucan from seeds of native tropical tree species (Hymenaea courbaril - jatobá, Copaifera langsdorffii - copaiba) and from seedlings of Eucalyptus grandis (eucalypt) were applied to paper making and we demonstrated that several properties of paper can be improved by using these xyloglucans during preparation. Similar results were obtained with galactomann ans from Sesbania virgata and Dimorphandra mollis, two fast-growing legume trees. The polymers increased paper resistance to mechanical stress so that they can be applied for applications where more resistant papers (such as rapping paper) are used. The xyloglucan from H. courbaril was studied more deeply, demonstrating that it can be applied in cosmetics as it is not cytotoxic and can be used to improve skin biochemistry such as collagen production. Galactomannan from D. mollis was studied from the rheological point of view and its properties were compared with other commercially used galactomannans. Our results showed that D. mollis galactomannan is appropriate to several applications in food industries. As a whole, our results indicate that both, native seeds and seeds of eucalyptus, might be used in several industrial applications so that these might be used as part of programs of sustainable use of biodiversity, leading to social and technological benefits to society. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T18:45:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DelBem_LuizEduardoVieira_M.pdf: 9371325 bytes, checksum: 4720605c3fed6784b51b26b99feff19c (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Introdução: Os xiloglucanos são os polímeros de açúcar mais abundantes na hemicelulose da maioria das espécies de plantas terrestres, em especial nas eudicotiledôneas. Possuem papel estrutural na parede celular vegetal, interagindo com os filamentos de celulose, e podem ser utilizados como reserva em sementes de várias espécies de eudicotiledôneas, como o Jatobá (Hymenaea courbaril), onde correspondem a quase 50% do peso seco da semente. Este polímero é formado por uma cadeia central de ß-glucano com ramificações que contêm xilose, galactose e fucose. O mecanismo de degradação deste polímero é realizado por cinco hidrolases: XTH, ß-Galactosidase, ß-Glucosidase,? a-Xilosidase e? a-Fucosidase. Estas enzimas são codificadas por genes que constituem famílias multigênicas nos genomas de plantas, e sua atividade na degradação seletiva de xiloglucano têm papel central na regulação do crescimento e morfogênese da célula vegetal. O Jatobá (Leguminosae) é uma árvore tropical, nativa do Brasil, que vem sendo utilizada como modelo vegetal para estudos de impacto ambiental por efeito estufa e estresses abióticos oriundos do aquecimento global. Foi observado que mudas de Jatobá, crescidas numa atmosfera com 720 PPM de CO2 (dobro da concentração atual), apresentam até 50% de aumento de biomassa aos 100 dias. O entendimento das respostas transcripcionais desta planta, em resposta a estes estresses, pode levar a conclusões à cerca de como as florestas tropicais responderão ao aumento inexorável na concentração de CO2, num quadro de aquecimento global. Resultados: Construímos bibliotecas de cDNA de folhas, caule, cotilédones e raízes de plântulas de 45 dias de Jatobá. Um seqüenciamento amostral dos ESTs levou à obtenção de 103 seqüências, parciais ou completas, de proteínas de Jatobá. São os primeiros dados de ESTs numa árvore tropical brasileira. Análises filogenéticas das enzimas que constituem o mecanismo de degradação de xiloglucano foram conduzidas ao longo de 13 genomas completos e 27 bancos de ESTs de espécies dos mais diversos grupos no reino Viridiplantae. Isso nos permitiu organizar a diversidade destas cinco famílias multigênicas em possíveis grupos de ortólogos (PoGOs). As XTHs foram divididas em seis grupos de genes homólogos e 19 PoGOs. As ß-Galactosidases foram divididas em dois grupos de genes homólogos e 10 PoGOs. As ß-Glucosidases foram divididas em dois grupos de genes homólogos e dois PoGOs. As? a-Xilosidase foram divididas em três PoGOs e as a-Fucosidase em dois PoGOs não relacionados evolutivamente. Conclusões e Perspectivas: As 103 seqüências peptídicas obtidas de Jatobá foram anotadas por comparação e serão disponibilizadas nos bancos de dados internacionais. A perspectiva de seqüenciar mais clones poderá levar à montagem do transcriptoma do Jatobá, algo inédito para uma árvore tropical. Concluímos, com as análises filogenéticas, que as XTHs, que formam um grupo monofilético de genes em Streptophyta, surgiram antes da conquista do ambiente terrestre. Estes genes foram progressivamente amplificados ao longo da evolução das plantas terrestres, o que sugere um ganho progressivo de complexidade, que teve seu auge nas Angiospermas. Apresentamos evidências que podem unir evolutivamente as XTHs exclusivas de plantas a enzimas transglicosiladoras de cadeias de ß -glucano em fungos, o que sugere uma origem comum do processo de transglicosilação de cadeias de ß-glucano como mecanismo de controle do crescimento e formato celular em eucariotos com parede celular. As ß-Galactosidases formam um grupo monofilético em Embryophytas com nove PoGOs, no entanto sua grande diversificação (seis PoGOs) ocorreu apenas em Angiospermas. As ß -Glucosidases formam um grupo monofilético em Embryophytas, seqüências similares em bactérias fotossintetizantes podem sugerir uma origem no ancestral dos cloroplastos. As a -Xilosidase, que são monofiléticas nas Spermatophytas, derivaram das ?a-Glucosidases que se encontram dispersas entre todos os eucariotos, é um caso de neofuncionalização. Duas linhagens distintas evolutivamente de a-Fucosidases foram encontradas, uma delas é monofilética em Embryophytas e a outra pertence a uma grande família multigênica (GDSL-motif) da qual pouco se sabe. Mostramos que o mecanismo completo (cinco hidrolases) de degradação de xiloglucano existia no ancestral comum das Spermatophytas (plantas com semente). Como perspectivas este trabalho permite a racionalização de estudos funcionais destas hidrolases o que, em longo prazo, pode contribuir com processos biotecnológicos que passem pela modificação seletiva da parede celular vegetal. / Abstract: Introduction: Xyloglucans are the main hemicelulose in most of land plants, especially in eudicots. It is a structural compound of plant cell-wall that interacts with cellulose and can be used as seed's energy storage of many species, like Jatoba (Hymenaea courbaril). Xyloglucan structure is composed of a ß-glucan backbone that it branched with xylose, galactose and fucose. Its degradation machinery is composed by five glycosil hydrolases: XTH, ß-Galactosidase, ß-Glucosidase,?a-Xylosidase and? a- Fucosidase. These enzymes are codified by multigenic families in plant's genomes and it plays a central role in key processes like growth and morphogenesis of plant cells. Jatoba (Leguminosae) is a tropical tree, native of Brazil. It's been used as a model tree in researches of plant's responses to stresses caused by global warming and high atmospheric CO2 concentration. It was observed a 50% increase in biomass of a 100 days Jatoba seedling when grown in a 720 PPM of CO2 atmosphere (two times bigger than today's atmospheric concentration). Understand the transcriptional responses to these stresses can lead to conclusions about how tropical forests will respond to high concentrations of CO2 and global warming. Results: We made cDNA libraries of leaves, stem, cotyledons and roots of 45 days seedlings of Jatoba. A preliminary sequencing of these libraries reveled 103 predict protein sequences (most partial sequences). Phylogenetic analyses of xyloglucan hydrolytic enzymes were conducted using 13 completed genomes and 27 ESTs assemblies, from a wild range of taxonomic groups in the Viridiplantae kingdom. It allowed us to divide XTH's diversity of genes into six homology groups and 19 possible groups of orthologues (PoGOs). ß-Galactosidases were divided into two groups of homologues and 10 PoGOs. ß -Glucosidases were divided into two groups of homologues and two PoGOs. a-Xylosidase were divided into three PoGOs and a-Fucosidase into two PoGOs evolutionarily unrelated. Conclusions and Perspectives: The 103 protein sequences of Jatoba were annotated by comparison to known proteins and will be deposited in international sequences assemblies. As a perspective, the sequencing of Jatoba ESTs will lead to the assembly of its transcriptome, something never done before in a tropical tree. We concluded that XTHs are monophyletic group o genes in Streptophyta, what means they emerged before lands conquest by plants. These genes were progressively amplified in land plants evolution, especially in Angiosperms, what suggests a progressive gain in complexity. We showed evidences of a possible evolutionary relation between plant's XTHs and fungus hydrolases/transglycosylases enzymes. It suggests a eukaryotic ancestral mechanism to control cell expansion and shape based in ß -glucan transglycosylation and its interaction to cellulose (in plants) or chitin (in fungus). The ß -Galactosidases are a monophyletic group in Embryophytas that were divided into nine PoGOs, six PoGOs only appeared in Angiosperms. The ß -Glucosidases belongs to a monophyletic group in Embryophytas that has sequence similarity to bacterial proteins, especially ones from photosynthetic bacteria species. The a-Xylosidases are a PoGO in Spermatophyta that probably emerged from a-Glucosidases presents in all eukaryotes. It's probably a neofunctionalization process. Two evolutionary distinct lineages of a-Fucosidases where found, one monophyletic in Embryophytas and another that belongs to the poorly understood multigenic family "GDSL-motif proteins". We showed that the complete machinery (all the five hydrolases) of Xyloglucan degradation already exists in Spermatophytas common ancestor. As a perspective, we expect to rationalize the functional characterization works among these multigenic families and to contribute in biotechnology processes that pass through cell-wall modification and selective control. / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Marcos Silveira Buckeridge, Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T04:13:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brandao_AlineDias_D.pdf: 19907287 bytes, checksum: dc16cfd53b17ed55d8ab52957dcdadae (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os jatobás (espécies pertencentes ao gênero Hymenaea, família Leguminosae) apresentam grande plasticidade fisiológica. Diferentes espécies e variedades de jatobás se adaptaram a praticamente todos os biomas tropicais brasileiros, incluindo a Floresta Amazônica, e o complexo de ecossistemas que é formado pela Mata Atlântica, Cerrado e Caatinga. Espécies do gênero possuem como principal reserva de carbono do embrião o xiloglucano, um polissacarídeo similar à celulose, mas solúvel em água devido a ramificações com xilose e galactose. Após a germinação, o xiloglucano dos cotilédones é completamente degradado, produzindo monossacarídeos livres que são rapidamente metabolizados à sacarose. A produção das enzimas de hidrólise do xiloglucano nos cotilédones é controlada pela auxina proveniente da parte aérea da planta, porém, não se sabe exatamente como esse mecanismo é controlado. O objetivo deste trabalho foi isolar cDNAs (DNA complementar) parciais dos genes da bgalactosidase - BGAL e xiloglucano endotransglicosilase ou endo-b-1,4-glucanase ¿ XET, relacionados com a degradação do xiloglucano e duas enzimas envolvidas no metabolismo da sacarose, a invertase neutra/alcalina - IN/IA e a sacarose sintase ¿ SUS, para tentar avaliar possíveis formas de controle da expressão gênica envolvidas nos mecanismos do catabolismo do xiloglucano em cotilédones de plântulas de Hymenaea courbaril. Primeiramente, foram desenhados primers com base em seqüências de espécies da família Leguminosae existentes em banco de dados para os respectivos genes. A partir daí foi possível clonar seqüências parciais de todos os genes. Utilizando a técnica de RT-PCR semi-quantitativa (semi-quantitative reverse transcription-polimerase chain reaction) foram realizadas análises da expressão nos cotilédones, folhas, hipocótilos e raízes no 45º dia após a embebição (quando ocorre a taxa máxima de mobilização do xiloglucano) a cada 6 horas em um período de 24 horas. As plântulas foram analisadas sob as seguintes condições: I) plântulas crescidas em condições naturais; II) excisão da parte aérea; III) aplicação do inibidor do transporte polar de auxina (NPA ¿ ácido naftil ftalâmico); IV) crescimento em luz contínua e V) crescimento em escuro contínuo. Observou-se que existem, basicamente, três formas de controle em resposta a auxina. Nos cotilédones, os genes responsáveis pela degradação do xiloglucano BGAL1 e XTH1, possivelmente são regulados em resposta a auxina endógena e a variação de luz, enquanto que os genes responsáveis pelo metabolismo da sacarose, AlkIN1 e SUS1 possivelmente são regulados pela disponibilidade de carbono. Nas folhas, hipocótilos e raízes o padrão de expressão variou de acordo com a disponibilidade de carbono proveniente da degradação do xiloglucano de reserva nos cotilédones. Os resultados apresentados relatam a primeira descrição do isolamento dos cDNAs, permitiram a caracterização do padrão de expressão de genes chave, envolvidos no estabelecimento de uma espécie arbórea nativa do Brasil e em conjuto com os dados de atividade enzimática possibilitaram observar que a mobilização de reserva no jatobá ocorre a nível transcricional. Através do seqüênciamento, também foi possível observar que a invertase neutra clonada da raiz do jatobá apresentou resíduos de aminoácidos que a caracterizam como invertase alcalina (AlkIN1). Diante do padrão de expressão observado para a ß-galactosidase, XTH, invertase alcalina e sacarose sintase no presente trabalho, é possível sugerir um modelo para o controle da degradação e mobilização do xiloglucano de reserva nos cotilédones sob influência da auxina endógena e da variação de luz, durante o desenvolvimento inicial nas plântulas de Hymenaea courbaril / Abstract: The jatobas (species belonging to the genus Hymenaea, family Leguminosae) display large physiological plasticity and as a consequence they have great adaptive capacity to several habitats. Different species and varieties of jatobas have adapted practically to all Brazilian tropical biomes, including the Amazon Forest and the complex of ecosystems that is formed by the Atlantic Forest, the Savannah and the Caatinga. Species of this genus contain xyloglucan as the main storage of carbon in their seeds. Xyloglucan is a polysaccharide similar to cellulose, but water soluble due to the branching with xylose and galactose. After germination, xyloglucan is completely degraded, producing free monosaccharides that are quickly metabolized to sucrose. The production of xyloglucan hydrolytic enzymes in the cotyledons is known to be controlled by auxin that comes from the shoot. However, it is not known how the mecanism is controlled. The aim of the present work was isolate partial cDNAs of the genes b-galactosidase (BGAL) and xyloglucan endo-transglycosylase or endo-b-1,4-glucanase (XET) xyloglucan degradation genes and two other genes related to sucrose metabolism (neutral/alkaline invertase - NI/AI and sucrose synthase - SUS) in order to try to evaluate possible forms of control of gene expression involved in the catabolism of xyloglucan in cotyledons of Hymenaea courbaril . Primers were designed on the basis of extant sequences obtained from databases for all genes. We guided the search by sequences obtained from species of the Leguminosae. We cloned partial sequences of genes coding BGAL, XTH, NI and SUS. Semi-quantitative RT-PCR (semi-quantitative reverse transcription-polimerase chain reaction) was used to analyze expression at the 45th day after imbibition (when the rate of mobilization is maximal) in cotyledons, leaves, hypocotyls and roots every 6 hours during 24 hours. The experimental treatments were 1) seedlings grown under natural conditions; II) seedlings with top shoot excised; III) seedlings treated with auxin transport inhibitor (NPA ¿ naphtyl phtalamic acid); IV) seedilings grown in continous light and V) seedilings grown in darkness. We observed that there are three mechanisms of response to auxin. In cotyledons the genes related to xyloglucan degradation, BGAL1 and XTH1, showed responses by auxin and light in the plant. The genes related to sucrose metabolism, AlkIN1 and SUS1, have shown responses to carbon flux. In leaves, hypocotyls and roots the gene pattern change according carbon source comes from product of storage xyloglucan degradation in cotyledons. Our results revealed the first description of cDNA isolation and allow characterize pattern of genes involved native Brazilian tree species establishment. Our results and enzymatic data obtained by other researchers suggest a transcriptional control of storage mobilization in jatoba. From the sequencing data, it was also possible to observe that neutral invertase (NI) gene cloned from roots of jatoba contains aminoacid residues that characterise the NI as an alkaline invertase (AlkIN1) instead. Based in degradation and mobilization of xyloglucan storage in cotyledons we propose an expression control model for ß-galactosidase, XTH, alkaline invertase and sucrose synthase in all analyzed tissues during early development in seedilings of Hymenaea courbaril by endogenous auxin influence and light alternance / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

O Brasil, segundo maior produtor mundial de biocombustíveis, produz etanol a partir da extração e fermentação de sacarose de colmos de cana-de-açúcar. A utilização da energia presente nas ligações químicas entre os carboidratos da parede celular (celulose, hemiceluloses e pectina), das biomassas de folha e bagaço (hoje ambos considerados resíduos de produção), é uma possibilidade para o incremento, de cerca de 3 vezes o valor atual, na produção de etanol. O entendimento da estrutura química dos polissacarídeos da parede celular de cana-de-açúcar é imprescindível para que esta tecnologia seja desenvolvida. O presente trabalho teve como objetivo isolar as hemiceluloses de colmo de cana-de-açúcar e estudar as suas estruturas químicas. Para tal, utilizou-se AIR (Alcohol Insoluble Residue) - parede celular sem açúcar solúvel - de colmo e folha de cana-de-açúcar SP80-3280 em hidrólises enzimáticas com endo-β-xilanase, liquenase e celulase isoladamente ou em conjunto de forma a determinar a estrutura fina dos polímeros atacáveis por tais hidrolases. O AIR de colmo também foi submetido ao fracionamento da parede celular com oxalato de amônio, seguido de extrações com 1M e 4M de NaOH para a separação das hemiceluloses. Somente as frações 1M e 4M de NaOH foram analisadas, através de hidrólises com endo-β-xilanases, seguido da análise dos oligossacarídeos resultantes por HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) e por espectrometria de massas MALDI-TOF. Paralelamente, grupos de oligossacarídeos provenientes de hidrólises do colmo com endo-β-xilanase foram isolados por cromatografia em camada delgada (TLC) preparativa e, em seguida, hidrolisados com α-arabinofuranosidases e analisados por PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) para o esclarecimento da estrutura fina de arabinoxilanos. Os resultados obtidos mostraram a presença de xiloglucano na fração NaOH 4M em pequena proporção, cerca de 3% da parede celular, sendo este xiloglucano de 2 tipos: estrutura fina típica de gramíneas (composta por glucose, e os oligossacarídeos isoprimeverose, XG, XXG, XXGG, XXGGG) e estrutura fina de eudicotiledôneas e monocotiledôneas não-comelinóides (composta por oligossacarídeos: XXXG, XLXG/XXLG, XXXXG). A análise por MALDI-TOF da hidrólise das frações 1M e 4M de colmo de cana-de-açúcar com endo-β-xilanase revelou a existência de xilanos lineares (série homóloga de xilanos) em conjunto com um grupo de xilanos ramificados com arabinose de forma regular, com motivos arabinosilados com até 6 xiloses na cadeia principal. As hidrólises com endo-β-xilanase e liquenase em conjunto revelaram que o arabinoxilano e o β-glucano, juntos, perfazem cerca de 40% da parede celular de cana-de-açúcar, e não interferem na hidrólise uma da outra, permitindo o uso concomitante das enzimas em processos industriais. Além disso, especula-se que as arabinoses do arabinoxilano interagem, possivelmente, através de ligações por compostos fenólicos, prevenindo a ação enzimática. O presente trabalho começa a desvendar a estrutura fina das principais hemiceluloses da parede celular de colmo de cana-de-açúcar e aponta para a necessidade de experimentos que permitam compreensão de outros níveis de complexidade da parede celular, como por exemplo, as ramificações com agliconas e interações entre os polissacarídeos. / Brazil is the second-generation ethanol producer in the World, obtaining it from sugarcane soluble sugar from culms. The second generation ethanol consists of using the energy present in the covalent linkages of the cell wall carbohydrates (cellulose, hemicelluloses and pectin) from culms and leaves (both considered nowadays as litter). This is considered as a great opportunity to increase ethanol production up to 3 times the current figures. The knowledge about sugarcane polysaccharide structure is crucial for the development of the second-generation ethanol technology. This work, aimed at the isolation and structural studis of the hemicellulosic components of the sugarcane cell walls. To achieve this, AIR (Alcohol Insoluble Residue) from culms and leaves (SP 80-3280 variety) were digested with endo-β-xylanase, lichenase and cellulase (in different sequences, or with isolated or combined enzymes) to help determining the fine structures of the polysaccharides. The AIR from culm was fractionated with increasing alkali concentrations (NaOH 0,1M, 1M and 4M) to purify the different hemicelluloses. Only the 1M and 4M fractions were analyzed, after digestions with endo-β-xylanase, followed by HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) and MALDI-TOF Mass Spectrometry analyses. Also, the oligosaccharides obtained by the endo-β-xylanase digestion were isolated by preparative TLC (Thin Layer Chromatography), re-digested with α-arabinofuranosidases and finally analyzed by PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) in order to clarify the fine structure of the arabinoxylan from sugarcane culm. The same fractionated material was digested by an endo-β-glucanase to clarify the xyloglucan structure. The results showed that in the 4M fraction, a small concentration of xyloglucan can be found (ca. 3% of the total hemicelluloses), and this polysaccharide has the typical grass structure: XG, XXG, XXGG and XXGGG/XLGG. Other oligosaccharides, typical from eudicotyledons were also found: the XXXG, XLXG/XXLG and XXXXG. The MALDI-TOF and PACE analyses performed after digestion with endo-β-xylanase and α-arabinofuranosidases, revealed the presence of linear xylan oligosaccharides (from 2 to 14) and also fragments with arabinose substitutions. The digestions with endo-β-xylanase and lichenase at the same time, revealed that the arabinoxylan and β-glucans, are 40% of all the sugarcane cell wall mass, and one enzyme does not interfere in the activity of the other. The present work starts to clarify the fine structure of the sugarcane culm (and leaves) major hemicelluloses, and also suggest that experiments aimed at understanding cell wall complexity are important steps to help developing efficient cellulosic ethanol technologies to obtain second generation ethanol from sugarcane biomass.

O Brasil, segundo maior produtor mundial de biocombustíveis, produz etanol a partir da extração e fermentação de sacarose de colmos de cana-de-açúcar. A utilização da energia presente nas ligações químicas entre os carboidratos da parede celular (celulose, hemiceluloses e pectina), das biomassas de folha e bagaço (hoje ambos considerados resíduos de produção), é uma possibilidade para o incremento, de cerca de 3 vezes o valor atual, na produção de etanol. O entendimento da estrutura química dos polissacarídeos da parede celular de cana-de-açúcar é imprescindível para que esta tecnologia seja desenvolvida. O presente trabalho teve como objetivo isolar as hemiceluloses de colmo de cana-de-açúcar e estudar as suas estruturas químicas. Para tal, utilizou-se AIR (Alcohol Insoluble Residue) - parede celular sem açúcar solúvel - de colmo e folha de cana-de-açúcar SP80-3280 em hidrólises enzimáticas com endo-β-xilanase, liquenase e celulase isoladamente ou em conjunto de forma a determinar a estrutura fina dos polímeros atacáveis por tais hidrolases. O AIR de colmo também foi submetido ao fracionamento da parede celular com oxalato de amônio, seguido de extrações com 1M e 4M de NaOH para a separação das hemiceluloses. Somente as frações 1M e 4M de NaOH foram analisadas, através de hidrólises com endo-β-xilanases, seguido da análise dos oligossacarídeos resultantes por HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) e por espectrometria de massas MALDI-TOF. Paralelamente, grupos de oligossacarídeos provenientes de hidrólises do colmo com endo-β-xilanase foram isolados por cromatografia em camada delgada (TLC) preparativa e, em seguida, hidrolisados com α-arabinofuranosidases e analisados por PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) para o esclarecimento da estrutura fina de arabinoxilanos. Os resultados obtidos mostraram a presença de xiloglucano na fração NaOH 4M em pequena proporção, cerca de 3% da parede celular, sendo este xiloglucano de 2 tipos: estrutura fina típica de gramíneas (composta por glucose, e os oligossacarídeos isoprimeverose, XG, XXG, XXGG, XXGGG) e estrutura fina de eudicotiledôneas e monocotiledôneas não-comelinóides (composta por oligossacarídeos: XXXG, XLXG/XXLG, XXXXG). A análise por MALDI-TOF da hidrólise das frações 1M e 4M de colmo de cana-de-açúcar com endo-β-xilanase revelou a existência de xilanos lineares (série homóloga de xilanos) em conjunto com um grupo de xilanos ramificados com arabinose de forma regular, com motivos arabinosilados com até 6 xiloses na cadeia principal. As hidrólises com endo-β-xilanase e liquenase em conjunto revelaram que o arabinoxilano e o β-glucano, juntos, perfazem cerca de 40% da parede celular de cana-de-açúcar, e não interferem na hidrólise uma da outra, permitindo o uso concomitante das enzimas em processos industriais. Além disso, especula-se que as arabinoses do arabinoxilano interagem, possivelmente, através de ligações por compostos fenólicos, prevenindo a ação enzimática. O presente trabalho começa a desvendar a estrutura fina das principais hemiceluloses da parede celular de colmo de cana-de-açúcar e aponta para a necessidade de experimentos que permitam compreensão de outros níveis de complexidade da parede celular, como por exemplo, as ramificações com agliconas e interações entre os polissacarídeos. / Brazil is the second-generation ethanol producer in the World, obtaining it from sugarcane soluble sugar from culms. The second generation ethanol consists of using the energy present in the covalent linkages of the cell wall carbohydrates (cellulose, hemicelluloses and pectin) from culms and leaves (both considered nowadays as litter). This is considered as a great opportunity to increase ethanol production up to 3 times the current figures. The knowledge about sugarcane polysaccharide structure is crucial for the development of the second-generation ethanol technology. This work, aimed at the isolation and structural studis of the hemicellulosic components of the sugarcane cell walls. To achieve this, AIR (Alcohol Insoluble Residue) from culms and leaves (SP 80-3280 variety) were digested with endo-β-xylanase, lichenase and cellulase (in different sequences, or with isolated or combined enzymes) to help determining the fine structures of the polysaccharides. The AIR from culm was fractionated with increasing alkali concentrations (NaOH 0,1M, 1M and 4M) to purify the different hemicelluloses. Only the 1M and 4M fractions were analyzed, after digestions with endo-β-xylanase, followed by HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) and MALDI-TOF Mass Spectrometry analyses. Also, the oligosaccharides obtained by the endo-β-xylanase digestion were isolated by preparative TLC (Thin Layer Chromatography), re-digested with α-arabinofuranosidases and finally analyzed by PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) in order to clarify the fine structure of the arabinoxylan from sugarcane culm. The same fractionated material was digested by an endo-β-glucanase to clarify the xyloglucan structure. The results showed that in the 4M fraction, a small concentration of xyloglucan can be found (ca. 3% of the total hemicelluloses), and this polysaccharide has the typical grass structure: XG, XXG, XXGG and XXGGG/XLGG. Other oligosaccharides, typical from eudicotyledons were also found: the XXXG, XLXG/XXLG and XXXXG. The MALDI-TOF and PACE analyses performed after digestion with endo-β-xylanase and α-arabinofuranosidases, revealed the presence of linear xylan oligosaccharides (from 2 to 14) and also fragments with arabinose substitutions. The digestions with endo-β-xylanase and lichenase at the same time, revealed that the arabinoxylan and β-glucans, are 40% of all the sugarcane cell wall mass, and one enzyme does not interfere in the activity of the other. The present work starts to clarify the fine structure of the sugarcane culm (and leaves) major hemicelluloses, and also suggest that experiments aimed at understanding cell wall complexity are important steps to help developing efficient cellulosic ethanol technologies to obtain second generation ethanol from sugarcane biomass.

El present treball de recerca s'emmarca en un projecte Europeu anomenat E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), l'objectiu del qual és la identificació de nous enzims vegetals per entendre amb major profunditat els processos de formació i modificació de les fibres vegetals per abordar en el futur la millora dels paràmetres de qualitat d'aquestes fibres, mitjançant la generació de línies transgèniques de plantes. En el present projecte es pretén aprofundir en el coneixement de les xiloglucà endotransglicosilases (XET), enzims claus en la construcció i modificació controlada de la xarxa de xiloglucà cel·lulosa, estudiant el seu mecanisme d'acció i la seva especificitat per substrat. En aquest treball s'estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretament la XET16A (Ptt-XET16A). Es dissenya i es valida un nou assaig enzimàtic mitjançant electroforesis capil·lar (HPCE), que permet l'estudi cinètic de les XET, emprant oligosacàrids de baix pes molecular de xiloglucà amb una estructura coneguda. Aquest substrats han estat sintetitzats en el present treball i també per l'equip del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Es determina que el màxim d'activitat de la Ptt-XET16A es dóna entre pH 5 i 5.5 i entre 30 i 40 ºC. Es demostra que aquest enzim actua mitjançant un mecanisme cinètic bi-bi ping-pong, en el que l'acceptor actua com a inhibidor competitiu del donador unint-se a l'enzim lliure i en el que, depenent del donador emprat, aquest també poc actuar com a inhibidor competitiu de l'acceptor, unint-se als subsetis positius de l'intermedi glicosil-enzim i donant diferent reaccions secundàries com són la polimerització del donador o l'elongació del producte, només en el cas que el donador presenti un grup glucosil en l'extrem no reductor. S'avalua un llibreria de xilogluco-oligosacàrids sintetitzada per l'equip del Dr. Driguez al CERMAV-CNRS com a donadors de la Ptt-XET16A. D'aquesta forma s'aprofundeix en el coneixement de l'activitat de les XTH, en el coneixement de la seva especificitat per substrat i es realitza un mapeig del centre actiu, obtenint la contribució dels diferents subsetis de la Ptt-XET16A en l'estabilització de l'estat de transició de la reacció de transglicosidació catalitzada per l'enzim estudiat. Finalment, s'ha dissenyat un substrat bifluorogènic derivat del tetradecasacàrid emprat com a substrat estàndard en el present treball, per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs mitjançant fluorescence resonance energy transfer (FRET). El substrat bifluorogènic ha estat obtingut i caracteritzat, tanmateix, no s'ha pogut demostrar si aquest substrat és adequat per mesurar les activitats hidrolasa i transglicosilasa de les XETs ja que les propietats fluorescents del marcador s'han perdut en el procés de síntesis del substrat. / El presente trabajo de investigación se enmarca en un proyecto Europeo llamado E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443), el objetivo del cual es la identificación de nuevos enzimas vegetales para entender con mayor profundidad los procesos de formación y modificación de las fibras vegetales para abordar en el futuro la mejora de los parámetros de calidad de estas fibras, mediante la generación de líneas transgénicas de plantas. En el presente proyecto se pretende profundizar en el conocimiento de las xiloglucano endotransglicosilasas (XET), enzimas claves en la construcción y modificación controlada de la red de xiloglucano-celulosa, estudiando su mecanismo de acción y su especificidad por sustrato. En este trabajo se estudia una XET de Populus tremula x tremuloides, concretamente la XET16A (Ptt-XET16A). Se diseña y se valida un nuevo ensayo enzimático mediante electroforesis capilar (HPCE), que permite el estudio cinético de las XET, utilizando oligosacáridos de xiloglucano de bajo peso molecular y de estructura conocida como sustratos. Estos sustratos han estado sintetizados en el presente trabajo y también por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS. Se determina que el máximo de actividad de la Ptt-XET16A se da entre pH 5 y 5.5 y entre 30 y 40 ºC. Se demuestra que este enzima actúa mediante un mecanismo cinético bi-bi ping-pong, en el que el aceptor actúa como inhibidor competitivo del dador uniéndose al enzima libre y en el que, dependiendo del dador utilizado , éste también puede actuar como inhibidor competitivo del aceptor uniéndose en los subsitios positivos del intermedio glicosilo-enzima y dando diferentes reacciones secundarias como son la polimerización del dador o la elongación del producto, solamente si el dador presenta un grupo glucosilo en el extremo no reductor. Se evalúa una librería de xilogluco-oligosacáridos sintetizada por el equipo del Dr. Driguez en el CERMAV-CNRS como dadores de la Ptt-XET16A. De esta forma se profundiza en el conocimiento de la actividad de las XTHs, en el conocimiento de su especificidad por sustrato y se realiza un mapeo del centro activo del enzima, obteniéndose la contribución de los diferentes subsitios de la Ptt-XET16A en la estabilización del estado de transición de la reacción de transglicosidación catalizada por el enzima estudiado. Finalmente, se ha diseñado un sustrato bifuorogénico derivado del tetradecasacárido utilizado como sustrato estándar en el presente trabajo para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasa de las XETs mediante fluorescence resonance energy transfer (FRET). El sustrato biofluorogénico ha sido obtenido y caracterizado, sin embargo no se ha podido demostrar si este sustrato es adecuado para medir las actividades hidrolasa y transglicosilasas de las XETs, ya que las propiedades fluorescentes del marcador se han perdido durante la síntesis del sustrato. / The present work is part of an European project named E.D.E.N. (Enzyme Discovery in hybrid aspen for fibre ENgineering, QLK5-CT-2001-00443). The general objective of the project is to identify novel plant enzymes for deeper understanding of the process of fiber formation and modification for future improvement of the quality parameters of wood fibers. The present project pretends to increase the knowledge about xyloglucan endotransglycosylases (XET), which are thought to be key enzymes in the construction and controlled modification of the xyloglucan¬cellulose network. It is pretended to study the mechanism of action and the substrate specificity of a XET from Populus tremula x tremuloides, concretely XET16A (Ptt-XET16A). A new enzymatic assay based on capillary electrophoresis is designed and validated. This assay allows the kinetic study of XETs using as substrates, low molecular mass xyloglucan oligosaccharides with defined structures. These substrates have been synthesized in the present work and also in collaboration with Dr. Driguez team from CERMAV-CNRS. It is concluded that the maximum of activity of Ptt-XET16A is between pH 5 and 5.5 and 30 and 40 ºC. It is demonstrated that Ptt-XET16A follows a bi-bi ping-pong kinetic mechanism, in which the acceptor acts as competitive inhibitor of the donor binding to the free enzyme and depending on the donor used, this one can act also as competitive inhibitor of the acceptor binding to the acceptor subsites of the glycosyl-enzyme intermediate giving rise to side reaction such as donor polymerization and product elongation only in case that the donor shows a glucosyl residue in the non reducing end. A library of xylogluco-oligosaccharides, synthesized in CERMAV-CNRS by Dr. Driguez team, is evaluated as Ptt-XET16A donors. With this studies we are able to deeper understand the activity of XETs, their substrate specificity and a subsite maping of the binding cleft is done, obtaining the contribution of different subsites of Ptt-XET16A to the stabilization of the transition state of the transglycosylation reaction catalyzed by the studied enzyme. Finally, a bifluorogenic substrate derived from the tetradecasacharide used as standard substrate in this project has been designed to measure hydrolase and transferase activities of XET enzymes by fluorescense resonance energy transfer (FRET). The bifluorogenic substrate was obtained, however, it could not be demonstrated if it is an adequate substrate to measure hydrolase and transferase activities because the fluorescent properties of the label were lost during substrate synthesis.