Cette étude a pour objet la mise en évidence de traces d'ADN bactérien pathogène dans des échantillons animaux et humains anciens, et ainsi améliorer les connaissances sur l'évolution des maladies au cours du temps. En parallèle, nous avons étudié les phénomènes de dégradation de l'ADN dans le sol sur des cadavres de souris enterrées après avoir été contaminées par des bactéries non pathogènes. Cette étude des processus taphonomiques s'est étalée sur trois ans et a permis de montrer une disparition rapide des bactéries simulantes, remplacé par l'ADN des bactéries du sol, qui colonisent rapidement la dépouille et dégradent tant l'ADN endogène (murin) qu'exogène (bactérien). Cette disparition rapide explique la grande difficulté à mettre en évidence des pathogènes dans des échantillons anciens, à de rares exceptions près. Notre étude n'a pas permis de détecter d'agents pathogènes particuliers dans les échantillons que nous avons étudié, mais nous avons mis en évidence l'intérêt d'analyser certains types de restes pour accéder à une information génétique préservée. Le tartre dentaire indique est un bon indicateur de la flore buccale de l'hôte et les kystes calcifiés assurent une bonne préservation de l'ADN endogène, moins soumis à contamination et digestion par les bactéries de l'environnement. Les kystes présentent en règle générale une teneur en ADN endogène supérieure à tous les autres tissus étudiés. / The aim of this study was the identification of pathogenic bacterial DNA traces in ancient animal and human samples, and thus improve knowledge of past diseases that affect humankind over time. In parallel, we studied the DNA degradation phenomena in the soil on the buried corpses of mice after being contaminated by non-pathogenic bacteria. This study of taphonomic processes was spread over three years and has shown a rapid disappearance of simulant bacteria, replaced with the DNA of soil bacteria that colonize the body quickly after burial and degrade both the endogenous DNA (murine) that exogenous (bacteria). This quick degradation can explain the high difficulty to detect and identify bacterial pathogens in old samples, with very few exceptions. Despite the fact in our study we were not able to detect specific pathogens in the samples we have studied, we have shown the interest to analyze certain types of remnants to access preserved and informative genetic data. Dental calculus is a good indicator of the oral flora of the host and calcified cysts ensure good preservation of the endogenous DNA, less subject to contamination and digestion by bacteria from the environment. Cysts generally have an endogenous DNA content higher than all other tissues examined.

Chez les eucaryotes supérieurs, la réplication de l'ADN est initiée à partir de plusieurs milliers d'origines. Mais la régulation spatio-temporelle de leur activation reste mal caractérisée. Une voie de contrôle (checkpoint) de la phase S est activée lorsque les fourches de réplication sont bloquées, inhibant ainsi l'activation d'origines tardives. L'objectif de ma thèse consistait à étudier deux facteurs essentiels dans le programme spatio-temporel de la réplication, dans le système du xénope : la protéine « checkpoint » Chk1, qui est un facteur inhibiteur de l'activation des origines, et les désoxyribonucléotides (dNTPs), précurseurs de la synthèse de l'ADN. Chez le xénope, après douze divisions embryonnaires, a lieu la transition mid-blastuléenne (MBT). A cette étape, une augmentation du ratio nucléo-cytosolique va entrainer la titration des facteurs de réplication, ce qui active le point de contrôle et ralentit la phase S. Il est possible de mimer in vitro les phases S rapides des embryons pendant le développement précoce en augmentant la concentration en noyaux dans l'extrait d'œufs.Nous avons pu voir par l'inhibition, la déplétion ou la surexpression de Chk1 que cette protéine régulait l'activation des origines lors d'un stress, mais également dans une phase S non perturbée, grâce à la technique du peignage moléculaire. Ce résultat montre que le niveau de Chk1 doit être finement régulé pour permettre une réplication correcte dans une phase S non perturbée, chez les eucaryotes supérieurs. Nous avons ensuite cherché à savoir si la concentration en dNTPs pouvait être limitante pendant le développement et comment elle modulait le programme de réplication. Nous avons comparé l'effet de l'ajout de dNTPs sur la réplication en mimant plusieurs stades précoces du développement pré-MBT. La variation de la concentration en dNTPs agit sur la réplication en augmentant à la fois l'activation des origines et, en fonction de la concentration en noyaux, aussi la vitesse des fourches. Cet effet est indépendant du checkpoint de la réplication dans ce système et d'autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes moléculaires. / DNA replication in higher eukaryotes initiates at thousands of origins according to a spatio-temporal regulation program which is not well characterized. The S phase checkpoint is activated when replication forks are blocked which inhibits the firing of late origins. The aim of my thesis consisted to study two essentials factors in spatio-temporal replication program in Xenopus system: the checkpoint protein Chk1, inhibitor of origin activation, and the deoxyribonucleotides (dNTPs), DNA synthesis precursors. In Xenopus, the mid-blastula transition (MBT) occurs after twelve embryonic divisions. An increase of the nucleo-cytosolic ratio induces a titration of replication factors, that activates the checkpoint and slows down the S phase. It is possible to mimic in vitro the rapid S phases of early Xenopus development stages by increasing the nuclei concentration. By DNA combing combined with Chk1 inhibition, depletion and overexpression experiments, we show that Chk1 controls origins activation in perturbed but also unperturbed S phase. My results show that Chk1 levels needs to be tightly regulated in order to properly control the replication program during normal S phase in higher eukaryotes. In order to determine whether the concentration of dNTPs could be another limiting replication factor, we compared the effect of dNTPs addition on replication by mimicking in vitro several early stages of pre-MBT development. Addition of dNTPs affects DNA replication, by increasing origin activation and, dependent on nuclei concentration, also the fork speed. This effect is independent of the S phase checkpoint and further studies are needed in order to understand the molecular mechanisms behind.

La tuberculose est une maladie contagieuse qui s’attaque habituellement aux poumons, mais parfois aussi à d’autres parties du corps, comme les reins, les ganglions et les os. La tuberculose tue près 1,8 millions de personnes chaque année dans le monde. Il y a par conséquent un besoin urgent de mettre des moyens analytiques pour détecter l’ADN de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, responsable de la propagation de la tuberculose. La recherche développée dans le cadre de cette thèse consiste en l'élaboration d'un outil de diagnostic pour la détection d’ADN génomique de bactérie M.Tuberculosis après la lyse et amplification par PCR. Dans cette perspective, nous nous sommes intéressés au développement des biocapteurs basés sur des différentes morphologies de polypyrrole comme transducteur pour la détection électrochimique d'ADN du gène rpob de Mycobacterium tuberculosis. Une étude de l’impact des différentes morphologies sur les propriétés électriques des matériaux et également sur les performances des biocapteurs électrochimiques d’ADN a été effectuée. Nous avons aussi étudié l’effet de la fonctionnalisation par différentes chaine linéaire et ramifiée sur la structure des nanomatériaux de polypyrroles et leurs effets sur la quantité de biomolécules immobilisées. La stratégie adoptée pour le développement de ces matériaux est une construction du biocapteur réalisée étape par étape. Les différentes couches le constituant ont été caractérisées par différentes techniques de surface telles que les techniques électrochimiques et optiques, la microscopie électronique à balayage et la microscopie électronique à force atomique. Les propriétés des biocapteurs ont été suivies à travers les propriétés redox des groupes ferrocényles et naphtoquinone. La détection électrochimique de l’ADN cible évaluée avec ces biocapteurs à base de polypyrrole nanostructure montre une sensibilité de détection plus élevée que celle du biocapteur à base de polypyrrole couche compacte. Cela démontre le potentiel d'utilisation de la surface élevée des nanostructures polypyrrole comme transducteur et l’utilisation des approches de modification douce. Les biocapteurs ont été appliqués à la détection de l'ADN dans des échantillons réels d'ADN génomique de Mycobacterium tuberculosis et de l'ADN muté présentant la résistance de la rifampicine. Les biocapteurs basés sur des nanostructures de polypyrrole démontre une application potentielle dans la détection d'ADN et la capacité à discriminer le gène rpoB du mutant et pourrait être utilisé comme plate-forme dans la technologie des biocapteurs. / Tuberculosis is a contagious disease that usually attacks the lungs but can sometimes reach other parts of the body such as the kidneys, ganglia and bones. This disease is responsible for killing nearly 1.8 million people each year worldwide. Therefore, we have an urgent need to put analytical means to detect the DNA of the bacterium Mycobacterium tuberculosis, responsible for the spread of tuberculosis. The research developed in this thesis consists in the development of a diagnostic tool for the detection of genomic DNA of M.Tuberculosis bacteria after lysis and amplification by PCR. In this perspective, we focused on the development of biosensors based on different polypyrrole morphologies as transducers for the electrochemical detection of DNA of the rpob gene of Mycobacterium tuberculosis. A study of the impact of different morphologies on the electrical properties of materials as well as the performance of electrochemical DNA biosensors was carried out. We also studied the effect of the functionalization by different linear and branched chains on the structure of polypyrrole nanomaterials and their effects on the number of immobilized biomolecules. The strategy adopted for the development of these materials is a biosensor construction carried out step by step. The various layers constituting it have been characterized by different surface techniques such as electrochemical and optical techniques, scanning electron microscopy and atomic force electron microscopy. The properties of the biosensors were monitored through the redox properties of the ferrocenyl groups. The electrochemical detection of the target DNA evaluated with these biosensors based on polypyrrole nanostrcutrue compared to the results obtained with a biosensor based on polypyrrole compact layer shows a higher detection sensitivity.This demonstrates a potential for using the high surface area of polypyrrole nanostructures as a transducer and the use of soft modification approaches. The biosensors were applied to the detection of DNA in real samples of genomic DNA of Mycobacterium tuberculosis and mutated DNA with resistance to rifampicin. The biosensors based on polypyrrole nanostructures demonstrate potential application in DNA detection and the ability to discriminate the mutant rpoB gene and could be used as a platform in biosensor technology.

Parmi tous les animaux domestiques, le cheval est sans aucun doute celui ayant le plus influencé l’histoire des peuplements humains. Le cheval domestique a d’abord fourni à de nombreuses civilisations des ressources primaires essentielles telles que la viande et le lait. Utilisé pour sa force physique et comme moyen de transport, il a eu de profondes conséquences sur les mouvements de personnes et de biens ainsi que sur la diffusion de cultures et d’idées à travers l’Eurasie. Le cheval a ainsi fortement contribué à l’expansion de sociétés et d’empires pendant des millénaires, et ce jusqu’au vingtième siècle. Les différentes étapes de la domestication du cheval restent cependant mal comprises d’un point de vue archéologique et sont complexes à retracer à partir des données génétiques recueillies sur les races chevalines actuelles. L’émergence de la génomique ancienne au début des années 2010 a révolutionné la biologie de l'évolution, en donnant un accès direct à l’histoire des populations anciennes et actuelles. Elle est donc particulièrement adaptée pour étudier la transition historique induite par la domestication du cheval. En s'appuyant sur les dernières avancées en matière d’extraction d'ADN ancien et des technologies de séquençage d’ADN à haut débit, ce travail de doctorat vise à décrypter les modifications génétiques sous-jacentes au processus de domestication du cheval. Pour se faire, nous avons généré le plus grand jeu de données génomiques anciennes jamais rassemblées sur un organisme non humain. Celles-ci ont révélé que les chevaux domestiqués pour la première fois à Botai, dans le nord du Kazakhstan, il y a environ 5 500 ans, ne sont pas les ancêtres des chevaux domestiques ayant vécu pendant ces dernières ~4 100 années. Ce sont les ancêtres des chevaux de Przewalski, que l’on pensait jusqu’alors totalement sauvages. Cette découverte inattendue suggère qu'un remplacement majeur de la population de chevaux domestiques a eu lieu au cours du troisième millénaire avant notre ère, contribuant probablement à faire entrer l'humanité dans l'âge du Bronze. En outre, ces trois années de recherche ont permis d'identifier les signatures génétiques associées à différentes stratégies d’élevage du cheval et ont révélé les dynamiques évolutives en jeu lors des étapes clés de la domestication. En particulier, il ressort des analyses de génomes anciens que les chevaux ibériques n’ont contribué que marginalement à la création du cheval domestique tel qu’on le connaît aujourd'hui. Ce travail de thèse a par ailleurs permis de détecter une influence croissante des chevaux perses dès le début du Moyen Age. / Among all domesticates, the horse can confidently be considered as the animal that most impacted the history of human dynamics. Once they domesticated the horse, human civilizations got hold of essential domestication products including meat and milk, but also invaluable secondary products, such as fast transportation and powerful workforce. The horse thus deeply enhanced the circulation of people, goods, culture and ideas, promoting the spread of vast military and political units across Eurasia up until the 1900s. The various steps underpinning horse domestication are however difficult to track in the archaeological record and still poorly understood based on patterns of DNA variation among modern breeds. In the last decade, the advent of ancient genomics has revolutionized evolutionary biology by providing a direct window into the past history of populations. Ancient genomics therefore provides the necessary time travel machine to investigate the key historical transition in the history of humankind that was induced by the horse domestication. Leveraging the latest advances in ancient DNA recovery and High-Throughput sequencing technologies, this PhD project aimed at deciphering the genetic changes underlying the horse domestication process by generating the largest ancient genome dataset for a non-human organism, spanning the whole temporal and geographic range of horse domestication. This dataset revealed that horses first herded at Botai in Northern Kazakhstan ~5,500 years ago are not the ancestors of modern domestic horses but instead of modern Przewalski’s horses, previously thought to represent last true wild population on Earth. This major discovery also suggests that a swift genomic replacement in the domestic stock took place in the third millennium BCE, probably contributing to precipitating humankind into a new metal era, the Bronze Age. Additionally, this PhD work identified the genetic signatures associated with different management strategies and the evolutionary dynamics at play within distinct domestication stages. In particular, we were able to rule out Iberia as a major contributor to the modern domestic stock and moving towards more recent times, we characterized the growing influence of Persian-like horses starting in the early Middle Ages.

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Realiza la caracterización molecular de Andiniastra violascens (Amazonas) y se obtuvo su posición filogenética dentro de la subfamilia Peruiniinae. Además, se aprovechó el material disponible en la colección científica de Malacología del Museo de Historia Natural de la UNMSM para caracterizar y evaluar molecularmente a los Clausiliidae peruanos del género Cylindronenia (Amazonas) y Symptychiella (San Martín) y a una población de Andiniastra sp. colectada en Cajamarca. Se estandarizaron los protocolos moleculares necesarios para obtener secuencias del marcador nuclear 28S rRNA. De esta manera, se obtuvieron por primera vez secuencias de Andiniastra y Symptychiella, aumentando así la cobertura de géneros de Peruiniinae a 40.7% de los 27 géneros descritos para ese grupo. El análisis de estas secuencias de ADN evidenció que el género Andiniastra es monofilético y comparte un ancestro común con el clado conformado por Andinia (género al que A. violascens fue asignada inicialmente), Steeriana y Cylindronenia, mientras que Symptychiella estaría formando un clado muy bien soportado con Zilchiella. Además, se generaron secuencias mitocondriales de COI (28 secuencias) y 16S rRNA (31 secuencias), las cuales representan las primeras en su tipo para Peruiniinae, que se utilizaron para evaluar la variación intraespecífica y la utilidad de ellas como código de barras. Finalmente, las diferencias morfológicas encontradas en el análisis inicial, la divergencia genética en base a los marcadores COI, 16S rRNA y 28S rRNA, los cambios hallados en las secuencias aminoacídicas deducidas de COI y los análisis de estructuras secundarias de 16S rRNA sugieren que Andiniastra sp. podría ser en realidad un nuevo taxón. Adicionalmente, se realizó una calibración secundaria del árbol ML y se encontró que A. violascens (Amazonas) y Andiniastra sp. (Cajamarca) divergieron hace aproximadamente 12.3 millones de años lo que concuerda con el periodo de levantamiento acelerado de los Andes (entre 10 y 5 Ma), evento que pudo haber influenciado en la especiación de este género. / Tesis

Les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs/ARTDs) sont des senseurs des cassures de l’ADN et utilisent la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) pour synthétiser un polymère de poly(ADP-ribose) (PAR) long et branché attaché aux résidus accepteurs des protéines nucléaires. Le travail présent montre que les protéines des mammifères PARP-1, PARP-2 et PARP-3 sont capables d’ADPribosyler les extrémités des duplex d’oligonucléotides in vitro. PARP-1 modifie préférentiellement les substrats resequés, alors que PARP-2 et PARP-3 modifient préférentiellement les substrats avec un nick, et sont capables d’ADP-ribosyler les groupements phosphate en 5’ ou 3’ au niveau des extrémités des cassures double brin des duplex d’ADN contenant à proximité un nick ou gap phosphorylé en 5’. Cet étude présente une caractérisationdétaillée des préférences de substrat d’ADN pour les enzymes structuralement proches PARP-2 et PARP-3, et propose un modèle putatif du mécanisme de l’ADP-ribosylation des extrémités de l’ADN catalysée par PARP-3 et PARP-2. L’ADPribosylationefficiente d’un fragment d’ADN d’environ 3kb par PARP-3 et PARP-2, l’ADPribosylationmédiée par les PARPs dans les extrait cellulaires ainsi qu’un signal persistant générée par l’anticorps anti-PAR sur de l’ADN génomique purifié en série à partir des cellules HeLa déplétées de PARG et traitées à la bléomycine suggèrent que certains types de cassures complexes de l’ADN peuvent être efficacement PARylés par les PARPs comme réponse cellulaire aux dommages de l’ADN. Cet nouveau type de modification postréplicative de l’ADN médiée par les PARPs in vitro apporte des nouveaux éléments sur les mécanismes moléculaires sous-jacents aux enzymes qui catalysent l’ADP-ribosylation. / Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs/ARTDs) act as DNA break sensors and use nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to catalyze the synthesis of a long branched poly(ADP-ribose) polymer (PAR) attached to the acceptor residues of nuclear proteins. The present work shows that mammalian PARP-1, PARP-2 and PARP-3 can ADP-ribosylate strand break termini in DNA oligonucleotide duplexes in vitro. PARP-1 preferentially modifies recessed substrates, while PARP2 and PARP3 preferentially modify nicked DNA and can ADPribosylate 5′- and 3′-terminal phosphate residues at double-strand break termini of a DNA duplex containing a proximal 5′-phosphorylated nick or a gap. This work provides detailed characterization of DNA substrate preferences for structurally

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La méthylation de l’ADN est l’un des facteurs épigénétiques les plus étudiés dans le cadre du dépistage de cancer. Détecter la méthylation de certains promoteurs de gènes permettrait d’identifier un cancer en particulier et d’améliorer, ainsi, le diagnostic lors de l’apparition de cellules cancéreuses. Plusieurs techniques ont été développées dans cette voie mais très peu sont basées sur une détection via des polymères conjugués. La majorité de ces techniques reposent sur une étape de PCR (Polymerase Chain Reaction) qui amplifie le nombre de copies d’ADN. L’utilisation de polymères conjuguée, notamment du poly(3-alkoxy-4-méthylthiophène) permettrait un affranchissement de cet étape due aux propriétés optiques associées aux changements conformationnels de ce dernier. Ce polymère a déjà fait ses preuves autant en détection d’éléments pathogènes (détection de séquences précises) qu’en études conformationnelles (détection de G-quadruplex). Ce mémoire traite de deux approches distinctes pour la détection d’ADN méthylé. La première approche se base sur l’impact de la méthylation d’ADN sur le polymère lui-même et l’étude de ces impacts par diverses techniques de caractérisation. La deuxième approche se penche sur la détection de séquence d’ADN modifiée artificiellement par un traitement au bisulfite de sodium. Ainsi, deux méthodes ont été abordées pour obtenir une détection d’ADN méthylé efficace et reproductible à des fins de diagnostics de cancer.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle.