Salmonella é um dos mais importantes patógenos causadores de enfermidades transmitidas por alimentos (ETA) no Brasil e em outros países. Devido ao surgimento de fenótipos multi-resistentes (MOR) a agentes antimicrobianos em Salmonella, a caracterização dos genes envolvidos neste processo, sua localização e diversidade são importantes para identificação e compreensão dos fatores envolvidos na resistência. O objetivo deste trabalho foi caracterizar determinantes genéticos de virulência, resistência e integrons classe 1 presentes em cepas de diferentes sorotipos de Salmonella enterica multi-resistentes a antibióticos, isoladas a partir de alimentos de origem suína, avícola e fontes relacionadas. As cepas empregadas pertenceram a nove perfis PFGE distintos com a enzima Xbal, com similaridade genética variando de 38% a 68%. Integrons classe 1 foram detectados em 9 (45%) das 20 cepas de Salmonella enterica, incluindo cinco diferentes sorotipos: Brandenburg, Panama, Agona, Mbandaka e Alachua, e variando de 0,7Kb a 2,7Kb. Os genes de resistência aadA, sul1, sul2, tetA, dhfr, qacEΔl e blatem, que conferem resistência a aminoglicosídeos, sulfonamidas, tetraciclinas, compostos de amônio quaternário e β-lactâmicos, respectivamente, foram identificados no interior dos integrons, no cromossomo bacteriano, ou em ambos. Os genes aadB, floR, tetB e tetG não foram detectados. A resistência às quinolonas foi caracterizada nas 11 cepas que apresentaram resistência ao ácido nalidixico pela análise do gene gyrAM e mutações Ser-83-Fen foram confirmadas após sequenciamento das amostras. Estudos de conjugação demonstraram que apenas uma cepa de Salmonella Mbandaka foi capaz de transferir o gene sul2, para uma cepa de E. coli K12. Com relação ao perfil de virulência, as 20 cepas de Salmonella enterica foram caracterizadas e os genes slyA, invA, sopB e aceK estiveram presentes em 100% delas e o gene h-1i esteve presente em 18 cepas (90%). O gene spvC não foi detectado nas cinco cepas que possuíam plasmídeos. Os dados do presente estudo sugerem que alimentos de origem animal podem ser considerados como reservatórios de cepas de Salmonella enterica virulentas, resistentes a antimicrobianos e apresentando integrons classe 1. Isto caracteriza os produtos de origem suína e avícola como uma importante fonte de patógenos multi-resistentes para humanos. / Salmonella is one of the most important foodborne pathogens in Brazil and worldwide. Due to the emerging of multiresistant phenotypes in Salmonella the characterization of the genes involved in this process, their localization and diversity are important for identifying and understanding the factors involved in the resistance. The purpose of this study was to characterize virulence and antimicrobial determinants in different serovars of antibiotic multiresistant Salmonella enterica strains isolated from pork, poultry and related sources. The isolates belonged to nine different PFGE profiles obtained with Xbal restriction enzyme and showing genetic similarity ranging from 38% to 68%. Class 1 integrons were detected in 9 (45%) of 20 S. enterica strains ranging in size from 0,7Kb to 2,7Kb and comprising five different serotypes: Brandenburg, Panama, Agona, Mbandaka and Alachua. Resistance genes aadA, qacEΔl, sul1, tetA, sul2, dhfr, blatem, that confer resistance to aminoglicosides, sulphonamides, tetracyclines, ammonium quaternary compounds and beta-Iactams, respectively, were identified within class 1 integrons, chromosome, or both. Genes aad8, floR, tetB and tetG were not detected. The resistance to quinolones was characterized in 11 strains that showed resistance to nalidixic acid analyzing gyrA genes and Ser-83-Fen mutations were confirmed after sequencing of the samples. Conjugation studies demonstrated that only one S. Mbandaka strain was able to transfer sul2 gene to the E.coli K12. Regarding virulence profile Salmonella enterica strains were characterized and PCR analysis revealed the presence of the virulence genes invA, aceK, sop8, slyA in all isolates and the presence of virulence gene h-1i in 18 (90%) of them. The spvC gene was not detected in the five strains that harbored plasmids. The data of the present study suggest that foods of animal origin can be considered reservoirs of Salmonella enterica that are virulent, resistant and show class 1 integrons. This characterizes pork and poultry products as important sources of multi-resistant pathogens to human beings.

Aquesta tesi doctoral se centra en l'estudi de l'aplicació de pèptids antimicrobians en la lluita contra agents patògens de cultius de plantes d'interès econòmic.L'estratègia sintètica s'ha portat a terme utilitzant metodologies convencionals de síntesi de pèptids en fase sòlida com l'estratègia tridimensional ortogonal Fmoc/tBut/Allyl. Ha calgut fer la recerca de les condicions òptimes per a l'eliminació del grup Allyl i la ciclació. D'entre els pèptids cíclics de 4-10 aminoacids sintetitzats, el decapèptid c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) ha resultat ésser el més efectiu i s'ha pres com a base per al disseny d'una quimioteca de 56 pèptids. Dels resultats obtinguts s'ha sintetitzat una segona quimioteca basada en l'estructura general c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) determinada com la que posseix el millor perfil d'activitat. Els pèptids més efectius obtinguts constituixen els primers exemples de pèptids cíclics actius contra E. amylovora i poden ser considerats com a bons candidats pel desenvolupament d'agents antimicrobians efectius en protecció vegetal. / This PhD thesis was centred on the study of the application of de novo designed head-to-tail cationic cyclic peptides as inhibitors of the plant pathogenic microorganisms responsible for diseases in plants of great economic importance.The solid-phase synthesis of the cyclopeptides was carried out using a three-dimensional orthogonal Fmoc/tBut/Allyl strategy. The optimisation study of the allyl group removal and of the head-to-tail cyclization of linear peptides on SynPhase Lanterns was required for the syntheses. From the synthesized cyclic peptides of 4 to 10 residues, the cyclodecapeptide c(Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) was the most active and has been used as parent peptide in a using a combinatorial chemistry approach. From the results, a second library based on the structure c(X1-X2-X3-X4-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Gln) has been synthesized. The best cyclodecapeptides are the first examples of cyclic peptides effective against E. amylovora and make them potential candidates for the development of antimicrobial agents for use in plant protection.

UGARTE, Sheila Dayanna Milan. Atividade antimicrobiana da cobertura comestível de quitosana adicionada com trans-cinamaldeído sobre Escherichia coli E Listeria innocua em melão cantaloupe (Cucumus melo, L.) minimamente processado. 2012. 96 f. : Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia de Alimentos, Fortaleza-CE, 2012 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-27T13:37:34Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_sdmugarte.pdf: 3028823 bytes, checksum: 631442b469207df51398ae6e1ded8c92 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-06-27T13:37:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_sdmugarte.pdf: 3028823 bytes, checksum: 631442b469207df51398ae6e1ded8c92 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T13:37:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_sdmugarte.pdf: 3028823 bytes, checksum: 631442b469207df51398ae6e1ded8c92 (MD5) Previous issue date: 2012 / The consumption of fresh-cut fruits have grown considerably in recent years due to its nutritional advantages and because these are ready-to-eat products. However, the potential presence of pathogenic microorganisms in these products is a health risk for consumers, as they are eaten raw. The main purpose of this research was to evaluate in vivo the efficiency of a chitosan edible coating added with trans-cinnamaldehyde applied to fresh-cut melon (Cucumis melo L.), against fresh-cut melon’s own microflora and against Escherichia coli (ATCC 25922TM) and Listeria innocua (ATCC 33090). Firstly, in order to obtain the effective antimicrobial concentration, the Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bactericidal Concentration (MBC) were obtained in vitro. Subsequently, the melons were minimally processed and divided into three parts, the first part without inoculation, the second part inoculated with E. coli and the third part inoculated with L. inocua; immediately, the fresh-cut melon was immersed in two types of edible coating: a medium molecular weight chitosan edible coating (2%) and a chitosan edible coating added with trans-cinnamaldehyde (0.05%). Fresh-cut melon inoculated with water, inoculated with E. coli and inoculated with L. inocua, was used as controls. The determination of mesophilic bacteria, psychrophilic, coliform, yeasts and moulds was realized in non inoculated fresh-cut melon. In the other hand, the counting of E. coli and L. innocua was realized in inoculated fresh-cut melon; these microbiological analysis were done, in times: 0, 3, 7, 14 and 21 days of storage at 4 °C. Both edible coatings showed antimicrobial action against E. coli and L. innocua, mesophilic, psychrophilic, coliform bacterias, yeasts and moulds, no statistically significant difference was found between them (P>0,001). The chitosan edible coating added with trans-cinnamaldehyde (0.05%) do not show improved efficiency in its antimicrobial action, regarding the microorganisms used in this research. / O consumo de frutas minimamente processadas tem crescido consideravelmente nos últimos anos devido suas vantagens nutricionais e por estarem prontos para o consumo. Porém, a presença de microrganismos patogênicos nestes produtos é um risco para a saúde dos consumidores, pois são consumidos crus. O foco principal desta pesquisa foi avaliar in vivo a eficiência de uma cobertura de quitosana adicionada de trans-cinamaldeído em melão (Cucumis melo L.) minimamente processado, sobre a microbiota própria do melão e do melão inoculado com Escherichia coli (ATCC 25922TM) e Listeria innocua (ATCC 33090). Inicialmente determinou-se a concentração inibitória mínima (CIM) e bactericida (CBM) do trans-cinamaldeído a nível in vitro para obter-se a concentração efetiva como antimicrobiano. Posteriormente, os melões foram minimamente processados e divididos em três partes, sendo uma sem inoculação, outra inoculada com E. coli e outra com L. innocua, sendo em seguida imersos em dois tipos de cobertura: cobertura de quitosana de médio peso molecular (2%) e em cobertura de quitosana de médio peso molecular (2%) com 0,05% de trans-cinamaldeído. Como controles foram utilizados o melão inoculado com água; inoculado com E. coli e inoculado com L. innocua. Foram realizadas determinação de bactérias mesófilas, psicrófilas, coliformes, bolores e leveduras nos melões não inoculados e contagem de E. coli e L. innocua nos melões inoculados, nos tempos: 0, 3, 7, 14 e 21 dias de armazenamento a 4 ºC. Ambas coberturas apresentaram atividade antimicrobiana sobre E. coli, L. innocua, bactérias mesófilas, psicrófilas, coliformes, bolores e leveduras, não ocorrendo entre elas uma diferença estatística significativa (P>0,001). A cobertura com trans-cinamaldeído não apresentou maior eficiência na ação antimicrobiana com relação aos microrganismos pesquisados.

COSTA, Helen Paula Silva da. Purificação e caracterização de um inibidor de tripsina com atividade antimicrobiana da torta de pinhão-manso (Jatropha curcas L.). 118 f. : Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-20T13:42:27Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_hpscosta.pdf: 3018720 bytes, checksum: eb4b6b465befb3e7211b53415f21b787 (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-23T12:00:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_hpscosta.pdf: 3018720 bytes, checksum: eb4b6b465befb3e7211b53415f21b787 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T12:00:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_hpscosta.pdf: 3018720 bytes, checksum: eb4b6b465befb3e7211b53415f21b787 (MD5) Previous issue date: 2012 / The residue (cake) obtained after the extraction of oil from jatropha (Jatropha curcas) seeds for biodiesel production is toxic. Despite of the obstacles related to its use in the animal feed, there are evidences that this residue has great potential for biotechnology applications due to its arsenal of molecules. Thus, the present study aimed to purify and characterize a trypsin inhibitor from jatropha cake, in order to make a better use of this residue. The centesimal composition analysis showed to be the jatropha cake mainly composed of proteins (37.21%), fiber (34.26%) and lipids (19.16%). The crude extract obtained from the jatropha cake under alkaline condition (100 mM sodium borate buffer, pH 10.0) showed the presence of lectin (319.76 HU/gF), papain inhibitor (1,287.38 IU/gF), protease (2.69 AU/gF) and, especially, trypsin inhibitor (1,649.7 IU/gF). The trypsin inhibitor, named JcTI, was purified by fractionation of the crude extract with trichloroacetic acid (2.5%) followed by affinity chromatography (trypsin-sepharose-4B) and molecular exclusion (sephacryl S-200). JcTI is a glycoprotein (6.4% carbohydrates) with molecular mass in the range of 20-21 kDa, pI of 6.6, NH2-terminal sequence (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) showing identity around 60% with plant albumins and highly stable to heat, pH and salinity. JcTI (500 µg/mL) slowed the growth of important phytopthogenic fungi, including Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum and Fusarium solani. This inhibitor also presented antibacterial activity against human pathogenic bacteria such as Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis and Staphylococcus aureus, with minimum inhibitory concentration less than 5 µg/mL. The results demonstrate the potential of JcTI for biotechnological application as a new defense protein against phytopthogenic fungi and human pathogenic bacteria. / O resíduo (torta) obtido após a extração de óleo das sementes de pinhão-manso (Jatropha curcas) para a produção de biodiesel é tóxico. Apesar dos entraves relacionados à sua utilização na alimentação animal, existem evidências de que esse resíduo tem grande potencial de utilização biotecnológica graças ao arsenal de moléculas que o constitui. Assim, o presente trabalho teve como foco a purificação e caracterização de um inibidor de tripsina da torta de pinhão-manso, vislumbrando um maior aproveitamento desse resíduo. A análise da composição centesimal revelou ser a torta de pinhão-manso composta principalmente por proteínas (37,21%), fibras (34,26%) e lipídios (19,16%). O extrato bruto obtido a partir da torta sob condição alcalina (tampão borato de sódio 100 mM, pH 10,0) mostrou a presença de lectina (319,76 UH/gF), inibidor de papaína (1.287,38 UI/gF), protease (2,69 UA/gF) e, principalmente, de inibidor de tripsina (1.649,7 UI/gF). O inibidor de tripsina, denominado JcTI, foi purificado do extrato bruto por fracionamento com ácido tricloroacético (2,5%) seguido de cromatografias de afinidade (tripsina-sepharose-4B) e de exclusão molecular (sephacryl S-200). JcTI é uma glicoproteína (6,4% de carboidratos) com massa molecular na faixa de 20-21 kDa, pI de 6,6, sequência NH2-terminal (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) exibindo similaridade em torno de 60% com albuminas vegetais e altamente estável ao calor, salinidade e pH. JcTI (500 µg/mL) retardou o crescimento de vários fungos fitopatogênicos de importância agrícola, incluindo Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum e Fusarium solani. Esse inibidor também mostrou atividade antibacteriana frente a bactérias patogênicas ao homem, tais como Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis e Staphylococcus aureus, com concentração inibitória mínima inferior a 5 µg/mL. Os resultados obtidos demonstram o potencial do JcTI para aplicação biotecnológica como uma nova proteína de defesa contra fungos fitopatogênicos e bactérias patogênicas ao homem.

A Senna occidentalis é uma leguminosa nativa das Américas largamente distribuída e utilizada popularmente em regiões tropicais do mundo, apresentando relevância na busca de novos produtos naturais biologicamente ativos. O presente trabalho teve como objetivo a avaliação da atividade antimicrobiana e citotóxica de extratos aquosos das sementes e suas trações protéicas, bem como dos extratos hidroalcoólicos das sementes e das partes aéreas dessa planta, visando a sua utilização em preparações tópicas. As atividades antibacteriana e antifúngica, frente aos microrganismos padrões farmacêuticos, foram avaliadas pela técnica de diluição em meios líquidos, adaptada para microplacas. A citotoxicidade das amostras ativas foi avaliada pelo teste do MTS, empregando-se cultura de fibroblastos NIH-3T3. Como resultado, o extrato hidroalcoólico de sementes a 0,3% (p/v) foi o que melhor demonstrou potencial antimicrobiano, além de toxicidade adequada, podendo ser um candidato para o uso como um antimicrobiano ou conservante de preparações tópicas. / Senna occidentalis is a native leguminous from America widely spread in tropical regions of the world and employed in folk medicine, showing a great importance on the search of new bioactive natural products. The aim of the present work was to evaluate the antimicrobial and cytotoxic activities of the aqueous extract seeds\' and its protein fractions, as well the hydro-alcoholic extracts seeds\' and aerial parts from this plant, considering its possible use in topic preparations. The antibacterial and antifungal activities, against the pharmaceutical standard microorganisms, were evaluated by broth dilution technique, adapted to microplates. The cytotoxicity of active samples was evaluated by the cellular viability test with MTS employing NIH-3T3 fibroblasts cell culture. As a result, the hydro-alcoholic extract seeds\' 0,3% (w/v) demonstrated a better antimicrobial potential and a suitable toxicity. In such case, this extract could be a candidate for the use as antimicrobial or preservative of topic preparations.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-19T12:28:29Z No. of bitstreams: 1 claudiaoliveirafontes.pdf: 4732336 bytes, checksum: b5385191fb0ea13de3e2e756b49d0981 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-06-29T12:22:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 claudiaoliveirafontes.pdf: 4732336 bytes, checksum: b5385191fb0ea13de3e2e756b49d0981 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T12:22:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 claudiaoliveirafontes.pdf: 4732336 bytes, checksum: b5385191fb0ea13de3e2e756b49d0981 (MD5) Previous issue date: 2013-04-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste estudo, os padrões de susceptibilidade a antimicrobianos, ocorrência de marcadores moleculares de resistência aos antimicrobianos e biocidas, bem como as características de virulência associadas aos Staphylococcus spp., foram avaliados tanto em SCN quanto em S. aureus isolados de queijo Minas Frescal no Brasil. Um total de 246 isolados bacterianos foram recuperados de 35 amostras de queijo, as quais foram obtidas em cinco lotes de cada uma das sete marcas comerciais diferentes avaliadas neste estudo. As contagens bacterianas variaram de 103 a 107 UFC/g de queijo. Os percentuais elevados de resistência a antimicrobianos foram observados nos dois grupos bacterianos com relação à oxacilina, penicilina e eritromicina. Um percentual baixo de resistência aos antimicrobianos foi encontrado com relação ao cloranfenicol, e todas as bactérias avaliadas se mostraram susceptíveis à vancomicina e linezolida. No total, o índice de resistência múltipla aos antimicrobianos (MAR) > 0,2 foi observado em 80,6 % e 84,2 % dos isolados de SCN e S. aureus, respectivamente. Entretanto, o índice MAR variou de 50 % a 100 % considerando apenas os isolados bacterianos estudados por marca comercial de queijo. Com relação à prevalência de SCN e S. aureus que carregam o gene mecA, respectivamente, 81,5 % e 47,4 % das linhagens isoladas foram consideradas mecA+, e 76,2 % e 42,1 % destas se mostraram fenotipicamente resistentes à oxacilina. Três isolados bacterianos carregavam o gene para produção de enterotoxina A (sea), 30,5 % produziram biofilme em um teste de laboratório, e a α ou ß-hemólise foi observada em 2,8 % e 7,2 %, respectivamente, em todos os Staphylococcus spp. avaliados. Os marcadores moleculares de resistência aos antimicrobianos e biocidas mais prevalentes encontrados nas linhagens de SCN e S. aureus foram blaZ, mecA, msrA, msrB, linA, aacA-aphD, e smr. Este estudo destaca a importância do fenômeno da resistência aos antimicrobianos com relação aos microrganismos negligenciados que são veiculados por alimentos, e os prováveis riscos para a saúde pública relacionados ao consumo de queijo contendo bactérias do gênero Staphylococcus. / In this study, antimicrobial susceptibility patterns, molecular markers of antimicrobial and biocide-resistance occurrence and virulence-associated characteristics were evaluated in CoNS and S. aureus isolated from soft cheese in Brazil. A total of 246 bacterial isolates were recovered from 35 cheese samples belonging to five batches with seven different trademarks. The bacterial counts ranged from 103 to 107 CFU g1. High antimicrobial resistance percentages were observed for oxacillin, penicillin and erythromycin for both S. aureus and SCN. A low antimicrobial resistance percentage was observed for chloramphenicol, and all of the tested bacteria were susceptible to vancomycin and linezolid. In total, a multiple antibiotic resistance (MAR) index of > 0.2 was observed for 80.6 % and 84.2 % of the isolated CoNS and S. aureus, respectively. However, the MAR index ranged from 50 % to 100 % when only bacterial cheese isolates belonging to the same trademark were considered. Regarding to the prevalence of SCN and S. aureus carrying mecA gene, respectively, 81.5 % e 47,4 % of the isolated strains were mecA+, and 76.2 % and 42.1 % of these were phenotypically resistant to oxacillin. Three isolates carried the enterotoxin A gene (sea), 30.5 % produced biofilm in a laboratory test, and α- or ßhemolysis was observed for 2,8 % and 7.2 %, respectively, for all the Staphylococcus spp.. blaZ, mecA, msrA, msrB, linA, aacA-aphD, and smr were most prevalent molecular markers found both in SCN and S. aureus strains. This study highlights the extent of the antimicrobial resistance phenomenon in neglected foodborne microorganisms and the potential public health risks that are related to the consumption of Staphylococci-contaminated soft cheese.

Proteínas e peptídeos ricos em glicina são encontrados em animais e plantas. Alguns apresentam atividade antimicrobiana. Como pouco se sabe sobre suas síntese, estrutura, relação estrutura-atividade e mecanismo de ação, tais tópicos foram estudados para os antimicrobianos cheferina I (Chef I) e/ou fragmentos da acantoscurrina (acanto). No que se refere à Chef I (67,9% de Gly, 28,6% de His, seis repetições do motivo GGH e uma Tyr), sintetizamos, purificamos, caracterizamos e testamos Chef I, os seus análogos truncados na(s) porção(ções) N- ou/e C-terminal (is) e os análogos amidados Chef la, Chef I (3-28)a e Chef I (6-28)a. Os três últimos e Chef I foram igualmente ativos frente a cepas de C. albicans (MIC: 12,5 µM), mas não frente a cepas de C. tropicalis e S. cerevisiae. A amidação tornou o análogo Chef I (3-28)a mais ativo frente a tais cepas. Enquanto as atividades antifúngicas de Chef la e de seus análogos foram reduzidas pelo aumento da força iônica, elas foram aumentadas em presença de ZnCl2 5-10 µM. A 62,5 µM a Chef la foi letal para C. albicans MDM8. Ela foi pouco hemolítica em tampão fosfato contendo NaCl ou em tampão glicose fosfato isotônico (100 µM: 18%). Análises por microscopia confocal e citometria de fluxo revelaram que Chef la marcada com carboxifluoresceína (FAM-Chef la) foi rapidamente internalizada nas células de C. albicans MDM8, um processo que não foi afetado pela força iônica do meio e se mostrou dependente de ATP e temperatura. Quanto aos fragmentos da acanto (proteína com 132 aminoácidos, 73% de Gly e 3 repetições de uma seqüência de 26 aminoácidos), estudamos a síntese em fase sólida dos fragmentos N- e C-terminais, acanto (1-22) e acanto (101-132) , respectivamente, e da porção repetitiva, acanto (23-48). Apesar de uma predição teórica não ter indicado alto potencial de agregação para a acanto, as sínteses foram problemáticas: a ocorrência de aminoacilações incompletas repetitivas a 60° C usando diferentes estratégias, resinas, reagentes acopladores, solventes e sais caotrópicos sugeriram a ocorrência de agregação das cadeias peptídicas em crescimento sobre as resinas O uso da resina CLEAR amida permitiu a obtenção do acanto (113-132). Tentativa de síntese convergente em fase sólida não foi bem sucedida. Espectros Raman das peptidil-resinas obtidas confirmaram a presença de estruturas em folha β pregueada. Somente o uso combinado de resina CLEAR amida, 60°C, 20% DMSO/NMP, Fmoc-(Fmoc-Hmb)Gly-OH e LiCI permitiram a síntese total de acanto (101-132) . O uso da resina CLEAR ácida permitiu a síntese do fragmento acanto (23-48) e acanto (10-22) , esta última durante a tentativa de síntese do acanto (1-22) . Os rendimentos foram baixissimos e os espectros Raman das peptidil-resinas correspondentes também indicaram a formação de folhas β pregueadas. Estes resultados indicaram que Chef I (3-28)a mimetiza Chef I, que Chef la é um fungicida potente com alvo intracelular, que a internalização do seu análogo marcado na célula de levedura ocorra via endocitose, que a Chef la tem potencial para agir como uma droga de uso tópico e que os fragmentos de acanto são \"difficult sequences\" típicas. / Proteins and peptides with high content of glycine have been found in animais and plants. Some of them display antimicrobial activity. As little is known about their chemical synthesis, structure, structure-activity relationship and mode of action, we studied such topics using shepherin I (Shep I) and fragments of acanthoscurrin (acantho) as targets. Concerning to Shep I (67.9% of Gly, 28.6% of His, six direct repeats of the motif GGH and one Tyr), we synthesized, purified, characterized and tested Shep I, its analogues truncated at the N- and/or C-terminal portions and the amidated analogues Shep la, Shep I (3-28)a and Shep I (6-28)a. The last three analogues and Shep I were equally active against C. albicans (MIC: 12.5 µM) strains, but not against C. tropicalis and S. cerevisiae strains. Cterminal amidation made Shef I (3-28)a more active against those fungai strains. Anticandidal activities of Shep la and truncated analogues were inhibited in high ionic strength solutions, but enhanced at 10 µM ZnCI (2 to 8-fold). At 62.5 µM (5 MIC), Shep la killed C. albicans MDM8 in 30 mino It caused low hemolysis in phosphate buffered saline and isotonic glucose phosphate buffer (100 µM: 18%). Confocal microscopy and flow cytometry analyses revealed that Shep I modified with carboxyfluorescein (FAM-Shep la) was rapidly internalized into C. albicans MDM8 cells, process not affected by ionic strength and showed to be energy and temperature-dependent. As to the fragments of acantho (a protein with 132 amino acids, 73% of Gly, and three repeats of 26 amino acids), we studied solid-phase syntheses of the N- and C-terminal portions, acantho (1-22) and acantho (101-132), respectively, and of the repetitive portion, acantho (23-48). A theoretical prediction did not indicate high aggregation potential for acantho, but solid-phase syntheses were troublesome: repetitive incomplete aminoacylations took place even at 60°C using different strategies, resins, coupling reagents, solvents and chaotropic salts, suggesting aggregation of the growing peptide chains. Change to CLEAR amide resin allowed obtaining acantho (113-132) . Attempt using convergent solid phase synthesis was not successful. Raman spectra of the growingpeptidyl-resins revealed pleated β-sheet structures. Only the combination of CLEAR amide resin, 60°C, 20% DMSO/NMP, Fmoc-(Fmoc-Hmb)Gly-OH and LiCl allowed the total synthesis of acantho (101-132). The use of CLEAR acid resin also allowed obtaining the fragments acantho (23-48) and acantho (10-22), the last one during the attempt of the synthesis of acantho (1-22). The synthesis yields were extremely low and, again, the Raman spectra of the growing peptide-resins indicated the occurrence of pleated β-sheet structures. Altogether, the results indicated that Shep l (3-28)a mimics the fungicidal activity of Shep l, Shep la is a potent anticandidacidal peptide that has an intracellular target, FAM Shep la may be internalized into the fungai cells via endocytosis, Shep la has the potential to act as a drug for topical use and acantho fragments are typical difficult sequences.

Na tentativa de reproduzir os benefícios ruminais dos ionóforos, pesquisadores exploram as propriedades antimicrobianas dos compostos secundários dos vegetais. Técnicas in vitro de produção de gás são amplamente utilizadas nas etapas iniciais de pesquisa. Óleos essenciais são compostos hidrofóbicos, sendo comum sua diluição com etanol em experimentos in vitro. Etanol é metabolizado no ambiente ruminal, havendo principalmente produção de acetato. No primeiro experimento, o objetivo foi avaliar o efeito de 10, 100 e 1000 µL de etanol em 75 mL de fluido ruminal tamponado, correspondendo a 0,13; 1,3 e 13,3 µL/mL, respectivamente. As inclusões de 100 e 1000 µL de etanol alteraram a fermentação ruminal in vitro. A dose de 10 µL não afetou a fermentação, exceto pela tendência (P < 0,10) de aumento na produção de gás ou na concentração de valerato ao se incubar feno ou dieta de alto concentrado, respectivamente. Sugere-se a utilização da menor dose possível de etanol (0,13 µL/mL). O segundo experimento trata do uso de brancos (frascos sem substrato, contendo somente inóculo ruminal e meio de incubação) em experimentos in vitro para se estimar as produções líquidas de gás e metano (CH4), assim como a degradação líquida da matéria orgânica incubada. Foi demonstrado que aditivos ruminais (monensina, carvarol, eugenol) afetaram a fermentação de frascos contendo substrato assim como dos brancos. Dessa forma, brancos específicos (brancos contendo aditivo) são necessários ao se avaliar aditivos ruminais sob condições in vitro. No terceiro experimento, incubações in vitro foram conduzidas para triar os efeitos de óleos essenciais sobre a fermentação ruminal. Foram selecionados os óleos essenciais de erva-baleeira (Cordia verbenacea), aroeira-vermelha (Schinus terebinthifolius; óleo extraído das folhas ou frutos), macela (Achyrocline satureoides), guaco (Mikania glomerata), carqueja (Baccharis cylindrica), arnica (Lychnophora pinaster), capim cidreira (Cymbopogon citratus), capim limão (Cymbopogon flexuosus) e citronela (Cymbopogon winterianum). Foram também incluídos os óleos resinóides de copaíba mari-mari (Copaifera reticulata), copaíba angelim (Copaifera multijuga), copaíba zoró (Copaifera langsdorfii) e copaíba vermelha (Copaifera langsdorfii). Os óleos de ervabaleeira, macela e as quatro óleoresinas de copaíba pouco alteraram a fermentação ruminal. Os outros óleos apresentaram claro efeito antimicrobiano, evidenciado pela queda na degradação de substrato. Os resultados mais promissores foram observados ao se incubar dieta de alto concentrado com inóculo adaptado a esta dieta. Os óleos essenciais que apresentaram os melhores resultados foram aroeira vermelha (folhas e frutos) e arnica. Sob a condição de alto concentrado, esses óleos aumentaram a concentração de propionato, reduziram a relação acetato:propionato e/ou diminuíram a produção de CH4. Os óleos essenciais de aroeira vermelha (extraídos das folhas e dos frutos) e arnica foram selecionados para subsequente avaliação in vivo. / In an attempt to reproduce the benefits of ionophores on rumen fermentation, researchers have been exploiting the antimicrobial properties of plant secondary metabolites. In vitro gas production techniques are widely used during the screening phase. Essential oils are hydrophobic compounds, being usual its dilution in ethanol for in vitro experiments. In the rumen environment, ethanol is metabolized mostly to acetate. In the first experiment, the objective was to evaluate the effects of 10, 100 and 1000 µL of ethanol in 75 mL of buffered rumen fluid, corresponding to 0.13, 1.3, and 13.3 µL/mL, respectively. Ethanol inclusions of 100 and 1000 µL affected in vitro rumen fermentation. The inclusion of 10 µL of ethanol had no effects on fermentation, except for the tendency (P < 0.10) of gas production increase or valerate increase when incubating hay or a high-concentrate diet, respectively. It is suggested that ethanol should be included at the lowest dose as possible, which corresponded to 10 µL (0.13 µL/mL) in our conditions. The second experiment dealt with the use of blanks (flasks without substrate, containing only inoculum and incubation medium) in in vitro experiments to estimate net production of gas and methane (CH4), as well as net degradation of organic matter incubated. It was demonstrated that rumen additives (monensin, carvacrol, eugenol) affected fermentation of flasks containing substrate and blanks. Thus, specific blanks (blanks containing additive) are necessary when rumen additives are evaluated in vitro. In the third experiment, in vitro incubations were conducted to screen the effects of essential oils on rumen fermentation. The selected essential oils were: cordia (Cordia verbenacea), Brazilian peppertree (Schinus terebinthifolius; extracted from leaves or fruits), macela (Achyrocline satureoides), guaco (Mikania glomerata), carqueja (Baccharis cylindrica), arnica (Lychnophora pinaster), West Indian lemongrass (Cymbopogon citratus), East Indian lemongrass (Cymbopogon flexuosus), and citronella (Cymbopogon winterianum). Oleoresins from copaiba mari-mari (Copaifera reticulata), copaiba angelim (Copaifera multijuga), copaiba zoro (Copaifera langsdorfii), and copaiba vermelha (Copaifera langsdorfii) were also included. The essential oils from cordia, macela and all copaiba oleoresins had little effect on in vitro rumen fermentation. The remaining essential oils showed a clear antimicrobial effect, mainly on truly degraded organic matter. The most promising results were obtained when using high-concentrate diet and inoculum from animals fed this same diet. The best results were observed for Brazilian peppertree (leaves and fruits) and arnica essential oils. In the condition of high-concentrate diet, these oils increased propionate concentration, had lower acetate to propionate ratio, and/or reduced CH4 production. The essential oils from Brazilian peppertree (leaves and fruits) and arnica were selected for further in vivo evaluation.