[pt] A descoberta da importância do óxido nítrico na fisiologia humana expandiu a investigação dos mecanismos de interação das espécies reativas derivadas de óxidos de nitrogênio com biomoléculas. S-nitrosotióis são uma fonte conveniente de óxido nítrico para utilização in vivo. Um dos métodos largamente utilizados para S-nitrosilação de compostos contendo o grupo -SH, incluindo proteínas contendo o aminoácido cisteína, é a reação com nitrito em meio ácido. Nesse trabalho investigaram-se as espécies derivadas da reação de albumina sérica, humana e bovina, e de insulina com nitrito, através de espectrofotometria de absorção e de fluorescência. Além da modificação dos resíduos de cisteína, demonstrou-se que resíduos do aminoácido triptofano também sofrem modificação, podendo participar dos processos in vivo. A partir da comparação entre os espectros de absorção dos cromóforos formados em albumina humana e bovina, bem como em insulina, demonstrou-se que a banda de absorção no ultravioleta, descrita na literatura como característica de S-nitrosilação de cisteína, é dominada pelos resíduos de triptofano N-nitrosados. Experimentos de fluorescência confirmaram a modificação dos resíduos de triptofano, já que os espectros apresentaram redução do rendimento quântico e também deslocamento do pico característico desses resíduos. Acompanhou-se a cinética de formação de novos cromóforos, comparando as albuminas nativas e bloqueadas no resíduo de cisteína. Investigou-se a cinética de modificação dos resíduos de triptofano em pH fisiológico através de fluorescência. / [en] The discovery of the importance of nitric oxide to the human physiology expanded the investigation of mechanisms involved in the interactions of nitrogen oxide reactive species with biomolecules. S-nitrosothiols are a convenient source of nitric oxide for in vivo applications. Acid treatment with nitrite of compounds containing the SH group, including proteins containing cysteine residues, is a widely used method to synthesize S-nitrosothiols. In this work, several species derived from the nitrite acid treatment of human and serum albumins as well as insulin were investigated using optical absorption and fluorescence. It was demonstrated that, besides cysteine, tryptophan residues are modified and can participate in processes in vivo. Comparing the absorption spectra from human and bovine serum albumin with that from insulin, it was demonstrated that the ultraviolet absorption band, described in the literature as coming from Snitrosylation, was mainly due to N-nitrosation of tryptophan residues. Fluorescence experiments confirmed the modification of tryptophan residues, since the characteristic fluorescence peak exhibited a reduction and a blue shift. The kinetics of the new chromophores was followed by comparison of native and cysteine-blocked albumins. The kinetics of tryptophan modifications was investigated at the physiological pH using fluorescence.

This experiment aimed to evaluate the replacement of soybean meal by non-protein nitrogen sources (NPN) in combination with ground or whole corn in the diet concentrate fraction of confined cattle on the dietary intake, blood protein metabolite analyzes, and performance and ingestive behavior. The experiment was developed at the Laboratório de Bovinocultura de Corte of the Department of Zootechnics of UFSM. We used 53 steers, with Charolais or Nellore predominance, with initial mean age and weight of 22 months and 250 kg. Experimental diets contained voluminous:concentrate ratio of 50:50 based on dry matter. The treatments were: soybean meal + whole grain corn; soybean meal + milled corn; common urea + whole grain corn; common urea + milled corn; protected urea + whole grain corn; protected urea + milled corn. The experimental design was completely randomized in a 3x2 factorial scheme. There was no significant interaction between nitrogen source and corn grain form for any of the variables studied (P>0.05). Dry matter and crude protein intakes were higher for animals fed with soybean meal both in kg and in kg/100 live weight. Daily weight gain was higher for steers fed with soybean meal (1,600 kg/day) vs common urea (1,238 kg/day) and protected urea (1.217 kg/day). Corn presentation did not reflect any differences in the parameters of consumption, performance and behavior. The concentration of circulating albumin showed a significant interaction between nitrogen source and date of collection (P<0.05). Animals fed with soybean meal presented increasing albumin over the experimental period, while animals fed with NPN had growth in albumin levels from the first to the second collection, stabilizing up to the end of the study. The values of globulin presented interaction of the dates of collection with nitrogen sources and also with forms of corn grain, having an inverse behavior to the value of albumin. The albumin/total protein ratio increased throughout the experimental period, except for steers that consumed protected urea, which had similar values between the first and last collection. Feeding time of soybean meal was higher than protected urea, while common urea had intermediate behavior. Idling time differed among all treatments, with superiority to soybean meal, while common urea was higher than protected urea. NPN sources promoted higher rumination time and number of chewing per ruminal bolus and lower ruminating efficiencies of DM and NDF than soybean meal (P<0.05). Higher daily chewing times were observed for protected urea, followed by common urea, which was higher than soybean meal. In the number of chews similar behavior was observed, only with common urea presenting intermediate values. The use of true protein source in the diet of confined steers provides better results in aspects of performance, blood metabolites and ingestive behavior in relation to NPN in the two evaluated forms. / O objetivo deste experimento foi avaliar a substituição do farelo de soja por fontes de nitrogênio não proteico (NNP) em combinação com milho moído ou inteiro na fração concentrado da dieta de bovinos confinados através do desempenho, comportamento ingestivo e análises dos metabólitos proteicos sanguíneos. O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Bovinocultura de Corte do Departamento de Zootecnia da UFSM. Foram utilizados 53 novilhos, mestiço Charolês Nelore com idade e peso médios iniciais de 22 meses e 250 kg. As dietas experimentais continham relação volumoso: concentrado de 50:50, com base na matéria seca. Os tratamentos foram: farelo de soja + milho grão inteiro; farelo de soja + milho moído; ureia comum + milho grão inteiro; ureia comum + milho moído; ureia protegida + milho grão inteiro; ureia protegida + milho moído. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3x2. Não houve interação significativa entre fonte nitrogenada e forma do grão de milho para nenhuma das variáveis estudadas (P>0,05). Os consumos de matéria seca e proteína bruta foram superiores para animais alimentados com farelo de soja tanto em kg quanto em kg/100 de peso vivo. O ganho de peso diário foi superior para novilhos alimentados com farelo de soja (1,600 kg/dia) vs ureia comum (1,238 kg/dia) e ureia protegida (1,217 kg/dia). A forma de apresentação do milho não refletiu nenhuma diferença nos parâmetros de consumo, desempenho e comportamento. A concentração de albumina circulante apresentou interação significativa entre fonte nitrogenada e data de coleta (P<0,05). Animais alimentados com farelo de soja apresentaram albumina crescente ao longo do período experimental, enquanto os animais alimentados com NNP tiveram crescimento nos níveis de albumina da primeira para a segunda coleta, estabilizando até o final do estudo. Os valores de globulina apresentaram interação das datas de coleta com fontes nitrogenadas e também com formas do grão de milho, tendo comportamento inverso ao valor de albumina. A relação albumina/proteínas totais aumentou ao longo do período experimental, exceto para os novilhos que consumiram ureia protegida, os quais tiveram valores semelhantes entre a primeira e última coleta. O tempo de alimentação da ureia protegida foi superior ao farelo de soja, enquanto a ureia comum teve comportamento intermediário. O tempo de ócio diferiu entre todos os tratamentos, com superioridade para o farelo de soja, enquanto a ureia comum foi superior à ureia protegida. As fontes de NNP promoveram maior tempo de ruminação e número de mastigadas por bolo e menores eficiências de ruminação de MS e FDN do que o farelo de soja (P<0,05). Maiores tempos de mastigação diária foram observados para a ureia protegida, seguida da ureia comum, que foi superior ao farelo de soja; no número de mastigadas mericíclicas se observou comportamento semelhante, apenas com a ureia comum apresentando valores intermediários. A utilização de fonte de proteína verdadeira na dieta de novilhos confinados proporciona melhores resultados nos aspectos de desempenho, metabólitos sanguíneos e comportamento ingestivo em relação ao NNP nas duas formas avaliadas.

Interaction between bovine serum albumin (BSA) and thimerosal (TM), organic mercury compound, was investigated by spectroscopic methods. The results, by molecular fluorescence, show that the interaction takes place by static quenching with electrostatic forces spontaneously (ΔG = - 4.40 kJ mol-1 at 30°C). The binding constant (Kb) was 3.24 ± 0.01x103 L mol-1 (30°C) is considered a moderate interaction. Fluorescence in three dimensions revealed that TM causes structural involving the the polypeptide chain BSA changes in the polarity of the tryptophan and tyrosine residues confirmed by circular dichroism (CD) showed an increase in α-helix content after interaction with TM. In addition, the TM decreases the surface hydrophobicity of the protein. Bilirubin was used as a marker for the subdomain IB, confirming that TM interacts in this region of the protein. The study of the interaction mechanism proposed that TM is reacted with BSA through the free cysteine residue, forming the adduct BSA-HgEt release of thiosalicylic acid (ATS), which interacts with amino acids with side chain positive. Besides, it was seen that TM accelerates the protein fibrillation kinetics by 42%, with a possible indication of the toxicity of this compound in biological systems. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A interação entre albumina do soro bovino (BSA) e timerosal (TM), composto orgânico de mercúrio, foi investigada utilizando métodos espectroscópicos. Os resultados, por fluorescência molecular, evidenciam que a interação acontece por quenching estático através de forças eletrostáticas de forma espontânea (ΔG = - 4,40 kJ mol-1 a 30ºC). A constante de ligação (Kb) foi de 3,24 ± 0,01x103 L mol-1 (30ºC) sendo considerada uma interação moderada. A fluorescência em três dimensões revelou que TM causa mudanças estruturais envolvendo a cadeia polipeptídica da BSA assim como altera a polaridade dos resíduos de triptofano e tirosina, confirmada por dicroísmo circular (DC) que evidenciou aumento no conteúdo de α-hélice após interação com TM. Além disto, TM diminui a hidrofobicidade superficial da proteína. Bilirrubina foi utilizada como marcador para o subdomínio IB, confirmando que TM interage nesta região da proteína. O estudo do mecanismo de interação propôs que TM reage com BSA através do resíduo de cisteína livre, formando o aduto BSA-HgEt com liberação de ácido tiosalicílico (ATS), que interage com os aminoácidos com cadeia lateral positiva. Por fim, foi visto que TM acelera a cinética de fibrilação proteica em 42%, sendo um possível indício da toxicidade deste composto em sistemas biológicos.

Produtos de glicação avançada (AGE) prejudicam o metabolismo de lipoproteínas e o transporte reverso de colesterol, o que contribui para a aterosclerose no diabete melito (DM). Em particular, a albumina modificada por AGE (albumina-AGE) reduz a remoção de colesterol por diminuir o conteúdo do receptor ABCA-1 em macrófagos. Isto se vincula ao insulto oxidativo e inflamatório, os quais são indutores do estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo do presente estudo foi avaliar, em macrófagos, os efeitos do tratamento com albumina-AGE sobre o estresse do RE e suas vias adaptativas (UPR), relacionando-os com o prejuízo na expressão do ABCA-1 e efluxo de colesterol celular. Albumina-AGE foi produzida pela incubação de albumina isenta em ácidos graxos com glicolaldeído 10 mM e, albumina controle (albumina-C) com PBS apenas. Albumina foi isolada do soro de pacientes portadores de DM com controle glicêmico inadequado (albumina-DM) ou indivíduos controles (albumina não- DM) por cromatografia para separação rápida de proteínas seguida por purificação alcoólica. Macrófagos de peritônio de camundongos ou macrófagos da linhagem J774 foram tratados com os diferentes tipos de albumina na presença ou ausência de ácido fenil butírico (PBA; chaperona química que alivia o estresse do RE) ou MG-132 (inibidor do sistema proteasomal) por diferentes intervalos de tempo. A expressão de marcadores do estresse do RE, UPR, proteína dissulfeto isomerase (PDI), calreticulina e ubiquitina foi determinada por imunoblot e o conteúdo de ABCA-1, por citometria de fluxo e imunocitoquímica. O efluxo de 14Ccolesterol foi avaliado, utilizando-se apoA-I como aceptora de colesterol. A albumina-AGE induziu aumento tempo-dependente na expressão das chaperonas marcadoras do estresse do RE - Gr78 e Grp94 - e de proteínas da UPR (ATF6 e eIF2-P) em comparação à albumina-C. O conteúdo de ABCA-1 e o efluxo de colesterol foram reduzidos em, respectivamente, 33% e 47% e ambos foram restaurados pelo tratamento com PBA, o qual também reduziu o estresse do RE. A associação entre estresse de RE e redução de ABCA-1 foi confirmada pelo uso da tunicamicina (indutor clássico de estresse do RE), que diminuiu em 61% o conteúdo de ABCA-1, prejudicando em 82% o efluxo de colesterol. A albumina-AGE aumentou o conteúdo total de ubiquitina. A inibição do sistema proteasomal não foi capaz de restaurar o conteúdo de ABCA-1 em células tratadas com albumina-AGE. Em macrófagos expostos à albumina-DM evidenciou-se maior expressão da PDI e calreticulina, com tendência à maior expressão da Grp94. A albumina-AGE (produzida in vitro ou isolada de portadores de DM) induz estresse de RE, o qual se vincula à redução no conteúdo de ABCA-1 e efluxo de colesterol. Estes eventos podem contribuir para a aterosclerose no DM. Chaperonas químicas, que aliviam o estresse do RE, podem ser ferramentas úteis na prevenção e tratamento da aterosclerose / Advanced glycation end products (AGE) disturb lipoprotein metabolism and reverse cholesterol transport, contributing to atherosclerosis in diabetes mellitus (DM). Particularly, advanced glycated albumin (AGE-albumin) reduces cell cholesterol removal by impairing the expression of ABCA-1 in macrophages. This is ascribed to the oxidative and inflammatory stress, conditions that elicit endoplasmic reticulum (ER) stress. In this study it was investigated the effect of AGE-albumin on ER stress and adaptative pathways (UPR) development in macrophages, and its relationship to the reduction in ABCA-1 expression and cholesterol efflux. AGE-albumin was prepared by incubating fatty acid free albumin with 10 mM glycolaldehyde and control albumin (C-albumin) with PBS only. Albumin was isolated from poorly controlled DM patients (DM-albumin) and control individuals (nonDMalbumin) by fast liquid chromatography and purified by alchoolic extraction. Mouse peritoneal macrophages or J774 cells were treated along time with the different types of albumin in the absence or presence of phenyl butiric acic (PBA; a chaperone that aleviates ER stress) or MG132 (a proteasomal inhibitor). The expression of ER stress and UPR markers, protein disulfide isomerase (PDI), calreticulin and ubiquitin was determined by immunoblot and ABCA-1 protein level, by flow cytometry and imunocytochemistry. 14Ccholesterol efflux was evaluated utilizing apo A-I as cholesterol acceptor. AGE-albumin induced a time-dependent increase in the expression of ER stress chaperone markers - Gr78 and Grp94 - and UPR proteins (ATF6 and eIF2-P) in comparison to C-albumin. ABCA-1 content and cholesterol efflux were diminished by, respectively, 33% and 47% and both were recovered by the treatment with PBA. The association between ER stress and ABCA-1 reduction was confirmed by the reduction, induced by tunicanycin (a classical ER stress inductior) in ABCA-1 protein level (61%) and cholesterol efflux (82%). AGE-albumin increased the amount of cellular total ubiquitin. The inhibiton of proteasomal system was unable to restore ABCA-1 protein level in cells treated with AGE-albumin. In macrophages exposed to DM-albumin a higher expression of PDI and calreticulin was observed together with a trend of enhanced Grp94 expression. In conclusion, AGE-albumin (produced in vitro or isolated from DM patients) induces ER stress which is related to the reduction in ABCA-1 level and cholesterol efflux in macrophages. These events can contribute to atherosclerosis in DM. Chemical chaperones that alleviate ER stress may be useful in the prevention and treatment of atherosclerosis

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-07-25T13:32:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-26T12:05:00Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-26T12:05:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Junaine Vasques da Silva - 2002.pdf: 3727327 bytes, checksum: 4cb8c1db4d3fb95798779f39aae78673 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2002-12-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The main function of the most superficial layer of the epidermis, the Stratum Corneum (SC), is to provide a physical barrier that controls the transepidermal water loss as well as the permeation of another substances in both directions across the skin. The SC is formed by anabolically dead cells, the terminally differentiated corneocyte, and its function is essentially accomplished by forming a highly insoluble protein structure on the surface of the corneocytes, termed the cornified cell envelope, and by impeding water diffusion across the SC by mortaring the corneocytes together by layers of skin-specific lipids, essentially ceramide, cholesterol and fatty acid. In this work the cell envelope of the SC was spin labeled with a sulfhydryl-specific nitroxide reagent to investigate the water content effects upon the protein dynamics directly in the intact tissue. A two-state model for the nitroxide side chain described the coexistence of two spectral components in the electron paramagnetic resonance (EPR) spectra. The so-called strongly immobilized component, S, is associated with the EPR signal of a motionally restricted nitroxide fraction having its N-O group hydrogen bonded to protein (rigid structure) while the weakly immobilized component, W, corresponds to the signal provided by the spin labels with higher mobility (~10 times greater) exposed to the aqueous environment. The relative populations between these two mobility states, S and W, are in thermodynamic equilibrium. The standard Gibbs free energy, enthalpy and entropy changes for transferring the nitroxide side chain from the state contacting the solvent, W, to the one contacting protein, S, indicated that the reduction of the SC water content to below ~h 0.69, g H2O per g dry SC, stabilizes the protein interacting state, S. Upon decreasing the SC hydration level below ~h 0.69 the segmental motion of the polypeptide chains and the rotational motion of the spin-labeled side chain were also constrained. To test our methodology in a pure and very well known protein, we also studied the effects of two types of detergents on the bovine serum albumin (BSA). Both detergents, the anionic sodium dodecyl sulfate (SDS) and the zwitterionic N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonium-1-propanesulfonate (HPS) increase the mobility of the protein backbone and of the nitroxide side chain. The thermodynamic parameters indicated that these detergents destabilize the protein favoring less compact conformations. This work can also be useful to improve the spectral analysis of site-directed spin labeling, especially for a more quantitative description in terms of thermodynamic parameters. / A camada mais superficial da epiderme, o Estrato Córneo (EC), tem como função principal a formação de uma barreira física que controla a perda de água do corpo bem como a permeação de outras substâncias em ambas as direções da pele. O EC é formado por células anabolicamente mortas, os corneócitos, os quais sofreram diferenciação celular terminal, e sua função é realizada formando uma estrutura de proteínas altamente insolúveis na superfície do corneócito, chamada de envelope celular, e também uma matriz lipídica, essencialmente ceramídios, colesterol e ácidos graxos, que dificultam a difusão da água. Neste trabalho, o EC foi marcado com marcadores de spin específicos para reagir com os grupos sulfidrilas das proteínas, para investigar os efeitos do conteúdo de água na dinâmica de proteínas diretamente no tecido intacto. Um modelo de dois estados para a cadeia lateral do nitróxido descreveu a coexistência de duas componentes espectrais de ressonância paramagnética eletrônica (RPE). A componente denominada fortemente imobilizada (S), surge de uma fração de marcadores com o átomo de oxigênio do nitróxido ligado à proteína (estrutura rígida) enquanto a componente fracamente imobilizada é gerada pelos marcadores com mobilidade mais alta (~10 vezes maior) e expostos ao ambiente aquoso. As populações relativas entre estes dois estados de mobilidade, S e W, estão em equilíbrio termodinâmico. Os parâmetros da termodinâmica: energia livre padrão de Gibbs, entalpia e entropia, envolvidos na transferência da cadeia lateral do nitróxido do estado W, contatando ao solvente, para o estado S, contatando a proteína, indicaram que a redução do conteúdo de água para abaixo de ~0.69g de H2O por g de EC seco, estabiliza o estado S (cadeia lateral do nitróxido dobrada sobre a cadeia principal da proteína). Ao diminuir o nível de hidratação para abaixo de ~ h 0.69 (g H2o/g EC seco) o movimento local da cadeia polipeptídica e o movimento rotacional da cadeia lateral do marcador de spin foram ambos reduzidos. Para testar nossa metodologia em uma proteína pura e bem conhecida, estudamos os efeitos de dois tipos de detergentes sobre a albumina do soro bovino (BSA). Ambos os detergentes, o aniônico dodecil sulfato de sódio (SDS) e o ziteriônico N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanosulfonato (HPS) aumentaram a mobilidade da cadeia principal da proteína e da cadeia lateral do nitróxido. Os parâmetros termodinâmicos indicaram que estes detergentes desestabilizam a proteína favorecendo conformações menos compactas. Os resultados do presente trabalho também podem contribuir para aprimorar a

Submitted by ÍCARO PUTINHON CARUSO null (ykrocaruso@hotmail.com) on 2016-09-19T16:20:38Z No. of bitstreams: 1 tese_doutorado_icaro_vf.pdf: 17027642 bytes, checksum: 71d2f869670d044aace5f2ab6326b657 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-09-22T14:26:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 caruso_ip_dr_sjrp.pdf: 17027642 bytes, checksum: 71d2f869670d044aace5f2ab6326b657 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-22T14:26:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 caruso_ip_dr_sjrp.pdf: 17027642 bytes, checksum: 71d2f869670d044aace5f2ab6326b657 (MD5) Previous issue date: 2016-08-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os flavonóides fazem parte de uma ampla classe de compostos polifenólicos os quais ocorrem naturalmente nas plantas e podem ser encontrados nas sementes, caules, folhas, flores e/ou frutos. Estudos recentes indicam que esses compostos polifenólicos podem apresentar uma variedade significativa de atividades biológicas benéficas para a saúde humana, como por exemplo: antioxidante, anti-inflamatória, antibacteriana, antiviral e anticancerígena. A Albumina do Soro Humano (HSA) é a principal proteína extracelular presente no plasma sanguíneo. A função central dessa proteína é transportar e distribuir ligantes endógenos e exógenos para diferentes alvos moleculares no corpo humano. Por tais aspectos, torna-se importante o desenvolvimento de estudos que caracterizam a interação dos flavonóides com a proteína transportadora HSA. Este trabalho investiga a interação dos flavonóides Isovitexina (ISO) e 2-Fenilcromona (2PHE) com a HSA, utilizando técnicas experimentais de espectroscopia de fluorescência, absorbância UV-Vis, dicroísmo circular (CD) e infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR); juntamente com ferramentas computacionais de cálculo {\it{ab initio}}, dinâmica molecular e modelagem molecular. A integração dessas abordagens experimentais e computacionais possibilita caracterizar a formação dos complexos HSA-flavonóides, determinando aspectos físico-químicos como: constantes de afinidade, parâmetros termodinâmicos, número de sítios de ligação, perfil de cooperatividade e resíduos de aminoácidos responsáveis pelas interações proteína-flavonóides (hidrofóbicas e eletrostáticas). / Flavonoids belong to a large class of polyphenolic compounds which occur naturally in plants and can be found seeds, stems, leaves, flowers and/or fruits. Recent studies indicate that these polyphenolic compounds can present a significant variety of beneficial biological activities on human health, such as: antioxidant, anti-inflammatory, antibacterial, antiviral, and anticancer. Human Serum Ambumin (HSA) is the main extracellular protein presents in blood plasma. The core function of this protein is to carry and distribute endogenous and exogenous ligands to different molecular targets in the human body. For these aspects, it is important to develop studies that characterize the interaction of the flavonoids with the carrier protein HSA. This work investigates the interaction of the flavonoids Isovitexin (ISO) and 2-Phenylchromone (2PHE) with the HSA, using experimental techniques of fluorescence, UV-Vis absorbance, circular dichroism (CD), and Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy; along with computational tools of ab initio calculation, molecular dynamics, and molecular modeling. The integration of these experimental and computational approaches allows to characterize the formation of the HSA-flavonoids complexes, determining physicochemical aspects, sucha as: affinity constants, thermodynamic parameters, number of binding sites, cooperativity profile and aminoacid residues responsable for the protein-flavonoids interactions (hydrophobic and electrostatic).

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiegoSD_DISSERT.pdf: 4467915 bytes, checksum: 1bb0defec90e5ed329ebefbf24ac108a (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Currently, computational methods have been increasingly used to aid in the characterization of molecular biological systems, especially when they relevant to human health. Ibuprofen is a nonsteroidal antiinflammatory or broadband use in the clinic. Once in the bloodstream, most of ibuprofen is linked to human serum albumin, the major protein of blood plasma, decreasing its bioavailability and requiring larger doses to produce its antiinflamatory action. This study aimes to characterize, through the interaction energy, how is the binding of ibuprofen to albumin and to establish what are the main amino acids and molecular interactions involved in the process. For this purpouse, it was conducted an in silico study, by using quantum mechanical calculations based on Density Functional Theory (DFT), with Generalized Gradient approximation (GGA) to describe the effects of exchange and correlation. The interaction energy of each amino acid belonging to the binding site to the ligand was calculated the using the method of molecular fragmentation with conjugated caps (MFCC). Besides energy, we calculated the distances, types of molecular interactions and atomic groups involved. The theoretical models used were satisfactory and show a more accurate description when the dielectric constant &#949; = 40 was used. The findings corroborate the literature in which the Sudlow site I (I-FA3) is the primary binding site and the site I-FA6 as secondary site. However, it differs in identifying the most important amino acids, which by interaction energy, in order of decreasing energy, are: Arg410, Lys414, Ser 489, Leu453 and Tyr411 to the I-Site FA3 and Leu481, Ser480, Lys351, Val482 and Arg209 to the site I-FA6. The quantification of interaction energy and description of the most important amino acids opens new avenues for studies aiming at manipulating the structure of ibuprofen, in order to decrease its interaction with albumin, and consequently increase its distribution / Na atualidade, os m?todos computacionais v?m sendo cada vez mais utilizados para auxiliar a biologia molecular na caracteriza??o de sistemas biol?gicos, principalmente quando esses possuem relev?ncia para a sa?de humana. O ibuprofeno ? um antiinflamat?rio n?o-esteroidal de larga utiliza??o na cl?nica. Uma vez na corrente sangu?nea, boa parte do ibuprofeno fica ligada a albumina de soro humano, a principal prote?na do plasma sangu?neo, diminuindo a sua biodisponibilidade e necessitando de maiores doses para a produ??o de seu efeito antiinflamat?rio. Este estudo teve por objetivo caracterizar, atrav?s da energia de intera??o, como ocorre a liga??o do ibuprofeno ? albumina e estabelecer quais os principais amino?cidos e intera??es moleculares envolvidas no processo. Para tal desenvolveu-se um estudo in silico, com utiliza??o de c?lculos de mec?nica qu?ntica, baseada na Teoria do Funcional da Densidade (DFT), com aproxima??es do Gradiente Generalizado (GGA) para descri??o dos efeitos de correla??o e troca. A energia de intera??o de cada amino?cido do s?tio de liga??o, com o ligante foi calculada com base no m?todo de fragmenta??o molecular com capas conjugadas (MFCC). Al?m da energia, foram calculadas as dist?ncias, tipos de intera??es moleculares e grupos at?micos envolvidos. Os modelos te?ricos utilizados foram satisfat?rios e demonstraram uma descri??o mais precisa com a utiliza??o da constante diel?trica &#949;=40. Os achados corroboram com a literatura colocando o s?tio Sudlow I (I-FA3) como o principal s?tio de liga??o e o s?tio I-FA6 como s?tio secund?rio. Contudo, difere quanto ? identifica??o dos amino?cidos mais importantes, que por meio da energia de intera??o, em ordem decrescente de energia, s?o: Arg410, Lys414, Ser 489, Leu453 e Tyr411 para o S?tio I-FA3 e Leu481, Ser480, Lys351, Val482 e Arg209 para o s?tio I-FA6. A quantifica??o da energia de intera??o e a descri??o dos amino?cidos mais importantes abre caminhos para novos estudos que visem a manipula??o da estrutura do ibuprofeno, no sentido de diminuir a intera??o desse com a albumina, e consequentemente aumentar a sua distribui??o

Produtos de glicação avançada (AGE) prejudicam o metabolismo de lipoproteínas e o transporte reverso de colesterol, o que contribui para a aterosclerose no diabete melito (DM). Em particular, a albumina modificada por AGE (albumina-AGE) reduz a remoção de colesterol por diminuir o conteúdo do receptor ABCA-1 em macrófagos. Isto se vincula ao insulto oxidativo e inflamatório, os quais são indutores do estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo do presente estudo foi avaliar, em macrófagos, os efeitos do tratamento com albumina-AGE sobre o estresse do RE e suas vias adaptativas (UPR), relacionando-os com o prejuízo na expressão do ABCA-1 e efluxo de colesterol celular. Albumina-AGE foi produzida pela incubação de albumina isenta em ácidos graxos com glicolaldeído 10 mM e, albumina controle (albumina-C) com PBS apenas. Albumina foi isolada do soro de pacientes portadores de DM com controle glicêmico inadequado (albumina-DM) ou indivíduos controles (albumina não- DM) por cromatografia para separação rápida de proteínas seguida por purificação alcoólica. Macrófagos de peritônio de camundongos ou macrófagos da linhagem J774 foram tratados com os diferentes tipos de albumina na presença ou ausência de ácido fenil butírico (PBA; chaperona química que alivia o estresse do RE) ou MG-132 (inibidor do sistema proteasomal) por diferentes intervalos de tempo. A expressão de marcadores do estresse do RE, UPR, proteína dissulfeto isomerase (PDI), calreticulina e ubiquitina foi determinada por imunoblot e o conteúdo de ABCA-1, por citometria de fluxo e imunocitoquímica. O efluxo de 14Ccolesterol foi avaliado, utilizando-se apoA-I como aceptora de colesterol. A albumina-AGE induziu aumento tempo-dependente na expressão das chaperonas marcadoras do estresse do RE - Gr78 e Grp94 - e de proteínas da UPR (ATF6 e eIF2-P) em comparação à albumina-C. O conteúdo de ABCA-1 e o efluxo de colesterol foram reduzidos em, respectivamente, 33% e 47% e ambos foram restaurados pelo tratamento com PBA, o qual também reduziu o estresse do RE. A associação entre estresse de RE e redução de ABCA-1 foi confirmada pelo uso da tunicamicina (indutor clássico de estresse do RE), que diminuiu em 61% o conteúdo de ABCA-1, prejudicando em 82% o efluxo de colesterol. A albumina-AGE aumentou o conteúdo total de ubiquitina. A inibição do sistema proteasomal não foi capaz de restaurar o conteúdo de ABCA-1 em células tratadas com albumina-AGE. Em macrófagos expostos à albumina-DM evidenciou-se maior expressão da PDI e calreticulina, com tendência à maior expressão da Grp94. A albumina-AGE (produzida in vitro ou isolada de portadores de DM) induz estresse de RE, o qual se vincula à redução no conteúdo de ABCA-1 e efluxo de colesterol. Estes eventos podem contribuir para a aterosclerose no DM. Chaperonas químicas, que aliviam o estresse do RE, podem ser ferramentas úteis na prevenção e tratamento da aterosclerose / Advanced glycation end products (AGE) disturb lipoprotein metabolism and reverse cholesterol transport, contributing to atherosclerosis in diabetes mellitus (DM). Particularly, advanced glycated albumin (AGE-albumin) reduces cell cholesterol removal by impairing the expression of ABCA-1 in macrophages. This is ascribed to the oxidative and inflammatory stress, conditions that elicit endoplasmic reticulum (ER) stress. In this study it was investigated the effect of AGE-albumin on ER stress and adaptative pathways (UPR) development in macrophages, and its relationship to the reduction in ABCA-1 expression and cholesterol efflux. AGE-albumin was prepared by incubating fatty acid free albumin with 10 mM glycolaldehyde and control albumin (C-albumin) with PBS only. Albumin was isolated from poorly controlled DM patients (DM-albumin) and control individuals (nonDMalbumin) by fast liquid chromatography and purified by alchoolic extraction. Mouse peritoneal macrophages or J774 cells were treated along time with the different types of albumin in the absence or presence of phenyl butiric acic (PBA; a chaperone that aleviates ER stress) or MG132 (a proteasomal inhibitor). The expression of ER stress and UPR markers, protein disulfide isomerase (PDI), calreticulin and ubiquitin was determined by immunoblot and ABCA-1 protein level, by flow cytometry and imunocytochemistry. 14Ccholesterol efflux was evaluated utilizing apo A-I as cholesterol acceptor. AGE-albumin induced a time-dependent increase in the expression of ER stress chaperone markers - Gr78 and Grp94 - and UPR proteins (ATF6 and eIF2-P) in comparison to C-albumin. ABCA-1 content and cholesterol efflux were diminished by, respectively, 33% and 47% and both were recovered by the treatment with PBA. The association between ER stress and ABCA-1 reduction was confirmed by the reduction, induced by tunicanycin (a classical ER stress inductior) in ABCA-1 protein level (61%) and cholesterol efflux (82%). AGE-albumin increased the amount of cellular total ubiquitin. The inhibiton of proteasomal system was unable to restore ABCA-1 protein level in cells treated with AGE-albumin. In macrophages exposed to DM-albumin a higher expression of PDI and calreticulin was observed together with a trend of enhanced Grp94 expression. In conclusion, AGE-albumin (produced in vitro or isolated from DM patients) induces ER stress which is related to the reduction in ABCA-1 level and cholesterol efflux in macrophages. These events can contribute to atherosclerosis in DM. Chemical chaperones that alleviate ER stress may be useful in the prevention and treatment of atherosclerosis

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory, autoimmune disease, characterized by peripheral and symmetrical polyarthritis that leads to joint destruction and deformity due to erosion of cartilage and bone. This is a common disease that affects approximately 1% of the world population and is more common in women than men, however, its peak incidence occurs between the fourth and sixth decades of life. Large amounts of reactive oxygen species (ROS) have been identified in the synovial fluid of RA patients, and such large amounts may lead to oxidative damage of hyaluronic acid, lipid, cartilage matrix and DNA. The accumulation of ROS in the cells, also serves as major intracellular signaling molecules that amplify the inflammatory response synovium proliferative. The objective of this study was to evaluate the levels of ischemia-modified albumin (IMA) and also other markers of oxidative stress and inflammation in 16 patients with RA and 20 healthy controls. IMA levels were significantly higher in RA patients than healthy controls (0.495 ± 0.01 vs 0.433 ± 0.02 ABSU, P=0.038). No significant differences were observed for the other markers studied. Thus it was concluded that besides RA being related to inflammation, elevated levels of IMA in RA patients suggest that this pathology promotes increased oxidative stress. / A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica, de caráter autoimune, caracterizada por poliartrite periférica e simétrica, que leva à deformidade e destruição das articulações devido à erosão da cartilagem e do osso. Esta é uma doença comum que afeta aproximadamente 1% da população mundial, sendo mais frequente em mulheres do que nos homens, no entanto, seu pico de incidência ocorre entre a quarta e sexta décadas de vida. Grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (EROs) foram identificadas no fluido sinovial de pacientes com AR, e essa grande quantidade pode levar a dano oxidativo ao ácido hialurônico, lipídios, matriz da cartilagem e ao DNA. O acumulo de EROs nas células, também serve como importantes moléculas sinalizadoras intracelulares que amplificam a resposta inflamatória - proliferativa sinovial. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os níveis de albumina modificada pela isquemia (IMA) e outros marcadores de estresse oxidativo e inflamação em 16 pacientes com AR e 20 controles saudáveis. Os níveis de IMA foram significativamente maiores no grupo de pacientes com AR do que os controles saudáveis (0.495 ± 0.01 vs 0.433 ± 0.02 ABSU, P=0.038). Não foram observadas diferenças significativas para os outros marcadores estudados. Desta forma, foi possível concluir que além da AR estar relacionada com a inflamação, os níveis elevados de IMA em pacientes com AR, sugerem que esta patologia promova o aumento do estresse oxidativo.

[pt] Na busca de novos quimioterápicos diferentes dos clássicos derivados de cisplatina, ligantes derivados aroíl-hidrazônicos e complexos de cobre(II) aparecem como compostos promissores. Esta tese relata o desenvolvimento e a síntese de uma nova combinação desses compostos a partir de oito ligantes bases de Schift aroíl-hidrazônicos inéditos e seus Cu2-complexos derivados de sais de perclorato ou acetato 1‒14. Os complexos de cobre(II) obtidos contêm em suas estruturas modelos estruturais de sítios ativos de algumas metaloenzimas. Os compostos foram amplamente caracterizados utilizando várias técnicas espectroscópicas e analíticas. As análises por difração de raios X de quatro ligantes e cinco complexos são descritas em detalhes nessa tese. A estabilidade dos compostos foi estudada em meio celular e sua atividade biológica foi analisada. Os resultados incluem um estudo da interação de dois ligantes derivados de tiofeno (H3L1) ou furano (H3L2) e seus respectivos complexos 1 e 2 (primeiro conjunto de compostos) com uma proteína e DNA do timo de vitelo (calf thymus DNA), com o objetivo de medir a afinidade de ligação à albumina sérica bovina e ao DNA usando as técnicas de absorção de UV/Visível e/ou fluorescência. Adicionalmente, foi visto através de técnicas de espalhamento de luz que a interação entre os compostos e a proteína é reversível. Uma importante contribuição do presente trabalho foi analisar a capacidade de clivagem do DNA plasmidial de dois complexos 1 e 2 usando a técnica de espalhamento de luz dinâmico. Neste trabalho são estudadas as alterações do raio hidrodinâmico do DNA plasmidial causada pelo corte nas hélices resultante da presença dos complexos. Ensaios de citotoxicidades em algumas células cancerígenas, revelaram a alta capacidade dos ligantes (H3L1 and H3L2) e dos complexos (1 e 2) de induzir a morte celular. Ademais, as muitas propriedades biológicas, incluindo a atividade anticancerígena do fragmento isoxazol, motivaram sua inclusão na estrutura dos ligantes H3L3 and H2L4 e complexos 3‒6 (segundo conjunto de compostos). A combinação dessas estruturas pode vir a ser promissora na procura de novos medicamentos contra o câncer. A interação dos derivados dos ligantes isoxazol-aroíl-hidrazônicos com o DNA foi diretamente estudada por espectroscopia na absorbância e fluorescência, usando as propriedades luminescentes apresentadas pelos ligantes. No caso dos complexos, o ensaio de deslocamento de brometo de etídio revelou uma afinidade importante através da intercalação nos ácidos nucleicos da sequência do DNA. Adicionalmente, este trabalho conseguiu demostrar que ligantes e complexos contendo um braço fenólico no lugar de um braço piridínico melhoram a citotoxicidade in vitro em células de câncer de mama epitelial humano, alcançando a faixa nanomolar. A capacidade de metalação e transmetalação dos ligantes binucleares H3L3 e H2L4 e seus complexos de cobre 3‒6 com Fe(II), Fe(III) e Zn(II) provenientes do meio biológico foi verificada como uma estratégia adicional para induzir a morte de células cancerígenas. Além disso, para estudar a interação dos compostos com o sistema biológico e/ou para demostrar a permeabilidade celular dos compostos, os ligantes (H3L5‒H3L7) e complexos (7‒12) foram funcionalizados com fluoróforos potentes como pireno (H3L5) (conjunto três de compostos), benzopiranotiofeno (H3L6) ou borodipirrometeno (H3L7) (conjunto quatro de compostos) associados aos fragmentos hidrazônicos. Estudos de microscopia de fluorescência do ligando H3L7 comprovaram sua presença dentro de células de câncer. Também, análises de co-localização para organelas mostraram a afinidade dos ligantes com a mitocôndria. Finalmente, motivada pelas propriedades biológicas da molécula isoniaziada e seu uso em tratamentos de quimioterapia, esta tese mostra de forma general a síntese, caracterização e citotoxicidade de um novo ligante isoniazídico (H2L8) e seus complexos de perclorato ou acetato de cobre(II) 13 e 14 (conjunto cinco de compostos) visando realizar um pedido de patente. / [en] On the search of new chemotherapeutic agents differing from the classic cisplatin family drugs, aroylhydrazonic derivatives and their copper(II) complexes appear as promising compounds. This thesis reports on the design and syntheses of a novel combination of them through eight new aroylhydrazones and their fourteen perchlorate and/or acetate Cu2-complexes 1‒14. The obtained bioinspired copper(II) complexes constitute structural models for the active sites of some type 3 copper enzymes. The compounds were fully characterized using various spectroscopic and analytical techniques. X-ray diffraction structures for four ligands and five complexes are described in detail. Compounds stability was studied in cellular medium and their biological activity was examined. The results include a large study on the interaction of two thiophene (H3L1) or furan (H3L2) ligand derivatives and their respective μ-hydroxo dicopper complexes 1 and 2 (first set of compounds) respectively, with bovine serum albumin protein and calf thymus DNA using different spectroscopic techniques, which include the binding affinity to BSA and DNA using UV/Visible and/or fluorescence techniques. Additionally, scattering techniques revealed that the interaction between the compounds and BSA induces reversible aggregation of the biomolecules. As an important contribution of the present work, the plasmid DNA cleavage ability of the complexes 1 and 2 was studied by Dynamic Light Scattering. The changes of hydrodynamic radius values of pBR322 plasmid DNA are correlated to the nick induced by the complexes in the helices. Cytotoxic assays on some cancer cells revealed the high ability of H3L1 and H3L2, and complexes 1 and 2 to induce cell death. On the other hand, the many biological properties, including anticancer activity, of the isoxazole molecule, motivated the inclusion of this moiety in two ligands H3L3 and H2L4 and four complexes 3‒6 (second set of compounds). Interaction of these isoxazole-aroylhydrazonic ligand derivatives with DNA was directly studied by absorbance and fluorescence spectroscopy, as a result of the fluorescence properties displayed by the ligands. In the case of the isoxazole-aroylhydrazonic complexes-DNA interaction, the ethidium bromide displacement assay revealed significant affinity by intercalation binding mode of the nucleic acid in the DNA sequence. Additionally, this work successfully demonstrated that ligands and complexes containing a phenol pendant arm instead of a pyridine one improve the in vitro cytotoxicity on human epithelial breast cancer cells, attaining nanomolar range. Metal chelation and transmetallation ability of binucleating ligands H3L3 and H2L4 and their copper complexes 3‒6 with Fe(II), Fe(III) and Zn(II) from the biological medium was verified as an additional cell death induction anticancer strategy. Moreover, to study the interaction of the compounds with the biological system and to demonstrate their cell permeability, ligands (H3L5‒H3L7) and complexes (7‒12) were functionalized in their hydrazone moieties with potent fluorophores, such pyrene (H3L5) (set three of compounds), benzopyranothiophene (H3L6), or boron-dipyrromethene (H3L7) derivatives (set four of compounds). Fluorescence microscopy studies proved the presence of ligand H3L7 inside cancer cells, proving its ability to pass through the cell membrane. Besides, co-localization analysis for organelles showed the affinity of this ligand for the mitochondria. Finally, motived by the wide spectrum of biological properties of the isoniazid molecule and its use in chemotherapy, this thesis reports the syntheses, characterization and cytotoxicity studies on cancer cells of a new isonicotinoyl hydrazone ligand (H2L8) and its perchlorate or acetate copper(II) complexes 13 and 14 (set five of compounds), which are involved in a patent request.